BÁO CÁO THỰC HÀNH KỸ THUẬT PHÂN TÍCH VI SINH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM – MÔI TRƯỜNG
BÁO CÁO THỰC HÀNH KỸ THUẬT PHÂN TÍCH VI SINH

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt
Nhóm 6 -Lớp 14DSH04

Tp. Hồ Chí Minh-2017

CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU
1


1.1 GIỚI THIỆU
Như chúng ta đã biết nước và thực phẩm là những nhu cầu cần thiết nuôi sống con
người thế nhưng cũng chính nó có thể gây ngộ độc hoặc gây bệnh cho con người, vì nếu
không biết cách chế biến hay bảo quản thì sẽ tạo các vi sinh vật gây bệnh, các độc tố hóa
học.
Có rất nhiều vụ ngộ độc thực phẩm hoặc các bệnh về đường ruột do các vi sinh vật
hiện diện trong nước và thực phẩm gây nên. Ngộ độc thực phẩm biểu hiện các triệu
chứng do vi sinh vật hiện diện trong thực phẩm hay nước uống mà chúng ta sử dụng hằng
ngày gây ra. Nhiễm bệnh do vi sinh vật trong thực phẩm là trường hợp nhiễm bệnh do sử
dụng thức ăn chứa các vi sinh vật gây bệnh như E.coli, Coliform, Staphylococus Aureus,
Salmonella, TPC.
Mặt khác, hiện nay ngộ độc thực phẩm còn bao gồm trường hợp thức ăn có chứa các
vi sinh vật gây bệnh hiện diện ở mật độ thấp trong nguyên liệu hay bị nhiễm vào trong
quá trình chế biến, vì trong quá trình chế biến hay bảo quản, các vi sinh vật này và độc tố
của chúng có thể tăng nhanh đến mức gây ngộ độc.
1.2 MỘT SỐ VI SINH VẬT GÂY BỆNH CÓ TRONG NƯỚC VÀ THỰC PHẨM

1.2.1 Tổng vi sinh vật hiếu khi (TPC)
- Vi sinh vật hiếu khí là những vi sinh vật tăng trưởng và hình thành trong điều

kiện có sự hiện diện của oxy phân tử.
- Chỉ tiêu tổng vi sinh vật hiếu khí (TPC) là tổng số vi sinh vật hiếu khí phát triển

trong điều kiện có sự hiện diện của oxy. Chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm.
1.2.2 Coliform
- Coliforms: là trực khuẩn, Gram âm, không sinh bào tử, kỵ khí tùy nghi, có khả
năng lên men lactose, sinh acid và hơi ở 37 oC trong 24 - 48 giờ. Có trong tự nhiên,
ruột người và động vật
- Được xem là vi sinh vật chỉ thị an toàn vệ sinh thực phẩm bởi vì số lượng của
chúng hiện diện trong mẫu chỉ thị khả năng có sự hiện diện của các vi sinh vật gây
bệnh khác trong thực phẩm.
2


1.2.3 Staphylococcus Aureus
- Staphylococcus aureus: Là cầu khuẩn gram dương, hiếu khí, thường kết dạng
chùm có mặt phổ biến ở khắp nơi như trên da, xoang mũi, tóc...
- Staphylococcus Aureus sản sinh ra độc tố đường ruột enterotoxin bền nhiệt. khi
ăn phải thực phẩm có chứa độc tố này sẽ bị ngộ độc.
1.2.4 E.Coli
- E.coli là là trực khuẩn, Gram âm, không sinh bào tử, kỵ khí tùy nghi, có khả
năng lên men lactose, sinh acid và hơi 44oC trong 24 - 48 giờ.
- Cho kết quả thử nghiệm IMViC lần lượt là: Indol(+), Methyl Red (+), Voges
Proskauer (-), Citrate (-).
1.2.5 Salmonella
- Salmonella: Vi sinh vật thuộc loại trực khuẩn gram âm, kỵ khí tuỳ nghi, không
sinh bào tử, di động bằng tiên mao.

- Samonella không lên men được Lactose ( trừ S.arizona ) và Sucrose. Chúng kém
chịu nhiệt, có 3 dạng bệnh do Samonella gây ra: sốt thương hàn do S.typhi, nhiễm
trùng máu do S.cholera-suis, rối loạn tiêu hoá do S.typhirium và S.enteritidis.

