Luận án Tiến sĩ Sinh học Sàng lọc và nghiên cứu đặc điểm của một số chất kháng sinh và kháng ung thư từ xạ khuẩn biển Việt Nam

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHẠM THANH HUYỀN

SÀNG LỌC VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CỦA MỘT
SỐ CHẤT KHÁNG SINH VÀ KHÁNG UNG THƯ TỪ
XẠ KHUẨN BIỂN VIỆT NAM

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số:

62 42 01 07

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội, 2016

1


Công trình được hoàn thành tại Viện Công nghệ sinh học
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Lê Gia Hy
Viện Công nghệ sinh học
2. TS. Phí Quyết Tiến
Viện Công nghệ sinh học
Phản biện 1:

Phản biện 2:

Phản biện 3:

Luận án được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án phiên chính thức
tại Viện Công nghệ sinh học
Vào hồi …h … , ngày … tháng … năm 2016

Có thể tìm thấy luận án tại:
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
- Thư viện Công nghệ sinh học
- Trang web của Bộ GD&ĐT
2


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Hiện nay, chất kháng sinh và kháng ung thư vẫn được xem là nhóm
thuốc thiết yếu trong y học, có tác dụng tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh hoặc
ức chế tế bào ung thư. Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc kháng sinh không
theo chỉ định dẫn đến sự xuất hiện ngày càng nhiều các vi khuẩn đa kháng
thuốc và sự thiếu hụt các kháng sinh mới làm cho con người đang phải đối
mặt với “thời kỳ hậu kháng sinh”. Việt Nam và nhiều nước trên thế giới
đang phải đối mặt với các loại bệnh nhiễm khuẩn mới và bệnh do tác nhân
kháng thuốc do sử dụng thuốc kháng sinh một cách tùy tiện. Bên cạnh đó,
môi trường sống của con người đang bị ô nhiễm nghiêm trọng nên gia tăng
các loại bệnh ung thư. Vì vậy, việc tìm kiếm các loại kháng sinh mới và
các thuốc kháng tế bào ung thư được các nhà khoa học trên thế giới rất
quan tâm, đặc biệt là các loại được sản xuất từ các chủng xạ khuẩn biển.
Trong mục tiêu chung là phát hiện và phát triển các sản phẩm có hoạt
tính sinh học từ vi sinh vật biển nhằm ứng dụng trong lĩnh vực bảo vệ sức

khỏe con người, chúng tôi tiến hành đề tài: “Sàng lọc và nghiên cứu đặc
điểm của một số chất kháng sinh và kháng ung thư từ xạ khuẩn biển Việt
Nam” với các mục đích và nội dung chính sau đây:
1. Mục đích
- Sàng lọc được tập hợp các chủng xạ khuẩn biển Việt Nam có khả
năng sinh chất kháng sinh và kháng ung thư.
- Nghiên cứu đặc điểm sinh học của xạ khuẩn biển được lựa chọn, xác
định tính chất hóa lý, cấu trúc hóa học và khả năng ứng dụng của các các
hợp chất kháng sinh và kháng ung thư tổng hợp bởi xạ khuẩn.
2. Nội dung nghiên cứu
- Sàng lọc các chủng xạ khuẩn từ các vùng biển có khả năng kháng vi
sinh vật kiểm định và kháng tế bào ung thư.
- Xác định đặc điểm sinh học, đặc điểm phân loại của các chủng xạ
khuẩn lựa chọn.
- Nghiên cứu điều kiện lên men và thu nhận chất kháng sinh từ các
chủng đã được tuyển chọn trong.
3


- Nghiên cứu tách chiết, tinh sạch, tính chất hóa lý và khả năng kháng
khuẩn và kháng tế bào ung thư của chất kháng sinh.
- Bước đầu nghiên cứu cấu trúc của chất kháng sinh thu nhận được.
3. Những đóng góp mới của luận án
- Luận án thu nhận được tập hợp 70 chủng xạ khuẩn biển có hoạt tính
kháng khuẩn và kháng tế bào ung thư phục vụ cho sàng lọc các chất kháng
sinh và góp phần bảo tồn nguồn gen vi sinh vật biển của Việt Nam.
- Luận án là công trình nghiên cứu có hệ thống về chủng xạ khuẩn
biển Streptomyces variabilis HP411 phân lập ở Việt Nam (phân loại, lên
men, tách chiết, tinh sạch chất kháng sinh; dự đoán cấu trúc kháng sinh;
đánh giá khả năng kháng khuẩn và kháng tế bào ung thư của chất kháng

sinh thu được).
4. Bố cục của luận án
Luận án gồm 156 trang: Mở đầu (3 trang); Chương 1: Tổng quan tài
liệu (24 trang); Chương 2: Vật liệu và phương pháp (17 trang); Chương 3:
Kết quả (41 trang); Chương 4: Bàn luận kết quả nghiên cứu (15 trang); Kết
luận và kiến nghị (2 trang); Danh mục các công trình công bố (2 trang);
Tài liệu tham khảo (16 trang gồm 9 tài liệu tiếng Việt, 138 tài liệu tiếng
Anh và 02 tài liệu trên các trang mạng); Summary (11 trang); Phụ lục (25
trang).
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về vi sinh vật biển
1.2. Xạ khuẩn biển và các chất có hoạt tính dược học từ xạ khuẩn biển
1.2.1. Xạ khuẩn biển
1.2.2. Các chất có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn biển
1.3. Đặc tính của các chất có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn biển
1.3.1. Nghiên cứu thu nhận các chất kháng sinh từ xạ khuẩn biển
1.3.2. Nghiên cứu tách chiết và xác định đặc trưng của chất kháng sinh và
kháng ung thư
1.3.3. Nghiên cứu phân tích cấu trúc chất kháng sinh
4


