Sàng lọc và nghiên cứu enzym phytase có khả năng thủy phân hoàn toàn 6 gốc photphat từ nấm men nhằm ứng dụng trong chăn nuôi

MÁU 14/KHCN
ị Ban hành kèm theo Oưyết định s ổ 3 8 3 9 /Q Đ -Đ 1 ỉQCÌHN ngùy 24 tháng 10 nám 20Ì4
cua (ìiả m d ố c Đ ạ i h ọ c Q uốc giư I ỉà Nội)_________________

« Ạ Ỉ HỌC Q Ư Ó C GIA HÀ NỘI

BÁO CÁO TONG KÉT
K Ế T QUÀ T H Ự C HIỆN ĐẺ TÀI KH&CN
CẤP ĐẠI H Ọ C QUỐC GIA

T en d ề tài: Sàng lọc và nghiên cứ u enzym phytasc có kliíi năng thùy phân
hoàn loàn 6 gôc photphat từ nấm men nhàm ứng dụng trong chăn nuôi
M ã số đ ề tài: QG. 12.23
C hủ nhiệm đ ề tài: T h S . Trần T hị Lệ Quyên

H à N ộ i, Iiăm 20 ĩ 4


M ẨU 14/K H CN

(Ban hành kèm theo Quyết định số 3839 /QĐ-ĐHQCiHN ngày 24 th á n g io năm 2014
của Giám đôc Đ ại học Quốc gia H à Nội)
ĐẠI H Ọ C Q U Ó C G IA HÀ NỘI

BÁO CÁO TỎNG KẾT
K É T Q U Ả T H Ụ C H IỆ N Đ Ề TÀ I K H & C N
CẤP Đ Ậ ĩ h ọ c q u ố c g ia

T ên đê tài: Sàng lọc và nghiên cứu enzym phytase có khả năng thủy phân
hoàn toàn 6 gốc photphat từ nấm men nhằm ứng dụng trong chăn nuôi
M ã số đề tài: QG. 12.23

C hủ nhiệm đề tài: T hS. Trần Thị Lệ Quyên

Hà N ội, năm 2014


PHẢN I. THÔNG TIN CHUNG
1.1. Tên đề tài: Sàng lọc và nghiên cứu enzym phytase có khả năng thủy phân hoàn
toàn 6 gốc photphat từ nấm men nhằm ứng dụng trong chăn nuôi
1.2. Mã số: QG. 12.23
1.3. Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực hiện đề tài
TT Chức danh, học vị, họ và tên

Đo n vị công tác

Vai trò thuc hiên đề tài

NCS. Trần Thị Lệ Quyên

Viện Vi sinh vật và
CNSH

Chủ trì đề tài

2

ThS. Trịnh Thị Vân Anh

Viện Vi sinh vật và
CNSH

Thành viên tham gia

3

CN. Hà Thị Hằng

Viện Vi sinh vật và
CNSH

Thành viên tham gia

4

N c s' Trịnh Thành Truna

Viện Vi sinh vật và
CNSH

Thành viên tham gia

1

1.4. Đon vị chủ trì: Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội
1.5. Thòi gian thực hiện:
1.5.1. Theo họp đồng: từ tháng 10 năm 2012 đến tháng 10 năm 2014
1.5.2. Gia hạn (nếu có): Không
1.5.3. Thực hiện thực tế: từ tháng 10 năm 2012 đến tháng 11 năm 2014
1.6. Những thay đối so vói thuyết minh ban đầu (nếu có): không
(Ve mục tiêu, nội dung, phương pháp, kết quả nghiên cứu và tô chức thực hiện; Nguyên
nhân; Ỷ kiến của Cơ quan quản lý)

1.7. Tổng kinh phí được phê duyệt của đề tài: 180 triệu đồng.

PHẦN II. TỔNG QUAN KÉT QUẢ NGHIÊN c ứ u
1. Đ ặt vấn đề
Phytases là enzyme xúc tác cho phản ử ns thủy phân axit phytic (Ins p 6) thành photphat
vô cơ tự do (Pi), tạo thành các este myo-inositol photphat bậc thấp hơn (Ins p 5 đến Ins P]),
và trone, m ột sổ trường hợp tạo thành myo-inositol. Hầu hết các phytase được biết thủy phân
axit phytic giải phóne ra 5 Pi và tạo thành /wjỡ-inositol 2 ’-monophotphat là sản phẩm cuối
cùng. Hiện nay mới chỉ có ba nhóm tác eiả côns bổ phytase có khả năng thủy phân cả

6

gôc

photphat và tạo thành myo-inositol từ axit phytic (Segueilha và cs., 1992; Raaon và cs.,
2008; Asano và cs., 2009). Việc tìm kiếm phytase có khả năns cất cả
có ý nghĩa, chúne

2

6

aốc photphat hết sức

Óp phần giải quyết được hai yêu cầu của ứns dụng công nghệ sinh học

vào cuộc sống: ( 1 ) hiệu quả sử dụns enzvme đạt tối đa và ( 2 ) tạo sản phẩm cuối cùnơ là
m^o-inositol có nhiều ứng dụns trone y học (Rason và cs.. 2008). Việc sử dụns phytase
neày càns nhiều trona các ứns dụn 2 côna nehệ sinh học đã thúc đay nhiều hướng nghiên
1

cứu phytase như: ( 1 ) phân lập các chủna, vi sinh vật sinh phytase có hoạt lực cao và có tính
năng mới, (2 ) tìm kiếm phytase có tính năn 2 , giải phóng nhiều photphat dễ tiêu hóa trong
đường ruột, và (3) chọn lọc được các phytase có thê duy trì được hoạt tính trons quá trình
chế biến và bảo quản, với giá thành sản phẩm thấp nhất (Raẹon và cs., 2008).
Tuy phytase được sản sinh bởi rất nhiều loài sinh vật như thực vật, động vật và đặc biệt
ở nấm sợi như chi Aspergillus (Gibson, 1987; Dvorakova, 1997; Fujita, 2003; Gareova,
2006). vi khuẩn như chi Baciiỉus (Gulati, 2007; Kim. 1998), chi Pseudomonas (Cho, 2003)
và m ột sô nâm men như Schwanniomyces castelii (Segueiha, 1992), Saccharomyces
cerevisiae (Zyla. 1994, Turk. 2000), Arxula adeninivorans (Sano, 1999), Pichia spartinae
và p. rhodanensis (Nakamura, 2000), Candida krusei (Quan, 2001)...Nhưnơ 2 trone số 3
nhóm tác eiả phát hiện phytase mang đặc tính quý thủy phân hoàn toàn

6

gốc photphat trên

đối tượna, nấm men: Debaryomyces castellii CBS 2923 (RaRơn và cs., 2008) và
Schwanniomyces castelii CBS 2863 (Seeueiha và cs., 1992).
Ở Việt Nam, chưa có một báo cáo nào nehiên cứu sản xuất phytase từ nấm men và cũne
chưa có báo cáo về phytase man^ đặc tính thủy phân hoàn toàn

6

gốc photphat, mặc dù có

một số tác eiả đã nghiên cứu sản xuất phytase từ vi sinh vật nhằm phần nào đáp ứng nhu cầu
trong nước, thay thế dần sản phẩm nhập ngoại, như PGS.TS Vũ Nguyên Thành (Viện Cône
nghiệp Thực phẩm, 2009) đã nghiên cứu và sản xuất phytase tái tổ họp từ nấm sợi

Aspergillus niger. Trần Thị Thủy (Đại học Sư phạm Hà nội, 2010) nghiên cứu nhân dòng và
biếu hiện gen phytase chịu nhiệt của Bacilỉus sp.MD2 trên E. cơ//....Tuy nhiên phytase của
các tác ai ả này mới chỉ thủy phân được <5 gốc photphat.
Như vậy, với neuồn een nấm men lớn (1000 chủng) được lưu giữ tại Bảo tàne RĨổns
chuẩn Vi sinh vật (VTCC), cùne với sự đa dạns lớn về nấm men của Việt nam ở các vùng
sinh thái khác nhau, thì việc tìm kiếm được neuồn phytase mới và quý từ chúng rất khả
quan. N aoài ra, nấm men được xem là loài vi sinh vật hầu như không sây bệnh và được coi
là an toàn (GRAS) (Mishra và cs., 2009), sinh khối nấm men đane được sử đụne làm ns;uồn
protein đơn bào cho neười và độns vật, do vậv, việc bố sune nấm men sinh phytase vào
thức ăn chăn nuôi có thể làm được đồne thời hai nhiệm vụ cung cấp photphat vô cơ và bổ
sung protein cho vật nuôi.
Vì vậy việc "Sàne lọc và nghiên cứu enzym phytase quý có khả năng thủy phân hoàn
toàn

6

2

ốc photphat từ nấm men được lưu eiữ tại Bảo tàng siố n s chuẩn Vi sinh vật, Viện Vi

sinh vật và cônạ nshệ Sinh học nhằm ứns dụns trong sản xuất thức ăn chăn nuôi” là rất cần
thiết.
2. M ục tiêu
- Tuyển chọn được 1 bộ nấm men có khả năno sinh enzyme phytase naoại bào thủy phân
?


hoan toàn

6

sốc Ịíhotphat

- Tinh sạch và nghiên cứu các đặc điểm sinh hóa của phytase ngoại bào sinh ra từ các chủng
nấm men lựa chọn
3.

