Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên (m, GP5, GP5ectoM) của virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn trong cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc nhờ agrobacterium

i

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THỊ MINH HẰNG

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN (M,
GP5, GP5ectoM) CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI
LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN TRONG CÂY
THUỐC LÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP THẨM LỌC NHỜ
AGROBACTERIUM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI – 2018

i


ii

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THỊ MINH HẰNG

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN (M,
GP5, GP5ectoM) CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI
LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN TRONG CÂY
THUỐC LÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP THẨM LỌC NHỜ

AGROBACTERIUM

Chuyên ngành: Hoá sinh học
Mã số: 94 20 116

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học:

1. TS. Nguyễn Trung Nam
Viện Công nghệ sinh học
2. PGS. TS. Chu Hoàng Hà
Viện Công nghệ sinh học

HÀ NỘI – 2018

ii


iii
LỜI CẢM ƠN
Luận án được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ gen,
Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ
sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam và Trung tâm Chẩn đoán
Thú y Trung ương. Với sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài thuộc nhiệm vụ nghiên cứu
thường xuyên của Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ
sinh học.
Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi luôn
nhận được sự giúp đỡ của tập thể cán bộ hướng dẫn, các thầy cô giáo, các nhà
khoa học, các anh chị em đồng nghiệp và quý cơ quan, phòng ban. Tôi xin chân
thành cảm ơn Ban Lãnh đạo, Bộ phận đào tạo sau đại học, các phòng chức năng

của Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành luận
án.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới hai thầy, PGS.TS. Chu Hoàng Hà và TS.
Nguyễn Trung Nam đã định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều
kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn GS.TS. Lê Trần Bình, PGS.TS. Phạm Bích Ngọc,
PGS.TS. Đinh Duy Kháng, PGS.TS. Tô Long Thành, TS. Nguyễn Tường Vân, ThS. Hồ
Thị Thương và tập thể cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng Thí nghiệm
trọng điểm Công nghệ gen đã luôn giúp đỡ, chia sẻ những kiến thức quý báu và tạo
những điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Lâm nghiệp, Ban
Lãnh đạo, cùng toàn thể cán bộ của Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp đã tạo
mọi điều kiện tốt nhất để cho tôi yên tâm học tập và thực hiện luận án.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và các đồng nghiệp đã luôn động
viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận án này.
Hà Nội, ngày tháng năm 2018
Nghiên cứu sinh

iii


iv

Nguyễn Thị Minh Hằng

iv


i
LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS.
Chu Hoàng Hà, TS. Nguyễn Trung Nam và một số kết quả cùng cộng tác với các
cộng sự khác.
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã
được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép
của các đồng tác giả.
Phần kết quả còn lại của luận án chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình
nào khác.
Hà Nội, ngày tháng năm 2018
Tác giả

Nguyễn Thị Minh Hằng

i


ii

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
MỞ ĐẦU
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................................6
1.1. Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn.....................................................6
1.1.1. Sơ lược tình hình dịch bệnh.............................................................................6
1.1.2. Bệnh tích của PRRS..........................................................................................8

1.1.3. Virus PRRS........................................................................................................9
1.2. Vaccine phòng PRRS.........................................................................................20
1.2.1.

Vaccine
sống
nhược
độc
....................................................................................................................
21

1.2.2.

Vaccine
vô
hoạt
....................................................................................................................
23

1.2.3. Các dạng vaccine thử nghiệm dựa vào kháng nguyên GP5 và M chống
PRRSV
....................................................................................................................
24
1.3. Biểu hiện tạm thời kháng nguyên của PRRSV bằng phương pháp thẩm lọc
nhờ Agrobacterium........................................................................................30
1.3.1. Lợi thế của phương pháp biểu hiện gen tạm thời nhờ Agrobacterium
....................................................................................................................
30

ii

iii
1.3.2.

Quá
trình
thẩm
lọc
nhờ
A.
tumefaciens
....................................................................................................................
33

1.3.3. Một số giải pháp tăng cường biểu hiện gen tạm thời ở thực vật
....................................................................................................................
35
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................43
2.1. Vật liệu.............................................................................................................43
2.1.1.

Chủng
vi
khuẩn
....................................................................................................................
43

2.1.2.

Các
vector
và
vật
liệu
thực
vật,
động
vật
....................................................................................................................
43

2.1.3.

Các
cặp
mồi
sử
dụng
trong
nghiên
cứu
....................................................................................................................
44

2.1.4.

Hoá
chất
....................................................................................................................

45

2.1.5.

Thiết
bị
....................................................................................................................
45

2.2. Phương pháp nghiên cứu................................................................................46
2.2.1. Nhân dòng gen mã hoá protein GP5, M và GP5ectoM của virus PRRS
....................................................................................................................
46
2.2.2. Thiết kế cấu trúc vector biểu hiện mang gen m, gp5opt và gp5ecto-m
phục
vụ
chuyển
gen
....................................................................................................................
47
2.2.3. Biểu hiện tạm thời gen mã hoá kháng nguyên tái tổ hợp trong lá thuốc lá
N.

benthamiana
iii


iv
....................................................................................................................
49

2.2.4. Đánh giá ảnh hưởng của các điều kiện biểu hiện gen tạm thời đến mức độ
biểu hiện protein M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP trong lá cây thuốc lá
....................................................................................................................
50
2.2.5.