1.3.4. Nghiên cứu và ứng dụng các chất kháng sinh và kháng ung thư từ vi
sinh vật biển
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu
Vật liệu nghiên cứu: Các mẫu nước và bùn được thu thập từ các vùng
ven biển Việt Nam; Các chủng vi sinh vật kiểm định nhận từ Bộ sưu tập
giống của Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học; Các dòng
tế bào ung thư được cung cấp từ Phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa

học các hợp chất thiên nhiên, phòng Công nghệ tế bào động vật, Viện
Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và
Khoa Molecular Oncology thuộc Viện Ung thư Chennai, Ấn Độ.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
1. Xác định thành phần và số lượng vi sinh vật trong mẫu (Egorov,
1976).
2. Xác định hoạt tính kháng sinh: sử dụng phương pháp khuếch tán
trên thạch của Barry (Barry và Thornsberry, 1985); phương pháp xác định
nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) sự tăng trưởng thấp nhất của kháng sinh
với vi sinh vật (Jennifer, 2006) và nồng độ ức chế vi khuẩn tối thiểu
(MBC) của chất kháng sinh (Jennifer, 2006).
3. Xác định hoạt tính gây độc tế bào phương pháp MTT (Van và
Vlietlinck, 1991) và phương pháp SRB (Likhiwitayawuid et al., 1993) với
nguyên lý đo sự tăng sinh và sống sót của tế bào thử nghiệm in vitro. Các
dòng tế bào được nuôi cấy theo phương pháp của Skehan và cs (1991).
4. Xác định đặc điểm sinh học của xạ khuẩn theo Waskman (1962);
Tresner và Backus (1963) và định tên xạ khuẩn theo Sổ tay phân loại vi
sinh vật của Bergey (Stanley et al., 1989) và Chương trình xạ khuẩn quốc
tế (ISP) (Shirling và Gottlieb, 1966).
5. Phân loại vi sinh vật bằng phân tích trình tự gen mã hóa 16S rRNA
theo Sambrook và cộng sự (1989); So sánh độ tương đồng bằng phần mềm
CLUSTL_X (Thompson et al., 1997); xác định khoảng cách di truyền theo
Kimura (1980), phương pháp Neighbor-joining (Saitou và Nei, 1987),
5


phân tích Bootstrap của cây phát sinh chủng loại được tính với 1000 mẫu
thử (Felsenstein, 1985).
6. Nghiên cứu điều kiện lên men kháng sinh thích hợp cho các chủng
xạ khuẩn theo Cornick và McGuire (1962); Yu (2008); Gao (2009);

Krishnaraj và Mathivanan (2009). Tối ưu hóa môi trường theo phương
pháp RSM với thiết kế phức hợp tại tâm (CCD-Central Composit design)
(www.DX7.com).
7. Tách chiết chất kháng sinh bằng dung môi ethyl acetate (Liu et al,
1986).
8. Xác định tính chất hóa lý các chất có hoạt tính kháng khuẩn từ dịch
lên men xạ khuẩn theo các phương pháp sắt ký, phân tích cấu trúc bằng
các phổ IR, LC-MS, ESI-MS, HPLC và NMR theo Nguyễn Đình Triệu
(2001).
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Sàng lọc xạ khuẩn biển có hoạt tính kháng sinh
3.1.1. Sàng lọc xạ khuẩn biển có hoạt tính kháng sinh
Từ 97 chủng xạ khuẩn phân lập được có 70 chủng có hoạt kháng
khuẩn chiếm 72,16%, trong đó ức chế vi khuẩn B. subtilis ATCC 6633 cao
nhất chiếm 47%, sau đó vi khuẩn E. coli ATCC 11105 chiếm 44,3% và
nấm men C. albicans 10231 chiếm 17,5% số chủng. Trong đó, lựa chọn 16
chủng có hoạt tính mạnh và kháng từ 2 chủng vi sinh vật kiểm định trở lên
dùng cho nghiên cứu tiếp theo với định hướng sàng lọc được các hoạt chất
sinh học mới ứng dụng trong y dược.
3.1.2. Sàng lọc các chủng xạ khuẩn biển có hoạt tính kháng sinh cao
Trong các chủng có khả năng đối kháng với các chủng vi sinh vật
kiểm định, 16 chủng có hoạt tính mạnh và kháng từ 2 chủng vi sinh vật
kiểm định trở lên được lựa chọn nghiên cứu tiếp theo với định hướng sàng
lọc được các hoạt chất sinh học ứng dụng trong y dược
3.2. Đặc điểm sinh học và phân loại các chủng xạ khuẩn biển
3.2.1. Đặc điểm sinh học của các chủng xạ khuẩn
6


Dựa trên quan sát màu sắc khuẩn ty cơ chất, khuẩn ty khí sinh, sắc tố

tan trên 7 môi trường ISP và hình thái cuống sinh bào tử, bề mặt bào tử để
phân loại đã nghiên cứu đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy của 16
chủng xạ khuẩn được lựa chọn.
Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa của 16 chủng xạ khuẩn như khả
năng sử dụng nguồn carbon, khả năng sử dụng nguồn nitơ, ảnh hưởng của
nhiệt độ và pH, ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl của 16 chủng xạ
khuẩn.
3.2.2. Phân loại các chủng xạ khuẩn biển
a. Phân loại theo đặc điểm sinh học
Đặc điểm sinh học của 16 chủng xạ khuẩn lựa chọn được so sánh các
chỉ tiêu phân loại theo các Khóa định tên loài xạ khuẩn của Nomomura
(1976), Khoá phân loại Gause (1983) và Bergey’s (1989) cho thấy, các
chủng nghiên cứu phần lớn thuộc chi Streptomyces (15 chủng) và 1 chủng
thuộc chi Nocardiopsis.
Kết quả định tên loài các chủng xạ khuẩn biển như sau: (1) Chủng
HLĐ3.16 có đặc điểm giống loài S. autotrophicus, dạng chủng aa-1-1; ISP
5011 nhóm A-2; (2) Chủng NA1132 giống loài S. rutgersensis dạng chủng
là IMRU 3350, ký hiệu ISP 5077, nhóm A- 9; (3) Chủng NA1134 giống
loài S. finlaryi, ký hiệu ISP 5218, nhóm B-12; (4) Chủng NA113 giống
loài S. scabies dạng chủng là IMRU 3018, ký hiệu ISP 5058, nhóm B-4;
(5) Chủng NA115 giống loài S. tendae dạng chủng ETH 11313, ký hiệu
ISP 5101, nhóm A-10; (6) Chủng NA116 giống loài S. galbus, ký hiệu ISP
5089, nhóm B-5; (7) Chủng HP112 gần giống với chủng chuẩn S.
litmocidini ISP 5164, dạng chủng 1823155, thuộc nhóm A-8; (8) Chủng
HP411 gần giống với chủng chuẩn S. variabilis ISP 5179 thuộc nhóm A-5;
(9) Chủng HPN11 gần giống với chủng chuẩn S. griseoincanatus ký hiệu
ISP 5274, nhóm B12; (10) Chủng HPX12 giống loài S. griseorubens dạng
chủng P-638, ISP 5160; (11) Chủng VD111 gần giống với chủng chuẩn S.
albogriseolus ISP 5003, nhóm A-2; (12) Chủng VD112 gần giống với cả 2
chi Streptomyces và Nocardiopsis, do đó cần xác định trình tự gen của

chủng để có thể định tên đến chi, loài cụ thể; (13) Chủng VD114 giống với
loài S. achromogenes, dạng chủng Z-4-1, ký hiệu ISP 5014 nhóm A-1;
7