Phuong pháp nghiên cứu

- Phươns pháp hoạt hóa vi sinh vật từ môi trường lạnh sâu
- Kỹ thuật nuôi cấy vi sinh
- Phươna pháp sàne lọc nâm men phytase trên môi trường đĩa thạch (theo Bae và cs., 1999)
- Phương pháp sàns, lọc nấm men sinh phytase trên môi trườnơ xốp và dịch thể (theo Gulati
và cs., 2007; .ĩorquera và cs.,2010)
- Phươne pháp định lượna phytase (theo Shimizu. 1992)
- Phươna pháp xác định sản phẩm thủy phân cuối cùne của phytase nghiên cứu trên cơ chất
đặc hiệu bằna, sẳc ký lỏne cao áp (HPLC) (theo Kerovuo và cs., 2000; Sạịidan và cs.,
2004;Raeon và cs., 2008; Hellstrom, 2012; Chen, 2003; Skoglund, 1998)
- Quan sát hình thái khuấn lạc và tế bào nấm men ( theo phương pháp của Yarrow, 1998)
- Phươns pháp tách chiết ADN (Manitis, 1982), PCR đoạn gen D1/D2 (Kurtzman và
Robnnet, 1998), phân tích trình tự đoạn D1/D2 (Kurtman và Robnett, 1997), và xây dựng
cây phát sinh chủng loại của các chủng nấm men sinh phytase (Kimura, 1980)

= Phương pháp tinh sạch phytasc bằne sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gcl và xác định kích
thước phytase bằng điện di SDS-PAGE (theo Lix và cs., 2007; Raeon và cs., 2008;
H artinssveldt và cs., 1993)
- Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởne nhiệt độ, pH, ion kim loại đến hoạt độns của
phytase(theo Gulati và cs., 2007)
- Phươna pháp lên men xốp và lên men dịch thế
- Phương pháp tách chiết enzyme từ môi trườns sau lên men

- Phươns pháp nghiên cứu tính bền của phytase dưới các điều kiện nhiệt độ, pH,(theo Gulati
vàc.s.,2007)
- Phươnơ pháp nghiên cứu invitro ảnh hưởne của các enzyme đường tiêu hóa độne vật đên
hoạt động của phytase (Kim và cs., 2003; Zhu và cs., 2010)
- Phương pháp lên men xốp và lên men dịch thể nấm men sinh phytase(Kammoun và cs.,
2011 )

- Phưưns pháp thu hồi phytase từ sản phẩm lên men bằne các duns dịch thích hợp (theo
Quan và cs., 2001)


4. Tông kết kết quả nghiên cứu
4.1. Hoạt hóa nấm men
Có 415 trons tổng sô 418 chủng nâm men phân lập từ

6

nguồn khác nhau lưu giữ tại VTCC

được hoạt hóa thành công từ lạnh sâu.
4.2. Sàng lọc khả năng sinh pliytase của các chủng nam men lưu giữ tại VTCC
Sà n g lọc trên đĩa thạch: 127 chủng nấm men sinh phytase trên dĩa thạch, trong đó 32 chủng
có hoạt tính phytase mạnh (D-d>10 mm), 63 chủna có hoạt tính trune bình (5 mmphàn giải cơ chất.
Sà n g lọc trên môi trường dịch thể: 32 chủns nấm men có vòng trone phân siải cơ chất
phytate lớn trên môi trườne đĩa thạch được nuôi cấy trên môi trườna dịch thể Tsana. có 7
chủng cho hoạt tính phytase cao (Ư/ml> 0 ,l), 15 chủne có hoạt tính phytase trune bình
(0,*05< ư /m l <0.1) và 10 có hoạt tính phytase thấp (U/ml<0,05).
S à n g lọc trên môi trường xốp: với 32 chủng nấm men được nghiên cứu trons thí nghiệm
nàv, chỉ có 5 chủne sinh phytase cao (U /m l>l), 16 chủne có hoạt tính phytase trune bình

(0,5< u /m l <1) và 11 chủng sinh phytase yếu (U/ml<0,5).
4.3. Phân loại các chủng nấm men
P hân tích cây phát sinh chủng loại cho thấy: chủng 180 nằm cùng vị trí với loài Candida
blainkii (trình tự rDNA 26S đoạn D1/D2 tương đồng 100%; 570/570 bp); chủng 102 và 81
nằm cùng vị trí với loài Saccharomycopsis jĩbuligera (tương đồng 100%, 594/594 bp);
chùng LM17 nằm cùne nhánh với loài Wickerhamomyces anomalus (tươiie đồna 100%,
585/585 bp); chủng BS9 nằm cùng vị trí với loài Candida tropicalis (tương đồng 100%,
589/589 bp). Kết họp đặc điểm hình thái và so sánh trình tự đoạn D1/D2 rDNA 26S, có thể
khẳng định chủne 180. LM17, BS9 lần lượt thuộc loài Candida bỉankii, Wickerhamomyces
anomaỉus, Candida tropicalis; hai chủna 102 và 81 cùne thuộc loài Saccharomycopsis
fìbĩuligera.
4.4. Tìm kiếm chủng nấm men có phytase có khả năng thủy phân 6 gốc photphat
Có ba chủng nấm men sinh enzyme phytase thủy phân hoàn toàn

6

2 0

C phosphate có ký

hiệ!uL M 17,B S9 và 180.
4.51 Khả năng sình trưởng của các chủng nấm men lựa chọn trong điều kiệìt đường tiêu
hóta
- K h ả năng tăng sinh của các chùng nấm men: Hai chùn? LM17 và 180 sinh trưởne tốt nhất
trê n 5 loại môi trườna với lượns sinh khối đạt cao nhất theo thứ tự là 7.5 và 8 s sinh khối
khõ/1 môi trường Hansen. Thí nehiệm này còn cho thấy môi trườns Tsans vừa thích họp
ch o nấm men sinh phytase và là môi trường đê nhân sinh khối nấm men. cả 2 chủng LM 17
và 180 đều đặt 7 a sinh khối khô/1 môi trườne.

4

- Khù năng chịu muôi mật của các chủng nàin men: 2 chủng LM 17 và 180 khôns bị ảnh
hưỏn? nhiều bởi muối mật. Với nồng độ muối mật từ 1 - 9 % chủne LM 17 và 180 vẫn đạt
đến 10 1 0 CFU/ ml, tuy nhiên đến nồng độ 7-9% cả hai chủne này đều có khuẩn lạc nhỏ hơn
3 lần so với khuẩn lạc ở nồng độ 0-5%.
- Khả năng chịu emyrne và p H đường tiêu tóứ.chủng 180 có khả năng chịu axit và kiềm,
sau thời gian ủ 1 giờ vẫn đạt 5 x l0 U) CFƯ/ml đổi với dung dịch pepsin và 7 x l0 1 0 CFU/ ml
đối với trypsin. Chủng LM 17 khả năng chịu kém hơn, đối với mẫu ủ trong pepsin thì số
lượng tế bào chỉ đạt 107 CFU/ml, còn mẫu ủ với trypsin thì số lượng tế bào là 3x1 o9.
4.6. N ghiên cứu đặc điếm sinh hóa của phytase lựa chọn
- Tinh sạch phytase: bằng phươns pháp sắc ký trao đổi ion, sắc ký lọc sel, điện di SDSPAGE. bước đầu kết luận kích thước protein phytase của chủns 180 và LM17 có kích thước
lần lượt khoảna 61 kDa và 75 kDa.
- N hiệt độ hoạt động tối ưu: trons dải nhiệt nahiên cứu 30-70°C. phytase của 2 chủne LM 17
và 180 hoạt động tốt trons khoảng 45-50°C.
- p H hoạt động toi ưu: phytase của cả 2 chủns LM 17 và 180 hoạt động tối ưu trons khoảnạ
pH từ 4-5,5 và từ pH 6 phytase dần giảm hoạt tính.
-Tính bển nhiệt của enzyme: phytase của chủne LM17 bền nhiệt ở 50°c sau 30 phút xử lý,
hoại tính vẫn giữ được trên 60%. Ở 60, 70 và 80°c hoạt tính gần như mất hoàn toàn sau 30
phủi. Phytase của chủng 180 bền nhiệt ở 6 0 °c sau 30 phút xử lý, hoạt tính vẫn giữ được trên
90%. Ở nhiệt độ 70 và 80°c hoạt tính chỉ còn dưới 20% sau 30 phút.
- Khả năng bền p H : sau 30 phút xử lý ở pH 3 và 4, phytase chủng LM17 còn trên 90% hoạt
tínlh; với chủna 180 sau 10 phút xử lý ở 2 pH này thì còn hơn 60%, nhưne khi tăng thời eian
xử lý lên 30 phút thì hoạt tính eiảm mạnh xuốne dưới 40%. Tại pH 8 cả 2 chủng LM 17 và
180 có hoạt tính phytase giảm nhanh sau 5 phút xử lý, sau 30 phút phytase chủng 180 còn
20®/o hoạt tính, phytase chủng LM 17 gần như mất hoàn toàn hoạt tính. Tại pH 9 phytase
chũng 180 bền sau 30 phút xử lý, hoạt tính còn 70%, chủng LM 17 sau 30 phút chỉ còn 30%
hoạt tính. Sự khác nhau khi xử lý ở hai pH

8

và 9 có thể do dùna các loại đệm khác nhau.