3


Chương II TỔNG QUAN
1. Nguồn mẫu phân tích:
a. Mẫu thực phẩm:
+ Tên mẫu: Chả lụa
+ Thời gian thu mẫu: Sáng 7h20 ngày 29/03/2017.
+ Địa điểm thu mẫu: chợ Hàng xanh, Phường 25, Quận Bình Thạnh
+ Một số yếu tố cảm quan đặc trưng của mẫu:
-

Màu: trắng đục đặc trưng.
Mùi: mùi đặc trưng của chả lụa không hôi thối.
Hình thức mẫu: lát tròn.

b. Mẫu nước:
+ Tên mẫu: trà tắc
+ Thời gian thu mẫu: Sáng 7h30 ngày 05/04/2017.
+ Địa điểm thu mẫu: chợ Hàng xanh, Phường 25, Quận Bình Thạnh TP.HCM
+ Một số yếu tố cảm quan đặc trưng của mẫu:
-

Màu sắc: nâu cam
Mùi: thơm mùi trà tắc
Hình thức mẫu: lỏng

2. Các tác nhân gây nhiễm trên mẫu:
Ba tác nhân có nguy cơ lớn gây nhiễm trên thực phẩm ( cụ thể là mẫu thí nghiệm: thịt
gà công nghiệp và nước giếng ): ô nhiễm sinh học, ô nhiễm hóa học, ô nhiễm vật lý.
 Ô nhiễm sinh học:
Các mối nguy gây ô nhiễm sinh học : vi khuẩn, virus, kí sinh trùng.
Con đường gây ô nhiễm sinh học vào thực phẩm:
Súc vật bị bệnh; chế biến thực phẩm không vệ sinh; bảo quản thực phẩm trong
điều kiện mất vệ sinh không che đậy
 Các tác nhân sinh học gây ô nhiễm thực phẩm:

4


Vi khuẩn: Vi khuẩn là mối nguy hay gặp nhất trong các mối nguy gây ô nhiễm thực
phẩm. Theo thống kê 50-60% các vụ ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam là do vi khuẩn
gây ra. Vi khuẩn có ở khắp mọi nơi, đặc biệt phân, nước thải, rác, bụi, thực phẩm tươi
sống là ổ chứa nhiều loại vi khuẩn gây bệnh. Ngay ở cơ thể người cũng có rất nhiều
loại vi khuẩn, chúng cư trú ở da, bàn tay, ở miệng, đường hô hấp, đường tiêu hoá, bộ
phận sinh dục, tiết niệu…
 Siêu vi trùng(virus)
Virus còn nhỏ hơn vi khuẩn nhiều lần, phải dùng kính hiển vi điện tử phóng đại hàng
vạn lần mới nhìn thấy chúng. Nói chung virus chịu được lạnh, không chịu được nóng
và tia tử ngoại. Virus bị ảnh hưởng bởi các chất sát khuẩn như formol, cồn, acid và
kiềm mạnh. Virus gây ngộ độc thực phẩm và các bệnh truyền qua thực phẩm thường
có trong ruột người. Các loại nhuyễn thể sống ở vùng nước bị ô nhiễm, rau quả tưới
nước có phân hoặc các món ăn sống chuẩn bị trong điều kiện thiếu vệ sinh thường
hay bị nhiễm virus bại liệt, virus viêm gan. Virus có thể lây truyền từ phân qua tay
người tiếp xúc hoặc từ nước bị ô nhiễm phân vào thực phẩm, với một lượng rất nhỏ,
virus đã gây nhiễm bệnh cho người. Virus nhiễm ở người có thể lây sang thực phẩm

hoặc trực tiếp lây sang người khác trước khi phát bệnh.
 Ký sinh trùng
Ký sinh trùng là những sinh vật sống nhờ (ký sinh) trong cơ thể các sinh vật khác (vật
chủ) đang sống, lấy thức ăn từ các sinh vật đó để tồn tại và phát triển. Hầu hết ký sinh
trùng bị chết và mất khả năng gây bệnh ở nhiệt độ - 150C. Các loại ký sinh trùng hay
gặp trong thực phẩm là giun, sán.

 Ô nhiễm hóa học:
Trong sản xuất, chế biến thực phẩm có thể xảy ra ô nhiễm hóa học. Những chất hoá
học hay bị ô nhiễm vào thực phẩm gồm:
+ Các chất ô nhiễm từ môi trường như: chì trong khí thải của các phương tiện vận
tải, có trong sơn, men gốm, mối hàn ô nhiễm vào thực phẩm; hoặc ô nhiễm cadimi do
xử lý nước thải, bùn, đất, rác, quặng...
+ Các chất hoá học sử dụng trong nông nghiệp như: thuốc bảo vệ thực vật, phân
bón, thuốc thú y, chất tăng trọng, kích thích tăng trưởng...
+Các chất phụ gia thực phẩm (các chất tạo mầu, tạo ngọt, hương liệu, chất ổn định,
chất chống ôxy hoá, chất tẩy rửa...) sử dụng không đúng quy định như ngoài danh mục
cho phép, hoặc sử dụng không đúng hướng dẫn của nhà sản xuất
+ Các hợp chất
không mong muốn có trong bao bì chứa đựng, đóng gói thực phẩm.
5


