Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên (m, GP5, GP5ectoM) của virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn trong cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc nhờ agrobacterium

i

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THỊ MINH HẰNG

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN (M,
GP5, GP5ectoM) CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI
LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN TRONG CÂY
THUỐC LÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP THẨM LỌC NHỜ
AGROBACTERIUM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI – 2018

i


ii

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THỊ MINH HẰNG

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN (M,
GP5, GP5ectoM) CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI
LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN TRONG CÂY
THUỐC LÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP THẨM LỌC NHỜ

AGROBACTERIUM

Chuyên ngành: Hoá sinh học
Mã số: 94 20 116

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học:

1. TS. Nguyễn Trung Nam
Viện Công nghệ sinh học
2. PGS. TS. Chu Hoàng Hà
Viện Công nghệ sinh học

HÀ NỘI – 2018

ii


iii
LỜI CẢM ƠN
Luận án được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ gen,
Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh
học, Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam và Trung tâm Chẩn đoán Thú
y Trung ương. Với sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài thuộc nhiệm vụ nghiên cứu thường
xuyên của Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học.
Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi luôn
nhận được sự giúp đỡ của tập thể cán bộ hướng dẫn, các thầy cô giáo, các nhà khoa
học, các anh chị em đồng nghiệp và quý cơ quan, phòng ban. Tôi xin chân thành
cảm ơn Ban Lãnh đạo, Bộ phận đào tạo sau đại học, các phòng chức năng của Viện
Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành luận án.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới hai thầy, PGS.TS. Chu Hoàng Hà và
TS. Nguyễn Trung Nam đã định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, tạo mọi
điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn GS.TS. Lê Trần Bình, PGS.TS. Phạm Bích Ngọc,
PGS.TS. Đinh Duy Kháng, PGS.TS. Tô Long Thành, TS. Nguyễn Tường Vân, ThS.
Hồ Thị Thương và tập thể cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng Thí
nghiệm trọng điểm Công nghệ gen đã luôn giúp đỡ, chia sẻ những kiến thức quý
báu và tạo những điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Lâm nghiệp, Ban
Lãnh đạo, cùng toàn thể cán bộ của Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp đã tạo
mọi điều kiện tốt nhất để cho tôi yên tâm học tập và thực hiện luận án.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và các đồng nghiệp đã luôn động
viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận án này.
Hà Nội, ngày tháng năm 2018
Nghiên cứu sinh

Nguyễn Thị Minh Hằng

iii


i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của
PGS.TS. Chu Hoàng Hà, TS. Nguyễn Trung Nam và một số kết quả cùng cộng tác
với các cộng sự khác.
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được
công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các
đồng tác giả.

Phần kết quả còn lại của luận án chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình
nào khác.
Hà Nội, ngày tháng năm 2018
Tác giả

Nguyễn Thị Minh Hằng

i


ii

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
MỞ ĐẦU 1
Chương 1 6
TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................................................................
Chương 2 43
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....................................................................
Chương 3 61
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU...........................................................................................................
Chương 4 108
BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU...................................................................................108
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................................................... 130
NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN......................................132
TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH............................................................................ 133

TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................................... 140

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
AS
aa
2b CMV

Acetosyringone
Amino acid (axit amin)
Cucumber mosaic virus (CMV) 2b protein (Protein 2b của virus
ii


iii

bp
BSA
CaMV
Cs
DNA
ER
ELISA
ELP
et al
Fc
GFP
GP5
GP5ecto
HC-Pro
HP-PRRSV

khảm dưa chuột)
Base pair (Cặp base)
Bovine serum albumin
Cauliflower mosaic virus (Virus khảm súp lơ)
Cộng sự
Deoxyribonucleic acid
Endoplasmic reticulum (Lưới nội chất)
Enzyme linked immunosorbent assay
Elastin-like polypeptide
And co-workers (và các cộng sự)
Fragment crystallizable
Green fluorescent protein (Protein huỳnh quang xanh)
Glycoprotein 5
Ectodomain of glycoprotein (Vùng ngoại bào của protein GP5)
Helper component protease (Protein hỗ trợ)
Highly pathogenic Porcine reproductive and respiratory syndrome
virus (Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp thể độc lực

HRP
IPMA

cao)
Horseradish peroxidase
Immunoperoxidase monolayer assay (Xét nghiệm miễn dịch đơn lớp

IgG
kb
kDa
LB

cộng hợp enzyme peroxidase)
Immunoglobulin G
Kilobase
Kilodalton
Luria-Bertani (Môi trường nuôi khuẩn Luria-Bertani)

iii


iv

LV
M
MES
mg
MLV
mITC

Lelystad virus
Matrix/ Membrance protein
2-(N- Morpholino)ethanesulfonic acid
Milligram
Modified-live virus (Virus sống đã làm biến đổi = virus nhược độc)
Membrane-based Inverse transition cycling (Chu trình chuyển pha

nptII

nghịch đảo qua màng)
Gene mã hoá Neomycin phosphotransferase (Gen kháng

Nos
nsp
OD

kanamycin)
Nopaline synthase terminator
Non-structural protein
Optical density (Mật độ quang)

ORF

Open reading frame (Khung đọc mở)

PBS

Phosphate-buffered saline

PCR

Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

Fc

Stabilizing domain - "Fragment of crystallizable chain of IgG"

PRRSV

(Vùng hằng định của kháng thể IgG)
Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus (Virus gây

RNA

hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn)
Ribonucleic acid

ScFv

Single chain variable fragment

SDS-PAGE

Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis

TSP

Total soluble protein (Protein tổng hợp)

35S Ter

35S Terminator (Trình tự kết thúc phiên mã)

VLP

Virus-like particle

WT

Wild type (Cây không chuyển gen)

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1

Tình hình dịch PRRS giai đoạn 2015 – 2016 ………………... 8

Bảng 2.1

Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu gen gp5opt, gp5ecto-

44

iv


v
m và m ………………………………………………………..
Bảng 2.2

Thành phần phản ứng ghép nối gen m, gp5opt với vector
pRTRA 35S-Histag-Cmyc-100xELP ………………………..