Tách chiết và xác định nồng độ protein tổng số
....................................................................................................................
52

2.2.6.

Điện
di
SDS-PAGE
và
lai
Western
blot
....................................................................................................................
52

2.2.7.

Tinh sạch protein M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP
....................................................................................................................
53

2.2.8. Phương pháp đánh giá tính sinh miễn dịch của các kháng nguyên GP5ELP, GP5ectoM-ELP, M-ELP trên động vật
thí nghiệm

....................................................................................................................
54
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU............................................................................61
3.1. Thiết kế vector chuyển gen thực vật mang gen m, gp5, gp5ecto-m và tạo
chủng A. tumefaciens mang vector tương ứng.............................................61
3.1.1. Vector chuyển gen mang gen mã hoá kháng nguyên M dung hợp ELP (MELP)
....................................................................................................................
61
3.1.2. Vector chuyển gen mang gen mã hoá kháng nguyên GP5 dung hợp ELP
(GP5-ELP)
....................................................................................................................
65
3.1.3. Vector chuyển gen mang gen mã hoá kháng nguyên GP5ectoM dung hợp
ELP

(GP5ectoM-ELP)

iv


v
....................................................................................................................
69
3.2. Tối ưu các điều kiện biểu hiện tạm thời gen mã hoá kháng nguyên M -ELP,
GP5-ELP, GP5ectoM-ELP trong cây thuốc lá N. benthamiana........................74
3.2.1.

Ảnh
hưởng
của

vector
hỗ
trợ
....................................................................................................................
75

3.2.2.

Ảnh
hưởng
của
nồng
độ
AS
....................................................................................................................
76

3.2.3.

Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn A. tumefaciens
....................................................................................................................
78

3.2.4.

Ảnh
hưởng
của
tuổi
của

lá
....................................................................................................................
79

3.2.5.

Ảnh
hưởng
của
tuổi
cây
....................................................................................................................
80

3.2.6. So sánh mức độ biểu hiện các gen mã hoá kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP,
GP5ectoM-ELP trong điều kiện đã được tối ưu bằng lai miễn dịch
....................................................................................................................
81
3.3. Tinh sạch kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP...........................82
3.3.1. Tối ưu nồng độ PEG 8000 cho quá trình tinh sạch thu nhận kháng nguyên
....................................................................................................................
83
3.3.2.

Tinh sạch kháng nguyên bằng phương pháp mITC
....................................................................................................................
86

3.4. Tính sinh miễn dịch dịch thể của các kháng nguyên tái tổ hợp trên động
vật thí nghiệm........................................................................................... 91

v


vi
3.4.1.

Đáp
ứng
kháng
thể
IgG
đặc
hiệu
trên
chuột
....................................................................................................................
91

3.4.2.

Đáp
ứng
kháng
thể
IgG
đặc
hiệu
trên
lợn

....................................................................................................................
98

Chương 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU........................................................108
4.1. Biểu hiện tạm thời gen mã hoá kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP và
GP5ectoM-ELP bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium.............108
4.1.1. Lựa chọn kháng nguyên trong thiết kế vector biểu hiện
....................................................................................................................
108
4.1.2. Mức độ biểu hiện tạm thời các kháng nguyên tái tổ hợp
....................................................................................................................
109
4.1.3. Cấu trúc vector biểu hiện và mức độ biểu hiện gen tạm thời ở thực vật
....................................................................................................................
110
4.2. Khả năng kích thích sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu trên chuột................116
4.3. Tính sinh miễn dịch dịch thể trên lợn.......................................................120
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..........................................................................................130
NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN..................................132
TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH.....................................................................133
TÀI LIỆU THAM KHẢO...............................................................................................140
PHỤ LỤC..................................................................................................................................I

vi


vii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
AS

aa
2b CMV

Acetosyringone
Amino acid (axit amin)
Cucumber mosaic virus (CMV) 2b protein (Protein 2b của virus

bp
BSA
CaMV
Cs
DNA
ER
ELISA
ELP
et al
Fc
GFP
GP5
GP5ecto
HC-Pro
HP-PRRSV

khảm dưa chuột)
Base pair (Cặp base)
Bovine serum albumin
Cauliflower mosaic virus (Virus khảm súp lơ)
Cộng sự
Deoxyribonucleic acid
Endoplasmic reticulum (Lưới nội chất)

Enzyme linked immunosorbent assay
Elastin-like polypeptide
And co-workers (và các cộng sự)
Fragment crystallizable
Green fluorescent protein (Protein huỳnh quang xanh)
Glycoprotein 5
Ectodomain of glycoprotein (Vùng ngoại bào của protein GP5)
Helper component protease (Protein hỗ trợ)
Highly pathogenic Porcine reproductive and respiratory syndrome
virus (Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp thể độc lực

HRP
IPMA

cao)
Horseradish peroxidase
Immunoperoxidase monolayer assay (Xét nghiệm miễn dịch đơn

