KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN Agrobacterium rhizogenes LÊN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ SINH TỔNG HỢP ALKALOID TRONG CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus) TRỒNG TRÊN HỆ THỐNG KHÍ CANH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN
Agrobacterium rhizogenes LÊN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ
SINH TỔNG HỢP ALKALOID TRONG CÂY
DỪA CẠN (Catharanthus roseus) TRỒNG
TRÊN HỆ THỐNG KHÍ CANH

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Sinh viên thực hiện: HỒ LÊ NHƯ SANG
Niên khóa: 2011 – 2013

Tháng 12/2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN
Agrobacterium rhizogenes LÊN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ
SINH TỔNG HỢP ALKALOID TRONG CÂY
DỪA CẠN (Catharanthus roseus) TRỒNG
TRÊN HỆ THỐNG KHÍ CANH

Hướng dẫn khoan học

Sinh viên thực hiện

TS. TRẦN THỊ LỆ MINH

HỒ LÊ NHƯ SANG

Tháng 12/2013


LỜI CẢM ƠN
Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:
Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện
cho em trong suốt thời gian học tập.
Các thầy cô, các anh chị trong Bộ môn Công nghệ sinh học cùng các thầy cô đã
trực tiếp giảng trong suốt hai năm qua.
TS. Trần Thị Lệ Minh, người đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện để em
thực hiện khóa luận này.
Anh Bùi Xuân Lượng và bạn Nguyễn Thị Định cùng toàn thể lớp LT11SH đã tận
tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tiến hành khóa luận.
Con thành kính ghi ơn Bố Mẹ và những người thân trong gia đình luôn tạo điều
kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập.
Tháng 12 năm 2013
Hồ Lê Như Sang

i


TÓM TẮT
Đề tài nghiên cứu “KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHỦNG VI
KHUẨN Agrobacterium rhizogenes LÊN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ SINH TỔNG HỢP

ALKALOID TRONG CÂY DỪA CẠN (Catharathus roseus) TRỒNG TRÊN HỆ
THỐNG KHÍ CANH”, được thực hiện tại trường Đại học Nông Lâm, Tp. Hồ Chí
Minh từ tháng 5/2013 đến tháng 11/2013.
Đề tài tiến hành khảo sát khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp alkaloid của
cây Dừa cạn, trồng trên hệ thống khí canh được tạo vết thương vùng rễ có bổ sung vi
khuẩn A. rhizogenes mật độ 109 CFU/ ml. Đồng thời, khảo sát ảnh hưởng của hai
chủng vi khuẩn A. rhizogenes TR7 và 11325 đến sự sinh trưởng của cây. Xác định
hàm lượng alkaloid trong cây bằng phương pháp đo mật độ quang và xác định hàm
lượng vincristine và vinblastine bằng phương pháp HPLC. Quá trình thực hiện đã thu
được kết quả như sau:
Cây Dừa cạn trồng trên hệ thống khí canh có bổ sung vi khuẩn A. rhizogenes
dòng 11325 có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt hơn dòng TR7.
Khả năng sinh trưởng của cây Dừa cạn trồng trên hệ thống khí canh, được tạo
vết thương vùng rễ có bổ sung vi khuẩn A. rhizogenes mật độ 109 CFU/ ml sinh
trưởng tốt, đồng thời cho lượng sinh khối và hàm lượng alkaloid trong cây cao hơn so
với cây trồng không được tạo vết thương vùng rễ và không bổ sung vi khuẩn A.
rhizogenes.
Hàm lượng vincristine và vinblastine của cây Dừa cạn trồng trên hệ thống khí
canh bổ sung vi khuẩn A.rhizogennes mật độ 109 CFU/ ml, cao nhất ở giai đoạn cây
tạo quả và cao hơn so với cây Dừa cạn trồng trên hệ thống khí canh không bổ sung vi
khuẩn.

ii


SUMMARY
The research was about "THE SURVEY

EFFECTS OF

Agrobacterium

rhizogenes bacteria growth and alkaloid biosynthsis on Catharathus roseus GROWN
IN AEROPONIC SYSTEM " was done at Department of Biotechnology Ínstitute of
Biotechnology and Enviroment, Nong Lam University Ho Chi Minh city from June to
October, 2013.
The reseach aimed: A.rhizogenes bacterium infect in The Catharanthus roseus with
two strains of TR7 and 11325.
Proceed monitoring the impact on the growth and development and concentration of
alkaloids, vincristine and vinblastine in plant aeroponic system.
Methods: The conduct surveys growth capacity of