Bảng 2.3

Thành phần phản ứng ghép nối đoạn gp5ecto với gen m và
với vector pRTRA 35S-Histag-Cmyc-100xEL ………………

Bảng 2.4

47
47

Thành phần phản ứng ghép nối các cassette gen với vector
pCB301 ………………………………………………………. 48

Bảng 3.1

So sánh mức độ biểu hiện tạm thời gen mã hoá các kháng
nguyên tái tổ hợp (M-ELP, GP5-ELP, GP5ectoM-ELP) trong
lá thuốc lá N. benthamiana …………………………………... 82

Bảng 3.2

Hiệu suất thu hồi và mức độ tinh sạch của các protein M-ELP,
GP5-ELP, GP5ectoM-ELP ……………………………..

91

DANH MỤC CÁC HÌNH

v


Hình 1.1
Hình 1.2
Hình 1.3
Hình 1.4
Hình 1.5
Hình 1.6

Đặc điểm hình thái của virus PRRS ………………………….

Ảnh hiển vi điện tử của các hạt Arterivirus ………………….
Mô hình cấu trúc hạt virus PRRS và các khung đọc mở trên
vi
hệ gen PRRS …………………………………………………
Đặc điểm của GP5 …………………………………................
Cấu trúc Arterivirus ………………………………………….
Sơ đồ mô tả sự biểu hiện gen tạm thời sử dụng các vector

9
9

Hình 1.7
Hình 1.8
Hình 2.1

pEAQ bằng phương pháp thẩm lọc A. tumefaciens …………. 34
Thẩm lọc nhờ A. tumefaciens vào lá N. benthamiana ……….. 34
Sơ đồ của chu kỳ chuyển pha nghịch đảo qua màng ………... 41
Chuyển gen tạm thời vào lá cây thuốc lá nhờ A. tumefaciens

Hình 2.2
Hình 2.3
Hình 3.1

bằng phương pháp hút chân không ………………………….. 50
Sơ đồ thí nghiệm gây miễn dịch trên chuột …………………. 55
Sơ đồ thí nghiệm gây miễn dịch trên lợn ……………………. 56
Thiết kế vector tách dòng pRTRA 35S-m-Histag-Cmyc-

Hình 3.2

100xELP ……………………………………………………... 61
Sơ đồ cấu trúc cassette gen m mã hoá protein M dung hợp
62

Hình 3.3

ELP............................................................................................
Kết quả thiết kế vector chuyển gen pCB301 35S-m-HistagCmyc-100xELP ………………………………………………
Phân tích sản phẩm Colony-PCR kiểm tra A. tumefaciens

63

Hình 3.4

65

Hình 3.5

mang vector pCB301 35S-m-Histag-Cmyc-100xELP ………..
Thiết kế vector tách dòng pRTRA 35S-gp5opt-Histag-Cmyc-

66

Hình 3.6

100xELP ……………………………...
Sơ đồ cấu trúc cassette gen gp5opt mã hoá protein GP5 dung
hợp ELP ……………………………………………………...
Kết quả thiết kế vector chuyển gen pCB301 35S-gp5opt-

67

Hình 3.7
Hình 3.8

Histag-Cmyc-100xELP ……………………………………… 68
Sản phẩm Colony-PCR kiểm tra A.tumefaciens mang vector

Hình 3.9

pCB301 35S-gp5opt-Histag-Cmyc-100xELP ……………….. 69
Thiết kế vector nhân dòng pRTRA 35S-gp5ecto-m-Histag-

12
13
14

Cmyc-100xELP ………………..…………
Hình 3.10 Sơ đồ cấu trúc cassette gen gp5ecto-m mã hoá protein

70

GP5ectoM dung hợp ELP trong vector pRTRA ………………
Hình 3.11 Kết quả phân tích kiểm tra vector chuyển gen mang gen

72

gp5ecto-m mã hóa kháng nguyên GP5ecto-M dung hợp
ELP…..………………..………………..………………..…….

Hình 3.12 Sản phẩm Colony-PCR kiểm tra A.tumefaciens mang vector

72

chuyển gen pCB301 35S-gp5ecto-m-Histag-CmycHình 3.13

100xELP…..………………..………………..……………….. 73
Ảnh hưởng của vector hỗ trợ pBI-35S-2bCMV và pIBT-35SHC-Pro PVY đến mức độ biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp
thông qua kết quả lai Western sử dụng kháng thể kháng C-

myc .. ………………..………………..………………..…….. 76
Hình 3.14 Ảnh hưởng của nồng độ AS đến sự biểu hiện của các protein
tái tổ hợp được xác định bằng Western blot sử dụng kháng thể

vi


vii

vii


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine reproductive and
respiratory syndrome – PRRS) là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm trên lợn do virus
gây ra. Ở Việt Nam, bệnh còn được gọi là “Bệnh lợn tai xanh” (theo ngôn ngữ
đại chúng) do lợn mắc bệnh thường bị xung huyết ở tai, lúc đầu đỏ sẫm, sau tím