+ Các chất độc tự nhiên có sẵn trong thực phẩm như ở mầm khoai tây, sắn, măng,
nấm độc, cá nóc, cóc, nhuyễn thể hai mảnh vỏ (sò, vẹm, nghêu vỏ cứng), nấm mốc
sinh độc tố (độc tố vi nấm Aflatoxin trong ngô, lạc, đậu, cùi dừa bị mốc ). Ngộ độc do
chất độc tự nhiện thường rất cấp tính, rất nặng, tỷ lệ tử vong rất cao (như ngộ độc
măng, nấm độc, cá nóc, cóc); hoặc ảnh không tốt đến sức khoẻ lâu dài.
 Ô nhiễm vật lý:
+ Các mảnh kim loại, thuỷ tinh, mảnh gỗ, sạn, đất, sỏi, xương, lông tóc... nếu bị lẫn

vào thực phẩm, có thể làm nguy hại đến sức khoẻ con người như làm gẫy răng, hóc
xương, làm tổn thương niêm mạc miệng, dạ dầy, ruột...
+ Ô nhiễm phóng xạ từ các sự cố như rò rỉ phóng xạ từ các trung tâm nghiên cứu
phóng xạ, các nhà máy điện nguyên tử... hoặc các thực vật, động vật, nuôi trong vùng
môi trường bị ô nhiễm phóng xạ, kể cả nước uống, sai sót trong việc bảo quản thực
phẩm bằng chiếu xạ sẽ làm cho thực phẩm bị nhiễm các chất phóng xạ và gây hại cho
người sử dụng khi ăn uống phải chúng.

6


Chương III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1 Địa điểm và thời gian:
3.1.1 Địa điểm:
- Địa điểm thu mẫu:
Chả lụa: chợ Hàng Xanh phường 25 quận Bình Thạnh
Trà tắc
- Địa điểm phân tích: phòng thực hành lầu 7 trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí
Minh
3.1.2 Thời gian:
- Thời gian: từ ngày 29/03/2016 đến 05/04/2016.
3.2 Vật liệu:
3.2.1 Mẫu:
- Chả lụa
- Trà tắc
3.2.2 Môi trường cần sử dụng:
- Môi trường pha loãng mẫu: Saline Pepton Water (SPW) hoặc Bufer pepton Water
(BPW).
- Môi trường nuôi cấy: Plate Count Agar (PCA).
- Môi trường Tryptone Soya Agar (TSA).

- Môi trường Violet Red Bile Agar (VRB).
- Môi trường Brilliant Green Bile Lactose broth (BGBL).
- Môi trường Baird Parker (BPA) bổ sung Egg Yolk Tellurite.
- Môi trường Eosine Methylene blue (EMB).
- Canh tryptone.
- Canh MR-VP.
- Thạch Simmon Citrate.
- Môi trường Urea broth.
- Môi trường Lysine Decarboxylase (LDC).
- Môi trường Lactose broth.
3.2.3 Hóa chất:
- Nước muối sinh lý.
- Thuốc thử Kovac’c.
- Thuốc thử Methyl Red.
3.2.4 Dụng cụ:
- Ống nghiệm, Đĩa petri, Ống Durnham , Chai thủy tinh (250ml, 100ml…).
- Dây cấy thẳng, dây cấy vòng, Đèn cồn.
- Micropipette.
3.2.5 Thiết bị:
- Tủ ấm.
- Bể điều nhiệt.
- Nồi hấp khử trùng Autoclave.
3.3 Phương pháp phân tích mẫu thực phẩm:
3.3.1 Xử lý mẫu phân tích cho các chỉ tiêu:
7


- Cắt nhỏ 25g mẫu cho vào PE vô trùng → sau đó thêm vào 225ml dung dịch BPW →
đồng nhất mẫu → thu được mẫu có nồng độ 10-1.
3.3.2 Chỉ tiêu tổng vi sinh vật hiếu khí (TPC):