The Catharanthus roseus

aeroponic system is pierced A.rhizogenes bacterium with added A.rhizogenes
bacterium density of 109 CFU / ml. Impact survey of two strains of A. rhizogenes TR7
and 11325 on the growth of the tree.
Quantitative determination of alkaloids in plants by measuring optical density method,
levels of vincristine and vinblastine by HPLC method.
Results: The Catharanthus roseus planting in the aeroponic system

is pierced

rhizosphere of plus - A.rhizogenes bacterium with the degree of 109 CFU/ml is able to
grow and develop better than one planting without plus - A.rhizogenes bacterium.
The Catharanthus roseus planting in the aeroponic system

is pierced

rhizosphere of plus- A.rhizogenes bacterium 11325 lines able to grow and develop

better than TR7 line.
The ability of

increasing content of vincristine and vinblastine in the

Catharanthus roseus planting in the aeroponic system of plus- A.rhizogenes bacterium
has higher degree compared with one planting in aeroponic system without plusbacteria.

iii


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. i
TÓM TẮT ................................................................................................................... ii
SUMMARY ...............................................................................................................iii
MỤC LỤC .................................................................................................................. iv
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................... vii
DANH SÁCH CÁC BẢNG ...................................................................................... viii
DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ ...................................................................... ix
Chương 1 MỞ ĐẦU ................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................. 1
1.2. Yêu cầu................................................................................................................. 2
1.3. Nội dung thực hiện................................................................................................ 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 3
2.1. Giới thiệu chung cây Dừa cạn ............................................................................... 3
2.1.1. Phân loại ............................................................................................................ 3
2.1.2. Sự phân bố ......................................................................................................... 3
2.1.3. Đặc điểm sinh thái ............................................................................................. 4
2.1.4. Thành phần hóa học của cây Dừa cạn................................................................. 5

2.1.5. Sự phân bố các alkaloid trong cây Dừa cạn ........................................................ 6
2.1.6. Công dụng của alkaloid Dừa cạn ........................................................................ 7
2.2 Hợp chất thứ cấp.................................................................................................... 8
2.2.1. Tình hình nghiên cứu hợp chất thứ cấp ở Việt Nam ........................................... 8
2.2.2. Vai trò của hợp chất thứ cấp............................................................................... 9
2.2.3. Sự phân loại hợp chất thứ cấp ............................................................................ 9
2.3. Alkaloid .............................................................................................................. 10
2.3.1. Khái niệm về alkaloid ...................................................................................... 10
2.3.2. Phân bố alkaloid trong tự nhiên ........................................................................ 10
2.3.3. Tính chất chung của alkaloid ............................................................................ 11
2.3.4. Phân loại alkaloid ............................................................................................. 11
iv


2.3.5. Ứng dụng của alkaloid ..................................................................................... 12
2.4. Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ................................................................... 13
2.4.1 Nguồn gốc phân loại ......................................................................................... 13
2.4.2. Đặc điểm chung ............................................................................................... 13
2.4.3. Ri plasmit và T - DNA ..................................................................................... 14
2.4.4. Chức năng các gen rol ...................................................................................... 16
2.4.5. Chức năng của vùng vir ................................................................................... 17
2.4.6. Quá trình chuyển T - DNA vào tế bào thực vật ................................................ 17
2.5. Hệ thống khí canh ............................................................................................... 19
2.5.1. Sơ lược về khí canh .......................................................................................... 19
2.5.2. Tình hình nghiên cứu công nghệ khí canh trên thế giới và Việt Nam................ 20
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................... 21
3.1. Địa điểm và thời gian .......................................................................................... 21
3.2. Vật liệu ............................................................................................................... 21
3.2.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu ..................................................................... 21
3.2.2. Hóa chất và thiết bị .......................................................................................... 21