xanh. PRRS gây thiệt hại kinh tế rất lớn ở những nước có bệnh. PRRS được phát
hiện ở Mỹ vào năm 1987. Hàng năm nước Mỹ phải chịu những thiệt hại do bệnh
này ước tính khoảng 664 triệu USD cho việc tiêu huỷ lợn chết, lợn ốm, chi phí
chống dịch và xử lý môi trường.
Ở Việt Nam, dịch PRRS do virus thể độc lực cao xuất hiện lần đầu tiên
vào năm 2007. Từ đó đến nay, dịch đã xuất hiện ở hầu hết các địa phương trong
cả nước. Theo thống kê của Cục Thú y, từ cuối tháng 4/2016 đến tháng 11/2016,
đã xuất hiện 14 ổ dịch PRRS tại 8 huyện của 4 tỉnh là Quảng Trị, Hậu Giang,
Nghệ An và Hà Tĩnh, làm 3.433 con lợn mắc bệnh, trong đó có 1.242 con lợn bị
tiêu huỷ. PRRS đã ảnh hưởng nặng nề tới ngành chăn nuôi lợn trong nước. Bệnh
vẫn xuất hiện ở một số địa phương và có tính chất 2-3 năm một lần. Điều này
cũng cho thấy nguy cơ xuất hiện trở lại của dịch bệnh này trong thời gian tới.
Hiện nay, các vaccine phòng PRRS chủ yếu là vaccine vô hoạt và nhược
độc. Các vaccine vô hoạt thường an toàn nhưng khả năng bảo hộ thấp. Các
vaccine nhược độc bảo hộ tốt hơn nhưng còn nhiều lo ngại về tính an toàn của
các loaị vaccine này. Vaccine nhược độc có thể giảm dần mức bảo hộ do giảm
mức tương đồng với chủng mới (nếu có) và bản thân virus vaccine sau nhiều lần
truyền nhiễm cũng có thể đột biến trở thành cường độc. Mặc dù vậy, phòng
chống PRRS tại Việt Nam đã đạt hiệu quả cao. Hiện nay, dịch chỉ xuất hiện lẻ tẻ,
trong những năm gần đây hầu như không có dịch, một phần là nhờ biện pháp chủ
động tiêm phòng cho lợn.
Virus gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn ở nước ta hiện nay
được xác định là thể độc lực cao và chưa có thuốc đặc trị. Việc phòng chống dịch
chủ yếu vẫn là tiêm phòng vaccine kết hợp các biện pháp thú y (Tiêu độc khử


2
trùng, vệ sinh truồng trại, cách ly và tiêu huỷ lợn bệnh ...). Để phòng chống virus
thể độc lực cao đang lưu hành tại Việt Nam cần phải có thêm vaccine phù hợp.
Nhu cầu về các loại vaccine PRRS thế hệ mới trong đó có vaccine tiểu đơn vị, an

toàn và hiệu quả là vấn đề cấp thiết.
Protein GP5 và M là những protein cấu trúc chính của virus PRRS
(PRRSV) được lựa chọn là những ứng viên tiềm năng để sản xuất vaccine tiểu
đơn vị chống PRRSV. Các kháng thể kháng GP5 và M ở lợn là các kháng thể có
khả năng trung hoà PRRSV. Sự kết hợp đoạn peptit miền ngoài của kháng nguyên
GP5 (Ectodomain, GP5ecto) được cho là chứa các epitope trung hoà của GP5 với
protein M với mong muốn sẽ tạo được protein tái tổ hợp heterodimer GP5ectoM có
khả năng kích thích tạo đáp ứng miễn dịch mạnh và trở thành một trong những ứng
viên tiềm năng làm nguyên liệu để phát triển sản xuất vaccine chống PRRSV.
Kháng nguyên của virus PRRS có thể được sản xuất trong hệ thống thực
vật nhằm phát triển vaccine tiểu đơn vị phòng PRRS thông qua phương pháp
biểu hiện gen tạm thời. Hệ thống biểu hiện gen tạm thời ở thực vật bằng phương
pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium nhằm sản xuất kháng nguyên có nhiều ưu
điểm như: Mức độ biểu hiện kháng nguyên cao, có thể sản xuất protein với số
lượng lớn, phương pháp thực hiện đơn giản, thời gian nhanh, không bị ảnh
hưởng bởi vị trí gắn gen đích trong tế bào thực vật và có thể tiến hành biểu hiện
trong các mô đã biệt hóa hoàn toàn như lá, cung cấp kháng nguyên cho mục đích
sản xuất vaccine chống chủng virus mới xuất hiện một cách nhanh chóng khi
dịch bệnh xảy ra.
Căn cứ vào các luận cứ khoa học và tình hình thực tiễn nêu trên, luận án
được thực hiện với đề tài “Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên (M, GP5,
GP5ectoM) của virus gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn trong
cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium” với mục đích tạo
cơ sở khoa học và thực nghiệm để biểu hiện các gen mã hoá kháng nguyên của
chủng virus PRRS gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn đang lưu hành ở
Việt Nam bằng phương pháp biểu hiện gen tạm thời trong thực vật phục vụ cho
định hướng phát triển sản xuất vaccine thế hệ mới.


3

2. Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu chung
Nghiên cứu cơ sở khoa học và thực nghiệm của việc sản xuất kháng nguyên
tái tổ hợp M/GP5/GP5ectoM của chủng virus PRRS (PRRSV) đang gây bệnh lợn
tai xanh ở Việt Nam bằng công nghệ biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá phục vụ
cho định hướng phát triển vaccine thế hệ mới.
Mục tiêu cụ thể
− Thiết kế được 3 cấu trúc vector chuyển gen mang gen m, gp5optimize
(gp5opt) và gp5ecto-m của chủng virus thể độc lực cao gây Hội chứng rối
loạn sinh sản và hô hấp ở lợn dưới sự điều khiển biểu hiện bởi promoter
CaMV 35S.
− Tối ưu các điều kiện biểu hiện tạm thời gen mã hoá 3 loại kháng nguyên M,
GP5 và GP5ectoM của chủng PRRSV thể độc lực cao trong lá cây thuốc lá và
tinh sạch được kháng nguyên M, GP5 và GP5ectoM tái tổ hợp từ mô lá thuốc
lá.
− Đánh giá được tính sinh miễn dịch của protein tái tổ hợp M, GP5 và
GP5ectoM trên động vật thí nghiệm.
3. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Thiết kế cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang các gen m,
gp5opt và gp5ecto-m mã hoá kháng nguyên tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP,
GP5ectoM-ELP và tạo chủng Agrobacterium tumefaciens mang vector tương ứng.
Nội dung 2: Tối ưu các điều kiện biểu hiện tạm thời gen m, gp5opt và
gp5ecto-m ở lá cây thuốc lá Nicotiana benthamiana. Biểu hiện tạm thời và tinh sạch
các kháng nguyên tái tổ hợp.
Nội dung 3: Đánh giá tính sinh miễn dịch dịch thể của kháng nguyên M-ELP,
GP5-ELP và GP5ectoM-ELP tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm.
4. Đóng góp mới của luận án
Luận án đã tiến hành thực hiện nghiên cứu một cách tổng thể, từ việc thiết kế
vector chuyển gen mang các gen mã hóa kháng nguyên của virus PRRS gây bệnh
lợn tai xanh, tối ưu các điều kiện biểu hiện gen tạm thời trong thực vật, biểu hiện và