IgG
kb
kDa
LB

lớp cộng hợp enzyme peroxidase)
Immunoglobulin G
Kilobase
Kilodalton
Luria-Bertani (Môi trường nuôi khuẩn Luria-Bertani)

vii

viii

LV
M
MES
mg
MLV
mITC

Lelystad virus
Matrix/ Membrance protein
2-(N- Morpholino)ethanesulfonic acid
Milligram
Modified-live virus (Virus sống đã làm biến đổi = virus nhược độc)
Membrane-based Inverse transition cycling (Chu trình chuyển pha

nptII

nghịch đảo qua màng)
Gene mã hoá Neomycin phosphotransferase (Gen kháng

Nos
nsp
OD

kanamycin)
Nopaline synthase terminator
Non-structural protein

Optical density (Mật độ quang)

ORF

Open reading frame (Khung đọc mở)

PBS

Phosphate-buffered saline

PCR

Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

Fc

Stabilizing domain - "Fragment of crystallizable chain of IgG" (Vùng

PRRSV

hằng định của kháng thể IgG)
Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus (Virus gây hội

RNA

chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn)
Ribonucleic acid

ScFv

Single chain variable fragment

SDS-PAGE

Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis

TSP

Total soluble protein (Protein tổng hợp)

35S Ter

35S Terminator (Trình tự kết thúc phiên mã)

VLP

Virus-like particle

WT

Wild type (Cây không chuyển gen)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1

Tình hình dịch PRRS giai đoạn 2015 – 2016 ………………...

8

viii


ix
Bảng 2.1

Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu gen gp5opt, gp5ectom và m ………………………………………………………..

Bảng 2.2

Thành phần phản ứng ghép nối gen m, gp5opt với vector
pRTRA 35S-Histag-Cmyc-100xELP ………………………..

Bảng 2.3

47

Thành phần phản ứng ghép nối các cassette gen với vector
pCB301 ……………………………………………………….

Bảng 3.1

47

Thành phần phản ứng ghép nối đoạn gp5ecto với gen m và
với vector pRTRA 35S-Histag-Cmyc-100xEL ………………

Bảng 2.4

44

48

So sánh mức độ biểu hiện tạm thời gen mã hoá các kháng
nguyên tái tổ hợp (M-ELP, GP5-ELP, GP5ectoM-ELP) trong lá
thuốc lá N. benthamiana …………………………………...

Bảng 3.2

82

Hiệu suất thu hồi và mức độ tinh sạch của các protein M-ELP,
GP5-ELP, GP5ectoM-ELP ……………………………..

91

DANH MỤC CÁC HÌNH

ix


Hình 1.1
Hình 1.2
Hình 1.3

9
9

Hình 1.4
Hình 1.5

Hình 1.6

Đặc điểm hình thái của virus PRRS ………………………….
Ảnh hiển vi điện tử của các hạt Arterivirus ………………….
Mô hình cấu trúc hạt virus PRRS và các khung đọc mở trên
x
hệ gen PRRS …………………………………………………
Đặc điểm của GP5 …………………………………................
Cấu trúc Arterivirus ………………………………………….
Sơ đồ mô tả sự biểu hiện gen tạm thời sử dụng các vector

Hình 1.7
Hình 1.8
Hình 2.1

pEAQ bằng phương pháp thẩm lọc A. tumefaciens ………….
Thẩm lọc nhờ A. tumefaciens vào lá N. benthamiana ………..
Sơ đồ của chu kỳ chuyển pha nghịch đảo qua màng ………...
Chuyển gen tạm thời vào lá cây thuốc lá nhờ A. tumefaciens

34
34
41

Hình 2.2
Hình 2.3
Hình 3.1

bằng phương pháp hút chân không …………………………..
Sơ đồ thí nghiệm gây miễn dịch trên chuột ………………….

Sơ đồ thí nghiệm gây miễn dịch trên lợn …………………….
Thiết kế vector tách dòng pRTRA 35S-m-Histag-Cmyc-

50
55
56

Hình 3.2

100xELP ……………………………………………………...
Sơ đồ cấu trúc cassette gen m mã hoá protein M dung hợp

61

Hình 3.3

ELP............................................................................................
Kết quả thiết kế vector chuyển gen pCB301 35S-m-Histag-

62

Hình 3.4

Cmyc-100xELP ………………………………………………
63
Phân tích sản phẩm Colony-PCR kiểm tra A. tumefaciens mang

Hình 3.5

vector pCB301 35S-m-Histag-Cmyc-100xELP ………..