3.2.3. Môi trường nuôi cấy......................................................................................... 21
3.2.3.1. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn A. rhizogenes ................................................. 21
3.2.3.2. Môi trường trồng khí canh............................................................................. 21
3.3. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 22
3.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của vi khuẩn A. rhizogenes dòng 11325 và dòng
TR 7 đến sự sinh trưởng và phát triển của cây Dừa cạn trồng trên
hệ thống khí canh. ...................................................................................... 22
3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của việc tạo vết thương vùng rễ đến sự sinh
trưởng và sinh tổng hợp alkaloid của cây Dừa cạn trồng trên hệ
thống khí canh có bổ sung vi khuẩn A. rhizogenes mật độ 109
CFU/ ml..................................................................................................... 22
3.3.3. Khảo sát khả năng sinh trưởng, phát triển và khả năng gia tăng hợp
chất thứ cấp ở cây Dừa cạn trồng trên hệ thống khí canh bổ sung
vi khuẩn A. rhizogenes mật độ 109 CFU/ ml .............................................. 23
3.4. Các phương pháp sử dụng trong thí nghiệm ........................................................ 23
v


3.4.1 Phương pháp đưa cây lên giá thể khí canh ......................................................... 23
3.4.2. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn A. rhizogenes ................................................. 24
3.4.3. Phương pháp tạo vết thương vùng rễ ................................................................ 24
3.4.4. Qui trình ly trích mẫu Dừa cạn khô .................................................................. 25
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 26
4.1. Khảo sát ảnh hưởng của vi khuẩn A. rhizogenes dòng 11325 và dòng
TR7 đến sự sinh trưởng và phát triển của cây Dừa cạn trồng
trong hệ thống khí canh. ............................................................................ 26
4.2. Khảo sát ảnh hưởng của việc tạo vết thương vùng rễ đến sự sinh trưởng
và sinh tổng hợp alkaloid của cây Dừa cạn trồng trong hệ thống
khí canh có bổ sung vi khuẩn A. rhizogenes mật độ 109 CFU/ ml............... 28
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................... 37

5.1 Kết luận ............................................................................................................... 37
5.2 Đề nghị ................................................................................................................ 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 38

vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ctv

: Cộng tác viên

DNA

: Deoxyribonuleotic acid

ĐC

: Đối chứng

LB

: Left border

MS

: Murashiga & Skoog, 1962

NT

: Nghiệm thức

OD

: Opical density (độ hấp thu quang phổ)

ORF

: Open reading Frame

RB

: Right border

Ri plasmid

: Root inducing plasmid

rol

: Resistance to osmotic lysis

TB

: Trung bình

TLC

: Trọng lượng cây

T - DNA

: Tranferred DNA

TL - DNA

: Tranferred left DNA

TR - DNA

: Tranferred right DNA

vir

: Gen vir

vir

: Virulence

VK

: Vi khuẩn

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Hàm lượng alkaloid trong các bộ phận của cây Dừa cạn ............................... 7

Bảng 4.1 Kết quả trắc nghiệm thống kê so sánh về số lá, chiều cao cây, chiều
dài rễ và số rễ phụ của cây Dừa trồng trên hệ thống khí canh cạn sau
35 ngày trồng ............................................................................................. 26
Bảng 4.2 Kết quả so sánh so sánh về số lá, chiều cao cây, chiều dài rễ và số rễ
phụ của cây Dừa cạn trồng trên hệ thống khí canh sau 42 ngày trồng......... 28
Bảng 4.3 Kết quả trắc nghiệm thống kê so sánh về số lá, chiều cao thân, chiều
dài rễ, số rễ phụ và trọng lượng khô của cây Dừa cạn trồng trên hệ
thống khí canh sau 42 ngày trồng............................................................... 29
Bảng 4.4 Kết quả đo mật độ quang xác định hàm lượng alkaloid trong cây Dừa
cạn trồng trong hệ thống khí canh .............................................................. 30
Bảng 4.5 So sánh sự sinh trưởng và phát triển của Dừa cạn trồng trên hệ thống
khí canh có bổ sung vi khuẩn và đối chứng sau 56 ngày trồng ................... 32
Bảng 4.6 Kết quả trắc nghiệm thống kê so sánh về số lá, chiều cao thân, chiều
dài rễ và trọng lượng của cây Dừa cạn trồng trên hệ thống khí canh
sau 42 ngày trồng....................................................................................... 33
Bảng 4.7 Kết quả trắc nghiệm thống kê so sánh về số lá, chiều cao thân, chiều
dài rễ và trọng lượng của cây Dừa cạn trồng trên hệ thống khí canh
sau 56 ngày trồng....................................................................................... 33
Bảng 4.8 Hàm lượng vincristine và vinblastine trong cây Dừa cạn ............................ 35

viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ
Hình 2.1 Cây dừa cạn .................................................................................................. 3
Hình 2.2 Cây dừa cạn .................................................................................................. 4
Hình 2.3 Con đường sinh tổng hợp các indol alkaloid ở cây Dừa cạn từ tiền chất........ 6
Hình 2.4 Công thức cấu tạo của ajmalicine ............................................................... 11
Hình 2.5 Công thức cấu tạo của vindoline ................................................................. 12
Hình 2.6 Công thức cấu tạo của vinblastine và vincristine ......................................... 12

Hình 2.7 Plasmid của vi khuẩn A. rhizogenes ........................................................... 14
Hình 2.8 Hệ thống khí canh ....................................................................................... 20
Hình 4.1 Chiều cao cây Dừa cạn sau 35 ngày trồng ................................................... 27
Hình 4.2 Chiều dà rễ cây Dừa cạn sau 35 ngày trồng ................................................ 27
Hình 4.3 Chiều cao cây Dừa cạn sau 42 ngày trồng ................................................... 31
Hình 4.4 Chiều dài rễ cây Dừa cạn sau 42 ngày trồng ............................................... 32
Hình 4.5 Thân và lá cây Dừa cạn sau 56 ngày trồng trên hệ thống khí canh .............. 34

ix


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Trong dân gian từ lâu Dừa cạn đã được gieo trồng để làm cây thuốc và cây
cảnh, người ta đã chiết xuất được nhiều chất hóa học khác nhau từ Dừa cạn có giá trị
với các phòng nghiên cứu dược và ngành khoa học vì con người. Các hoạt chất chính
của Dừa cạn đã xác định là các alkaloid có nhân idol, tiêu biểu là vincaleucoblastin
(vinblastin), leurocristin (vincristin), đây là những alkaloid quan trọng nó có tác dụng
chống ung thư. Tuy nhiên hàm lượng các alkaloid trong tế bào rất thấp, đồng thời quá
trình điều chế alkaloid từ cây Dừa cạn qua khá nhiều công đoạn với giá thành cao nên
thuốc khá đắt. Do đó nhiều nghiên cứu như bổ sung tiền chất, cơ chất hay nhân tố cảm
ứng để gia tăng tổng hợp alkaloid trong tế bào đã và đang được thực hiện.
Một số nghiên cứu cho thấy hàm lượng alkaloid trong các bộ phận của cây Dừa
cạn tập trung nhiều ở phần rễ. Đối với những cây trồng ngoài đất, để thu hoạch được
tất cả các bộ phận của cây kể cả phần rễ dễ xảy ra tình trạng rễ cây không thu hoạch
hết, việc sử dụng dung dịch dinh dưỡng để trồng cây sẽ tránh được tình trạng này. Tuy
nhiên ứng dụng các hệ thống thủy canh (trồng cây trong dung dịch dinh dưỡng) hay
khí canh (trồng cây trong điều kiện rễ cây tiếp xúc với không khí) chưa được nghiên
cứu nhiều trên cây dược liệu, chủ yếu được áp dụng để trồng các loại rau, củ.
Ngoài ra để gia tăng tổng hợp alkaloid trong cây Dừa cạn có thể sử dụng

phương pháp lây nhiễm bởi vi khuẩn A. rhizogenes. Đã có một số tác giả nghiên cứu
sử dụng vi khuẩn A. rhizogenes để gia tăng hợp chất thứ cấp ở thực vật. Cây Dừa cạn
trồng trên hệ thống khí canh kết hợp với việc sử dụng vi khuẩn A. rhizogenes cũng là
hướng làm gia tăng tổng hợp alkaloid trong cây Dừa cạn.
Từ ý nghĩa thực tiễn đó đề tài: "Khảo sát ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn A.
rhizogenes lên sự sinh trưởng và sinh tổng hợp alkaloid trong cây Dừa cạn
(Catharanthus roseus) trồng trên hệ thống khí canh" được thực hiện.