- Phân tích định lượng bằng phương pháp đổ đĩa.
- Quy trình phân tích:
25g mẫu + 225ml BPW → đồng nhất mẫu → độ pha loãng 10 -1. Pha loãng mẫu bằng
nước muối sinh lý → độ pha loãng 10-3, 10-4, 10-5. Mỗi độ pha loãng hút 1ml mẫu cho
vào 2 đĩa petri vô trùng. Sau đó đổ môi trường PCA đã nguội ở 45 oC vào. Lắc nhẹ đều,
chờ thạch nguội → úp ngược đĩa → đem ủ ở nhiệt độ 30oC trong 72 giờ.
- Đọc kết quả và tính toán kết quả.
3.3.3 Chỉ tiêu Coliform:
- Phân tích định lượng bằng phương pháp đổ đĩa.
- Quy trình phân tích:
25g mẫu + 225ml BPW → đồng nhất mẫu → độ pha loãng 10 -2. Hút 1ml mẫu pha loãng
vào 2 đĩa petri vô trùng. Sau đó đổ môi trường TSA (khoảng 5ml) đã nguội và chờ 30
phút. Sau đó đổ môi trường VRB (10 ml) đã nguội. Ủ ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ.
- Chọn và đếm các khuẩn lạc màu đỏ đến đỏ sậm, có quần tủa muối mật, đường kính lớn
hơn 0.5mm. Ở mỗi đĩa chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy sang môi trường BGBL. Ủ ở nhiệt
độ 37oC trong 24 giờ. Đếm số ống BGBL dương tính và tính toán kết quả.
3.3.4 Chỉ tiêu Staphylococcus Aureus:
- Phân tích định lượng bằng phương pháp cấy trang.
- Quy trình phân tích:
25g mẫu + 225ml BPW → đồng nhất mẫu → độ pha loãng 10 -1. Hút 0.1ml mẫu vào đĩa
petri chứa môi trường BP có bổ sung 5% Egg Yolk Tellurite. Sau đó trang đều đến khô. Ủ
ở nhiệt độ 37oC trong 48 giờ. Ở mỗi đĩa chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy sang môi trường
đông tụ huyết tương.( do điều kiện không có huyêt tương nên khi thực hành không thực
hiện bước này  . R=1
3.3.5 Chỉ tiêu E.coli:
- Phân tích định tính.
- Quy trình phân tích:
25g mẫu + 225ml BPW → đồng nhất mẫu → độ pha loãng 10-1.
Hút 1ml mẫu pha loãng 10 -1 vào ống nghiệm chứa 10ml môi trường BGBL.Ủ ở nhiệt độ
44oC trong 24 giờ. Chọn ống BGBL đục có sinh hơi cấy chuyển sang môi trường EMB.

Ủ ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ. Khuẩn lạc đặc trưng của E.coli trên môi trường EMB có
đặc điểm: tròn, dẹt, tâm đen, có ánh kim tím (giả định). Cấy sang môi trường TSA → ủ
37oC trong 24 giờ.
Cấy vào 1 môi trường Trypton, 2 MR-VP, 1 Simmons Citrate. Ủ 37 0C trong 24 giờ. Sử
dụng các loại thuốc thử để test thử nghiệm IMVIC (Indol, Methy Red, Voges –
Proskauer, Citrate).
Kết luận: phát hiện E.Coli trong mẫu hay không.
3.3.6 Chỉ tiêu Salmonella:
- Phân tích định tính.
8


- Quy trình phân tích:
25g mẫu + 225ml BPW → đồng nhất mẫu → độ pha loãng 10 -2. Ủ 37oC trong 24 giờ. Hút
0.1 ml mẫu sau khi tăng sinh cho vào ống nghiêm chứa 10ml môi trường RV. Ủ 42 oC
trong 24 giờ. Sau đó, cấy ria sang môi trường XLD, ủ 37 oC trong 24 giờ. Khuẩn lạc đặc
trưng của Salmonella trên XLD: tròn, lồi, có tâm đen, môi trường xung quanh khuẩn lạc
chuyển sang màu hồng.
-Cấy khuẩn lạc vào môi trường thử nghiệm sinh hóa: TSI, LDC, Mannitol phenol red,
Urea, canh trypton, MR-VP.
-Đọc các kết quả trên các môi trường thử nghiệm sinh hóa. Kết luận: phát hiện
Salmonella trong mẫu hay không.

9


Chương IV: KẾT QUẢ
4.1 Kết quả đánh giá cảm quan mẫu:
Mẫu thực phẩm: Chả lụa.
Kết cấu: có độ rắn vừa phải. Thời gian lấy mẫu: 7g20 sáng ngày 29/03/17

Mẫu nước: Trà tắc.
Có màu nâu cam, mùi thơm của trà tắc. Thời gian lấy mẫu: 7g30 sáng ngày 05/04/17
4.2 Kết quả định lượng TPC

Khuẩn lạc TPC được nuôi cấy trong môi trường PCA ủ ở 370C 72 giờ.

Nồng độ
Đĩa 1
Đĩa 2

Bảng kết quả đếm khuẩn lạc
10-3
32
34

Mật độ TPC trong mẫu:
A = = = 55.103 (cfu/ml)
10

10-4
26
29


4.3 Kết quả phân tích định lượng Coliform

Môi trường VRB nuôi cấy Coliform ủ 370C trng 24 giờ.