(14) Chủng VD115 giống với loài S. eurythermus, ký hiệu ISP 5028 nhóm
A-1; (15) Chủng C141 giống loài S. matensis, ký hiệu ISP 5188, nhóm A13 và (16) Chủng TB5.3 mang nhiều đặc điểm giống với chủng chuẩn S.
viridodiastaticus ISP 5249, thuộc nhóm A-5.
b. Phân loại theo phân tích trình tự gen 16S rDNA
Kết quả phân loại phân tích trình tự gen 16S rDNA cho thấy, trong số
các chủng nghiên cứu có 7 chủng có độ tương đồng <90% và 8 chủng có
độ tương đồng >98% đến loài thuộc chi Streptomyces và 1 chủng thuộc chi
Nocardiopsis.
Như vậy, kết hợp cả đặc điểm sinh học và phân tích trình tự gen đã
cho kết quả định tên đến loài được 9 chủng xạ khuẩn như sau: (1) chủng
NA113 được định tên là Streptomyces scabiei NA113, (2) chủng NA115
định tên là S. tendae NA115, (3) chủng NA116 định tên là S. coelicoflavus
NA116, (4) chủng HP411 định tên là S. variabilis HP411; (5) chủng
HPN11 định tên là S. griseoincarnatus HPN11, (6) chủng HPX12 định tên
là S. griseorubens HPX12, (7) chủng VD11 định tên là S. albogriseolus
VD111, (8) chủng TB5.3 định tên là S. viridodiastaticus TB5.3 và (9)
chủng VD112 đinh tên là Nocardiopsis sp. VD112. Các chủng này được
sử dụng nghiên cứu tiếp.
3.3. Nghiên cứu thu nhận chất kháng sinh từ xạ khuẩn biển
3.3.1. Lựa chọn môi trường lên men thích hợp
Các môi trường lên men sinh tổng hợp kháng sinh được lựa chọn cho
các chủng như sau:
- MT7 (g/l): Glucose 5, tinh bột tan 10 và peptone 4, thích hợp cho
chủng NA113.
- A4H (g/l): Glucose 10 và bột đậu tương 15, thích hợp cho các chủng

NA115 và C141.
- M1ASW(g/l): Tinh bột tan 10, cao men 4, và pepton 4, thích hợp cho
các chủng HP411, HPN11, HPX12, VD111 và TB5.3.
Các chủng được nhân giống trong môi trường M1ASW và ISP2, tỷ lệ
tiếp giống 5% ở 48 giờ nuôi, lên men trong bình với 20% môi trường lên
men so với thể tích bình trên máy lắc 220 v/phút trong 120 giờ.
8


3.3.2. Thu nhận chất kháng sinh của các chủng xạ khuẩn
Dịch lên men các chủng xạ khuẩn được chiết trong dung môi ethyl
acetate có khả năng chiết được chất kháng khuẩn cao nhất với tỷ lệ dung
môi ethyl acetate và dịch lên men là 2:1.
3.3.3. Hoạt tính sinh học của các chất kháng sinh sau khi tách chiết
a. Hoạt tính kháng vi sinh vật
Kết quả xác định hoạt tính kháng sinh của các chất kháng sinh thô
(Bảng 3.13) cho thấy, ngoài chủng C141, các chủng khác đều có phổ
kháng khuẩn rộng, ức chế cả vi khuẩn kháng kháng sinh và nấm Candida
albicans.
Bảng 3.13. Hoạt tính kháng sinh của chất thô các chủng xạ
khuẩn với vi sinh vật kiểm định
VSV
kiểm định

Vòng kháng khuẩn (mm)
NA
113

NA
115

HP
411

25

24

40

20

20

21,9

0

43,4

22,7

17,4

31,2

0

32,6

Salmonella typhy ATCC
14028

9

0

0

0

0

0

0

0

Salmonella typhy IFO 14193

15

19

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

B. subtilis ATCC 6633
Enterococcus faecalis ATCC
29212

E. aerogenes ATCC 13048
Alcaligenes faecallis

13,6 13,2 23,1
0

S. lutea M5

HPN HPX
11
12

VD C1
111 41

TB
5.3

17,5 18 24,6

12

0

0

0

10

14

0

0

17,6 15 24,3

B. cereus ATCC 11778

20,7

21

40

0

19,5

17,2 13 17,2

S. typhimurium ATCC 14028

21,5

0

40

0

14,8

20,8

0

24,5

E. coli ATCC 25922

16,4

17

45,3

24

19

17,7

9

22,7

A. baumannii ATCC 19606

23,7

0

40,2

19,8

20,8

16,8

0

29,1

K. pneumoniae ATCC 13883

22,4

0

44,7

18,6

20,5

19,3

0

28,6

S. aureus ATCC 29213

11,4

0

40,1

13,6

14,8

20,8

0

24,5

S. aureus (MRSA)

50,1 21,5 50,1

18,7

20,8 24,2

S. epidermidis ATCC 12228

26

22

21

20

18

19

0 28,5
9

21
9


S. epidermidis (MRSE)

17,5

0 49,5

16,3

18,2 23,8

0 21,6

Aeromonas hydrophila
THWQJ

23,6

0 54,3

21,7

22,1 29,4

0 30,1

C. albicans ATCC 10231

21,9

16

17,4 16,8

0 16,8

15

44

b. Khả năng gây độc tế bào
Nghiên cứu khả năng gây độc tế bào của các chất kháng sinh thô
(Bảng 3.15) cho thấy, 5 chất của các chủng HP411, HPN11, HPX12,

VD111 và TB5.3 không gây độc với dòng tế bào lành tính Hek ở giá trị
40µg/ml. Ở hàm lượng này chất thô của 2 chủng VD111 và TB5.3 có khả
năng gây độc với dòng tế bào ung thư M14 và HeLa với khả năng sống sót
của tế bào lần lượt là 45,05 và 22,1%; 39,40 và 38,56%.
Bảng 3.15. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào giá trị IC50 từ chất kháng
sinh của các chủng
Ký hiệu
mẫu

µg/ml)
Giá trị IC50 trên các dòng tế bào (µ
HepG2

MCF7

RD

FL

Hek293

M14

HeLa

NCIH
460

Chứng
(+)

