TẠO DÒNG và BIỂU HIỆN GENE e7 HPV18 TRONG tế bào e COLI THÔNG QUA VECTOR pET 28 (a)

THỰC TẬP DI TRUYỀN LỚN
TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GENE E7 HPV18 TRONG TẾ BÀO E.COLI
THÔNG QUA VECTOR pET-28 (a)

NỘI DUNG THỰC TẬP
NGÀY 1: Thu nhận gene E7 của HPV 18 từ tế bào Hela. Tạo plasmid pET28 tái tổ hợp mang gene E7
NGÀY 2: Tạo plasmid pET28 tái tổ hợp mang gene E7 (tiếp theo), Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào
E.coli DH5α.
NGÀY 3:. Sàng lọc dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp
NGÀY 4:. Tách chiết và kiểm tra plasmid tái tổ hợp được thu nhận bằng phản ứng cắt giới hạn. Biến nạp
plasmid tái tổ hợp vào tế bào E.coli BL21 (DE3)
NGÀY 5 : Hoạt hóa chủng biểu hiện
NGÀY 6: Biểu hiện gene E7 trong tế bào E.coli BL21 (DE3).

YÊU CẦU ĐỐI VỚI SINH VIÊN
-

Đọc kĩ quy trình thực tập trước buổi học

-

Mỗi nhóm chuẩn bị 1 cuốn tập để làm Lab book: ghi nhận lại các công việc, thiết kế thí nghiệm
đã thực hiện theo từng ngày; ý nghĩa các thiết kế thí nghiệm đó; kết quả đạt được ở mỗi thí
nghiệm; phân tích kết quả đó (cuối khóa thực tập sẽ thu lại lab book chấm điểm)

-

Mỗi nhóm mang theo 1 laptop vào ngày 1 (13/12/2010)

- Đánh giá môn học dựa trên: Báo cáo thí nghiệm (lab book), Kết quả thí nghiệm và Bài thi
cuối khóa

- Vắng từ 2 buổi trở lên sẽ cấm thi. Trong thời gian học nếu muốn xin ra ngoài trong 1
khoảng thời gian nào đó phải làm đơn xin phép trước.

- Đi trễ quá 5 phút coi như vắng buổi học đó
1


NGÀY 1: THU NHẬN GENE E7 CỦA HPV 18 TỪ TẾ BÀO HELA
I.

Tách DNA từ tế bào HeLa.

 Thu dịch nuôi cấy chứa khoảng 2.106 tế bào.
 Ly tâm 5000rpm, 10 phút. Thu tủa.
 Thêm vào 500µl Chelex. (Lưu ý: vortex kỹ Chelex trước khi sử dụng).
 Vortex kỹ hỗn hợp tế bào và chelex trong 5 phút.
 Ủ mẫu ở 75oC trong 10 phút.
 Ủ trong đá đang tan 2 phút.
 Ly tâm 13000 rpm trong 2 phút.
 Thu dịch nổi vào một eppendorf 1,5 mới. Cẩn thận không hút phân đoạn có hạt resin.
 Giữ eppendorf trong đá.
 Đo OD với bước sóng 260nm và 280nm.
II.

PCR thu nhận gene E7 từ DNA tế bào HeLa bằng cặp mồi E7fNde và E7rSal.
-

Pha loãng mẫu PCR đến nồng độ 50 ng/µl bằng TE

-

Thành phần phản ứng PCR (mỗi nhóm đặt 2 phản ứng):
Master mix:

12,5µl.

Primer:

1 µl

ddH2O:

10,5µl.

Sản phẩm PCR (50 ng):

1 µl.