- A n h hưởng của ion kim loại: sự có mặt của ion Na+ và EDTA làm tăng nhẹ hoạt tính
phytase ở cả 2 chủng LM17 và 180. Hiện tượna EDTA không nhữnR khôna làm giảm hoạt
tínlh phytase mà còn làm tăng nhẹ có thể do EDTA làm kết tủa một số tác nhân ức chế hoạt
động của enzyme. Sự có mặt của SDS làm mất hoàn toàn hoạt tính của enzyme phytase ở cả
2 c;hủng LM17 và 180. Sự có mặt của các ion K+, Ca2+, Cu 2 +,Zn2+, M g 2+, M n 2+, B a 2+ làm
eiảim một phần hoạt tính phytase của 2 chủnạ LM 17 và 180.
- A'nh hưởng của em ym e và p H đường tiêu hỏa: phytase chủna LM17 chỉ còn dưới 20%
hoạt tính sau 30 phút ủ với 2 enzyme tiêu hóa pepsin (0.2 mg/ml) pH 2 và trypsin (0.2
mgĩ/ml) pH

8

. trona khi đó phytase chủna 180 khi ủ với pepsin và trvpsin cùna nồng độ trên

vẫm giữ nsuyên được hoạt tính. Thực hiện thí nehiệm tiếp với phytase chủna 180 ở nồna độ


pepsin và trypsin cao hơn, với pepsin 1 mg/ml sau 30 phút ủ phytase vẫn siừ được trên 70%
hoạt tính, với trypsin 1 mg/ml trong 30 phút ủ hoạt tính chỉ còn dưới 20%.
4 . 7. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh pltytase của các chủng nấm men
lựa chọn và điều kiện thu hồi phylase từ sản phẩm lên men
Điều kiện nhân giong thích hợp. Với 5 môi trường nhàn eiốne đuợc sử dụII2 trons nghiên
cứu, chủng 180 sinh trưởng tốt nhất trên môi trường Hansen, sau 24 giờ nuôi lắc số lượng tế
bào đạt 4 ,5 x l0 9 CFU/ml. Trên môi trườne Tsane và PDA, chủna 180 cho sinh khối tốt nhất
vào giờ lên men 36. với sổ lượna đạt lần lượt 22x1 o 8 và 8,7x10 8 CFƯ/ml. Như vậy, để nhân
giống cho các nshiên cứu tiếp theo, chủng 180 được nuôi lắc 140 vòne/phút, trons 24 giờ
trên 20 ml môi trườna Hansen ở nhiệt độ 28°c.

Lựa chọn cơ chât thích hợp cho khả năng sinh trưởng và sinh phytase của chùng nám men.
Hoạt tính phytase của chủng 180 đạt cao nhất trên 3 môi trường gạo lứt+cám; malt+trấu và
ngô vỡ (lần lượt là 4.4; 4,1 và 3,8 Ư/2 , cơ chất khô), tuy nhiên trone quá trình chiết enzyme,
hai môi trường gạo lứt+cám; malt+trấu cho rất nhiều photphat tự do, sây nhiễu phép đo
quanR phổ; do vậy để 2 ,iúp việc xác định hoạt tính phytase được chính xác trong các thí
nghiệm sau, môi trường nẹô vỡ tiếp tục được sử dụng để nghiên cứu.
Nghiên cún các yếu tố ảnh hưởng đến lên men xop. Độ ẩm thích hợp cho sinh tổng hợp
phytase của chủng 180 là 55%. Khi cấy giống với tỷ lệ 5-7% cho hoạt tính phytase cao nhất
(đạt 3,78-3,9 u /g ) và khi tỷ lệ cấy giống tăng dần không làm tăng hoạt tính phytase mà có
xu thế giảm dần. Chủng 180 có thể sử dụng nhiều nguồn cacbon khác nhau và n^uồn
cacbon có ảnh hưởng đến sinh tône hợp phytase. Trong các nguôn cacbon dược nghiên cứu.
glucose và sucrose có ảnh hưởng tích cực đến sinh tổng hợp phytase, với hoạt tính phytase
đạt 3,96 và 4,38 u /g cơ chất khô. Với mẫu đối chứng không bổ sung nguồn cacbon, hoạt
tính phytase vẫn đạt khá cao 3,5 u /g , như vậy chứng tỏ chủng nấm men có khả năna sử
dụng nguồn cacbon có sẵn trong cơ chất. N suồn nitơ bổ sung có ảnh hưởng đến khả năne
sinh phytase của chủng 180, trong đó N a N 0 3, N a N 0 2, cao thịt làm tăng khả năns sinh tổne
hợp phytase so với đối chứng dươns từ 3,8 đến 5,6%. Còn nguồn nitơ cao men. ure,
(NH 4 )2 S 0 4 làm siảm sinh tổna hợp phytase so với đối chứng dương từ 23-72%. Chủns
LM 17 cho hoạt tính phytase cao nhất vào ngày nuôi cấy thứ 4, đạt sần 4,3 Ư/g CO' chất. Khi
tăng thời 2 Ìan nuôi thì hoạt tính phytase có xu hướna giảm đần.
4.8. Nghiên cứu điểu kiện thu hồi em ytne phytase
Nghiên círu dung dịch chiết enzyme phytase. Nước máy có khả năng chiết được phytase tôt
nhất từ môi trườne lên men xốp, với hoạt tính enzyme đạt 4.93 u /s , cao hơn so với đối
chứn£ dươne nước cất 2 ần 19%. Đối với duns dịch Triton-XlOO 1% và NaCl 50 mM thì có
kết quả tương tự như khi chiết bằne nước cất. Đ áns chú ý là duna dịch Tween 20 1% hầu
như khôns chiết được phytase, hoạt tính enzyme thấp hơn 96% so với khi chiết bàna nước
cất. D u n a dịch SDS 1% cũng cho tỉ chiết phvtase rất thấp, chỉ b ằ n s 35% đối chứns.

6

Thu hói enzyme phytase từ môi trường lên men xốp. ở tât cả các phân đoạn tủa dịch chiêt
enzyme phytase của muối ammonium sunfate đều thu được protein nhưng hoàn toàn không
xác định được hoạt tính phytase. Do đó không thể sử dụng muối ammonium suníầte khi tủa
phytase trong trườne hợp này. Trone khi đó duns môi cồn và aceton ở nồng độ tủa cuối
cùng lần lượt là 70% - 80% cho hoạt tính phytase cao, hiệu suất thu hồi đạt sấp xỉ 90-92%.
5. Đánh giá về các kết quả đã đạt đuọc và kết luận
5.1. Đánh giá về các kết quả đã đạt đuọc
- Tính mới và giá trị khoa học: phát hiện ra 3 hai chủng nấm men có khả năne sinh phvtase
có khả năng thủv phân hoàn toàn 6 sốc phosphate.
- Giá trị thực tiễn và khả năng ứng dụng: chủna nấm men được lựa chọn trons, nehiên cứu
có đầy đủ tính chất cho ứne dụns, thực tiễn trons cône nehiệp thức ăn chăn nuôi
5.2. Kết luận
-Sàng lọc được 127 chủng nấm men sinh phytase trên đĩa thạch. 7 chủng sinh phytase cao
trên môi trường dịch thể, 5 chủng sinh phytase cao trên môi trường lên men xốp
- Phân loại 5 chủng nấm men có hoạt tính phytase cao thuộc các loài Candida blankii,
Wickerhamomyces anomalus, Candida tropicalis; Saccharomycopsis jìbuligera.
-Lựa chọn được 2 chủne nấm men sinh phytase thủy phân hoàn toàn
-Tinh sạch và xác định kích thước phân tử của phytase thủy phân

6

6

2 0

C phosphate

gốc phosphate từ hai

chủng nấm men lựa chọn. Nghiên cứu được đặc điểm hoạt động của enzyme này.
- Toi ưu hóa điều kiện lên men xốp chủng nấm men 180 cho phytase cao
- Nghiên cứu điều kiện chiết và thu hồi phytase của chủne 180
- Đưa ra quy trình lên men và thu hồi phytase phytase từ chủng 180
- Đưa ra quy trình bước đầu tinh sạch phytase chủne 180
6

. T ó m tắ t k ết qu ả (tiếns Việt và tiếng Anh)

6.1. Tiếng việt
Hoạt hóa thành côn? 415/418 chủng nấm men được bảo quản ở -80°c thuộc bộ eions
nấm men của VTCC. Trong số 415 chủne có 127 chủne sinh phytase trên đĩa thạch, 7
chủng cho hoạt tính phytase trên môi trường lên men dịch thể và 5 chủnR cho phytase cao
trên m ôi trường lên men xốp.
Phân loại bành phương pháp quan sát hình thái tế bào, khuân lạc và sinh học phân tử
cho thấy 5 chủng nấm men lựa chọn thuộc về các loài Candìda blankii, Wickerhamomyces
anomalus, Candida tropicalis; Saccharomvcopsisfìbuligera.
Trons số 5 chủne nấm men lựa chọn có 3 chủns nấm men (180, BS 9 và LM17) sinh
phytase thủy phân 6 gốc phosphate và hai chủne 180, L M 17 thuộc nhóm nấm men an toàn,
cho sinh khối cao, chịu được các điều kiện trona đườne tiêu hóa nhân tạo.
Phương pháp tinh sạch enzyme cho thấy phytase của hai chủna nấm men nshiên cửu
có kích thước 75 và 61 kDa.