0,19

0,15

0,22

0,18

1,3

0,4

1,2

2,1

NA113

4,55

36,45

1,39

2,1

34,71

14,10

>40

-

NA 115

4,15

>40

2,68

5,67

-

-

-

-

HP411

13,73

>40

4,41

12,6

-

-

>40

-

HPN11

-

34,25

-

-

-

-

-

-

HPX12

6,01

25,08

5,53

8,83

-

-

-

3,93

VD111

3,72

27,99

17,94 10,97

-

26,04

14,59

-

C141

2,74

30,16

21,01 20,50

TB5.3

-

-

-

29,56

29,93

-

-

-

Chất kháng sinh thô của chủng xạ khuẩn HPX12 có khả năng diệt tế

bào hơn 90% ở nồng độ 40µg/ml, còn chủng NA113 có khả năng diệt cả tế
bào lành Hek293 với khả năng sống sót 45,05% và tế bào ung thư M14 là
17,05% ở cùng nồng độ 40µg/ml.
3.3.4. Một số đặc trưng của các chất kháng sinh
a. Hệ số di chuyển Rf trên sắc ký giấy
10


Rf trên sắc ký giấy của các chất kháng sinh được trình bày trên bảng
3.19 cho thấy, các chất kháng sinh có hệ số di chuyển Rf khác nhau, các
chất này có thể khác nhau.
Bảng 3.19. Giá trị Rf của các chất kháng sinh trên sắc ký giấy
Tên chủng

Giá trị Rf

Sai số

Tên chủng

Giá trị Rf

Sai số

NA113

0,765

0,005

HPX12

0,85

0,02

NA115

0,825

0,005

VD111

0,78

0,01

HP411

0,92

0,01

C141

0,75

0,01

HPN11

0,86

0,01

TB5.3

0,90

0,01

b. Phân tích bằng phổ IR
Kết quả đo phổ IR các chất kháng sinh với mục tiêu dự đoán cấu trúc
phân tử và xác định các nhóm chức đặc trưng có mặt trong các chất thô
như sau: Trong chất kháng sinh của HP411 có mặt 2 liên kết –NH và CN,
chất kháng sinh của NA113 có liên kết keton, C=O, NR2, =C-H và =CH2;
chất kháng sinh của VD115 có C=N, vòng benzen có nhóm halogen;
HPX12 có nhóm amin vòng 5 và C-H; chất kháng sinh của VD111 có
nhóm ketone, liên kết R-N=O và cis-RCH=CHR; chất kháng sinh của
NA115 có liên kết C-H mạch thẳng, có nhóm aldehyde C-H và cisRCH=CHR; chất kháng sinh của C141 và HPN11 có liên kết của nhóm
ketone và cấu trúc nhóm nitro.
c. Tinh sạch chất kháng khuẩn trên cột trao đổi ion
Kết quả đối với chủng NA113 cho thấy khả năng hấp phụ trên cột
Dowex 50 H+ ở phân đoạn 8-12. Chất kháng khuẩn của HP411 có khả
năng hấp phụ cao nhất ở phân đoạn 2 và 3 của cột H+, các phân đoạn sau
có hoạt tính nhưng thấp. Trên cột Cl- mẫu cũng có khả năng cố định, hoạt
tính ở phân đoạn 1- 5 là cao nhất, trên 23 mm. Kết quả đối với chất kháng
khuẩn của chủng HPX12 cho thấy trên cột H+ phân đoạn 1-4 có hoạt tính
kháng khuẩn cao >22 mm.

c. Phân tích bằng sắc ký lớp mỏng (TLC)
Kết quả nghiên cứu phân tích bằng sắc ký lớp mỏng trên 5 hệ dung
môi khác nhau thì hệ dung môi Isopropanol : Acid acetic : Nước ( 3 : 1 : 1)
và 2- Butanol : Acid acetic : Nước (4 : 1: 2) phân tách rõ ràng nhất.
11


Kết quả phân tích các chất có phản ứng với các chất hiện mầu trên
TLC cho thấy, trong cấu trúc của các chất tách từ các chủng xạ khuẩn
HP411, HPX12, NA113 và TB5.3 có mặt các nhóm chức khác nhau như:
benzophenon, antracen và thiol... (Bảng 3.24) với các giá trị Rf khác nhau
trên
cùng
hệ
dung
môi
theo
/>Bảng 3.24. Dự đoán sơ bộ các nhóm chất có mặt trong chất
kháng sinh thô của 4 chủng xạ khuẩn
Dự đoán nhóm liên kết qua phản ứng màu
Chất thô
của các
chủng
xạ
khuẩn

NA113

UV:
Benzoph

enone,
Antrace
ne

+

KMnO4 + (alcohol,
ether, ester, alkene,
alkyne, ketone, alkyl
aromatic,
carboxylic
acid, amine, amide): màu
nâu- nhóm chất 1
KMnO4
+
(thiols,
phosphines): không màu

Iodine
(chuyển
màu
nâu)

Nynhydrin +
R2CH-NH2=
Màu + R2C=O

Cả 2 nhóm chất

Nhóm R-SH

Nhóm -NH2, có
nhóm glutamin,
có -COOH
Nhóm –NH, có
vòng benzen, COOH

HP411

+

Cả 2 nhóm chất

Nhóm R-SH

HPX12

+

Nhóm chất 1

Nhóm R-SH

Có liên kết
threonine

+

Nhóm chất thiols hoặc
phosphines

Nhóm R-SH

Có nhóm lysine
(-NH2, -COOH,
-NH2)

TB5.3

Tổng hợp các nghiên cứu trên cho thấy, trong chất kháng sinh thô của
các chủng xạ khuẩn có nhiều hơn một chất. Với các ưu điểm của HP411
trong tách chiết cũng như hiệu quả diệt vi sinh vật gây bệnh và gây độc các
dòng tế bào ung thư nên được lựa chọn nghiên cứu tiếp.
3.4. Nghiên cứu lên men thu nhận chất kháng sinh của chủng HP411
3.4.1. Tối ưu hóa môi trường lên men
12


Dựa vào kết quả nghiên cứu trên, chọn miền khảo sát được trình bày
như trong bảng 3.25 để tối ưu môi trường lên men chủng HP411.
Bảng 3.25. Các yếu tố biến đổi của thành phần môi trường lên men
Biến ảnh hưởng
Nồng độ tinh bột tan
Nồng độ cao nấm
men
Nồng độ pepton

Ký
hiệu
X1

Đơn
vị
g/l

-α
8,32

X2

g/l

X3

g/l

-1
9

Mức
0
10

+1
11

+α
11,68

2,32

3

4

5

5,68

3,32

4

5

6

6,68

Sau khi nhập số liệu thí nghiệm vào phần mềm tối ưu DX7, thu được
kết quả phân tích số liệu, thiết lập được phương trình tối ưu với giá trị tính
hoạt tính kháng khuẩn là Y như sau:
Y = 33,32 + 0,11*A + 1,52*B – 0,24*C + 0,31*A*B + 0,39*A*C –
2,20*A2 – 1,51*B2 – 0,78*C2