4
tinh sạch kháng nguyên và đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng nguyên tái tổ
hợp trên động vật thí nghiệm.
Luận án là công trình nghiên cứu thành công đầu tiên tại Việt Nam về việc
thiết kế vector chuyển gen và biểu hiện tạm thời các gen m/ gp5opt/ gp5ecto-m mã
hoá kháng nguyên tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP của chủng virus
PRRS gây bệnh lợn tai xanh đang lưu hành tại Việt Nam trong lá cây thuốc lá N.
benthamiana bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium.
Kết quả của luận án cũng đã chứng minh được các kháng nguyên tái tổ hợp
M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP có khả năng kích thích sinh kháng thể đặc
hiệu kháng virus PRRS trên động vật thí nghiệm. Trong đó, kháng nguyên GP5ecto
(vùng ngoại bào của GP5) dung hợp với kháng nguyên M (GP5ectoM-ELP) kích
thích đáp ứng kháng thể đặc hiệu tốt hơn kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP riêng lẻ.
Kháng nguyên GP5ectoM-ELP và GP5-ELP là hai ứng viên tiềm năng để sản xuất
vaccine tiểu đơn vị chống PRRSV thể độc lực cao đang gây bệnh ở Việt Nam.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Ý nghĩa khoa học
Luận án cung cấp cơ sở khoa học quan trọng trong việc thiết kế các cấu trúc
vector chuyển gen mang gen m/gp5opt/gp5ecto-m mã hóa cho các kháng nguyên tái
tổ hợp M, GP5 và GP5ectoM của PRRSV dung hợp Elastin - like polypeptide
(ELP); biểu hiện tạm thời kháng nguyên tái tổ hợp trên cây thuốc lá bằng phương
pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium; tách chiết, tinh sạch và đánh giá khả năng kích
thích đáp ứng miễn dịch dịch thể của các kháng nguyên tái tổ hợp này trên động vật
thí nghiệm. Kết quả đề tài luận án là bằng chứng khoa học về tiềm năng của việc
sản xuất, phát triển vaccine tiểu đơn vị phòng PRRS trong thực vật.
Ý nghĩa thực tiễn
Các cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang gen m/ gp5opt/ gp5ecto-m mã
hóa các kháng nguyên tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP của chủng

virus PRRS đang lưu hành ở Việt Nam và các chủng A. tumefaciens mang các
vector này có thể được sử dụng để nghiên cứu biểu hiện, sản xuất và phát triển
vaccine tiểu đơn vị phòng PRRS.


5
Quy trình biểu hiện gen tạm thời trên lá cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm
lọc nhờ A. tumefaciens với các điều kiện tối ưu của đề tài luận án có thể ứng dụng
để sản xuất các kháng nguyên tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP, GP5ectoM-ELP hoặc
các protein tái tổ hợp khác.
Kháng nguyên tái tổ hợp GP5-ELP và GP5ectoM-ELP được tạo ra trong đề
tài luận án là hai ứng viên tiềm năng cho sản xuất vaccine tiểu đơn vị phòng bệnh
lợn tai xanh ở Việt Nam.


6

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn
1.1.1. Sơ lược tình hình dịch bệnh
Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine Reproductive and
Respiratory Syndrome - PRRS) còn được gọi là Bệnh lợn tai xanh (theo ngôn ngữ
đại chúng), lần đầu tiên được phát hiện ở Mỹ vào năm 1987, với các biểu hiện bệnh
ở cơ quan sinh sản và hô hấp. Lợn nái mắc hội chứng này bị sảy thai ở thai kỳ cuối,
thai lưu, đẻ non, lợn con sinh ra yếu hoặc bị chết, tỷ lệ đẻ thấp, chậm động dục trở
lại. Lợn con đang bú sữa hoặc lợn con đã cai sữa có biểu hiện rối loạn hô hấp
nghiêm trọng. Sau đó, dịch PRRS đã lây lan nhanh sang nhiều quốc gia khác bao
gồm: Canada (1988); Đức (1990); Hà Lan, Tây Ban Nha, Bỉ, Anh (1991) và ở Pháp
(1992) (Rossow, 1998). Đến năm 1991, nguyên nhân gây bệnh “bí hiểm” được xác

định là do một loại virus RNA gây ra. Ngay sau đó, virus này cũng đã được phân
lập ở Mỹ (Collins et al., 1992), Canada (Dea et al., 1992a,1992b) và nhiều nước
trên thế giới. Năm 1992, hội nghị quốc tế về bệnh này được tổ chức tại St. Paul,
Minnesota đã thống nhất tên gọi là hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn
PRRS và được tổ chức Thú y thế giới (OIE) công nhận. Từ đó, virus gây bệnh cũng
được gọi là PRRSV.
Tại Trung Quốc, PRRS xuất hiện từ những năm 1995, gây chết hàng loạt lợn
bệnh. Năm 2006, PRRS lại bùng phát trong vòng ba tháng, làm trên 2 triệu lợn mắc
bệnh, 400 nghìn con chết, ước tính tỷ lệ chết khoảng 20%. Bệnh có tốc độ lây lan
nhanh, chỉ sau 3 - 5 ngày bệnh có thể lây ra toàn đàn, với biểu hiện sốt cao 40 420C, vì vậy năm 2006 bệnh này còn có tên là “bệnh sốt cao”. Năm 2007, dịch lại
tiếp tục bùng phát, xảy ra ở 26/33 tỉnh với 257.000 con mắc, làm chết hơn 68.000
con, tiêu huỷ 175.000 con. Các chủng PRRSV thể độc lực thấp và thể độc lực cao
thuộc dòng Bắc Mỹ đều đã được phân lập từ các mẫu bệnh phẩm của lợn mắc bệnh.
Từ đó đến nay, bệnh vẫn diễn biến phức tạp. Ở Philippines, PRRS xuất hiện từ năm
2006, trong năm 2007 có 18 ổ dịch, 13.542 con mắc, làm chết 1.743 con. Sau đó
PRRS lan ra cả nước, gây ốm và chết lợn nái và lợn con theo mẹ (Cục Thú y, 2008).