Chủne. nấm men 180 cho hoạt tính phytase cao nhất trên môi trườn £ naô vỡ được
làm âm đến 50% với dịch khoáng Tsane, tỉ lệ giống cấy 5-7%. bố suna nguồn c là sucrose
hoặc elucose 1%. nguồn nitơ 0,1%, nuôi ở 28°c, trong 4 nsày.
Enzyme phytase của chủng 180 được chiết từ môi trường lên men xốp băns nước
máy và tủa bana cồn hoặc aceton lạnh nồng độ 70%-80%, hiệu suất thu hồi 90-93%.
6.2. Tiếng Anh

415/418 yeast strains stored at -80°c o f the yeast strains o f VTCC were activated
succcssíully. O f the 415 strains, 127 ones exhibited phytase activity on aear plates. 7 strains
produced hieh level o f phvtase in liquid medium and 5 strains shovved hiah level o f phytase
in solid State medium.
The taxonomy o f fíve strains baseđ on morpholoay and molecular bioloey shows that
they belone to species Candida blankii, Wickerhamomyces anomaỉus, Candida tropicalis;
Saccharomycopsis f i buligera.
O f the íĩve selected yeast strains with three yeast strains (180, BS9 and LM17)
produced 6 phosphate completely hydrolysis phytase and 180, LM17 strains belons to
safety yeast group, with high biomass, stabilize with conditions o f the eastrointestinal tract.
Phytases of two strains LM17 and 180 have size 75 and 61 kDa. resspectively.
Strain 180 showed the highest phytase activity in solid State o f broken corn
moistened to 50% with Tsana broth, the rate o f 5-7% innoculum, additional carbon source is
glucose or sucrose 1%, nitrogen meat extract 0, 1%, incubate at 28°c for 4 days.
Phytase o f this strain is extracted from the fennentation medium with tap water and
precipitated by alcohol or cold acetone concentration o f 70%-80%, 90-92% recovery
effíciency, respectively.
PHẦN III. SẢN PHẢM, CÔNG BỐ VÀ KÉT QUẢ ĐÀO TẠO CỦA ĐÈ TÀI
3.1. Kết quả nghiên cứu
Yêu cầu khoa học hoặc/và chỉ tiêu kinh tế - kỹ thuật
TT

Tên sản phẩm
Đăng ký

1

2

3

Đạt được

bộ các chủng nấm men
sinh phytase có khả năng
thủy phân được 6 gốc
photphat

2-5 chủng

2 chủng

Quy trình tách chiết, tinh
sạch enzyme phytase

1 quy trình

1 quy trình

Quy trình lên men và thu
hồi enzvme phytase

1 quy trình

1 quy trình

1

3.2. Hình thức, cấp độ công bố kết quả
TT

Sản phâm

Tình trạng
(Đã in/ chấp nhận in/ đã
nộp đơn/ đã được châp

Ghi địa chi
và cảm ơn
sư tài tro’

Đánh giá
chung
(Đạt,
8


nhận đơn hợp lệ/ đã được
của
cấp giấy xúc nhận SHTT/ ĐHQGHN
xác nhận sử dụng sản
đúng quy
phàm)
định
Cône trình côna bô trên tạp chí khoa học quôc tê iheo hệ thông ISI/Scopus

1

không
đạt)

1.11
1 . 2

Sách chuyên khảo được xuât bản hoặc ký hợp đôns xuât bản

2
2.11
2 . 2

3
Đ ăne ký sở hữu trí tuệ
3.11
3.11
Bài báo quôc tê không, thuộc hệ hôns ISI/Scopus
4
4.11
4.2
Bài báo trên các tạp chí khoa học của ĐHQGHN. tạp chí khoa học chuyên
5
ngành quốc gia hoặc báo cáo khoa học đăns trong kỷ yếu hội nghị quốc tế
Có ghi cảm
Đạt
5.11 Trân Thị Lệ Quyên, Lưu Thị Đã in
Ngọc, Đào Thị Lương (2014).
ơn sự hỗ trợ
Tuyển chọn và nghiên cứu chủng
kinh phí từ
nấm men sinh phytase lưu giữ tại
đề tài QG.

Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật.
12.23
Tạp chí Di truyền và ứng dụngChuyên san Công nghệ sinh học,
9,25-35
Có ghi cảm
Đạt
5.2 Trân Thị Lệ Quyên (2014). Nghiên Đã in
cứu điều kiện lên men xốp và thu
ơn sự hỗ trợ
hồi enzyme phytase từ chủng nấm
kinh phí từ
men Candida blankii 180. Di
đề tài QG.
truyền và ứng dụng-Chuyên san
12.23
Công nghệ sinh học, 9, 18-24
Báo cáo khoa học kiên nehị, tư vân chính sách theo đặt hàng của đơn vị sử
6
dụng
6.11
6 . 2

7

Kêt quả dự kiên được ứ ns dụna tại các cơ quan hoạch định chính sách hoặc
cơ sở ứne dụng KH&CN

7.11
7.2’
.3.3. Ket quả đào tạo

TT

Họ và tên

Thòi gian và
kinh phí tham Công trình công bố liên quan
(Sán phấm KHCN, luận án,
gia đề tài
luận văn)
(số tháng/sỏ
tiền)

Đã bảo vệ

N ghiên cứu sinh
9


1

Tràn Thị Lệ Quyên

Tháng
1 0 /2 0 1 2 10/2014

Hô trợ đào tạo

Chưa bảo vệ

Tháng
1 0 /2 0 1 2 tháng
10/2013

Sàng lọc và nghiên cứu các
chủng nấm men sinh phytase
từ các bộ eiống nấm men lưu
eiữ tại Bảo tàng Giống chuẩn
Vi sinh vật (VTCC) nhằm ứna
dụne trona sản xuất thức ăn
chăn nuôi

Đă bảo vệ

Hoc viên cao hoc
1

Cử nhân
Lưu Thị Ngọc
1

Ghi chú:
Gửi kèm bàn photo trang bìa luận án/ luận văn/ khóa luận và băng hoặc giây chửng
nhận nghiên cím sinh/thạc sỹ nếu học viên đã bảo vệ thành công luận án/ luận văn;
Cột công trình công bo ghi như mục III. 1.
PHẦN IV. TỎNG HỢP KÉT QUẢ CÁC SẢN PHẲM KH&CN VÀ ĐÀO TẠO CỦA
ĐÈ TÀI
T
T
1

2
3
4
5

6
7
8
9
1 0

Số
lượng
đăng ký

Sản phẩm

Bài báo công bổ trên tạp chí khoa học quốc tế theo hệ
thống ISI/Scopus
Sách chuyên khảo được xuât bản hoặc ký họp đône
xuất bản
Đăng ký sở hữu trí tuệ
Bài báo quôc tê khône thuộc hệ thông ISI/Scopus
Sô lượng bài báo trên các tạp chí khoa học của
2
ĐHQGHN, tạp chí khoa học chuyên ngành quốc gia
hoặc báo cáo khoa học đăne trong kỷ yếu hội n^hị quốc
tế
Báo cáo khoa học kiên nehị, tư vân chính sách theo đặt
hàng của đơn vị sử dụns

Kêt quả dự kiên được ứne dụng tại các cơ quan hoạch
định chính sách hoặc cơ sở ứng dụng KH&CN
1
Đào tao/hô trơ đào tao NCS
Đào tao thac sĩ
2
Đào tạo cử nhân

Số lượng
đã hoàn
thành

2

1
1

PHẢN V. TÌNH HÌNH s ử DỤNG KINH PHÍ

T
T

Nội dung chi

Kinh phí
đuọc
duyệt
(triệu

Kinh phí

thực hiện
(triệu
đông)

Ghi chú

10


đồng)

A
1
2

3
4
5
6

7
8

B
1
2

Chi p hí trực tiêp
Thuê khoán chuyên môn
Nguyên, nhiên vật liệu, cây con..