Hình 3.11. Bề mặt đáp ứng có hàm lượng chất kháng khuẩn (khả năng đối
kháng với vi khuẩn kiểm định) tương quan với các biến. A. Sự tương tác
giữa tinh bột tan và pepton; B. Peptone và cao nấm men; C. giữa cao nấm
men và tinh bột tan.
Như vậy, kết quả thực nghiệm cho thấy giá trị “Model-F-value” là

10,15 và mô hình hoàn toàn có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 99,94%
(p=0,0006), mô hình hoàn toàn tương thích với thực nghiệm (p= 0,5708).
Khảo sát tác động cho thấy nồng độ cao nấm men có tác động rất lớn tới
hoạt tính kháng sinh của chủng xạ khuẩn HP411. Kết quả phân tích
ANOVA cho thấy giá trị R2 là 0,9013 gần bằng 1, chứng tỏ giá trị hoạt
tính kháng sinh thu được từ thực nghiệm gần với giá trị dự đoán của mô
hình.
13


Hoạt tính kháng khuẩn (mm)

Phương án tối ưu nhất là số 32 trong 39 phương án, hoạt tính kháng
sinh đạt được theo mô hình tối ưu là 33,70 mm, với thành phần môi trường
(g/l) là: Tinh bột tan 10,01; cao nấm men 4,61 và peptone 4,65. Kết quả
này đã được kiểm chứng với hoạt tính đạt được là 34,6mm.
3.4.2. Động thái quá trình lên men
Kết quả nghiên cứu động thái quá trình sinh trưởng, phát triển và sinh
chất kháng sinh của chủng HP411 trên môi trường M1ASW-32 đã được
tối ưu (Hình 3.15 và 3.16) cho thấy, sinh khối đạt cao nhất ở 84 giờ và
hoạt tính kháng sinh cao nhất ở 96 giờ lên men.
40
35
30
25
20
15
10
5
0

25
20
15
10
5
0
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108120132

Thời gian lên men (h)

VKK (mm)
Sinh khối (mg/ml)
pH

Hình 3.15. Động thái quá trình lên men
sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng
HP411.

Hình 3.16. Khả năng ức chế vi
sinh vật của chất kháng sinh
chủng HP411.

3.5. Phân tích cấu trúc chất kháng sinh của chủng HP411
3.5.1. Phân tích cấu trúc chất kháng sinh
Sơ đồ quy trình phân tích chất kháng sinh thô của chủng HP411 được
trình bày trên hình 3.22.

14

Hình 3.22. Quy trình phân lập từ cặn chiết tổng và tinh chế hợp
chất HPE 2.4.
Kết quả phân tích các phân đoạn tách chiết như sau:
- Phân đoạn HPE1.6 thu được một chất acid béo.
- Phân đoạn HPE 1.9 được xác định là có hoạt tính kháng sinh nên
phân đoạn này được chọn để tiếp tục phân tách trên cột sắc ký pha thường
với hệ dung môi rửa giải Hexan-Aceton có tỷ lệ thể tích là 5/1. Trên phân
đoạn HPE1.9 được tách rồi tinh chế lại trên cột sắc ký pha thường với hệ
dung môi rửa giải Hexan-Diclometan-Aceton có tỷ lệ thể tích là 15/15/1
thu được 5 phân đoạn chất có ký hiệu HPE2.1- 2.5. Trong đó thu được các
chất sạch là HPE2.4 có khối lượng 16mg. Chất HPE2.4 được sử dụng để
xác định cấu trúc NMR.
- Phân đoạn HPE1.10 phân lập được một chất là HPE3.4 có khối
lượng 2 mg. Lượng chất sạch của HPE3.4 ít nên không đủ để xác định cấu
trúc.
15


- Hợp chất HPE 2.4 có dạng bột màu vàng. Trên phổ khối lượng xuất
hiện tín hiệu [M + H]+ tại m/z 225.1 cho phép dự đoán công thức phân tử
là C13H8N2O2 (Hình 3.16).

Hình 3.16. Phổ ESI-MS của HPE 2.4.

Hình 3.17. Phổ 1H-NMR của HPE 2.4.

16

Hình 3.18. Phổ 1H-NMR giãn rộng của HPE 2.4.

Hình 3.26. Phổ 13C-NMR của HPE 2.4.

Hình 3.27. Phổ DEPT90, DEPT135 và 13C NMR của HPE 2.4.
17


Bảng 3.30. Dữ liệu phổ của hợp chất HPE2.4 được so sánh với chất
Tubermycin B
*δ
δC, ppm
δC, ppm
δH, ppm
124.9,C
124.93, C
1
137.4, CH
137.41, CH
9.0; dd; J= 1.0, 8.5Hz
2
130.3, CH
130.27, CH
8.06; m
3
135.1, CH
135.09, CH
8.54; dd; J= 1.0, 8.5Hz
4
143.4, C

143.36, C
4a
139.8, C
139.83, C
5
128.0, CH
127.96, CH
8.29; dd; J= 1.0, 8.5Hz
6
133.2, CH
133.21, CH
8.03; m
7
131.7, CH
131.73, CH
7.99; m
8
130.1, CH
130.27, CH
8.36; dd; J= 1.0, 8.5Hz
9
144.1, C
144.07, C
9a
140.1, C
140.04, C
10
165.9, C
165.91, C
COOH

Ghi chú: *δC là độ dịch chuyển hóa học của chất Tubermycin B đã được công bố.
Vị trí

Dựa vào các dữ kiện trên, so sánh với số liệu đã công bố trước đây
(Samina et al., 2013), có thể thấy chất HPE 2.4 có cấu trúc gần giống với
cấu trúc của Tubermycin B (hay 1-Phenazinecarboxylic acid).

Hình 3.28. Tương tác HMBC của
HPE2.4.

Hình 3.29. Cấu trúc của HPE2.4.

3.5.2. Kiểm tra hoạt tính sinh học của chất kháng sinh
Chất kháng sinh HPE2.4 được kiểm tra hoạt tính kháng sinh với 3
chủng vi sinh vật gây bệnh (Bảng 3.31) và hoạt tính gây độc với 5 dòng tế
bào (Bảng 3.32).