7
Tại Thái Lan, PRRS xuất hiện vào năm 1989 bao gồm hai chủng thuộc dòng
châu Âu và Bắc Mỹ. Các báo cáo cho thấy, từ năm 2005 trở lại đây, 25 nước và
vùng lãnh thổ thuộc tất cả các Châu lục trên thế giới đều có PRRSV lưu hành
(ngoại trừ châu Úc và Newzeland) đã gây ra những thiệt hại lớn về kinh tế cho
người chăn nuôi ở nhiều quốc gia trên khắp thế giới (Han et al., 2006). Ở Mỹ, hàng
năm PRRS gây tổn thất ước tính thiệt hại lên đến 664 triệu USD/năm (Holtkamp et
al., 2012).
Tại Việt Nam, bệnh được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1996 trên đàn lợn
giống 51 con nhập từ Mỹ vào các tỉnh phía Nam. Từ cuối 1996 đến đầu năm 2007,
không có các thông báo về bệnh lâm sàng hoặc thiệt hại trực tiếp do PRRSV gây ra
mà chỉ có thống kê về trường hợp dương tính với PRRSV của một số mẫu khi kiểm

tra 478 mẫu huyết thanh của lợn tại Cần Thơ (Tô Long Thành, 2007). Cuối tháng
2/2007, bệnh xảy ra trên các đàn lợn tại Hải Dương được xác định do nhiễm
PRRSV thể độc lực cao, là virus PRRS type II tương đồng 99% với các chủng của
Trung Quốc (Feng et al., 2008). Cũng trong năm 2007, các trường hợp lợn mắc
PRRS với tỷ lệ mắc và tỷ lệ chết cao lần đầu tiên được ghi nhận xảy ra tại Việt Nam
(Cục Thú y, 2007). Dịch có xu hướng trầm trọng hơn do thường phát hiện vi khuẩn
kế phát (Tiêu Quang An et al., 2011). Trong giai đoạn 2007-2012, dịch PRRS liên
tục xảy ra trên diện rộng tại nhiều địa phương, đặc biệt trong các năm 2008, 2010
và 2012, đã gây thiệt hại nghiêm trọng cho người chăn nuôi lợn, ảnh hưởng tiêu cực
đến an sinh xã hội và gây ô nhiễm môi trường do phải tiêu hủy hàng trăm ngàn con
lợn mắc bệnh và chết.
Tháng 3/2008, bệnh tiếp tục bùng phát ở Thanh Hoá và Hà Tĩnh, đến tháng
7/2008 bệnh lây lan trên 17 tỉnh/thành phố, trong đó có các tỉnh đồng bằng sông
Cửu Long gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi lợn trong nước (Đậu Ngọc
Hào et al., 2008). Dịch có tính chất chu kỳ 2-3 năm một lần (Cục Thú y, 2011).
Theo thống kê của Cục Thú y năm 2016 (Bảng 1.1), từ cuối tháng 4/2016 đến
tháng 11/2016, đã xuất hiện 14 ổ dịch PRRS tại 8 huyện của 4 tỉnh là Quảng Trị,
Hậu Giang, Nghệ An và Hà Tĩnh làm 3.433 con lợn mắc bệnh, trong đó có 1.242
con lợn tiêu huỷ. So với năm 2015, diện dịch có giảm nhẹ, nhưng số lợn mắc bệnh
phải tiêu hủy là tăng cao hơn. Bệnh vẫn còn diễn biến phức tạp do sự biến chủng


8
nhanh chóng của virus PRRS và sự tồn tại của virus này trong các đàn lợn lành
bệnh. Điều này cũng cho thấy nguy cơ bùng phát trở lại của dịch bệnh trong thời
gian tới (Cục Thú y, 2016).
Bảng 1.1: Tình hình dịch PRRS giai đoạn 2015 – 2016
Nội dung so sánh
Số xã có dịch
Số huyện có dịch

Số tỉnh có dịch
Số gia súc mắc bệnh, chết, tiêu hủy

Năm 2015

Năm 2016

19
11
06
1.288

14
08
04
3.433

(Nguồn: Cục Thú y, 2016)

1.1.2. Bệnh tích của PRRS
Trong cơ thể lợn bệnh, virus phá hủy đại thực bào làm giảm về số lượng và
chức năng, dẫn đến suy giảm miễn dịch. Lợn bị mắc PRRS thường đi kèm nhiễm
trùng các loại mầm bệnh kế phát khác như Dịch tả, tụ huyết trùng .v.v.
Đối với PRRS, bệnh tích đặc trưng nhất là ở phổi. Phổi có hiện tượng viêm
hoại tử, đặc trưng bởi những đám chắc, đặc. Trên các thuỳ phổi bị bệnh có màu xám
đỏ, có mủ, chắc đặc. Mặt cắt ngang của các thuỳ phổi bệnh lồi ra, khô. Lợn bị viêm
phế quản, phổi hóa mủ. Bệnh tích vi thể thấy phổi có hiện tượng dịch thẩm xuất và
hiện tượng thâm nhiễm bạch cầu, trong phế nang chứa đầy dịch viêm, đại thực bào.
Một số trường hợp hình thành tế bào khổng lồ nhiều nhân. Một bệnh tích khá đặc
trưng ở phổi là hiện tượng phế nang bị nhăn và thấy có hiện tượng đại thực bào bị

phân huỷ. Ở các bộ phận khác cũng có các dấu hiệu như xuất huyết trên da, thâm
tím do chảy máu trong mô, lách nhồi máu, hóa gỗ và nhiều bọt khí. Thận có nhiều
đốm máu, tim có nhiều dịch ở màng bao, gan hoại tử, chảy dịch màu trắng ngà.
Các mạch máu não mềm và mỏng, hạch não rỉ máu. Hạch bạch huyết có những đốm
xuất huyết. Ngoài bệnh tích ở phổi, một số bệnh tích khác thường gặp tùy theo tình
trạng bội nhiễm như viêm màng bao tim, viêm màng phổi, viêm phúc mạc, viêm
màng não khi ghép với Salmonella cholerasuis, Haemophilus parasuis (Mateu và
Diaz, 2007).
1.1.3. Virus PRRS


9
1.1.3.1. Đăc điểm hình thái, cấu trúc và phân loại PRRSV
Virus PRRS (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus, virus
gây Hội trứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn – PRRSV) thuộc chi Arterivirus, họ
Arteriviridae, thuộc bộ Nidovirales, là virus RNA sợi đơn, dương có vỏ bao bọc
(Lunney et al., 2016). PRRSV có hình dạng thay đổi từ hình oval đến hình cầu
(Hình 1.1). PRRSV có vỏ bọc ngoài với đường kính của hạt virus từ 50 – 65 nm
(trung bình là 55 nm). Phần lõi nucleocapsid có đường kính khoảng 40 nm, có cấu
trúc đối xứng 20 mặt, được bao bọc bên ngoài bởi một lớp vỏ bọc.