Thiêt bị, dụng cụ
Công tác phí
Dịch vụ thuê ngoài
Hội nehị. Hội thảo, kiêm tra tiên độ,
nghiệm thu
In ân, Văn phòng phâm
Chi phí khác
Chi p hí gián tiêp
Quản lý phí
Chi phí điện, nước
Tông sô

110
39

110
39

13

13

5
4

5
4

9

9

180

180

PHÀN V. KIÉN NGHỊ (vềphát triển các kết quả nghiên cứu của đề tài; về quản lý, tô
chức thực hiện ở các cấp)
PHẦN V I. PHỤ LỤC
Phụ lục 1. Bài báo - Đào tạo
Phụ lục 2. Thuyết minh - Họp đồng
Phụ lục 3. Quy trình
Phụ lục 4. Báo cáo tống kết

Hà Nội, ngày 22 thángl năm 2015
Đơn vị chủ trì đề tài
VI ký ten đóng dấu)
V

V ăn

Chủ nhiệm đề tài
(Họ tên, chữ ký’)

ÌN T R Ư Ở N G

HỢP
Trần Thị Lệ Quyên

11

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC 1

BÁO-ĐÀO


Di truyền học vù ímg dụng - Chuyên sun Công nghệ sinh học

S ố 9 - 2014

NG H IÊN CỨU ĐIÈU KIỆN LÊN M EN XÓP VÀ THU HÒI ENZYM E PH YTASE T Ừ
CH ỦNG NÁM M EN CANDIDA B LA N K II 180
Trần Thị Lệ Quyên

Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học
MỞ ĐẦU
Phytases phân bố phố biến trong tự nhiên,
được tìm thấy trong thực vật, vi sinh vật và
một số mô động vật. Chúng xúc tác cho sự
thủy phân acid phytic và các muối của acid
phytic để tạo thành photphat vô CO' và các
dẫn xuất myo-inositol. Dựa vào vị trí c
trong vào myo-inisitol của phytic mà tại đó
phản ứng dephotphoryl hóa bắt đầu. phytase
có thể được xếp vào nhóm 3-phytases (EC
3. 1.3,8) và 6 -phytases (EC 3.1.3.26) [3].
Do tiềm năng của chúng trong các ứng dụng

công nghiệp mà phytase được đặc biệt quan
tâm nghiên cứu trong các thập kỷ gần đây.
Một Số vi khuẩn, nấm sợi và nấm men được
công bố có khả năng sinh phytase. Trong
thực tể, việc sản xuất thương mại enzyme
phytase cho công nghiệp thức ăn chăn nuôi
giai đoạn đầu chủ vếu tập trung vào đối
tượna nấm mốc và nấm men. Gần đây,
phytase từ các loài Bacillus được công bố có
những ưu điểm như bền nhiệt và đặc hiệu
cao. Tuy nhiên, có thể phần nào do các
phương pháp sản xuất enzvme thiếu hiệu
quả mà phytase từ Bacilỉus không được áp
dụng trên quy mô lớn. Có hai phương pháp
được sử dụng trong sản xuất phytase vi sinh
vật được biết đến là lên men xốp và lên men
bề mặt. Lên men xốp đã thu hút được nhiều
sự quan tâm trong những năm gần đây, chủ
yếu do chúng tiêu tốn ít năng lượng, lượng
nước thải đầu ra thấp, môi trưòng lên men

đơn giàn, thôníì khí dề dàng và sự tạp nhiễm
vi khuẩn được hạn chế [3].
Các điều kiện nuôi cấy, chủng giống, tính
chất tự nhiên của cơ chất và hàm lượng các
chất dinh dưỡng được đưa vào bài toán đầu
vào để quyết định năng suất sản xuất các sản
phẩm enzyme. Các cơ chất hiệu quả kinh tế
nhất được sử dụng phổ biển là cám mỳ, bột
đậu tương nguyên chất, bột canola thô. rỉ

đường, bã ép dầu thô [3].
Trong nghiên cứu này chủng nấm men
Candida bỉankii 180 sinh phytase có khả
năng thủy phân 6 gốc phosphate, sinh khối
tốt và an toàn cho vật nuôi được nghiên cứu
một số điều kiện lên men xốp và bước đầu
tách chiết enzyme phytase phục vụ cho các
nghiên cứu về sau.
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Chủng giống. Chủng nấm men Candida
blankii 180 sinh phytase thủy phân 6 gốc
phosphate có nguồn gốc từ bánh men được
lưu giữ tại VTCC.
Môi trường nhăn giong. YM (g/1: glucose 10; cao men - 3; cao malt - 3: pepton - 5:
pH 6,5); Hansen (g/l: glucose - 30; pepton 10 ; cao men - 1 ; MgSOí - 2 ; KH2 PO4 - 3;
pH 6,5); PDA (g/1: khoai tây - 200 , glucose
- 10; pH 6,5); YDP (g/l: cao men - 10 ,
pepton - 20 . alucose - 20; pH 6.5); Tsang
[8].
18

./. Genelics and Applications - Speciaì ỉssue: Biotechnology
InstUute ofM icrobìolog\’ and Biotechnology, Vietnam National Ưniversity , Hanoi


Di truyền học và úvg dụng - Chuyên san Công nghệ sinh học

Chủng
nấm men I 80 được nuôi cấy trên các môi
trường nhân giống khác nhau, với thể tích

môi trường 2 0 ml/bình tam giác 1 0 0 ml, ở
nhiệt độ 28°c trong khoảng thời gian 16, 24,
36 giờ, tốc độ lắc 140 vòng/phút, sau đó xác
định khả năn? sinh trườne; của chùng nấm
men tròn các môi trường bàng phương pháp
xác định cfu/ml.

N g h iên cứ u đ iều kiện n h ân giốn g.

N g h iên c ứ u cá c điều kiện lên m en x ố p

Số 9 - 2014

tủa được hòa tan về thể tích ban đầu bằng
nước cất và xác định hoạt tính phytase.
Tủa emyme bănq các dung môi hữu cơ: dịch
chiết enzyme phytase được tủa bằng hai
dung môi ethanol và aceton lạnh đến nồng
độ cuối cùng là 70%. Cặn tủa được hòa tan
về thể tích ban đầu bằng nước cất và xác
định hoạt tính phytase.

ch o kh ả n ă n g sin h ph yta se.

P h ư ơ n g p h á p x á c địn h h o ạ t độ ph vía se.

Nguồn cơ chất, thời gian nuôi, ti lệ giống, độ
ẩm, nguồn cacbon, nguồn nitơ và các ion
kim loại được thực hiện theo phương pháp
mô tả của Gulati và cộng sự (2007) [ 1].

Xác định theo phương pháp của Shimizu,
1992 [7].

thích

họp

Chiết enzxme. Enzym phytase được chiết từ
môi trường lên men xốp bằng các dung dịch:
Triton X I00 1%, NaCl 50 mM, SDS 1%,
Tween 20 1%, Tris HC1 0,1 M pH 7, nước
cất, nước máy vói tỷ lệ cơ chất : dịch chiết =
1 :2 ,
sau đó lắc 1 giờ và ly tâm 8000
vòng/phút/15 phút, thu dịch trong xác định
hoạt tính phytase.
Thu h ồ i e n z v m e

Tủa enzyme bang muối (NH4) 2SO/. dịch
chiết enzvme phytase được tủa bằng muối

KÉT Q UẢ VÀ TH ẢO LUẬN

Với 5 môi
trường nhân giống đuợc sử dụng trong
nghiên cứu, chủng 180 sinh trường tốt nhất
trên môi trưòng Hansen, sau 24 giờ nuôi lắc
số lượng tế bào đạt 4,5xl0 9 CFU/ml. Trên
môi trường Tsang và PDA, chủng 180 cho

sinh khối tốt nhất vào giờ lên men 36, với số
lượng
đạt
lần
lượt
2 2 x 1 o8
và
8,7x108 CFU/ml. Như vậy, để nhân giống
cho các nghiên cứu tiếp theo, chùng 180
được nuôi lắc 140 vòng/phút, trong 24 giờ
trên 20 ml môi trường Hansen ở nhiệt độ
28°c. (Hình 1)

Đ iều kiện n hân g iố n g th ích hợp.