18


Bảng 3.31. Khả năng diệt khuẩn của HPE2.4 với các chủng vi
khuẩn gây bệnh
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của HPE2.4 (µg/ml)
S. aureus MRSA
ATCC 25923

S. epidermidis
A. hydrophila C. albican
MRSE ATCC 35984 THWQJ
ATCC 10231

71,25 ± 0,12

20,83 ± 0,01

51,61 ± 0,05

2,96 ± 0,08

Bảng 3.32. Khả năng gây độc với các dòng tế bào của HPE2.4
Giá trị IC50 trên các dòng tế bào (µ
µg/ml)

Ký hiệu mẫu
Hek

MCF7

A549

Hela

Đối chứng (+) 0,11± 0,05 1,5± 0,12 1,93±0,03 5,28 ±0,13
HPE2.4

Hep-G2
3,66 ± 0,1

35,2± 0,21 6,15±0,04 6,91±0,12 6,84± 0,15 9,28±0, 07

CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ
4.1. Sàng lọc vi sinh vật biển có hoạt tính kháng sinh
Kết quả nghiên cứu này cho thấy, số lượng xạ khuẩn có hoạt tính đối
kháng với vi sinh vật gây bệnh chiếm khoảng 67,9%. Điều này cho thấy
tiềm năng ứng dụng của các chất có hoạt tính kháng sinh của xạ khuẩn
biển trong y dược (Berdy, 2005; Das et al., 2006; Lam, 2006). Trong số
các chủng nghiên cứu đã lựa chọn được 16 chủng xạ khuẩn có hoạt tính
đối kháng cao để nghiên cứu sàng lọc các hoạt chất ứng dụng trong y
dược.
4.2. Đặc điểm sinh học và phân loại các chủng xạ khuẩn biển
Theo các tài liệu đã nghiên cứu về xạ khuẩn, việc xác định đặc điểm
sinh học là cần thiết để phân loại và định tên các chủng xạ khuẩn (Nguyễn
Lân Dũng và cs, 1998; Lê Gia Hy, 1994, 2010; Rajeswari et al., 2014).
Trong nghiên cứu này, 16 chủng xạ khuẩn đã được phân loại đến loài,
trong đó 15 chủng thuộc chi Streptomyces và 1 chủng thuộc chi
Nocadiopsis. Điều này cũng phù hợp với các công bố trên thế giới, các
chất có hoạt tính dược học thu được phần lớn do chi Streptomyces sản sinh

19


ra, chi này được coi như một nguồn cung cấp chính để phát triển các loại
thuốc mới hiện nay (Shin et al., 2008, 2010).
4.3. Nghiên cứu thu nhận chất kháng sinh từ xạ khuẩn biển
Trong nghiên cứu thu nhận chất kháng sinh từ xạ khuẩn biển cho thấy,
cần phải nghiên cứu lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp nhất cho lên
men sinh chất kháng sinh (Jensen et al., 2005; Rath et al., 2005; Ilic et al.,
2007; Han et al., 2009). Dung môi cho chiết tách sử dụng là ethyl acetate
(Gailliot, 1998; Wanner, 2009; Rofiq và Bambang 2010; Ravikumar et al.,
2012; Rajeswari et al., 2014). Ưu điểm của việc sử dụng ethyl acetate có

thể được loại bỏ khi cô ở nhiệt độ dưới 60oC.
Các chất kháng sinh thô được kiểm tra khả năng đối kháng với các vi
sinh vật gây bệnh cho thấy, phần lớn chúng có hoạt phổ kháng khuẩn rộng,
ức chế mạnh các vi sinh vật gây bệnh như: Salmonella typhimurium ATCC
14028, Escherichia coli ATCC 25922, Sarcina lutea M5, K. pneumoniae
ATCC 13883, Bacillus cereus ATCC 11778, Enterobacter aerogenes
ATCC 13048; Acinetobacter baumannii ATCC 19606; Staphylococcus
aureus ATCC 29213; Aeromonas hydrophila THWQJ; Candida albicans
ATCC 10231, đặc biệt là khả năng ức chế hai chủng vi khuẩn gây bệnh
kháng thuốc MRSA ATCC 25923 và MRSE ATCC 35984.
Quá trình tìm kiếm và phát triển các hợp chất mới có tiềm năng trong
điều trị bệnh ung thư từ các chủng xạ khuẩn biển sẽ gia tăng cơ hội để phát
triển các loại thuốc mới cho y dược (Li et al., 2006; Kwon et al., 2006;
Shin et al., 2008, 2010). Trong nghiên cứu của luận án cho thấy, chất của
chủng TB5.3 không có khả năng gây độc với 4 dòng tế bào ung thư là
Hep-G2, MCF7, RD và FL. Chất thô của chủng HPN11 chỉ có khả năng
gây độc với dòng tế bào MCF7 với lượng tế bào sống sót là 43,64%. Chất
thô thu được từ chủng HP411 và NA115 có hoạt tính gây độc với 3 dòng
tế bào Hep-G2, RD và FL và không gây độc dòng tế bào MCF7. Tuy
nhiên, chất thô của chủng HP411 lại không có khả năng gây độc với dòng
tế bào M14 và NCIH460.
Trên các nghiên cứu phân tích phổ IR cũng như kết quả sắc đồ trên
bản mỏng (TLC) cho thấy có sự xuất hiện của nhiều chất khác nhau. Trong
chất thô của các chủng xạ khuẩn cho thấy đây là các sản phẩm thứ cấp, do
20


đó trong nghiên cứu tách chiết và tinh sạch được các chất kháng sinh cần
phải trải qua nhiều bước khá phức tạp: lựa chọn hệ dung môi cho phù hợp.
Trong các nghiên cứu đã đưa ra được dự đoán được ít nhất 2- 3 chất có