Tổng thể tích:

25 µl

 Nhóm 1 đặt thêm 1 phản ứng như sau:
Master mix:

12,5 µl

Primer:

1µl

ddH2O:

10,5µl

plasmid pet28-E7HPV18:

1 µl

Tổng thể tích:

25µl

2


 Nhóm 2 đặt thêm 1 phản ứng như sau:
Master mix:

12,5 µl

Primer:

1µl

ddH2O:

11,5µl

Tổng thể tích:

25µl

Chương trình nhiệt của phản ứng PCR
950C

940C
720C

5 phút

30
giây
500C

1
phút

720C

6 phút

30 giây
1

2(lặp lại 35 lần)

3

 Trộn 2 sản phẩm PCR lại trong một eppendorf 1,5ml
 Điện di 5µl sản phẩm PCR trên gel Agarose 1% với hiệu điện thế: 80V trong 30 phút.
 HỎI: ý nghĩa các phản ứng nhóm 1 và 2 làm thêm?

III.

Tinh sạch sản phẩn PCR.

 Cho 260 µl TE 1X vào sản phẩm PCR
 Cho 300 µl phenol:chloroform. Vortex kỹ trong 5 phút.
 Ly tâm 13.000 rpm trong 10 phút ở 4oC.
 Thu hết dịch nỗi phía trên vào một eppendorf 1,5ml mới.
 Cho thêm 1V chloroform, vortex kỹ trong 2 phút.
 Ly tâm 13.000 rpm trong 10 phút ở 4oC.
 Thu hết dịch nổi phía trên vào một eppendorf 1,5ml mới.
 Thêm 1/10V Sodium acetat 10X, 2V Ethanol tuyệt đối lạnh, Đảo eppendorf 4-5 lần.
3


 Ủ ở -20oC trong 1 giờ
 Ly tâm 13.000 rpm trong 10 phút ở 4oC.
 Loại bỏ dịch nổi. Nhẹ nhàng thêm 1ml Ethanol 70% lạnh. Không được vortex.
 Ly tâm 13.000 rpm trong 5 phút ở 4oC.
 Hòa tủa trong 20µl TE 1X.
 Đo OD ở bước song 280nm và 260 nm.
 Điện di trên gel Agarose 1% với hiệu điện thế: 80V trong 30 phút.
IV.

Xử lý plasmid pET28 (a) và sản phẩm PCR gene E7

Thành phần phản ứng cắt:
Vector pET-28a(+) /PCR-E7

3,0 l (600 ng)

Buffer D

4,0l

BSA 10X

4,0l

SalI(10u/l)

1,0l

NdeI(10u/l)

1,0l

dH2O

25,0l

Tổng thể tích

40,0l

Ủ phản ứng cắt ở 370C trong 3 giờ. Giữ ở -20oC đến sang hôm sau

4


NGÀY 2: TẠO PLASMID pET28 TÁI TỔ HỢP MANG GENE E7.
I.

Tinh sạch sản phẩm cắt.

 Cho 260 µl TE 1X vào 2 eppendorf chứa sản phẩm cắt
 Cho 300µl phenol:chloroform. Vortex kỹ trong 5 phút.
 Ly tâm 13.000 rpm trong 10 phút ở 4oC.
 Thu hết dịch nổi phía trên vào một eppendorf 1,5ml mới.
 Cho thêm 1V chloroform, vortex kỹ trong 2 phút.
 Ly tâm 13.000 rpm trong 10 phút ở 4oC.
 Thu hết dịch nổi phía trên vào một eppendorf 1,5ml mới (khoảng 200µl) .
 Thêm 1/10V Sodium acetat 10X, 2V Ethanol tuyệt đối lạnh, Đảo eppendorf 4-5 lần.
 Ủ ở -20oC trong 1 giờ.
 Ly tâm 13.000 rpm trong 10 phút ở 4oC.
 Loại bỏ dịch nổi. Nhẹ nhàng thêm 1ml Ethanol 70% lạnh. Không được vortex.
 Ly tâm 13.000 rpm trong 5 phút ở 4oC.
 Hòa tủa trong 20µl TE 1X.
 Đo OD ở bước song 280nm và 260 nm.
 Điện di
II.