Thử nghiệm khẳng định Coliform trên môi trường BGBL
11

Nồng độ pha loãng
Đĩa 1
Đĩa 2

Bảng kết quả
10-3
Số ống BGBL dương tính
14
Không có ống BGBL nào
dương tính
16

- Không có khuẩn lạc Coliform nào xuất hiện → Không có Coliform trong mẫu → Kết
quả phân tích âm tính.
- Mật độ Coliform trong mẫu:
N: số khuẩn lạc (10-100)
R: tỷ lệ xác nhận (Số ống BGBL dương tính/Tổng số ống BGBL thử nghiệm)
A = = = 0 (cfu/ml)

4.4 Kết quả định lượng Staphylococcus Aureus

Khuẩn lạc Staphylococcus Aureus trên môi trường BP

Khuẩn lạc có đặc điểm tròn, lồi, có tâm đen, có quầng sáng bao xung quanh trên
môi trường BPA có bổ sung 5% Egg Yolk Tellurite.
- Có Staphylococcus Aureus trong mẫu.
12

Nồng độ pha loãng
Đĩa 1
Đĩa 2

Bảng kết quả
10
Số ống huyết tương dương tính
57
R=1
51
-1

- Mật độ Staphylococcus Aureus có trong mẫu:
N: số khuẩn lạc (10-100)
R: tỷ lệ xác nhận (Số ống BGBL dương tính/Tổng số ống BGBL thử nghiệm)
A = (cfu/ml)

4.5 Kết quả định tính E.coli
13


14


Các thử nghiệm định tính E.coli

Bảng kết quả
Kết quả BGBL
(+)

Kết quả EMB
(+)

Kết quả sinh hóa
Indol: (-)
MR: (+)
VP: (-)
Citrate: (+)

- Kết quả trên môi trường BGBL dương tính, EMB dương tính, trong thử nghiệm
imVic không khớp 2 trong 4 nghiệm pháp → trong mẫu không có E.coli

15


4.6 Kết quả phân tích Salmonella

Khuẩn lạc Salmonella trên môi trường XLD trong 24 giờ.
- Kết quả trên môi trường BPW: môi trường đục
- Kết quả trên môi trường RV: ống nghiệm chứa RV hơi đục.
- Kết quả trên môi trường XLD dương tính : xuất hiện khuẩn lạc đặc trưng (tròn lồi,
trong suốt, có tâm đen, môi trường xung quanh khuẩn lạc chuyển sang màu đỏ).
- Kết quả thử nghiệm sinh hóa:

16


TSI

Nghiêng vàng, sâu đen, có
H2S, có sinh hơi
LDC
+
Mannitol
Urea
+
Indol
+
VP
- Từ kết quả cho thấy không có sự xuất hiện của Salmonella trong mẫu do thí nghiệm
TSI âm tính (không nghiêng đỏ, sâu vàng) → Salmonella âm tính.

4.7 Kết quả phân tích mẫu nước

17


- Kết quả: các ông nghiệm đều có Coliform trong môi trường LSB
- Kết quả tính toán
A == = 0,72x103 (MPN/ml).
V. Kết luận và kiến nghị
5.1 Kết luận:
- Từ các kết quả thí nghiệm mẫu chả lụa ta thấy mật độ vi sinh vật phát triển thấp (mật độ
vi sinh vật nuôi cấy trên môi trường TPC), xuất hiện Staphylococcus Aureus nhưng với
mật độ thấp, không chứa Coliform, E.coli, Salmonella. Chúng ta có thể sử dụng nguồn
chả lụa này làm thực phẩm nhưng không được để quá lâu hay qua ngày.
- Từ kết quả thí nghiệm nước trà tắc: nước trà tắc dương tính Colifom. Chúng ta nên hạn
chế sử dụng loại nước này.

18


CÂU HỎI ÔN TẬP
Bài 2/ 10
Câu 1: Nêu cách thu mẫu nước từ sông, suối, ao hồ?
Lấy mẫu từ sông, suối, ao, hồ như sau: cầm chai ở vị trí gần đáy chai, đưa cổ chai
hướng xuống dưới và đưa sâu vào dưới mặt nước. Xoay nhẹ để cổ chai hơi
nghiêng lên bề mặt nước và miệng chai hướng về phía dòng chảy. Trong trường
hợp không có dòng chảy phải tạo ra một dòng chảy nhân tạo bằng cách xoay chai
theo hướng nằm ngang và đẩy chai về hướng miệng chai. Trong trường hợp lấy
mẫu khi đi trên thuyền, mẫu phải được lấy trước mũi thuyền. Nếu không thể lấy
mẫu bằng cách thức này, có thể buộc một vật nặng vào đáy chai rồi từ từ đưa nước
vào trong. Trong tất cả các trường hợp tránh không cho dụng cụ lấy mẫu tiếp xúc
với bờ hay đáy của suối hay bồn chứa
Câu 2: Nêu cách thu mẫu thực phẩm trên 1 quy trình sản xuât?
Khi tiến hành thu mẫu thì việc thu mẫu ở công đoạn nguyên liệu và thành phẩm là
bắt buộc, trong khi đó ở giai đoạn bán thành phẩm thì tùy từng loại mặt hàng sản
phẩm mà sẽ có các công đoạn khác nhau mà số lượng công đoạn cũng nhiều ít
khác nhau. Tuy nhiên, không thể thu mẫu hết tất cả các công đoạn ở giai đoạn bán
sản phẩm mà chỉ thu mẫu ở hai công đoạn liên tiếp của giai đoạn bán thành phẩm
trong một lần thu mẫu.
Câu 3: Các thông tin cần thiết khi thu mẫu là gì?
Việc lấy mẫu phải đảm bảo hai điều kiện sau:
Mẫu lấy phải đại diện được cho lô hàng hoặc nơi lấy mẫu (khi kiểm tra vệ sinh
công nghiệp) và nhận dạng được rõ ràng.
Hàm lượng các chất hay các vi sinh vật cần xác định không được biến đổi kể từ khi
lấy mẫu đến khi phân tích.
Câu 4: Các bước chuẩn bị mẫu?
Gồm các bước rã đông mẫu , (nếu có), cắt mẫu, cho vào dịch pha loãng, đồng nhất