mặt trong các chất kháng sinh thô; các chất đó cũng đã được dự đoán một
số các liên kết như amin/amino, có vòng benzen, có nhóm S-S, có nhóm
OH, COOH nhóm chức có mặt trong và tuy nhiên do kinh phí cũng như
thời gian nên luận án chỉ tiến hành tinh sạch và xác định đối với chất
kháng sinh của chủng xạ khuẩn HP411.
4.4. Nghiên cứu lên men thu nhận chất kháng sinh của chủng HP411
Trong nghiên cứu này, nghiên cứu tối ưu điều kiện lên men được thực
hiện bằng phương pháp tối ưu đáp ứng bề mặt để lên men sinh chất kháng
sinh của chủng S.variabilis HP411, sau đó dựa vào phần mềm xây dựng
lên phương trình tối ưu nhất cho sinh chất kháng khuẩn. Phân tích sự phù
hợp của các thí nghiệm tối ưu hóa của chủng xạ khuẩn biển HP411 được
đánh giá là mô hình hoàn toàn có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 99,94%
và cả 3 yếu tố trên đều có ảnh hưởng tới hoạt tính kháng sinh của chủng
HP411.
Kết quả nghiên cứu động thái lên men của chủng xạ khuẩn HP411 cho
kết quả, thời gian đạt hoạt tính kháng sinh cao nhất tại 96 giờ, hoạt tính
kháng khuẩn đạt 34,6 mm. Đây sẽ là thời gian thích hợp thu dịch lên men
để tách chiết chất kháng sinh của chủng này.
4.5. Phân tích cấu trúc chất kháng sinh của chủng HP411
Chất kháng sinh thô của HP411 được tinh sạch theo quy trình ở hình
3.27 thu được: Một acid béo, 2 chất tinh là HPE2.4 và HPE3.4. Chất
HPE2.4 được dự đoán công thức phân tử là C13H8N2O2.
Số liệu phổ của HPE2.4:
1
H-NMR (500 MHz, CDCl3), δH (ppm):8.99 (1H, dd,J= 1.0, 8.5Hz,
H-2), 8.06 (1H, m, H-3), 8.54 (1H,dd, J = 1.0, 8.5 Hz, H-4), 8.29 (1H,dd, J
= 1.0,8.5Hz, H-6), 8.03 (1H, m, H-7), 7.99 (1H, m, H-8), 8.36 (1H,dd,J =
1.0,8.5Hz, H-9).
13
C-NMR (500 MHz, CDCl3), δC (ppm): 124.93 (C-1); 137.41 (C-2);

130.27 (C-3); 135.09 (C-4); 143.36 (C-4a); 139.83 (C-5); 127.96 (C-6);
21


133.21 (C-7); 131.73 (C-8); 130.27 (C-9); 144.07 (C-9a); 140.04 (C-10);
165.91 (COOH).
ESI-MS (positive): m/z 225.1[M + H]+.
Dựa vào số liệu phổ NMR cho thấy chất HPE2.4 thuộc nhóm
phenazine, so sánh với một số tài liệu đã công bố trước đó cho thấy chất
HPE2.4 có nhiều đặc điểm gần giống với chất Tubermycin B (1Phenazinecarboxylic acid, viết tắt là PCA) (Samina et al., 2013) (Bảng
3.30). Theo một số nghiên cứu, năm 1961 Nagatsu và cộng sự đã tìm ra
chất kháng sinh này và đặt tên là Tubermycin B, chất này được sinh ra từ
chủng xạ khuẩn S. amakuaensis now. sp. (Nakamura et al., 1961). Tuy
nhiên, chất tubermycin B hay PCA là một dẫn xuất thuộc nhóm phenazine
và chỉ có hoạt tính kháng nấm gây bệnh cho thực vật được sử dụng trong
nông nghiệp. Chất PCA đã được thử khả năng gây độc tế bào nhưng không
có hoạt tính gây độc với các dòng tế bào ung thư (Gurusiddaiah et al,
1986).
Các hợp chất này có tiềm năng trong ứng dụng công nghệ sinh học
như: phản ứng oxy hóa khử trong tế bào, có hoạt tính chống u, hoạt tính
kháng khuẩn, gây độc với tế bào ung thư (Gebhardt et al., 2002; Kamal et
al., 2012). Các chất phenazine được sinh ra từ nhiều chủng vi sinh vật
khác nhau, trong đó có xạ khuẩn và vi khuẩn. Chủng xạ khuẩn biển
Nocardia dassonvillei BM-17 có khả năng sinh N-(2-hydroxyphenyl)-2phenazine (NHP) và 6 chất kháng sinh, các chất này có hoạt tính kháng
nấm Candida albicans và có khả năng gây độc với các dòng tế bào
HepG2, A549, HCT-116 và COC1 (Gao et al., 2012). Theo như Saleh et
al., 2012 và Ramos et al., 2010, thì các chủng xạ khuẩn thuộc chi
Streptomyces là S. anulatus 9663 (Saleh et al., 2012), S. cinnamonensis
(Haagen et al., 2006), S. lomondensis (Johnson và Dietz, 1969) và S.
misakiensis (Nakamura, 1961) có khả năng sinh kháng sinh PCA.

Hoạt tính sinh học của chất HPE2.4 của chủng HP411 có nhiều đặc
điểm khác biệt so với chất tubermycin đã được công bố, đặc biệt là hoạt
tính sinh học. Hoạt tính kháng vi sinh vật gây bệnh của HPE2.4: chất có
hiệu quả diệt vi khuẩn gây bệnh S. aureus MRSA ATCC 25923. S.
epidermidis MRSE ATCC 35984 và C. albican ATCC 10231 với các giá
22


trị IC50 khác nhau lần lượt là 71,25; 20,83 và 2,96 µg/ml. Hiệu quả diệt
khuẩn của HPE2.4 đối với MRSE là tốt nhất (Bảng 3.31). Khả năng gây
độc của HPE2.4 và HPE3.4 được thực hiện trên 4 dòng tế bào ung thư, kết
quả của chất HPE3.4 chưa rõ ràng nên không công bố, kết quả thử trên các
dòng tế bào của HPE2.4 khá rõ nét (Bảng 3.32). HPE2.4 có khả năng gây
độc mạnh với dòng tế bào ung thư MCF7, A549, Hela và Hep-G2 với giá
trị IC50 lần lượt là 6,15; 6,91; 6,84 và 9,28 µg/ml và gây độc với dòng tế
bào Hek ở giá trị IC50 là 35,2 µg/ml.
Chất HPE2.4 có tiềm năng trong phát triển thành thuốc kháng ung thư
và đây cũng được xem là công bố đầu tiên về chất HPE2.4 thu được từ
chủng xạ khuẩn biển S. variabilis HP411 phân lập ở Việt Nam có hoạt tính
gây độc với dòng ung thư phổi hiệu quả hơn so với dòng tế bào ung thư vú
và ở nồng độ thấp không có khả năng gây độc với dòng tế bào lành. Chất
HPE2.4 không những có hiệu quả diệt chủng vi khuẩn gây bệnh kháng
kháng sinh cao như chủng S. epidermidis MRSE ATCC 35984 với giá trị
MIC là 20,83 µg/ml, chủng S. aureus MRSA ATCC 25923 với giá trị
71,25 µg/ml và chủng A. hydrophila THWQJ với giá trị 51,61 µg/ml, mà
còn có hoạt tính mạnh với chủng nấm men C. albicans ATCC 10231 với
giá trị 2,96 µg/ml.
Như vậy, cùng với các nghiên cứu đã công bố trên thế giới và một số
kết quả sơ bộ đã đạt được ở nghiên cứu này có thể nhận định về tiềm năng
tìm ra các chất mới từ xạ khuẩn biển nhằm ứng dụng vào y dược là đúng

và cần được thực hiện các nghiên cứu sâu hơn.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
1. Từ 97 chủng xạ khuẩn phân lập từ các vùng biển Việt Nam đã sàng
lọc được 70 chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với ít nhất một loại vi
sinh vật kiểm định và đã lựa chọn 16 chủng xạ khuẩn có hoạt tính đối
kháng cao với các chủng vi sinh vật gây bệnh như: S. epidermidis ATCC
12228, E. coli ATCC 11105 và C. albicans ATCC 10231 để thực hiện các
nghiên cứu sàng lọc chất kháng sinh.
23