(NH4 )2 S 0 4 ở các phân đoạn từ 30-90%. Cặn

19

J. Genetics and Applications - Special Issue: Biolecìmology
Institute ọ f M icrobioỉogy and Biotechnolog}’, Vielnam National University, Hanoi


Di tniyờn học và ứng dụng

Chuyên san Công nghệ sinh học

Số 9 - 2014

Hình 1. Môi trưòìig và thòi gian nhân giống khỏi động

L ự a chọn c ơ ch ấ t

thích h ọp ch o khá n ăn g

sin h trư ở n g và sìn h p h y ta se củ a ch ủ n g

nấm men. Dựa vào ưu điểm của môi trường
lên men xốp khá giống với môi trường tự
nhiên của vi sinh vật, cơ chất rắn vừa có vai
trò là nguôn dinh dưỡng vừa là giá thê giúp
tế bào vi sinh vật bám vào. Với đặc điểm
nước ta là nước nông nghiệp, nên việc tìm
nguồn cơ chất là sản phẩm hoặc phụ phẩm
từ nông sản với giá thành hợp ]ý tương đối
dễ dàng. Trong nghiên cứu này, hoạt tính
phytase của chủng 180 đạt cao nhất trên 3
môi trưòng gạo lúrt+cám; malt+trấu và ngô
vỡ (lần lưọt là 4,4; 4,1 và 3,8 u/g cơ chất
khô), tuy nhiên trong quá trình chiết
enzyme, hai môi trường gạo lứt+cám;
malt+trấu cho rất nhiều photphat tự do, gây

nhiễu phép đo quang phổ; do vậy để giúp
việc xác định hoạt tính phytase được chính
xác trong các thí nghiệm sau, môi trường
ngô vỡ tiếp tục được sử dụng để nghiên cứu
(Hình 2). Trong khi đó nghiên cứu cùa
Vohra (2011) cho thấy nấm men
Wickerhamomyces unomaỉus cho hoạt tính
cao nhất khi nuôi trên bột đậu tương, đạt

1000 u/kg [9]. Đối với vi khuẩn Bacillus
một số tác giả lại cho rằng cám lúa mỳ là
nguồn cacbon thích họp nhất cho sản xuất
phytase ở B. amyỉoìique/aciens DS11 [5] và
B. amylolique/aciens FZB45 [5]. Tuy nhiên,
cơ chất này lại không có ảnh hường tích cực
đến quá trinh sản sinh phytase từ B.
laevolacticus [ 1 ].

20

J. Genelics and Applications - Special Issue: Biotechnoìog)'
Insútute o f Microbiolog}' and Bioteclmology, Vietnam National University, Hanni


Số 9 - 2014

Di truyền học rà ứng dụng - Chuyên san Công nghệ sinh học

5
.45
4
3.5

1.5

■

1

0.5
I

0

N aò vỡ

G ạ o lừ t

Đ ậu tư ơ n g
vờ

N eò
N aô
v ỡ + C á m V Ỡ+B Đ T

G ạo lin +
cá m

G ạ o lứt
+BĐT

Đ ậ u tư ơ n g M a lt+ trấ u
vỡ+ cám

Cơ chất

Hình 2. Co’ chất thích họp cho lên men xốp sinh phytase

men xốp. Trong nghiên cứu này, độ ẩm

thích hợp cho sinh tổng họp phytase cùa
chủng 180 là 55% (Hình 3).Tỷ lệ cấy giống
cũng là một trong các yếu tố quan trọng
trong quá trình sản xuất phytase. Khi cấy
giống với tỷ lệ 5-7% cho hoạt tính phytase
cao nhất (đạt 3,78-3,9 u/g) và khi tỷ lệ cấy
giống tăng dần không làm tăng hoạt tính
phytase mà có xu thế giảm dần (Hình 4).

Nghiên cứu các yểu tổ ảnlĩ hưởng đến lên
men xốp. Trong lên men xốp, độ ẩm có ảnh
hưởng rất lớn đến quá trình sinh trường
cũng như sinh tổng hợp enzyme của vi sinh
vật. Không giống như lên men dịch thể,
tròng lên men xốp, vi sinh vật sinh trưởng
và sinh enzyme trên hoặc gần bề mặt cơ chất
có độ ẩm thấp, do vậy mà chỉ một số giới
hạn vi sinh vật nào đó mới thích hợp cho lên

1

1
■

1 !
30%

35%

40%

1
1 1 ị
45%

50%

1
1=

■— -

h
55%

60%

1
65%

1
70%

Đ ộ ẩm

Hình 3. Ảnh hưỏng của độ ấm cơ chất đến khả năng sinh phytase

21

J. Genetics and Applications - Special Issue: Bìotechnology

Instiíute o f M icrobiology and Biotechnolog}’, Vietnam National Ưniversitỵ, Hanoi


Di truyền học và ứng dụng - Chuyên san Công nghệ sinh học

2%

3%

5%
Tì

7%

Sổ 9 -2 0 1 4

10%

lệg iố n g

Hình 4. Ánh hưỏng của tí lệ giống đến khả năng phytase

Ket quả trên hình 5 cho thấy chùng
180 có thể sử dụng nhiều nguồn cacbon
khác nhau và nguồn cacbon có ảnh hường
đến sinh tổng họp phytase. Trong các nguồn
cacbon được nghiên cứu, glucose và sucrose
có ảnh hường tích cực đến sinh tổng hợp
phytase, với hoạt tính phytase đạt 3,96 và
4,38 u/g cơ chất khô. Với mẫu đối chứng

không bổ sung nguồn cacbon. hoạt tính
phytase vẫn đạt khá cao 3,5 u/g, như vậy
chứng tỏ chủng nấm men có khả năng sử
dụng nguồn cacbon có sẵn trong cơ chất. Ở
một số nghiên cứu, glucose được coi là
nguồn cacbon được sử dụng rộng rãi bời
nhiều vi sinh vật. Nồng độ glucose 1% là
nồng độ tối ưu cho quá trình sản xuất
phytase ở Lactobacillus amylovorus và
Enterobacter sp. 4, trong khi đó Bacillus
subtilis thích họp với nồng độ elucose 2 %
[4,11].
Nguồn nitơ bổ sung có ảnh hưởng đến
khả năng sinh phytase của chủng 180 (Hình
6 ), trong đó NaNƠ 3 , NaNƠ2 , cao thịt làm
tăng khả năng sinh tổng hợp phytase so với
đối chứng dương từ 3,8 đến 5,6%. Còn
nguồn nitơ cao men, ure, (NH4 )2 S0 4 làm

giảm sinh tổng hợp phytase so với đối chứng
dương từ 23-72%. Nghiên cứu của Gulati và
cs (2007) cho thấy quá trình sinh phytase
bời Bacillus laevoìacticus được kích thích
nhờ sự có mặt cùa NH4 H2 PO4 . B. subtilis sử
dụng casein thủy phân 1 % và (NH^SCU
0 , 1 % là nguồn nitơ trong quá trình tổng họp
phytase [ 1 ].
Ket quả trong hình 7 chỉ ra rằng
chùng 180 cho hoạt tính phytase cao nhất
vào ngày nuôi cấy thứ 4, đạt 4,3 u/g cơ chất.

Khi tăng thời gian nuôi thì hoạt tính phytase
có xu hướng giảm dần. Nghiên cứu cùa
Gulati và cộng* sự (20Ơ7) cho thay tí.
laevolacticus cho hoạt tính phytase cao nhất
sau 60 giờ nuôi cấy. Nghiên cứu của
Ramesh và Lonsane (1987) cho kết quả
phytase đạt tối đa ỏ' 72 giờ, sau đó giảm dần.
Nguyên nhân của sự giảm sinh tổng họp
phyatse có thể là do sự tăng sinh trưởng sinh
khối tế bào làm giảm hàm lượng các yếu tố
dinh dưỡng trong môi trường, cũng có thể là
do sự ức chế tế bào hoặc biến tính protein do
sự tương tác với các thành phần khác trong
môi trường [ 1 ].

22

J. Genetics and Applications - Special Issue: Bioteclmology
ĩnstitute o/M icrobiologỵ and Biotechnologv, Vietnam National Universit}’, Hanoi


Di In iyê n học và ÚVỈỊ CỈỊIIIÍỊ - Chuyên san Công nghệ sinh học

G lu c o s e

S u c ro s e

D -L a c to se

Sổ 9 - 2014

D - M a n n ito l

X y lo s e

Đ ố ic h ím a â m

N g u ồ n c a c b o n b ổ su n g

Hình 5. Anh hưỏìig của nguồn cacbon bôúnung đến khả năng sinh
■3

A

....................................................................

...............................................................................

o
3

ĩ

11
11
ầ
m

ỉ

2 5

?•

'

1

■

U .D
0

....

“

_

^
ề

f

^
f

11
1
m

.........

1

^
ỵ

tỷ

/

ỵ

Vi

N guồ n

/ ■

*

n ito * bổ s u n g

Hình 6. Ảnh hưởng của nguồn nitơ bổ sung đến khả năng sinh phytase

s/5

'

c .
s

-

/

08*

©

1

”*

/
4Ệ
1 ngàv

2 ngày

3 ngày

4 ngày

5 ngày

6 ngày

7 ngày

T h ò i g ia n lên m en

Hình 7. Ánh hưởng của thời gian lên men xốp đến khả năng sinh phytase

cứu d u n g dịch ch iết enzvme
phytase. Ket quả cùa nghiên cứu cho thấy
nước máy có khả năng chiết được phytase
N gh iên

tốt nhất từ môi trườna lên men xốp. với hoạt
tính enzyme đạt 4.93 u/g, cao hơn so với
đối chứng dương nước cất gần 19%. Đối với

J. Genetics and Applications - Special Issue: Biotechnology
Institute ọ f Microbiolog}’ and Biotechnolog}’, Vietnam National ưniversiiy, Hanoi


Di In iyên học và ím g dụng - Chuyên san Công nghệ sinh học

dung dịch Triton-XlOO 1% và NaCl 50 mM
thì có kết quả tu'0 'ng tự như khi chiết bằng
nước cất. Đáng chú ý là dung dịcli Tvveen 20
1 % hâu như không chiết được phytase, hoạt
lính enzyme thấp hon 96% so với khi chiết
bằng nước cất. Dung dịch SDS 1% cũng cho
tỉ lệ chiết phvtase rất thấp, chỉ bằna 35% đối
chứng (Hình 8 ). Đối với từng vi sinh vật
khác nhau lên men trên các loại môi trường
khác nhau thì việc sử dụng các dung dịch

đệm khác nhau cũng ảnh hưởng nhiều đến

Sổ 9 - 2 0 1 4

quá trình thu hồi enzyme. Trong nghiên cứu
của Rezaei và cộng sự (2011) trên đối tượng
cơ chất là cỏ switchgrass được bổ sung
enzyme xylanase thương mại (nguồn gốc
nấm sợi) thỉ đệm natri acetate 50 lĩiM là một
đệm chiết xuất lý tưởng, trong khi đó cùng
loại cò này được lên men xốp bởi chủng
Axilothermus celỉuỉolyticus lại cho thấy
nước là một đệm chiết xuất ưa thích để thu
hồi xylanase [6 ].