Thiết kế vector tách dòng pRTRA 35S-gp5opt-Histag-Cmyc-

65

Hình 3.6

100xELP ……………………………...
Sơ đồ cấu trúc cassette gen gp5opt mã hoá protein GP5

66

Hình 3.7

dung hợp ELP ……………………………………………………...
Kết quả thiết kế vector chuyển gen pCB301 35S-gp5opt-

67

Hình 3.8

Histag-Cmyc-100xELP ………………………………………
68
Sản phẩm Colony-PCR kiểm tra A.tumefaciens mang vector

Hình 3.9

pCB301 35S-gp5opt-Histag-Cmyc-100xELP ………………..
Thiết kế vector nhân dòng pRTRA 35S-gp5ecto-m-Histag-

69

Hình 3.10

Cmyc-100xELP ………………..…………
Sơ đồ cấu trúc cassette gen gp5ecto-m mã hoá protein

70

GP5ectoM dung hợp ELP trong vector pRTRA ………………
Hình 3.11 Kết quả phân tích kiểm tra vector chuyển gen mang gen

12
13
14

72

gp5ecto-m mã hóa kháng nguyên GP5ecto-M dung hợp
ELP…..………………..………………..………………..…….
Hình 3.12 Sản phẩm Colony-PCR kiểm tra A.tumefaciens mang vector

72

chuyển gen pCB301 35S-gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP…..
Hình 3.13

………………..………………..………………..
73
Ảnh hưởng của vector hỗ trợ pBI-35S-2bCMV và pIBT-35S- 76
HC-Pro PVY đến mức độ biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp

thông qua kết quả lai Western sử dụng kháng thể kháng C-

x


xi

xi


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine reproductive and
respiratory syndrome – PRRS) là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm trên lợn do virus
gây ra. Ở Việt Nam, bệnh còn được gọi là “Bệnh lợn tai xanh” (theo ngôn ngữ
đại chúng) do lợn mắc bệnh thường bị xung huyết ở tai, lúc đầu đỏ sẫm, sau tím
xanh. PRRS gây thiệt hại kinh tế rất lớn ở những nước có bệnh. PRRS được phát
hiện ở Mỹ vào năm 1987. Hàng năm nước Mỹ phải chịu những thiệt hại do bệnh
này ước tính khoảng 664 triệu USD cho việc tiêu huỷ lợn chết, lợn ốm, chi phí
chống dịch và xử lý môi trường.
Ở Việt Nam, dịch PRRS do virus thể độc lực cao xuất hiện lần đầu tiên vào
năm 2007. Từ đó đến nay, dịch đã xuất hiện ở hầu hết các địa phương trong cả
nước. Theo thống kê của Cục Thú y, từ cuối tháng 4/2016 đến tháng 11/2016,
đã xuất hiện 14 ổ dịch PRRS tại 8 huyện của 4 tỉnh là Quảng Trị, Hậu Giang, Nghệ
An và Hà Tĩnh, làm 3.433 con lợn mắc bệnh, trong đó có 1.242 con lợn bị tiêu
huỷ. PRRS đã ảnh hưởng nặng nề tới ngành chăn nuôi lợn trong nước. Bệnh vẫn
xuất hiện ở một số địa phương và có tính chất 2-3 năm một lần. Điều này cũng
cho thấy nguy cơ xuất hiện trở lại của dịch bệnh này trong thời gian tới.

Hiện nay, các vaccine phòng PRRS chủ yếu là vaccine vô hoạt và nhược
độc. Các vaccine vô hoạt thường an toàn nhưng khả năng bảo hộ thấp. Các
vaccine nhược độc bảo hộ tốt hơn nhưng còn nhiều lo ngại về tính an toàn của
các loaị vaccine này. Vaccine nhược độc có thể giảm dần mức bảo hộ do giảm
mức tương đồng với chủng mới (nếu có) và bản thân virus vaccine sau nhiều lần
truyền nhiễm cũng có thể đột biến trở thành cường độc. Mặc dù vậy, phòng
chống PRRS tại Việt Nam đã đạt hiệu quả cao. Hiện nay, dịch chỉ xuất hiện lẻ tẻ,
trong những năm gần đây hầu như không có dịch, một phần là nhờ biện pháp
chủ động tiêm phòng cho lợn.


2
Virus gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn ở nước ta hiện nay
được xác định là thể độc lực cao và chưa có thuốc đặc trị. Việc phòng chống
dịch chủ yếu vẫn là tiêm phòng vaccine kết hợp các biện pháp thú y (Tiêu độc
khử trùng, vệ sinh truồng trại, cách ly và tiêu huỷ lợn bệnh ...). Để phòng chống
virus thể độc lực cao đang lưu hành tại Việt Nam cần phải có thêm vaccine phù
hợp. Nhu cầu về các loại vaccine PRRS thế hệ mới trong đó có vaccine tiểu đơn
vị, an toàn và hiệu quả là vấn đề cấp thiết.
Protein GP5 và M là những protein cấu trúc chính của virus PRRS (PRRSV)
được lựa chọn là những ứng viên tiềm năng để sản xuất vaccine tiểu đơn vị
chống PRRSV. Các kháng thể kháng GP5 và M ở lợn là các kháng thể có khả năng
trung hoà PRRSV. Sự kết hợp đoạn peptit miền ngoài của kháng nguyên GP5
(Ectodomain, GP5ecto) được cho là chứa các epitope trung hoà của GP5 với
protein M với mong muốn sẽ tạo được protein tái tổ hợp heterodimer GP5ectoM
có khả năng kích thích tạo đáp ứng miễn dịch mạnh và trở thành một trong những
ứng viên tiềm năng làm nguyên liệu để phát triển sản xuất vaccine chống PRRSV.
Kháng nguyên của virus PRRS có thể được sản xuất trong hệ thống thực
vật nhằm phát triển vaccine tiểu đơn vị phòng PRRS thông qua phương pháp
biểu hiện gen tạm thời. Hệ thống biểu hiện gen tạm thời ở thực vật bằng

phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium nhằm sản xuất kháng nguyên có
nhiều ưu điểm như: Mức độ biểu hiện kháng nguyên cao, có thể sản xuất
protein với số lượng lớn, phương pháp thực hiện đơn giản, thời gian nhanh,
không bị ảnh hưởng bởi vị trí gắn gen đích trong tế bào thực vật và có thể tiến
hành biểu hiện trong các mô đã biệt hóa hoàn toàn như lá, cung cấp kháng
nguyên cho mục đích sản xuất vaccine chống chủng virus mới xuất hiện một
cách nhanh chóng khi dịch bệnh xảy ra.
Căn cứ vào các luận cứ khoa học và tình hình thực tiễn nêu trên, luận án
được thực hiện với đề tài “Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên (M, GP5,
GP5ectoM) của virus gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn trong cây
thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium” với mục đích tạo cơ sở


3
khoa học và thực nghiệm để biểu hiện các gen mã hoá kháng nguyên của chủng
virus PRRS gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn đang lưu hành ở Việt
Nam bằng phương pháp biểu hiện gen tạm thời trong thực vật phục vụ cho định
hướng phát triển sản xuất vaccine thế hệ mới.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu chung
Nghiên cứu cơ sở khoa học và thực nghiệm của việc sản xuất kháng nguyên
tái tổ hợp M/GP5/GP5ectoM của chủng virus PRRS (PRRSV) đang gây bệnh lợn tai
xanh ở Việt Nam bằng công nghệ biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá phục vụ cho
định hướng phát triển vaccine thế hệ mới.
Mục tiêu cụ thể
 Thiết kế được 3 cấu trúc vector chuyển gen mang gen m, gp5optimize
(gp5opt) và gp5ecto-m của chủng virus thể độc lực cao gây Hội chứng rối
loạn sinh sản và hô hấp ở lợn dưới sự điều khiển biểu hiện bởi promoter
CaMV 35S.
 Tối ưu các điều kiện biểu hiện tạm thời gen mã hoá 3 loại kháng nguyên M,

GP5 và GP5ectoM của chủng PRRSV thể độc lực cao trong lá cây thuốc lá và
tinh sạch được kháng nguyên M, GP5 và GP5ectoM tái tổ hợp từ mô lá thuốc
lá.
 Đánh giá được tính sinh miễn dịch của protein tái tổ hợp M, GP5 và
GP5ectoM trên động vật thí nghiệm.
3. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Thiết kế cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang các gen m,
gp5opt và gp5ecto-m mã hoá kháng nguyên tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP, GP5ectoMELP và tạo chủng Agrobacterium tumefaciens mang vector tương ứng.
Nội dung 2: Tối ưu các điều kiện biểu hiện tạm thời gen m, gp5opt và
gp5ecto-m ở lá cây thuốc lá Nicotiana benthamiana. Biểu hiện tạm thời và tinh
sạch các kháng nguyên tái tổ hợp.


4
Nội dung 3: Đánh giá tính sinh miễn dịch dịch thể của kháng nguyên M-ELP,
GP5-ELP và GP5ectoM-ELP tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm.
4. Đóng góp mới của luận án
Luận án đã tiến hành thực hiện nghiên cứu một cách tổng thể, từ việc thiết
kế vector chuyển gen mang các gen mã hóa kháng nguyên của virus PRRS gây bệnh
lợn tai xanh, tối ưu các điều kiện biểu hiện gen tạm thời trong thực vật, biểu hiện
và tinh sạch kháng nguyên và đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng nguyên tái tổ
hợp trên động vật thí nghiệm.
Luận án là công trình nghiên cứu thành công đầu tiên tại Việt Nam về việc
thiết kế vector chuyển gen và biểu hiện tạm thời các gen m/ gp5opt/ gp5ecto-m
mã hoá kháng nguyên tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP của chủng virus
PRRS gây bệnh lợn tai xanh đang lưu hành tại Việt Nam trong lá cây thuốc lá N.
benthamiana bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium.
Kết quả của luận án cũng đã chứng minh được các kháng nguyên tái tổ hợp
M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP có khả năng kích thích sinh kháng thể đặc hiệu
kháng virus PRRS trên động vật thí nghiệm. Trong đó, kháng nguyên GP5ecto (vùng