Hình 1.1. Đặc điểm hình thái của virus PRRS
(Nguồn: và )

Mặt ngoài virus nhẵn với vài điểm lồi lõm do các vùng ngoại bào
(ectodomain) của các glycoprotein vỏ tạo thành, cách biệt với vỏ bọc khoảng 2 - 3
nm. Bên trong hạt virus là một vòng trống với đường kính trung bình khoảng 39 nm
(Hình 1.2). Lớp lipit kép và phần lõi nucleocapsid cách nhau khoảng 3 nm. Lớp lõi
nuclecapsid sắp xếp dạng xoắn, không đối xứng (Eric et al., 2013).

Hình 1.2. Ảnh hiển vi điện tử của các hạt Arterivirus
(Nguồn: A: Snijder et al., 1998; B, C: Spilman et al., 2009)
(A): Hình ảnh hiển vi điện tử của các hạt PRRSV; (B): Các hạt PRRSV tinh khiết; (C): Hạt PRRSV
điển hình với kích thước xác định.


10
1.1.3.2. Hệ gen và protein cấu trúc của virus PRRS
Hệ gen của PRRSV đã được giải mã thành công và được ghi nhận vào năm
1993. Dựa vào kiểu gen (genotype), PRRSV được chia làm hai loại: kiểu gen Châu
Âu (type I), đại diện tương ứng là chủng Lelystad (LV) và kiểu gen Bắc Mỹ (type
II), đại diện tương ứng là chủng VR2332. Genome của chủng virus VR2332 phân
lập tại Mỹ (số đăng ký: AY150564) thuộc type II, đại diện dòng Bắc Mỹ có độ dài
là 15451 bp (Nielsen et al., 2003). Genome của virus PRRS chủng GD (Quảng
Đông, Trung Quốc) (số đăng ký: EU109503) đại diện cho nhóm độc lực cao phân
lập ở Trung Quốc cũng thuộc type II, có độ dài là 15353 bp (Zhou et al., 2009).
Trong các tế bào bị nhiễm virus PRRS, có tất cả 6 RNA thông tin (mRNA)
được tổng hợp. Tất cả 6 mRNA đều chứa trình tự sắp xếp chung nhận được từ đầu
5' của hệ gen RNA và tất cả chúng đều có gắn thêm đuôi 3' polyA. Độ dài các gen
hoàn toàn khác nhau giữa PRRSV dòng châu Âu và Bắc Mỹ phản ánh sai khác di
truyền và mức độ tương đồng kháng nguyên giữa các chủng thuộc 2 dòng này.
Trong cùng một dòng Bắc Mỹ, các gen mã hoá cho các protein chức năng (ORF 27) có độ dài gần như nhau, nhưng có độ khác nhau về kích thước và thành phần gen
mã hoá cho RNA-polymerase (ORF1a và ORF1b). Đặc điểm gen và hệ gen này là
yếu tố ảnh hưởng đến độc lực của virus PRRS mới xuất hiện gần đây ở Trung Quốc
từ cuối năm 2006 (Tian, 2007) và có lẽ xâm nhập vào Việt Nam đầu năm 2007 với
đặc tính hoàn toàn đồng nhất về đặc điểm di truyền và tính gây bệnh (Lê Thanh Hòa
et al., 2009). Sự xuất hiện và lây lan của PRRSV độc lực cao ở Trung Quốc, Việt
Nam và Nam Á, sự đa nhiễm trộn lẫn các dòng PRRSV trên thế giới sẽ làm phức
tạp hoá dịch tễ học và vaccine phòng chống PRRSV.
Cấu trúc nucleocapsid của Arterivirus bao gồm genome RNA có chiều dài 13

- 15 kb và protein nucleocapsid (N). Màng lipid kép bao quanh nucleocapsid chứa 7
protein vỏ (Hình 1.3). Genome RNA đơn, chuỗi dương của virus chứa 9 khung đọc
mở (ORF - open reading frame) 1a, 1b, 2a, 2b và 3 – 7 (Hình 1.4). Trong đó, ORF
1a và 1b mã hóa cho protein phi cấu trúc replicase và polymerase tham gia vào quá
trình nhân bản của virus, ORF 2 - 7 mã hóa các protein cấu trúc. ORF 1a và ORF 1b
chiếm xấp xỉ khoảng 80% genome virus, mã hoá hai polyprotein lớn là protein sao