Phản ứng nối.
 Công thức thiết lập phản ứng nối.

 Cho biết: M (kb) of insert = 0,3 kb; M (kb) of vector = 5,4 kb

 Đặt hai phản ứng nối: 1) tỉ lệ nối (insert:vector) = 3:1 và 2) tự nối (insert:vector) = 0:1

5


Thành phẩn phản ứng nối.
3:1

Tự nối

Sp PCR

3µl

0µl

Plasmid pET28 (100-200ng/µl)

1µl

1µl

Buffer T4 DNA ligase10X

1µl

1µl

T4 DNA ligase

1µl

1µl

ddH2O

4µl

7µl

Tổng thể tích

10µl

10µl

Ủ ở 16oC, 4 giờ.
III.

Tạo tế bào khả nạp (PTN đã chuẩn bị)
 Hoạt hóa 5 ml tế bào E. coliDH5 trong môi trường LB, qua đêm.
 Nuôi 1 ml tế bào E. coliDH5 trong 50 ml môi trường LB, lắc ổn nhiệt ở 370C cho đến khi
dịch tế bào đạt OD từ 0,3 -0,6.
 Ly tâm 5.000 vòng/phút, 5 phút ở 40C để thu sinh khối.
 Rửa sinh khối bằng dung dịch 25 ml CaCl2 100mM, ủ trong đá 30 phút.
 Ly tâm 5.000 vòng/phút, 5 phút, ở 40C để thu sinh khối.
 Huyền phù lại trong 5ml dung dịch CaCl2 100mM
 Bổ sung Glycerol đến nồng độ cuối là 12%.
 Aliquot thành 5 eppendorf giữ ở -80oC.

IV.

Biến nạp

Mỗi nhóm làm 5 phản ứng biến nạp:
A

B

C

D

E

Tế bào khả 100µL
nạp

100µL

100µL

100µL

100µL

Sản phẩm nối

3:1

Tự nối

-

-

-

pET28
nguyên

-

-

1µl

-

-

6


 Cho sản phẩm nối vào eppendorf có sẵn 100 l tế bào khả nạp. Ủ trên đá 30 phút.
 Heat shock ở 420C trong 90 giây.
 Ủ trên nước đá đang tan trong 2 phút.
 Bổ sung 1ml môi trường LB vào mỗi eppendorf, ủ ở 37oC, trong 1 giờ.
 Ly tâm 10.000 vòng/ phút trong 2 phút
 Đổ bỏ dịch nổi. Còn lại phần tủa và 1 ít dịch nổi, dùng pipette huyền phù và chuyển lên đĩa

trải.
 Trải các eppendorf A,B,C,D lên đĩa LB có bổ sung Kanamycin(30g/ml), eppendorf E trải
trên đĩa LB, ủ qua đêm ở nhiệt độ 370C.
 HỎI: ý nghĩa của 5 phản ứng biến nạp đã thực hiện?

7


NGÀY 3: SÀNG LỌC DÒNG TẾ BÀO MANG PLASMID pET/E7
I.

Sàng lọc khuẩn lạc bằng phương pháp PCR với cặp mồi T7 promoter và E7r-Sal

 Quan sát và ghi nhận, giải thích kết quả trên các đĩa trải A, B, C, D, E
 Mỗi nhóm chọn 5 khuẩn lạc trên đĩa A và 1 khuẩn lạc trên đĩa C để thực hiện 6 phản ứng PCR
 Thành phần phản ứng PCR:
Master mix:

12,5 µl

Primer:

1µl

ddH2O:

11,5µl

Một ít sinh khối khuẩn lạc
Tổng thể tích:

25µl

 Nhóm 3 đặt thêm 1 phản ứng như sau:
Master mix:

12,5 µl

Primer:

1µl

ddH2O:

11,5µl

Một ít sinh khối khuẩn lạc E.coli DH5α mang plasmid pet28-E7HPV18
Tổng thể tích:

25µl

 Nhóm 4 đặt thêm 1 phản ứng như sau:
Master mix:

12,5 µl

Primer:

1µl

ddH2O:

11,5µl

Tổng thể tích:

25µl

8


Chương trình nhiệt.
950C

940C
720C

5 phút

720C

30 giây
1 phút

6 phút

500C
30 giây
1

2(lặp lại 35 lần)

3

 Điện di trên gel aragose 2%.
 Chọn 1 khuẩn lạc cho kết quả PCR dương tính với insert, hoạt hóa khuẩn lạc qua đêm trong 5ml
môi trường LB-Kanamycin (30µg/ml).
 Hỏi: ý nghĩa của các phản ứng nhóm 3 và 4 làm thêm?

9


NGÀY 4: TÁCH CHIẾT VÀ KIỂM TRA PLASMID TÁI TỔ HỢP BẰNG
PHẢN ỨNG CẮT GIỚI HẠN
I.

Tách plasmid tái tổ hợp.

 Ly tâm thu sinh khối 5ml dịch vi khuẩn nuôi qua đêm ở 5000 rpm trong 10 phút.
 Thêm 200µl dung dịch 1. Trộn đều bằng vortex.
 Thêm 400µl dung dịch 2. Đảo ống 4-5 lần. Ủ trên đá đang tan không quá 5 phút.
 Thêm 300µl dung dịch 3. Đảo ống 10 lần. Ủ trên đá 15 phút.
 Li tâm 13000 rpm trong 15 phút.
 Thu dịch nổi (khoảng 500µl) vào một eppendorf mới.
 Thêm 50µl Sodium acetat (1/10V), 1ml Ethanol tuyệt đối lạnh
 Đảo nhẹ ống 2-3 lần ủ ở -20oC trong 30 phút.
 Ly tâm 13.000 rpm trong 10 phút ở 4oC.
 Loại bỏ dịch nổi. Nhẹ nhàng thêm 1ml Ethanol 70% lạnh. Không được vortex.
 Ly tâm 13.000 rpm trong 5 phút ở 4oC.
 Phơi khô tủa ở 65oC

 Hòa tủa trong 20µl TE 1X.
 Bổ sung 2µl RNAse (20mg/ml), ủ 37oC trong 30’
 Điện di trên gel Agarose 1% trong 30 phút với dòng điện một chiều 80V.
 Đo OD

II.

Cắt plasmid bằng hai enzyme NdeI và SalI.

Thành phần phản ứng cắt:
Plasmid tái tổ hợp

3,0 l (600 ng)

Buffer D

2,0l

BSA 10X

2,0l

SalI(10u/l)

0,5l

NdeI(10u/l)

0,5l

dH2O

12,0l

Tổng thể tích

20,0l
10




Ủ ở 37oC trong 2 giờ



Điện di toàn bộ 20µl phản ứng cắt và 3µl plasmid chưa cắt trên gel Agarose 1% trong 30
phút với dòng điện một chiều 80V.

III.

Biến nạp vào E.coli BL21 (DE3)
-

Chọn 1 plasmid tái tổ hợp có mang insert từ kết quả cắt giới hạn ở mục II

-

Biến nạp vào E.coli BL21 (DE3): Hút 1 µl plasmid cho vào 100 µl E.coli khả nạp.

-

Quy trình biến nạp giống quy trình biến nạp vào tế bào E.coli DH5α

-

Mỗi nhóm làm 3 phản ứng biến nạp:
A

-

B

C

Tế bào khả 100µL
nạp

100µL

100µL

Plasmid tái tổ 1µl
hợp

-

-

Trải eppendorf A,B lên đĩa LB có bổ sung Kanamycin(30g/ml), eppendorf C trải trên đĩa

LB, ủ qua đêm ở nhiệt độ 370C

-

Hỏi: ý nghĩa của 3 phản ứng biến nạp đã thực hiện?