ngoại bào của GP5) dung hợp với kháng nguyên M (GP5ectoM-ELP) kích thích đáp
ứng kháng thể đặc hiệu tốt hơn kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP riêng lẻ. Kháng
nguyên GP5ectoM-ELP và GP5-ELP là hai ứng viên tiềm năng để sản xuất vaccine
tiểu đơn vị chống PRRSV thể độc lực cao đang gây bệnh ở Việt Nam.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Ý nghĩa khoa học
Luận án cung cấp cơ sở khoa học quan trọng trong việc thiết kế các cấu trúc
vector chuyển gen mang gen m/gp5opt/gp5ecto-m mã hóa cho các kháng nguyên
tái tổ hợp M, GP5 và GP5ectoM của PRRSV dung hợp Elastin - like polypeptide
(ELP); biểu hiện tạm thời kháng nguyên tái tổ hợp trên cây thuốc lá bằng phương
pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium; tách chiết, tinh sạch và đánh giá khả năng kích
thích đáp ứng miễn dịch dịch thể của các kháng nguyên tái tổ hợp này trên động
vật thí nghiệm. Kết quả đề tài luận án là bằng chứng khoa học về tiềm năng của
việc sản xuất, phát triển vaccine tiểu đơn vị phòng PRRS trong thực vật.


5
Ý nghĩa thực tiễn
Các cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang gen m/ gp5opt/ gp5ecto-m
mã hóa các kháng nguyên tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP của chủng
virus PRRS đang lưu hành ở Việt Nam và các chủng A. tumefaciens mang các vector
này có thể được sử dụng để nghiên cứu biểu hiện, sản xuất và phát triển vaccine
tiểu đơn vị phòng PRRS.
Quy trình biểu hiện gen tạm thời trên lá cây thuốc lá bằng phương pháp
thẩm lọc nhờ A. tumefaciens với các điều kiện tối ưu của đề tài luận án có thể ứng
dụng để sản xuất các kháng nguyên tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP, GP5ectoM-ELP hoặc
các protein tái tổ hợp khác.
Kháng nguyên tái tổ hợp GP5-ELP và GP5ectoM-ELP được tạo ra trong đề tài
luận án là hai ứng viên tiềm năng cho sản xuất vaccine tiểu đơn vị phòng bệnh lợn
tai xanh ở Việt Nam.

6

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn
1.1.1. Sơ lược tình hình dịch bệnh
Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine Reproductive and
Respiratory Syndrome - PRRS) còn được gọi là Bệnh lợn tai xanh (theo ngôn ngữ
đại chúng), lần đầu tiên được phát hiện ở Mỹ vào năm 1987, với các biểu hiện
bệnh ở cơ quan sinh sản và hô hấp. Lợn nái mắc hội chứng này bị sảy thai ở thai kỳ
cuối, thai lưu, đẻ non, lợn con sinh ra yếu hoặc bị chết, tỷ lệ đẻ thấp, chậm động
dục trở lại. Lợn con đang bú sữa hoặc lợn con đã cai sữa có biểu hiện rối loạn hô
hấp nghiêm trọng. Sau đó, dịch PRRS đã lây lan nhanh sang nhiều quốc gia khác
bao gồm: Canada (1988); Đức (1990); Hà Lan, Tây Ban Nha, Bỉ, Anh (1991) và ở
Pháp (1992) (Rossow, 1998). Đến năm 1991, nguyên nhân gây bệnh “bí hiểm” được
xác định là do một loại virus RNA gây ra. Ngay sau đó, virus này cũng đã được phân
lập ở Mỹ (Collins et al., 1992), Canada (Dea et al., 1992a,1992b) và nhiều nước trên
thế giới. Năm 1992, hội nghị quốc tế về bệnh này được tổ chức tại St. Paul,
Minnesota đã thống nhất tên gọi là hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn
PRRS và được tổ chức Thú y thế giới (OIE) công nhận. Từ đó, virus gây bệnh cũng
được gọi là PRRSV.
Tại Trung Quốc, PRRS xuất hiện từ những năm 1995, gây chết hàng loạt lợn
bệnh. Năm 2006, PRRS lại bùng phát trong vòng ba tháng, làm trên 2 triệu lợn mắc
bệnh, 400 nghìn con chết, ước tính tỷ lệ chết khoảng 20%. Bệnh có tốc độ lây lan
nhanh, chỉ sau 3 - 5 ngày bệnh có thể lây ra toàn đàn, với biểu hiện sốt cao 40 420C, vì vậy năm 2006 bệnh này còn có tên là “bệnh sốt cao”. Năm 2007, dịch lại
tiếp tục bùng phát, xảy ra ở 26/33 tỉnh với 257.000 con mắc, làm chết hơn 68.000
con, tiêu huỷ 175.000 con. Các chủng PRRSV thể độc lực thấp và thể độc lực cao
thuộc dòng Bắc Mỹ đều đã được phân lập từ các mẫu bệnh phẩm của lợn mắc