mẫu.

19


Bài 3/ 15
Câu 1: Nêu khái niệm chỉ tiêu tổng sinh vật hiếu khí?
Tổng vi sinh vật hiếu khí là : là tống số vi sinh vật hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ
thị ở mức độ vệ sinh của thực phẩm.
Câu 2: Nêu quy trình phân tích chỉ tiêu TPC
1. Cân 25g mẫu pha chung với 225 ml SPW hoặc BPW sau đó đồng nhất mẫu
trong 30s ta thu được độ pha loãng 10-1.
2. Pha loãng trong nước muối sinh lý ta thu được độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4
3. Từ mỗi độ pha loãng hút 1ml cho vào hai đĩa petri vô trùng .Sau đó đổ môi
trường PCA đã được làm nguội ở 450C
4. Lắc đều và chờ đĩa thạch nguội úp ngược đem ủ ở nhiệt độ 300C trong 72
giờ
5. Đọc kết quả từ các kết quả từ 25 – 250 khuẩn lạc.
6. Sau đó áp dụng công thức A =
Trong đó A: số tế bào vi khuẩn (khuẩn lạc) có trong 1g mẫu
N: tổng số khuẩn lạc đếm được
ni: số lượng đĩa cấy tại nồng độ pha loãng thứ i
V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào môi trường
fi: độ pha loãng tương ứng
Câu 3: Tính toán kết quả và đối chiếu kết quả trên TCVN đối với mẫu thực tế
Bài 4/21
Câu 1: Khái niệm Coliform tổng số: là số lượng hiện diện của chúng trong thực
phẩm, nước hay các loại mẫu môi trường.
Câu 2: Tại sao khi phân tích Coliform phải tiến hành đổ môi trường 2 lớp TSA và
VRB?

Bởi vì môi trường VRB dùng để chọn lọc vi khuẩn gram ( - ) thì các tế bào vi sinh
vật có khả năng phát triển tốt mà chọn lọc vi sinh vật rất mạnh nên dẫn đến các tế
bào bị tổn thương , xay xát mạnh nên ta cần phải phục hồi các té bào này nên ta đổ
thêm môi trường TSA để phục hồi lại các tế bào vi sinh vật để tránh kết quả bị sai
sót làm kết quả chính xác hơn.
20


Câu 3: Nêu quy trình phân tích Coliform trong mẫu bằng phương pháp đỗ đĩa
1. 25g mẫu + 225ml SPW sau đó đồng nhất mẫu trong 30 giây dduocrj độ pha
loãng 10-1
2. Từ mỗi độ pha loãng hút 1ml vào 2 đĩa petri vô trùng. Sau đó đổ môi trường
TSA đã được làm nguội đến 450C và chờ trong 30 phút.
3. Đổ vào môi trường VRB lên môi trường TSA
4. Ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ
5. Chọn và đếm các khuẩn lạc có màu đỏ đến đỏ sậm , có quần tủa muối mật ,
đường kính <0.5 mm
6. Ở mỗi đĩa chọn 3 – 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy sang môi trường BGBL
7. Ủ 370C± 0,5 trong 24 giờ
8. Tỷ lệ xác nhận R = Số khuẩn lạc sinh hơi trong BGBL/ số khuẩn lạc đã cấy
9. Tống số Colifroms ( cfu/g) A =
Câu 4: Tính toán mật độ coliform trong các bài tập sau:
a) Kết quả phân tích Coliform bằng phương pháp đỗ đĩa ở nồng độ pha loãng
10-1 trên 2 đĩa được kết quả lần lượt là 9 và 8 khuẩn lạc. Chọn 5 khuẩn lạc
cấy vào môi trường BGBL thấy có 4 ống dương tính. Hãy tính kết quả?
A x => A< 7,2 x 101 (CFU/ml)
b) Kết quả định lượng Coliform bằng phương pháp đổ đĩa như sau: nồng độ 10 1

ở 2 đĩa là 105 và 80 khuẩn lạc, nồng độ pha loãng 10 -2 ở 2 đĩa là 20 và 38.