1


1.2. Yêu cầu
Theo dõi sinh trưởng và phát triển của cây Dừa cạn trồng trong hệ thống khí
Xác định hàm lượng alkaloid trong cây Dừa cạn bằng phương pháp đo mật độ
quang.
Phân tích định lượng vincristine và vinblastine bằng phương pháp HPLC.
1.3. Nội dung thực hiện
Khảo sát sự sinh trưởng và phát triển của cây Dừa cạn trồng trong hệ thống khí
canh bổ sung vi khuẩn A. rhizogenes dòng 11325 và dòng TR7.
Khảo sát sự sinh trưởng và phát triển của cây Dừa cạn trồng trong hệ thống khí
canh khi được tạo vết thương vùng rễ có bổ sung vi khuẩn.
Đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển và gia tăng hợp chất thứ cấp ở cây
Dừa cạn trồng trên hệ thống khí canh bổ sung vi khuẩn A. rhizogenes.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu chung cây Dừa cạn
2.1.1. Phân loại

Giới: Plantae; Giới phụ: Tracheobionta; Ngành: Magnoliophyta; Ngành
phụ: Spermatophyta; Lớp: Magnoliopsida; Lớp phụ: Asteridae; Bộ: Gentianales;
Họ: Apocynaceae; Tên khoa học: Catharanthus roseus; Danh pháp khoa học:
Catharanthus roseus (L). G; Tên thông thường: Bông dừa, hoa hải đằng, Trường
xuân hoa, Madagascar periwinkle.

Hình 2.1 Cây dừa cạn
(Hồ Lê Như Sang, 2013)

2.1.2. Sự phân bố
Ở Việt Nam, Dừa cạn là cây hoang dại, có vùng phân bố tự nhiên tương đối đặc
trưng từ tỉnh Quảng Ninh đến Kiên Giang dọc theo vùng ven biển, tương đối tập trung
ở các tỉnh miền Trung như Thanh Hóa, Nghệ An, Huế, Quảng Nam, Ðà Nẵng, Bình
Ðịnh và Phú Yên. Ở những vùng phân bố tự nhiên ven biển, Dừa cạn có khi mọc gần
như thuần loại trên các bãi cát dưới rừng phi lao, trảng cỏ cây bụi thấp, có khả năng
chịu đựng điều kiện đất đai khô cằn của vùng cát ven biển. Dừa cạn được trồng khắp
nơi trong nước để làm cảnh và làm thuốc.
Cây Dừa cạn nguyên sản vùng Đông Phi và nhiệt đới châu Á, ưa ấm, không
chịu rét, sợ ngập nước và đất ẩm ướt. Nói chung có thể trồng trên các loại đất nhưng
mọc tốt hơn ở những nơi đất cát, thoáng khí, thoát nước, kiềm.
3


Ngoài ra còn có ở Côn Đảo và Phú Quốc. Môi trường ven biển cũng là nơi mọc
tập trung của Dừa cạn ở Madagasca, Srilanca, Ấn Độ, Philippines, Malaysia, Thái Lan.
Ở Madagasca, cây còn mọc cả ở những vùng đồi, savan, cây bụi trên đất pha cát hoặc
sỏi đá, độ cao tới 1.500 m. Cây ra hoa quả nhiều hàng năm, cây trồng từ hạt ra hoa quả
sau 4 - 5 tháng. Trong thời kỳ sinh trưởng mạnh, nếu bị cắt, cây tái sinh chồi khỏe.
Dừa cạn mọc tự nhiên ở Việt Nam tương đối phổ biến.
2.1.3. Đặc điểm sinh thái

Cây Dừa cạn thuộc họ Trúc đào, là cây sống 1 năm, hoa thẳng, lá xanh tươi
bóng, hoa đơn tính hoặc có 2 lá nách, màu đỏ tím, đỏ, trắng, có loại hoa trắng nhụy đỏ,
hoa tự hình tán, ra hoa vào các tháng 7 - 10. Cây Dừa cạn ít bị sâu bệnh hại, dễ trồng.
Thân cỏ nhỏ, mọc đứng, phân nhiều cành,
cao 40 - 60 cm. Thân hình trụ có 4 khía dọc, có
lông ngắn, thân non màu xanh lục nhạt sau
chuyển sang màu hồng tím. Lá đơn nguyên, mọc
đối, chéo chữ thập, hình trứng, đầu hơi nhọn, dài
4 - 7 cm, rộng 2 - 3 cm, mặt trên sẫm, mặt dưới
nhạt, có lông. Cuống lá ngắn, dài 3 - 5 mm. Gân
lá hình lông chim lồi mặt dưới, 12 - 14 cặp gân
phụ hơi lồi mặt dưới, cong hướng lên trên. Cụm
hoa: hai hoa ở kẽ lá. Hoa đều, lưỡng tính, mẫu 5;
cuống hoa dài 4 - 5 mm. Lá đài : hơi dính nhau ở
dưới, trên chia thành 5 thùy hình tam giác hẹp, có
lông ở mặt ngoài, dài 3 - 4 mm, hoa có 5 cánh.