bệnh. Từ đó đến nay, bệnh vẫn diễn biến phức tạp. Ở Philippines, PRRS xuất hiện


7
từ năm 2006, trong năm 2007 có 18 ổ dịch, 13.542 con mắc, làm chết 1.743 con.
Sau đó PRRS lan ra cả nước, gây ốm và chết lợn nái và lợn con theo mẹ (Cục Thú y,
2008). Tại Thái Lan, PRRS xuất hiện vào năm 1989 bao gồm hai chủng thuộc
dòng châu Âu và Bắc Mỹ. Các báo cáo cho thấy, từ năm 2005 trở lại đây, 25 nước
và vùng lãnh thổ thuộc tất cả các Châu lục trên thế giới đều có PRRSV lưu hành
(ngoại trừ châu Úc và Newzeland) đã gây ra những thiệt hại lớn về kinh tế cho
người chăn nuôi ở nhiều quốc gia trên khắp thế giới (Han et al., 2006). Ở Mỹ, hàng
năm PRRS gây tổn thất ước tính thiệt hại lên đến 664 triệu USD/năm (Holtkamp et
al., 2012).
Tại Việt Nam, bệnh được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1996 trên đàn lợn
giống 51 con nhập từ Mỹ vào các tỉnh phía Nam. Từ cuối 1996 đến đầu năm 2007,
không có các thông báo về bệnh lâm sàng hoặc thiệt hại trực tiếp do PRRSV gây ra
mà chỉ có thống kê về trường hợp dương tính với PRRSV của một số mẫu khi kiểm
tra 478 mẫu huyết thanh của lợn tại Cần Thơ (Tô Long Thành, 2007). Cuối tháng
2/2007, bệnh xảy ra trên các đàn lợn tại Hải Dương được xác định do nhiễm PRRSV
thể độc lực cao, là virus PRRS type II tương đồng 99% với các chủng của Trung
Quốc (Feng et al., 2008). Cũng trong năm 2007, các trường hợp lợn mắc PRRS với
tỷ lệ mắc và tỷ lệ chết cao lần đầu tiên được ghi nhận xảy ra tại Việt Nam (Cục Thú
y, 2007). Dịch có xu hướng trầm trọng hơn do thường phát hiện vi khuẩn kế phát
(Tiêu Quang An et al., 2011). Trong giai đoạn 2007-2012, dịch PRRS liên tục xảy ra
trên diện rộng tại nhiều địa phương, đặc biệt trong các năm 2008, 2010 và 2012,
đã gây thiệt hại nghiêm trọng cho người chăn nuôi lợn, ảnh hưởng tiêu cực đến an
sinh xã hội và gây ô nhiễm môi trường do phải tiêu hủy hàng trăm ngàn con lợn
mắc bệnh và chết.
Tháng 3/2008, bệnh tiếp tục bùng phát ở Thanh Hoá và Hà Tĩnh, đến tháng
7/2008 bệnh lây lan trên 17 tỉnh/thành phố, trong đó có các tỉnh đồng bằng sông

Cửu Long gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi lợn trong nước (Đậu Ngọc Hào
et al., 2008). Dịch có tính chất chu kỳ 2-3 năm một lần (Cục Thú y, 2011).


8
Theo thống kê của Cục Thú y năm 2016 (Bảng 1.1), từ cuối tháng 4/2016 đến
tháng 11/2016, đã xuất hiện 14 ổ dịch PRRS tại 8 huyện của 4 tỉnh là Quảng Trị,
Hậu Giang, Nghệ An và Hà Tĩnh làm 3.433 con lợn mắc bệnh, trong đó có 1.242 con
lợn tiêu huỷ. So với năm 2015, diện dịch có giảm nhẹ, nhưng số lợn mắc bệnh phải
tiêu hủy là tăng cao hơn. Bệnh vẫn còn diễn biến phức tạp do sự biến chủng nhanh
chóng của virus PRRS và sự tồn tại của virus này trong các đàn lợn lành bệnh. Điều
này cũng cho thấy nguy cơ bùng phát trở lại của dịch bệnh trong thời gian tới (Cục
Thú y, 2016).
Bảng 1.1: Tình hình dịch PRRS giai đoạn 2015 – 2016
Nội dung so sánh
Số xã có dịch
Số huyện có dịch
Số tỉnh có dịch
Số gia súc mắc bệnh, chết, tiêu hủy

Năm 2015

Năm 2016

19
11
06
1.288

14

08
04
3.433

(Nguồn: Cục Thú y, 2016)

1.1.2. Bệnh tích của PRRS
Trong cơ thể lợn bệnh, virus phá hủy đại thực bào làm giảm về số lượng và
chức năng, dẫn đến suy giảm miễn dịch. Lợn bị mắc PRRS thường đi kèm nhiễm
trùng các loại mầm bệnh kế phát khác như Dịch tả, tụ huyết trùng .v.v.
Đối với PRRS, bệnh tích đặc trưng nhất là ở phổi. Phổi có hiện tượng viêm
hoại tử, đặc trưng bởi những đám chắc, đặc. Trên các thuỳ phổi bị bệnh có màu
xám đỏ, có mủ, chắc đặc. Mặt cắt ngang của các thuỳ phổi bệnh lồi ra, khô. Lợn bị
viêm phế quản, phổi hóa mủ. Bệnh tích vi thể thấy phổi có hiện tượng dịch thẩm
xuất và hiện tượng thâm nhiễm bạch cầu, trong phế nang chứa đầy dịch viêm, đại
thực bào. Một số trường hợp hình thành tế bào khổng lồ nhiều nhân. Một bệnh
tích khá đặc trưng ở phổi là hiện tượng phế nang bị nhăn và thấy có hiện tượng đại
thực bào bị phân huỷ. Ở các bộ phận khác cũng có các dấu hiệu như xuất huyết
trên da, thâm tím do chảy máu trong mô, lách nhồi máu, hóa gỗ và nhiều bọt khí.
Thận có nhiều đốm máu, tim có nhiều dịch ở màng bao, gan hoại tử, chảy dịch