Chọn 5 khuẩn lạc cấy vào môi trường BGBL  có 4 KL dương tính. Hãy
tính kết quả?
A = = 9,2 x 102 (CFU/ml)
c) Tiến hành phân tích chỉ tiêu Coliform trong mẫu thịt heo. Quy trình thực
hiện như sau: cân 1g mẫu sau đó cho vào 99ml dung dịch pha loãng. Thực
hiện phương pháp đổ đĩa trên môi trường VRB. Kết quả thu được lần lượt là
85 và 20. Lấy 5 khuẩn lạc cấy vào môi trường BGBL thấy có 4 ống dương
tính. Hãy tính kết quả?
Nồng độ pha loãng mẫu: => 10-2
A = 4,2 x 103 ( CFU/ml)
Bài 5/28
21


Câu 1: Nguyên tắc định lượng S. aureus
Tiến hành cân một lượng mẫu nhất định, pha loãng đến độ pha loãng phù hợp.
Hút mẫu cho vào môi trường đăc trưng cho Staphylococcus aureus và tiến hành
trang đều mẫu, ủ ở nhiệt độ 370C trong 48 giờ.
Đếm số khuẩn lạc đặc trưng cho S. aureus, khẳng định bằng thử nghiệm
coagulase và tính toán kết quả trong 1g mẫu. Một vài chủng cho coagulase âm tính
nhưng cũng tạo độc tố đường ruột.
Câu 2: Đặc điểm khuẩn lạc của S. aureus trên môi trường BPA? Giải thích
Trong môi trường Baird Parker: S. aureus có đặc điểm tròn, lồi, có tâm đen,
bóng vun có vòng sáng quanh khuẩn lạc. Khuẩn lạc Staphylococci có hai đặc
điểm: khuẩn lạc có màu đen do khử telurite thành telurium, dạng lồi và tạo vòng
trong xung quanh khuẩn lạc,đường kính từ 2 – 5 mm do sự thủy phân protein. Sau
đó có thể xuất hiện 1 vòng đục ở trong vòng trong (có tác động của lecithinase,
một loại lipase). Đây là một đặc tính thường thấy và có tính chuyên biệt ở các tụ
cầu khuẩn gây bệnh.
Câu 3: Tại sao khi khẳng định S. aureus trên huyết tương thỏ ủ ở 37 oC lại theo dõi

2,4,6,8 và 24 giờ?
Trên môi trường BP: Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng và 5 khuẩn lạc không đặc
trưng từ môi trường BP cấy vào môi trường TSA. Ủ ở 37 oC trong 24 giờ. Cấy sinh
khối vi sinh vật vào ống nghiệm chứa môi trường huyết tương thỏ. Ủ ở 37 oC. Theo
dõi phản ứng đông tụ huyết tương trong 2,4,6,8,24 giờ. Tính tỉ lệ khẳng định trên
các khuẩn lạc đặc trưng và không đặc trưng.
Để khẳng định đặc tính, thời gian đông tụ máu càng ngắn thì độc tính càng
mạnh.
Câu 4: Nêu quy trình định lượng S. aureus trong mẫu bằng phương pháp đổ đĩa
22


Cấy 0,1 ml dịch mẫu pha loãng cho vào 2 đĩa petri môi trường BPA có bổ sung
Egg Yolk rồi trang đều cho đến khi khô mẫu  ủ 37oC trong 48h  Sau 48 giờ có
các khuẩn lạc đặc trưng (tròn, lồi, có tâm đen, quầng sáng bao quanh)  Đếm số
lượng khuẩn lạc trên đĩa  chọn 5 khuẩn lạc cấy chuyền sang môi trường TSA  ủ
37oC qua đêm  Cấy chuyền vào ống chứa huyết tương, ủ ở 37 oC theo dõi sau
2,4,6,8 và 24 giờ
Câu 5: Tính toán mật độ S. aureus trong các bài tập sau
a) Kết quả phân tích S. aureus bằng pp cấy trang ở nồng độ pha loãng 10 -1 ở 2
đĩa là 55 và 78 khuẩn lạc. Chọn 5 khuẩn lạc cấy vào huyết tương thấy có 4
ống dương tính. Hãy tính kết quả?
A= = 5,32.102 (CFU/g)
b) Kết quả phân tích S. aureus bằng pp đỗ đĩa ở nồng độ pha loãng 10 -1 trên 2
đĩa thu được 35 và 78 khuẩn lạc. Chọn 5 khuẩn lạc cấy vào huyết tương thấy
có 4 ống dương tính. Hãy tính toán kết quả?
A= = 4,5.103 (CFU/g)
c) Tiến hành phân tích chỉ tiêu S. aureus trong mẫu thịt heo. Quy trình thực
hiện như sau: cân 1g mẫu sau đó cho vào 99 ml dd pha loãng. Thực hiện pp
đỗ đĩa trên môi trường BPA. Kết quả thu được lần lượt là 85 và 20. Lấy 5