Hình 8. Khả năng chiết phytase từ môi trường lên men xốp của các dung dịch

Thu hồi enzvme p h y ta s e từ môi trường lên
men xốp. Ket quả thể hiện trên hình 9 cho
thấy ờ tất cả các phân đoạn tủa dịch chiết
enzyme phytase của muối ammonium
sunfate đều thu được protein nhưng hoàn
toàn không xác định được hoạt tính phytase.
Do đó không thể sử dụng muối ammonium
sunfate khi tủa phytase trong trường hợp
này, tuy nhiên theo nhiều nghiên cứu cùa
các tác già khác như Kerovuo (1998) đã tủa

phytase bằng (NH4 )2 S0 4 65% và thu hồi
được 56% hoạt tính phytase; theo Wang

xueying (2003) thu hồi được phytase ờ các
phân đoạn từ 20-80% (NH4 )2 S0 4 [4,
1 0 ].Trong khi đó dung môi cồn và aceton ở
nồng độ tủa cuối cùng là 70% cho hoạt tính
phytase cao, hiệu suất thu hồi đạt sấp xí
100%. Trong nghiên cứu của Kerưvo (1998)
đã sử dụng cồn 75% để tủa phytase và thu
hồi được 93% hoạt tính phytase [4].

24

J. Genetics and Applications - Special Issue: Biolechnology
ỉnstitute o f Microbiolog}' and Biotechnologỵ, Vietnam National Universitỵ, Hanoi


Số 9 - 20 ỉ 4

Di Iruvữn học và ứng dụng - Chuyên san Công nghệ sinh học

1.2 TE

=

■—
—

0.8
<s>

Ã

*
E_-C
s «■
I I

0.4

s8 «o•
'C
= ĩ 0.2

I

0

N

;í/

-ặ' & 4 ° ể'° 4^ ,ữ°'° Ẩ
A° A° A°
A°
.v^ - > v _ .v^
.v^
_>v
^
y
_y
„

„

D u n g m ôi tủ a
* H àm lư ơ n g p ro te in

H o ạ t tin h p h y ta se

Hình 9. Lựa chọn dung môi tủa phytase thích họp

KÉT LUẬN
Chủng nấm men Ccmdida bìankii 180 là
chủng nấm men có tính an toàn sinh học,
cho hoạt tính phytase cao trên môi trường
lên men xốp với cơ chất ngô vỡ, đồng thời
được tách chiết dễ dàng với hiệu xuất thu
hồi cao nhờ dung môi là cồn, thứ hóa chất
dễ tìm và dễ sử dụng. Ket quả của thí
nghiệm cho thấy chùng nấm men 180 có thể
được ứng dụng vào sàn xuất thức ăn chăn
nuôi sừ dụng nguồn cơ chất có sẵn trong
nước, vừa cung cấp nguồn enzyme phytase
vừa cung cấp lượng protein đơn bào cho vật
nuôi. Dựa vào kết quả thu được, một quy mô
lên men xốp lớn hơn có thể được thiết kế với
mục đích sản xuất thử.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Gulati H.K., Chadha B.S., Saini U.S.
(2007)
Production
and

characterization of thermostable

alkaline phytase from Bacillus
ìaevolacíicus
isolated
from
rhizosphere soil. J Ind Microbiol
Diotechnol 34:91-98
2. Idriss E.E., Makarewicz o., Farouk
A., Rosner K., Greiner R., Bochow
H., Richter T., Borriss R., (2002)
Extracellular phytase activity of
Bacillus arnvloliquefacierts FZB45
contributes to its plant-growthpromoting effect. Microbiology 148:
2097-2109
3. Kammoun R., Farhat A., Chouayekh
H„ Bouchaala K„ Bejar s. (2011)
Phytase production by Bacillus
subtilis US417 in submerged and
solid State fermentations. Ann
Microbioh 1-10
4. Kerovuo J., Lauraeus M., Nurminen
p., Kalkkinen N., Apajalahti J.
(1998) Isolation, characterization,
molecular
gene
cloning
and
sequencing of novel phytase from
Bacillus subtiỉlis. Appl Environ

Microbioì 64: 2079-2085
25

J. Genelics and Applications - Speciaì Issue: Biotechnology
Inslitute ofM ìcrobioìog\' and Bioìechnology, Yietnam National Universit}-, Hanoi


Di Inivên học và ứng dụng — Chuyên san Công nghệ sinh học

5. Kim Y„ Kim H.K., Bae K.S., Yu
J.H., Oh T.K. (1998) Puriíìcation
and properties of a thermostable
phytase from Baciìỉus sp. DSI1.
Enzyme and Microbial Technology
22:2-7
6 .
Rezaei F., Joh L.D., Kashima H.,
Reddy A.P., VanderGheynst J.s.
(2011) Selection of conditions for
cellulase and xylanase extraction
from switchgrass colonized by
Acidothermus celỉuìolyticus. Applied
Biochemicaỉ Biotechnology 164(6):
793-803
7. Shimizu M. (1992) Purifícation and
characterization of phytase from
Bacilỉus subtilis (natto) N-77. Biosci
Biotechnol Biochem 56: 1266-1269
8 .
Tsang K.w.p. (2011) Differentiaỉ

phytate utiIization in Candida
species. Mvcopalhologia 172:473479
9. Vohra A., Kaur p., Satyanarayana T.,
(2 0 1 1 ) Production, characteristics
and applications of the cell-bound

Số 9 - 2 0 1 4

phytase of Pichia anomaỉa. Antonie
van Leeinvenhoek 99:51-55
10. Wang xueying (2003) Phytase
studies: producer screening, enzyme
puri/ìcation and characleri-ation
and gene cìoning. PhD thesis,
Facultv of graduate studies Mahidol
University.
11.Yoon S.J., Choi Y.J., Ki M.H.,
Kwang C.K., Wook K.J„ Cheol L.C.,
Hoo J.Y. (1996) ỉsolation and
identiíication of phytase producing
bacterium, Enterobacterium sp. 4
and, enzymatic properties of phytase
enzyme.
Enzyme
Microbial
Technology 18(6): 449-45
Lòi cảm ơn

*Công trình được hỗ trợ kinh phí từ đề tài:
“Sàng lọc và nghiên cíni enzym phytase có

khả năng thủy phản hoàn toàn 6 gốc
photphat từ nam men nhằm ứng dụng trong
chăn nuôF- QG. 12.23.
*Người thẳm định: GS. TS. Phạm Văn Ty

SU M M A RY
O PTIM A L C O N D IT IO N S FO R SOLIĐ STATE FE R M EN TA T IO N AND R EC O V ER
EN ZY M E PH YTASE FROM STRAIN CANDIDA B L A N K II180
Tran Thi Le Quyen

Institute o f Microbioìogy & Biotechnology (IMBT), Vietnam National University, Hanoi (VNU)
Optimal conditions for solid - State fermentation of strain Candida bỉankii 180 were raw
corn substrate with moisture content 55%, inoculum size ranging from 5-7%, previously grown
for 24 hours in Hansen broth, 4 days fermentation time. Higher amount of enzyme phytase was
obtained in presence of sucrose and either NaNC>3 , NaNO: or meat extract. Of the seven studied
solutions, tap water was the best one for extracting phytase from substrate. Alcohol and acetone
at 75% íinal concentration were suitable for enzyme recovery \vith performance of
approximatelv 1 0 0 %.