Hình 2.2 Cây dừa cạn
(Hồ Lê Như Sang, 2013)

Ống tràng màu xanh, cao 2 - 4 cm, hơi phình ở gần họng, mặt ngoài có 5 chấm lồi; 5
thùy có màu đỏ hay hồng, trắng, tím, ở mặt trên, mặt dưới màu trắng, dài 1,5 - 1,7 cm,
miệng ống tràng có nhiều lông và có màu khác phiến (màu vàng hay đỏ nếu hoa trắng,
màu đỏ sẫm hay vàng nếu hoa màu hồng tím) tiền khai hoa vặn cùng chiều kim đồng
hồ. Có 5 nhị, rời, đính ở phần phình của ống tràng, xen kẽ cánh hoa, chỉ nhị ngắn. Bao
phấn hình mũi tên, 2 ô, hướng trong, khai dọc, đính đáy. Các bao phấn chụm trên đầu
nhụy. Hạt phấn rời, hình chữ nhật, có rãnh dọc. Có 2 lá noãn, rời ở bầu nhưng dính ở
vòi và đầu nhụy, mặt ngoài có nhiều lông, mỗi lá noãn mang nhiều noãn, đính noãn
4

mép, bầu trên. 1 vòi nhụy, dài bằng ống tràng, dạng sợi màu trắng. Đầu nhụy hình trụ,
màu xanh, đỉnh có 2 thùy nhọn, phía dưới có màng mỏng màu vàng. 2 đĩa mật màu
vàng, hình tam giác hẹp nằm xen kẽ 2 lá noãn, 2 quả đại dài 3 - 5 cm, mỗi quả chứa 12
- 20 hạt, xếp thành 2 hàng, hạt nhỏ, hình trứng (Trương Thị Đẹp, 2007).
2.1.4. Thành phần hóa học của cây Dừa cạn
Hoạt chất của Dừa cạn là alkaloid có nhân indol trong tất cả các bộ phận của
cây, nhiều nhất trong lá và rễ. Dừa cạn Việt Nam có tỷ lệ alkaloid toàn phần là 0,1 0,2%. Rễ chứa hoạt chất (0,7 - 2,4%) nhiều hơn trong thân (0,46%) và lá (0,37 1,15%). Các chất chủ yếu là: vinblastin, vincristin tetrahydroalstonin, prinin, vindolin,
catharanthin, vindolinin, ajmalicin, vincosid (glucoalkaloid tiền thân để sinh tổng hợp
các alkaloid) (Trương Thị Đẹp, 2007).
Nghiên cứu của các nhà khoa học cho thấy, Dừa cạn có chứa một số alkaloid có
tác dụng hạ huyết áp như trong cây ba gạc Ấn Độ (Rawolfia serpentiana Benth).
Ngoài ra còn có resecpin, secpentin, ajmalixin, vinxein, vindolixin, digitalin và hoạt
chất giống insulin, nhưng đáng chú ý nhất là những alkaloid có nhân indol có trong tất
cả các bộ phận của cây, nhiều nhất là ở rễ và rất thấp ở thân. Vincristin và vinblastin là
hai alkaloid được chiết xuất từ Dừa cạn có tác dụng điều trị ung thư thông qua ức chế
sự phân chia tế bào.
Năm 1870, Greshoff là người đầu tiên tìm thấy hoạt chất alkaloid trong cây
Dừa cạn. Năm 1928, Kaolay - Penet đã chiết suất được hai chất muối sulphat alkaloid
và một tactrac alkaloid dưới dạng tinh thể từ cây Dừa cạn. Năm 1953 Beer - Noble và
Cutts đã phân lập được Vincaleuco - blastin (Vinblastin) có tác dụng đối với một số
bệnh ung thư máu như Hodgkin. Năm 1959, Gordon H.svoboda - Norbert Neuss và
Marvia Gorman đã chiết được Vincristin và một số loại alkaloid từ cây Dừa cạn có tác
dụng chữa bệnh ung thư như leurosine và leurosdine. R.H.F Manske (1960) trong công
trình nghiên cứu về các loài cây cho alkaloid đã công bố ba hoạt chất có trong cây Dừa
cạn là Ajmalicine, Reserpine và Serpentine với các đặc điểm hóa học của nó. Trong
hội nghị ngành dược lần thứ 28 ở Hamburg (Đức) năm 1968 đã chính thức xác nhận
tác dụng điều trị bệnh ung thư của cây Dừa cạn. Từ đó các nhà khoa học đã tham gia
đông đảo vào nghiên cứu loài cây này (Trích theo Nguyễn Thị Định, 2012).
5