11
chép pp1a và pp1b. Những protein này được cắt đồng thời hoặc sau khi dịch mã bởi
4 protease thành 14 protein phi cấu trúc (NSPs), NSP1α, NSP1β và NSP2 đến
NSP12. Một vùng đặc biệt thuộc protein NSP11 đóng vai trò quan trọng chu trình
sao chép của tất cả các virus thuộc chi Arterivirus. Chức năng sinh học của từng
NSPs ở virus PRRS đến nay cũng chưa được hiểu đầy đủ, ngoại trừ chúng có hoạt
tính sao chép, protease và polymer hóa (Fang và Snijder, 2010).
ORFs 2a, 2b và 3-7 nằm ở đầu 3’ của hệ gen virus, sau dịch mã được phân
cắt thành các protein cấu trúc của virus PRRS (Wu et al., 2009). Các protein cấu
trúc được mã hoá bởi các đoạn mRNA nằm ở đầu 3’ của hệ gen virus và có cùng
promoter nằm ở đầu 5’ (Meulenberg, 2000). Glycoprotein 5 (GP5), protein màng
(M) và nucleoprotein (N) được mã hóa bởi các ORF 5-7, là các thành phần chính
của hạt virus (Dea et al., 2000). ORF 2a, 3 và 4 mã hóa cho các protein khác thuộc
hạt virus bao gồm GP2a, GP3 và GP4. Các protein này tương tác với nhau và tập
hợp thành virion như một phức hệ đa thành phần và cũng tham gia vào quá trình lây
nhiễm virus (Wissink et al., 2005). ORF 2b mã hóa cho protein vỏ (E). Khi phân
tích hệ gen của PRRSV thấy rằng các khung đọc mở (ORFs) lồng vào nhau
từ 1 - 253 bp. Ví dụ: khung đọc mở 4 (ORF4) và 5 (ORF5) lồng vào nhau bởi
1 bp, ORF3 và ORF4 lồng vào nhau bởi 253 bp. Như vậy, các gen sau sử dụng
một phần cuối chuỗi nucleotide của gen trước làm promoter hoạt động (Meng,
2000) (Hình 1.3). Glycoprotein GP3 (42 - 45 kDa), glycoprotein vỏ GP5 (24 - 26
kDa) và protein màng M (Membrane M, 18 - 19 kDa) và nucleocapsid N (15 kDa)

được mã hóa bởi ORF 3, 5, 6 và 7 là những protein cấu trúc chính. Protein cấu trúc
của PRRSV mã hóa bởi ORF2 đến ORF7 được biểu hiện từ 6 mRNA. ORF2a,
ORF2b và ORF 3 - 7 mã hóa lần lượt cho protein cấu trúc virus GP2a, GP2b (E),
GP3, GP4, GP5, M và N (Snijder & Meulenberg, 1998). GP2b là một ORF nhỏ ở
bên trong và hoàn toàn nằm trong ORF2. GP2a, GP3 và GP4 là các protein vỏ phụ
bị glycosyl hóa ở đầu N, tạo thành dị tam hợp bằng liên kết disulphide (Wieringa et
al., 2003).
ORF 1a và 1b mã hoá enzyme RNA polymerase có chức năng xúc tác
sao chép và tổng hợp như các RNA polymerase của các virus RNA khác. ORF 2


12
đến ORF 6 mã hoá cho các protein kết hợp với màng của virus, trong đó các
protein chính đã xác định bao gồm: Nucleocapsid protein (N, ORF7),
Glycoprotein GP5 (ORF 5) và protein M (ORF 6).
Nucleocapsid protein (N, ORF7) có khối lượng phân tử khoảng 14 - 15 kDa,
không được glycosyl hóa và chiếm khoảng 20 - 40% protein của virion. Protein N
tương tác với hệ gen virus để hình thành nên nucleocapsid. Protein N có tính kháng
nguyên cao. Hiện nay, protein N được dùng như là một kháng nguyên để phát hiện
kháng thể trong huyết thanh của lợn.

Hình 1.3. Mô hình cấu trúc hạt PRRSV và các khung đọc mở trên hệ gen của PRRSV
(Nguồn: )

Glycoprotein (GP5) được mã hóa bởi ORF5, là một trong những thành phần
chính của hạt virus với vùng ngoại bào 40 axit amin và vùng nội bào 50 đến 70 axit
amin (Dea et al., 2000), có trọng lượng phân tử từ 24 - 25 kDa là protein liên kết
vỏ bọc kết hợp glycogen. Protein GP5 có một đoạn peptide định hướng tại đầu
cuối N của protein và bị glycosyl hóa sau dịch mã. GP5 được glycosyl hoá ở đầu N
tại vị trí N46 và N53 đối với virus PRRS type I và tại vị trí N44 và N51 đối với

virus PRRS type II (Zhou et al., 2009, Music và Gagnon, 2010). Glycosyl hoá ở đầu
N tại vị trí N44 của virus PRRS type II đã được chứng minh là quan trọng trong sự
truyền nhiễm virus (Ansari et al., 2006). GP5 chứa một epitope trung hòa ở vị trí
axit amin 38-54 đối với virus PRRS type I và ở vị trí axit amin 37 - 47 đối với virus
PRRS type II (Oleksiewicz et al., 2002, Ostrowski et al., 2002, Plagemann, 2004a,
2004b). Vị trí được glycosyl hóa rất quan trọng cho quá trình hình thành cấu trúc
và duy trì hoạt tính của protein. GP5 được biết như yếu tố kích thích việc sản sinh
kháng thể trung hòa ở lợn và đây là một vấn đề then chốt của miễn dịch dịch thể.


13
Các kháng thể trung hòa chủ yếu liên kết trực tiếp với các epitope có trên bề mặt
của protein GP5, do vậy virus có thể bị trung hòa (Ansari et al., 2006).

Hình 1.4. Đặc điểm GP5
(Nguồn: Thaa et al., 2013)
(A): Sơ đồ mô phỏng của GP5. Các số dưới thanh chỉ ra vị trí của các axit amin trong protein này,
so với các vùng mã hóa; tín hiệu dẫn (Signal peptide, màu cam), vùng ngoại bào (ectodomain,
màu đỏ), miền xuyên màng (Transmembrance region, màu nâu) và vùng nội bào (endodomain,
màu lam). “N” và “C” được viết tắt cho N-terminus và C-terminus của GP5. Các vị trí N-glycosyl
hóa (N33, N44 và N51) được thể hiện bằng màu xanh lá cây. "decoy epitope" A ở vị trí axit amin 27
- 31, epitope trung hòa B nằm ở vị trí 37 - 45. (B): Cấu trúc liên kết giả định của GP5 chưa qua xử
lý trên màng virus. Màng virus được thể hiện bằng màu tím. Các peptide tín hiệu được phân cắt,
do đó tách ra khỏi vùng ngoại bào. Vùng xuyên màng là kỵ nước và được nhúng vào màng tế bào,
trong khi đó vùng nội bào được giả thiết định vị vào bên trong virus.