J. Genetics and Applications - Special Issue: Biotechnology
Institule o f M icrobiolog}’ and Biolecìmology, Vietnam National University, Hanoi


SỐ 9 - 2014

D i tr u y ề n h ọc và íhỉíỊ d ụ n g - ( 'huyên sa n C ô n ẹ nghệ sìn h học

T U Y Ẻ N C H Ọ N VÀ N G H IÊ N c ử u C H Ủ N G NẤM M EN SINH PH Y T A SE
L Ư U G IŨ TẠI BẢ O TÀ N G G IÓ NG C H U À N VI SINH VẬT
Trần Thị Lệ Quyên1, Lưu Thị N gọc2. Đào Thị Lương1

'v iện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học. Đại học Quốc gia Hà Nội
2Viện Đại học Mỏ- Hà Nội

ĐẶT VÁN ĐÈ
Axit phytic là một dạng dự trữ photplio
chủ yếu trong hạt ngũ cốc và các cây họ đậu.
nhưng chi một lượng rất nhỏ đưọc thúy phân
tạo photphat vô cơ và nó được xem như một
chất kháng dinh dưỡng, cản trờ sự tiêu hóa các
protein và các ion kim loại [23].
Phytases là enzym e xúc tác cho phản ứng

thùy phân axit phytic thành photphat vô cơ tự
do. Phytases được sản sinh bởi thực vật. động
vật và vi sinh vật [18, 35]. Những nghiên cứu
gần đây chi ra rằng nguồn vi sinh vật mang
đầy hứa hẹn cho sản xuất phytase thương
phẩm, với sản phẩm thương mại đầu tiên là
PhyA từ chủng nấm sợi Aspergillus niger [18].
Ngoài phytase từ nấm sợi, các nhà khoa học
trên thế giới cũng rất quan tâm đến đối tượng
nấm men. Từ việc nghiên cứu 738 chủng nấm
men, Nakamura và cs. (2000) đã phát hiện

khác, như Vũ Nguyên Thành đã nghiên cửu
sản xuất phytase tái tổ hợp từ nấm sợi
Aspergillus niger [31], Trần Thị Thúy nghiên
cứu nhân dòng và biểu hiện gen phytase chịu
nhiệt cùa Bacilìus sp. MD2 trên E. Coìi [32].
Vói nguồn gen nấm men lớn lưu giữ tại

Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật (VTCC),
cùng với sự đa dạng về nấm men cùa Việt nam
ỏ' các vùng sinh

thái khác nhau, thì việc tìm

kiếm được nguồn phytase mới từ chúng rất
khả quan. Ngoài ra, nấm men đưọc xem là vi
sinh vật hầu như không gây bệnh và đưọc coi
là an toàn (GRAS) [26], sinh khối nấm men
đang được sử dụng làm nguồn protein đon bào
cho ngưòi và động vật, do vậy, việc bổ sung
nấm men sinh phytase vào thức ăn chăn nuôi
có thể làm được đồng thời hai nhiệm vụ cung

cấp enzymtí phytase và bổ sung protein cho
vật nuôi.

hoạt tính phytase ỏ' 35 chủng, với khoảng pH

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

và nhiệt độ tối ưu rộng [17]. Gần đây nhất
nhóm tác giả Ragon và cs., (2008, 2009) đã

Đ ổi tượng nghiên cứu: 418 chủng nấm men

nshiên cứu sâu về cấu trúc và hoạt động của
phytase quý từ nấm men có khả năng thủy
phân hoàn toàn 6 gốc photphat [22].

PhyA từ A spergilìus niger được biết đến là

lưu giữ tại VTCC phân lập từ Cúc Phương,
Trùng Khánh, Cát Tiên, Lang Bi-ang, bánh
men, thực phẩm lên men, sân bay quân sự Đà
Nang.
M ôi trưcmg:

sản phẩm thương mại đầu tiên với vai trò là
dạng bổ sung vào thức ăn. Việc bổ sung

- Môi trường sàng lọc nấm men sinh phytase

phytase vi sinh vật vào chế độ ăn cùa vật nuôi

trên đĩa thạch theo mô tả của Jorquera [9].

giúp hạn chế việc cung cấp photphat và làm

- Môi trường dịch thể kích thích sinh phytase

tăng khả năng hấp thu sinh học các protein và

theo mô tả cùa Tsang [33], Hussin [7], Vohra

khoáng chất thiết yếu. do đó làm tăng hiệu quả

[34], Ọuan [21], Femandez [2], Lambrechts

chăn nuôi, giảm lượng photpliat trons bã thải

[13] Staden [29], Ries [24].

chăn nuôi, giảm ô nhiễm môi trưòng [3].
- Mỏi trưòns lên men xốp kích thích nấm men
ơ Việt Nam, chưa có một báo cáo nào về

sinh ph)tase: môi trường cơ chất khác nhau

nghiên cứu phytase từ nấm men, một số tác giả

được làm ẩm vói 80% (v/w) dịch khoáng

nghiên cứu phvtase trên đối tượng vi sinh vật

27

J. Genetics and Applications - Speciaỉ Issue: Biotechnology
lnstitute o f M ỉcrobiology and Biotechnoỉogy, Vieínam National University, Hanoi


D i tru yền h ọc và ứ n g d ụ n g - ( 'huyên su n CôìiiỊ n g h ệ sin h h ọ c

Sổ 9 - 2014

Tsang [33]. Các cơ chất sử dụim gồm: uạo,

tách chiết theo Manitis [14]. Trình tự 1'DNA

ngô võ', đậu tương vỡ, gạo+bột đậu tưona,

26S đoạn D1/D2 được xác định theo phương

cám+trấu. naô vỡ+aạo. ngô vỡ+bột đậu tương,

pháp cùa Kurtman và Robnett [12] sử dụng

ngô võ'+cáin; malt+trấu (ti lệ 3:1).

máy đọc trình tự 3100 -

Avant Genetic

Analyzer và hóa chất cùa hãng AB Apply

- Môi trường tăng sinh nấm men: YM (ạ/1:
glucose - 10; cao men - 3; cao malt - 3;

Biosystem. So sánh và xử lý số liệu dùng
chương trinh máy tính CLUSTAL X. cùa

pepton - 5; pH 6,5); H ansen (g/1: glucose - 30;

Thompson và cs.. (1997). Các trình tự tham

pepton - 10 ; cao men - 1 ; MÍ1SO4 - 2 ;

khảo dùng trong nghiên cứu cây phát sinh

KH2PO4 - 3; pH 6.5); PDA (g/l: khoai tây -

chủng loại được lấy từ dữ liệu cùa GenBank.

200 , glucose - 10; pH 6,5); YDP (g/1: cao men

Cây phát sinh chùng loại được xây dựng theo

- 10 , pepton - 20 , glucose - 20; pH 6,5);

Kimura [10], sử dụng phương pháp cùa Saitou

T sang [33].

và Nei [25]; pliân tích bootstrap được thực
Anh hướiig cua muôi mật đèn sinh trưởng cua

hiện từ 1000 lần lặp lại ngẫu nhiên.

nấm men. Chùng nấm men được cấy eạt trên
Hoạt độ phylase: Xác định theo phương pháp

đĩa thạch YM có bồ sung thêm muối mật ỏ' các

cùa Shimizu [28].

nồng độ 1, 3, 5, 7, 9%. Đối chứng là đĩa thạch
YM không chứa muối mật. Sau 48 giò' quan

Nghiên cứu ánh hường cùa các yếu tố đến

sát mật độ và kích thước khuân lạc nấm men
trên đĩa thạch.

hoại động của phvlase. Nhiệt độ và pH tối ưu.
độ bền nhiệt, bền pH, bền ion kim loại được
tiến hành theo phương pháp như mô tả cùa

Anh hưởng cùa em ym e đường tiêu hóa đến

Gulati [4]. Ảnh hường của enzvme tiêu hóa

sinh trướng cùa ìiâni men. Tê bào chủng nấm

đến hoạt động của enzyme được thực hiện như

men được ủ trong dung dịch pepsin và trypsin

mô tả cùa Zhu [38].

ở 3 7 °c trong 1 giờ theo Zhu [38], sau đó cấy
gạt trẽn dĩa thạch YM, sau 48 giờ quan sát khả

KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

năng sinh trường của nấm men. Đồi chứna là

S àng lọc trên đĩa thạch: 127/415 chùng nấm

mẫu ủ với nước cất.

men sinh phytase trên đĩa thạch, trong đó 32
chủng có hoạt tính phytase mạnh (D-d>10

Phân loại nấm men

mm), 63 chùng có hoạt tính trung bình (5

- Quan sát hình thái khuẩn lạc và tế bào nam

mm
men theo phương pháp cùa Yarrovv [36].

yếu (D-d<5 mm), với D-d là đưòng kính vòng
- Phàn loại nấm men bằng sinh học phân tử:

trong phân giải cơ chất.

DNA tổng số của các chủng nấm men đưọc

\

.;■* * •

»

%

^

*' ■

gg

w-

#

*

# * 0 # *

V

...

ềl ý

Hình 1: Khả năng sinh phvtase của các chủng nấm men trên môi trưòng sàng lọc đĩa thạch
Sàng lọc trên m ôi trường dịch thể: 32 cliủng

phytate lớn trên môi trưòng đĩa thạch được

trong phân giải CO' chất

nuôi cấy trên môi trường dịch tliể Tsana, có 7
28

J. Genetics and Applications - Special Issue: Biotechnology
Insiiiute o f M icrobiology and Biotechnology, Vietnam National University, Hanoi