11


NGÀY 5: HOẠT HÓA CHỦNG BIỂU HIỆN
IV.

Hoạt hóa chủng E.coli BL21 (DE3) mang plasmid tái tổ hợp.
 Quan sát, ghi nhận và giải thích kết quả ở các đĩa biến nạp ở ngày 4
 Chuẩn bị một ống nghiệm chứa 5ml môi trường LB lỏng bổ sung Kanamycin (30µg/ml)
 Dùng đầu típ vàng lấy môt khuẩn lạc E.coli BL21 (DE3) mang plasmid tái tổ hợp thu được trên
đĩa LB-Kanamycin (30µg/ml) vào ngày 5 cho vào ống nghiệm.
 Nuôi cấy lắc ở 37oC qua đêm.
 Nhóm 5 hoạt hóa thêm 1 ống từ 1 khuẩn lạc E.coli BL21 (DE3) mang plasmid pET28
nguyên.

12


NGÀY 6: BIỂU HIỆN GENE E7 TRONG TẾ BÀO E.coli BL21(DE3)
I.

Cảm ứng biểu hiện gene E7 bằng IPTG

 Chuẩn bị 3 ống nghiệm/nhóm có 5ml môi trường LB lỏng có bổ sung Kanamycin (30µg/ml).

 Bổ sung 400µl dịch vi khuẩn mang plasmid tái tổ hợp/ống
 Nuôi cấy lắc ở 37oC cho đến khi OD600 của dịch vi khuẩn đạt trong khoảng 0,6-1,0.
 Bổ sung IPTG 100mM vào môi trường nuôi cấy theo bảng sau:

IPTG 100mM

ỐNG A

ỐNG B

ỐNG C

54 µL

54 µL

0 µL

 Nhóm 6 làm thêm 2 ống hoạt hóa plasmid pET28 nguyên như sau:

IPTG 100mM

ỐNG D

ỐNG E

54 µL

0 µL

 Nuôi cấy lắc trong 4 giờ ở 37oC.
 HỎI: nồng độ IPTG sử dụng để cảm ứng biểu hiện là bao nhiêu? Ý nghĩa của thiết kế thí
nghiệm cảm ứng biểu hiện?
II.

Điện di SDS-PAGE

 Chuyển dịch nuôi cấy vào falcon 15ml.
 Ly tâm thu sinh khối ở 5000rpm trong 10 phút.
 Hòa sinh khối bằng dung dịch NaCl (50mM)/EDTA (1mM) pH8.0 theo bảng sau:

NaCl/EDTA

ỐNG A

ỐNG B

ỐNG C

ỐNG
D ỐNG
E
(nhóm 5 làm) (nhóm 6 làm)

500 µL

250 µL

500 µL

500 µL

500 µL

 Chuyển hết dịch sinh khối đã hòa tan sang 1 eppendorf 1.5ml
 Đem ống B đi sonicate 10s, 5 lần. Các ống khác giữ trên đá
 Ly tâm ống B 13.000 rpm, 20’. Chuyển dịch nổi sang 1 eppendorf 1.5ml mới (B1). Phần cặn hòa
lại trong 250 µL NaCl/EDTA (B2)
13


 Lấy 35µl dịch ở mỗi ống A, B1, B2, C, D, E và 7µl dung dịch nạp mẫu 6X. Trộn đều
 Đun ở 100oC trong 10 phút. Spin down.
 Nạp mẫu vào giếng.
 Điện di ở dòng điện 100V trong 30 phút. Sau đó, điện di tiếp tục với dòng điện 120V cho đến khi
vạch màu đi ra khỏi bản gel.
 Nhuộm gel phân tách với thuốc nhuộm Coomasive Blue trong 30 phút.
 Giải nhuộm với dung dịch giải nhuộm cho đến khi bản gel trong suốt.
 Phân tích kết quả biểu hiện của các ống A, B1, B2, C, D, E

14


PHỤ LỤC
I.

II.