khuẩn lạc cấy vào môi trường huyết tương thỏ thì có 4 ống dương tính. Tính
toán kết quả.
Nồng độ pha loãng mẫu: => 10-2
A= = 4,2.103 (CFU/g)

Bài 6/34
Câu 1: Nguyên tắc định tính E. Coli
Phương pháp này dùng để định tính và kết luận phát hiện hay không phát hiện
E.Coli trong một khối lượng mẫu xác định
23


-

Tiến hành tăng sinh chọn lọc trong môi trường thích hợp (BGBL)
Phân lập trên môi trường phù hợp (EMB)
Khẳng định bằng các phản ứng sinh hóa phù hợp (IMViC)
Kết luận có sự hiện diện của E.Coli trong 25 g mẫu hay không?

Câu 2: Đặc điểm khuẩn lạc của E. Coli trên môi trường EMB? Giải thích
Đặc điểm khuẩn lạc của E.Coli trên môi trường EMB: tròn, dẹt, tâm đen, có ánh
kim tím
- Đặc điểm của khuẩn lạc: tròn, dẹt, tâm đen, có ánh kim tím.
- Có tâm đen: Do E.Coli phân hủy lưu huỳnh tiết enzyme sulfohydrolase khử
S kết hợp Fe2+ tạo kết tủa FeS.
- Có ánh kim tím: Lactose lên men tạo sản phẩm là acid, acid tích tụ nhiều
làm cho pH giảm. Khi pH giảm xảy ra hiện tượng cộng hưởng màu sắc do
Eosine và Methylene Blue kết hợp làm nên ánh kim tím.
Câu 3: Nêu cơ sở sinh hóa của các thử nghiệm khẳng định E. Coli
Các thử nghiệm sinh hóa được dùng để khẳng định E.Coli như sau:

 (1): Thử nghiệm Indole: môi trường canh trypton, Indole kết hợp với pdimetylaminobezabdehyde tạo phức màu đỏ hồng cánh sen.
Indole dùng thuốc thử Kovac’s :
(+): Vòng đỏ
(-): Không đổi màu
 (2): Thử nghiệm Methyl Red: có khả năng lên men đường glucose sẽ tạo ra
acid trong môi trường làm cho pH môi trường giảm; môi trường sẽ đổi màu
đỏ đậm (+), không đổi màu (-)
Methyl Red dùng thuốc thử Methyl Red :
(+):Đỏ
(-):Vàng
 (3): Thử nghiệm Voges – Proskauer: kiểm tra vi sinh vật có khả năng sinh
acetoin
Dùng thuốc thử: 3 giọt - napthol 5% và 1 giọt KOH 40% :
(+): Đỏ
(-): Không đổi màu
24


 (4): Thử nghiệm Citrate: kiểm tra xem vi sinh vật có khả năng sử dụng muối
Citrate hay không, nếu vi sinh vật có sử dụng sẽ sinh ra NH 3  pH tăng , môi
trường chuyển sang màu xanh dương (+)
(+): Xanh dương
(-): Xanh lá
STT

Thử nghiệm sinh hóa

Kết quả

1

Indole

+

2

Methyl Red

+

3

Voges Proskauer

-

4

Citrate

-

Câu 4: Nêu quy trình định tính E. Coli trong mẫu
25g mẫu + 225ml SPW  đồng nhất trong 30 giây  độ pha loãng 10-1
Hút 1ml mẫu ở độ pha loãng 10 -1 cho vào ống nghiệm chứa 10ml môi trường
BGBL
Ủ ở nhiệt độ 44oC trong 24 giờ
Chọn các ống BGBL đục và có sinh hơi cấy chuyển sang môi trường EMB
Ủ ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ

Sau đó, lấy môi trường ra, chọn các khuẩn lạc có các đặc trưng của E.Coli trên
EMB: tròn, dẹt, đường kính < 0,5 mm , có ánh kim tím
Ủ ở nhiệt độ là 37oC trong 24 giờ
Cấy vào môi trường: 1 trypton, 2 MR-VP, 1 Simmons Citrate
Ủ ở 37oC trong 24 giờ
Sử dụng các loại thuốc thử để test thử nghiệm IMViC
25