9
màu trắng ngà. Các mạch máu não mềm và mỏng, hạch não rỉ máu. Hạch bạch
huyết có những đốm xuất huyết. Ngoài bệnh tích ở phổi, một số bệnh tích khác
thường gặp tùy theo tình trạng bội nhiễm như viêm màng bao tim, viêm màng
phổi, viêm phúc mạc, viêm màng não khi ghép với Salmonella cholerasuis,
Haemophilus parasuis (Mateu và Diaz, 2007).
1.1.3. Virus PRRS
1.1.3.1. Đăc điểm hình thái, cấu trúc và phân loại PRRSV

Virus PRRS (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus, virus gây
Hội trứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn – PRRSV) thu ôc chi Arterivirus, họ
Arteriviridae, thuộc bộ Nidovirales, là virus RNA sợi đơn, dương có vỏ bao bọc
(Lunney et al., 2016). PRRSV có hình dạng thay đổi từ hình oval đến hình cầu (Hình
1.1). PRRSV có vỏ bọc ngoài với đường kính của hạt virus từ 50 – 65 nm (trung bình
là 55 nm). Phần lõi nucleocapsid có đường kính khoảng 40 nm, có cấu trúc đối
xứng 20 mặt, được bao bọc bên ngoài bởi một lớp vỏ bọc.

Hình 1.1. Đặc điểm hình thái của virus PRRS
(Nguồn: và )

Mặt ngoài virus nhẵn với vài điểm lồi lõm do các vùng ngoại bào
(ectodomain) của các glycoprotein vỏ tạo thành, cách biệt với vỏ bọc khoảng 2 - 3
nm. Bên trong hạt virus là một vòng trống với đường kính trung bình khoảng 39
nm (Hình 1.2). Lớp lipit kép và phần lõi nucleocapsid cách nhau khoảng 3 nm. Lớp
lõi nuclecapsid sắp xếp dạng xoắn, không đối xứng (Eric et al., 2013).


10

Hình 1.2. Ảnh hiển vi điện tử của các hạt Arterivirus
(Nguồn: A: Snijder et al., 1998; B, C: Spilman et al., 2009)
(A): Hình ảnh hiển vi điện tử của các hạt PRRSV; (B): Các hạt PRRSV tinh khiết; (C): Hạt PRRSV điển hình với
kích thước xác định.

1.1.3.2. Hệ gen và protein cấu trúc của virus PRRS
Hệ gen của PRRSV đã được giải mã thành công và được ghi nhận vào năm
1993. Dựa vào kiểu gen (genotype), PRRSV được chia làm hai loại: kiểu gen Châu
Âu (type I), đại diện tương ứng là chủng Lelystad (LV) và kiểu gen Bắc Mỹ (type II),
đại diện tương ứng là chủng VR2332. Genome của chủng virus VR2332 phân lập tại

Mỹ (số đăng ký: AY150564) thuộc type II, đại diện dòng Bắc Mỹ có độ dài là 15451
bp (Nielsen et al., 2003). Genome của virus PRRS chủng GD (Quảng Đông, Trung
Quốc) (số đăng ký: EU109503) đại diện cho nhóm độc lực cao phân lập ở Trung
Quốc cũng thuộc type II, có độ dài là 15353 bp (Zhou et al., 2009).
Trong các tế bào bị nhiễm virus PRRS, có tất cả 6 RNA thông tin (mRNA)
được tổng hợp. Tất cả 6 mRNA đều chứa trình tự sắp xếp chung nhận được từ đầu
5' của hệ gen RNA và tất cả chúng đều có gắn thêm đuôi 3' polyA. Độ dài các gen
hoàn toàn khác nhau giữa PRRSV dòng châu Âu và Bắc Mỹ phản ánh sai khác di
truyền và mức độ tương đồng kháng nguyên giữa các chủng thuộc 2 dòng này.
Trong cùng một dòng Bắc Mỹ, các gen mã hoá cho các protein chức năng (ORF 2-7)
có độ dài gần như nhau, nhưng có độ khác nhau về kích thước và thành phần gen
mã hoá cho RNA-polymerase (ORF1a và ORF1b). Đặc điểm gen và hệ gen này là yếu
tố ảnh hưởng đến độc lực của virus PRRS mới xuất hiện gần đây ở Trung Quốc từ
cuối năm 2006 (Tian, 2007) và có lẽ xâm nhập vào Việt Nam đầu năm 2007 với đặc
tính hoàn toàn đồng nhất về đặc điểm di truyền và tính gây bệnh (Lê Thanh Hòa et
al., 2009). Sự xuất hiện và lây lan của PRRSV độc lực cao ở Trung Quốc, Việt Nam và