Sơ đồ cấu tạo plasmid pET28a

Mã số gene E7HPV18 trên NCBI: AY262282

15


III.

Một số hóa chất sử dụng
A. Hóa chất dùng trong nuôi cấy và cảm ứng vi khuẩn

Môi trường Luria-Bertan (LB) (pH 7,0)
Trypton

10 g

Cao nấm men

5g

NaCl

10 g

Môi trường LB thạch: LB + agar 15% (w/v)
Môi trường LB-Kan: LB + Kanamycin (30 g/ml).
Hóa chất dung trong biểu hiện gene mục tiêu
Dung dịch IPTG (isopropylthio--D-galactoside) 100mM (giữ ở -200C)
B. Hóa chất điện di
Hóa chất điện di gel agarose
TAE 50X

Tris-HCl

242g/l

Acid acetic đậm đặc

57,1ml/l

EDTA 0,5M pH8

100ml/l

Hóa chất điện di gel polyacrylamide.
-

Gel polyacrylamide nồng độ 12% có thành phần như sau:

 Gel phân tách (separating gel)
dH2O

3,3 ml

Tris-HCl 1,5M pH 8.8

2,5 ml

30% acrylamide: 0,8% bisacrylamide

4,0 ml

SDS 10%

0,01 ml

APS 10%

0,01 ml

TEMED

15l

16


 Gel gom (stacking gel)

-

dH2O

2,8 ml

Tris-HCl 1.5M pH 6.8

0,5 ml

30% acrylamide: 0,8% bisacrylamide

0,66 ml

SDS 10%

0,04 ml

APS 10%

0,04 ml

TEMED

10l

Dung dịch nạp mẫu 6X (pH=6,8)

-

Glycerol

30%

SDS

10% (w/v)

DTT

0.6 M

Tris-HCl pH 6,8

0,5 M

Bromophenol blue

0,012% (w/v)

Dung dịch điện di SDS-PAGE 1X (giữ ở nhiệt độ phòng)

-

Tris-HCl

25 mM

Glycine

200 mM

SDS

0,1% (w/v)

Dung dịch nhuộm gel (giữ ở nhiệt độ phòng)

-

Coomasive brilliant blue

0,625 g

Ethanol tuyệt đối

112,5 g

Glacial acetic

25,0 ml

dH2O

112,5ml

Dung dịch giải nhuộm
Glacial acetic

100 ml

Ethanol tuyệt đối

200 ml

dH2O

800 ml

17


C. Hóa chất trong tách chiết plasmid

-

Dung dịch I :
Glusoce

50 mM

Tris-HCl (pH8,0)

25 mM

EDTA (pH 8,0)

10 mM

- Dung dịch II (pha trước khi dùng)
NaOH

0,2N

SDS

1%(w/v)

- Dung dịch III: pH=5,0
Potassium acetate

3,0 M

Glacial acetic

0,2 M

- RNAse 20mg/ml (giữ ở -200C)
- Ethanol tuyệt đối lạnh
- Ethanol 70%
- Dung dịch TE 1X pH=8,0 (Tris-HCl 10,0 mM, EDTA 1,0 mM)
D. Hóa chất dùng cho lai Southern Blot
Denhardt’s solution 100X
- 2% (w/v) BSA
- 2% (w/v) Ficoll
- 2% (w/v) PVP (polyvinylpyrolidone)
SSC 20X pH 7,0
- NaCl 3M
- Sodium citratre 0,3M
E. CHỦNG VI KHUẨN:

18


 E.coli DH5α: F–, ø80dlacZΔM15, Δ(lacZYA-argF)U169, deoR, recA1, endA1, hsdR17 (rK–
, mK+), phoA, supE44, λ–, thi-1, gyrA96, relA1



E.coli BL21 (DE3): F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1

ind1 sam7 nin5])
F. THANG CHUẨN
Thang chuaån 1 kb DNA:

Thang chuẩn unstained protein

19