Những epitope trung hòa này nằm sát ngay cạnh các vị trí glycosyl hoá.
Phân tử GP4 và protein M cũng chứa các epitope trung hòa (Meulenberg et al.,
1997) và phân tử GP3 cũng chứa một epitope trung hòa. Mặc dù vậy, những
protein này có tác dụng kích thích miễn dịch và hoạt tính sinh học nhỏ hơn đáng kể

so với protein GP5 (Cancel -Tirado et al., 2004).
GP5 của chủng PRRSV type II (VR-2332) bao gồm 200 axit amin (aa), kích
thước khoảng 25 kDa được chia thành các vùng: (1) một trình tự tín hiệu đầu N (aa
1 - 32), có thể dẫn protein đến mạng lưới nội chất thô (ER); (2) một vùng ngoại bào
ectodomain (aa 33 - 63) chứa các vị trí N-glycosyl hóa (N33, N44 và N51), trong đó
N44 và N51 được bảo tồn cao trong các chủng khác nhau; (3) vùng kỵ nước mở
rộng (aa 64 - 134) được gọi là vùng xuyên màng; (4) một phần C đầu cuối ưa nước


14
(aa 135 - 200), được gọi là endodomain, nằm trong cấu trúc của virus (Thaa et al.,
2013) (Hình 1.4).

Hình 1.5. Cấu trúc Arterivirus
(Nguồn: Spilman et al., 2009)
A,B: Vị trí giả định của các protein bao gồm GP2 đến GP5, E, và M, protein ORF 5a và protein N
được phát hiện gần đây. Các protein bao quanh GP5 và M tạo thành một heterodimer liên kết
disulfide. Các glycoprotein nhỏ GP2, GP3, và GP4 tạo thành một heterotrimer bằng liên kết
disulfide.

Theo Wang và cộng sự (2016), kháng nguyên GP5 là một glycoprotein loại I
điển hình và có 200 axit amin, chứa peptit tín hiệu (axit amin 1 - 31), một vùng
ngoại bào (ectodomain), ba vùng xuyên màng (axit amin 64 - 82, 87 - 99 và 107 129) và một vùng nội bào (endodomain). Toàn bộ phân tử protein GP5 đã được
chứng minh không thể biểu hiện được trong E. coli Rosetta (DE3), có thể là do tính
kỵ nước mạnh của các vùng xuyên màng nằm trên GP5 (Wang et al., 2006).
Protein màng M (Membrane protein M) là một trong những protein cấu trúc
chính của virus PRRS được mã hoá bởi khung đọc mở số 6 (ORF6). Protein M là
protein liên kết vỏ bọc, có trọng lượng phân tử khoảng 18 - 19 kDa, bao gồm 173
(PRRSV type I) và 174 axit amin (PRRSV type II). Protein M, không được glycosyl
hoá, mang tính kháng nguyên và có tính bảo thủ cao nhất trong số các protein của

PRRSV. Trong virion, protein M liên kết với protein GP5 bằng cầu nối disulfide
giữa các ectodomain N-terminal của GP5 và M, hình thành nên heterodimer cần
thiết cho việc lắp ráp hạt virus (Wieringa et al., 2004) (Hình 1.5).
Hạt virus sẽ không được giải phóng nếu thiếu protein M hoặc GP5 (Wissink


15
et al., 2005). Kháng thể kháng protein M có thể trung hòa PRRSV (Yang et al.,
2000). Protein M cũng đã được nghiên cứu như một ứng viên để sản xuất vaccine.
Việc tiêm chủng cho lợn đồng thời hai loại protein GP5 và M/PRRSV được biểu
hiện bằng chủng M. bovis BCG đã đạt được mức độ bảo vệ nhất định tương quan
với sự xuất hiện của kháng thể trung hoà (Bastos et al., 2004).
Một nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng, protein M được làm biến đổi
một axit amin đơn (Tyr-10) trong protein M đã tạo ra kháng thể trung hoà trong
huyết thanh lợn kháng lại PRRSV (Trible et al., 2015). Như vậy, protein M của
PRRSV cũng đóng một vai trò nhất định trong việc trung hoà virus ngoài vai trò
của GP5. Protein M được dùng để thiết kế vaccine tiểu đơn vị tái tổ hợp chống lại
sự xâm nhiễm của virus PRRS, gây đáp ứng miễn dịch tế bào mạnh (Ansari et al.,
2006, Lalit, 2011).
1.1.3.3. Sự biến chủng của PRRSV và các chủng PRRSV lưu hành tại Việt Nam
Gần đây, trong hệ thống phân loại mới, PRRSV type I và type II được phân
loại thành thành hai loại trong chi Porartevirus: PRRSV type I và PRRSV type II
(Adams et al., 2016; Kuhn et al., 2016). Biểu hiện bệnh và dấu hiệu lâm sàng tổng
thể, tổ chức hệ gen và thời gian xuất hiện đều giống nhau giữa hai dòng. Các dòng
PRRSV type I và PRRSV type II có khoảng 60% trình tự nucleotide tương đồng
(Forsberg, 2005). Tuy nhiên, kể từ khi PRRSV type I và PRRSV type II được phát
hiện và mô tả, các biến thể mới của PRRSV liên tục phát triển và xuất hiện trong
các đợt bùng phát mới với đặc điểm và tính độc ngày càng khác biệt (Kappes và
Faaberg et al., 2015). Ngoài các chủng PRRSV không gây bệnh đang lưu hành ở
đợt bùng phát đầu tiên, chủng PRRSV type II độc lực (VR-2385) đã được phân lập

từ đàn lợn bị nhiễm PRRSV type II chủng VR-2332 (ATCC VR-2332) vào giữa
những năm 1990, khác biệt so với VR-2332 khoảng 8% nucleotide (Meng et al.,
1996). Năm 1998, xuất hiện một chủng PRRSV không điển hình đã gây ra tỷ lệ thai
chết lưu và sảy thai cao ở đàn lợn được tiêm chủng tại Hoa Kỳ (Mengeling et al.,
1998). Sau đó, kể từ năm 2001, nhiều chủng độc lập thuộc cùng một nhóm virus đã
được xác định, trong đó đã phát hiện chủng MN184 có độc tính cao (sai khác > 14.5
% nucleotide) từ các chủng type II (Han et al., 2006).