2. Kết quả nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại 16 chủng xạ
khuẩn đã định danh đến chi 8 chủng (7 chủng thuộc chi Streptomyces và 1
chủng thuộc chi Nocardiopsis) và 8 chủng được phân loại đến loài là:
Streptomyces scabiei NA113, chủng S. tendae NA115, chủng S.
coelicoflavus NA116, chủng S. variabilis HP411; chủng S.
griseoincarnatus HPN11, chủng S. griseorubens HPX12, chủng S.
albogriseolus VD111 và chủng S. viridodiastaticus TB5.3.
3. Đã nghiên cứu lựa chọn được môi trường, điều kiện lên men và
dung môi tách chiết thích hợp để thu nhận chất kháng sinh thô từ 8 chủng
xạ khuẩn: NA113, NA115, HP411, HPN11, HPX12, VD111, C141 và
TB5.3.
4. Chất kháng sinh thô nhận được có hoạt phổ kháng khuẩn rộng (ức
chế cả vi khuẩn kháng thuốc MRSA, MRSE và nấm men) và gây độc với
các dòng tế bào ung thư. Chất kháng sinh thô nhận được từ các chủng
NA113, NA115, HP411, HPX12, VD111 và C141 có khả năng gây độc tế
bào với 4 dòng tế bào ung thư Hep-G2, MCF7, RD và FL với giá trị IC50
nhỏ hơn 40 µg/ml, chất từ các chủng VD111 và TB5.3 gây độc với dòng tế

bào M14 và HeLa với IC50 lần lượt là 26,04; 14,59; 29,56 và 29,93; chất từ
chủng HPX12 gây độc tế bào NCIH460 với IC50 là 3,93 µg/ml. Đặc biệt,
chất kháng sinh thô từ các chủng HP411, HPN11, HPX12, VD111 và
TB5.3 không gây độc tế bào thận lành tính Hek293 ở giá trị 40 µg/ml.
5. Nghiên cứu tối ưu hóa môi trường lên men cho chủng S. variabilis
HP411 theo phương pháp đáp ứng bề mặt, thu được môi trường tối ưu nhất
là M1ASW-32 cải tiến (g/l): Tinh bột tan 10,01; cao nấm men 4,61;
peptone 4,65 và pH trung tính, hoạt tính kháng sinh cao nhất đạt được tại
thời điểm 96 giờ lên men.
6. Đã phân tích cấu trúc của chất kháng sinh thô thu được từ chủng S.
variabilis HP411 và thu được 1 chất acid béo, chất tinh HPE3.4 và chất
tinh HPE2.4. Chất HPE2.4 được phân tích bằng NMR cho thấy, công thức
cấu tạo của chất này là C13H8N2O2 và có cấu trúc vòng benzen thuộc nhóm
phenazine.
7. Chất HPE2.4 có hoạt tính kháng vi sinh vật gây bệnh MRSA ATCC
25923, MRSE ATCC 35984 và C. albicans ATCC 10231 với giá trị IC50
24


lần lượt là 71,25; 20,83 và 2,96 µg/ml. Chất này gây độc với 4 dòng tế bào
ung thư MCF7, A549, Hela và Hep-G2 với giá trị IC50 là 6,15; 6,91; 6,84
và 9,28 µg/ml.
KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục tách chiết, phân tích và xác định cấu trúc của các chất
HPE3.4 của chủng HP411 để nghiên cứu thêm về hoạt tính kháng vi sinh
vật và diệt tế bào ung thư của các chất này.
2. Tiếp tục nghiên cứu tách chiết và tinh sạch các hoạt chất của các
chủng xạ khuẩn còn lại để sàng lọc các chất kháng sinh và kháng ung thư
và nghiên cứu về chất có hoạt tính chống oxy hóa của chủng xạ khuẩn
VD111.

CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
1. Phạm Thanh Huyền, Lê Gia Hy, Nguyễn Phương Nhuệ (2012) Phân loại
chủng xạ khuẩn biển VD112 có hoạt tính kháng khuẩn. Báo cáo khoa học
về nghiên cứu và giảng dạy sinh học ở Việt Nam: 537-542.
2. Nguyễn Phương Nhuệ, Phạm Thanh Huyền, Hồ Văn Hoàn, Lê Gia Hy
(2012) Đặc điểm sinh học của một số chủng xạ khuẩn biển có hoạt tính
kháng khuẩn. Báo cáo khoa học về nghiên cứu và giảng dạy sinh học ở
Việt Nam: 637-642.
3. Nguyễn Văn Hiếu, Phạm Thanh Huyền, Lê Gia Hy, Phí Quyết Tiến, Vũ
Thị Hạnh Nguyên, Phan Thị Hồng Thảo, Nguyễn Phương Nhuệ (2012)
Phân lập và định tên chủng HLĐ 3.16 có hoạt tính kháng sinh từ vùng ven
bờ biển Việt Nam. Tạp chí Khoa học và Công nghệ 50 (5): 579- 591.
4. Phạm Thanh Huyền, Lê Gia Hy, Nguyễn Phương Nhuệ (2013) Ảnh
hưởng của điều kiện nuôi cấy tới hoạt tính kháng khuẩn của chủng xạ
khuẩn VD115 phân lập từ vùng biển Việt Nam. Báo cáo khoa học hội nghị
khoa học công nghệ sinh học toàn quốc 2013 (2): 271 - 274.
5. Phạm Thanh Huyền, Hồ Tuyên, Nguyễn Văn Hiếu, Lê Gia Hy, Phí Quyết
Tiến, Nguyễn Phương Nhuệ (2013) Một số đặc điểm sinh học và khả năng
sinh chất kháng khuẩn của vi khuẩn lam phân lập từ vùng ven biển miền
Bắc Việt Nam. Tạp chí Khoa học và Công nghệ 11 (2): 369-377.
25