Ngoài ra trong cây Dừa cạn còn có một số chất khác có tác dụng hạ huyết áp, hạ
đường huyết như Ajmalicine, Reserpine và Serpentine, Tetrahydroserpentine, Akuamine.
Về mặt tính chất hóa học, các alkaloid có thể tham gia phản ứng cộng, oxi hóa khử.
Dưới tác dụng xúc tác của enzyme, một số monomer có thể kết hợp tạo thành
các dimer, ví dụ như sự kết hợp của hai tiền chất catharanthine với vindoline tạo thành
vinblastine và vincristine (Hình 2.3).
Đơn phương ứng
Đa phương ứng

Hình 2.3 Con đường sinh tổng hợp các indol alkaloid
ở cây Dừa cạn từ tiền chất (Tikhomiroff C, 2002).
2.1.5. Sự phân bố các alkaloid trong cây Dừa cạn
Sự phân bố các alkaloid khác nhau ở các bộ phận khác nhau của Dừa cạn tùy
thuộc nhiều vào các yếu tố liên quan đến quá trình sinh tổng hợp của cây. Sự hình
6


thành alkaloid ở lá, thân, rễ tùy thuộc vào bước sóng ánh sáng chiếu vào cây. Quá trình
tạo alkaloid trong rễ cây không có phản ứng quang hợp như các bộ phận trên mặt đất
của cây nên các alkaloid trong rễ cây là indol alkaloid không chứa nhóm methoxy như
ajmalicin, cathidine, serpentine, perivin, alstonin, tertrahydroalstonin, còn các alkaloid
ở lá có chứa nhóm methoxy như anhydrovinblastine, catharanthine, leusosine,
leurosidin, vinblastine, vincristine, vindoline, ở hạt thì có vinsedicin, vincedine, còn ở
hoa chỉ có có vinblastine dạng vết (Nguyễn Ngọc Hồng, 2004).
Ngoài ra, hàm lượng của alkaloid trong cây cũng phụ thuộc vào nhiều yếu tố
như khí hậu, ánh sáng, chất lượng đất, giống cây và cũng rất khác nhau tùy vào các bộ
phận thu hái.
Bảng 2.1 Hàm lượng alkaloid trong các bộ phận của cây Dừa cạn

Các bộ phận của cây

Hàm lượng alkaloid (%)

Lá

0,37 - 1,15

Thân

0,46

Rễ chính

0,7 - 2,4

Rễ phụ

0,9 - 3,7

Hoa

0,14 - 0,84

Vỏ quả

1,14

Hạt

0,18
(Nguồn: Phạm Thanh Kỳ, 2002)

2.1.6. Công dụng của alkaloid Dừa cạn
Vinblastin sulfat: Là thuốc dùng trong liệu pháp phối hợp, được lựa chọn hàng
đầu để điều trị ung thư biểu mô tinh hoàn và được lựa chọn hàng thứ hai trong liệu
pháp trị bệnh Hodgkin, ung thư nhau, ung thư biểu mô da đầu và ung thư biểu mô
thận. Lựa chọn hàng thứ ba để điều trị u nguyên bào thần kinh, ung thư vú, ung thư cổ
tử cung và ung thư dạng nấm da. Nó cũng được dùng chữa bệnh sarcom lympho,
sarcom chảy máu Kaposi và sarcom tế bào lưới.
Vincristin sulfat: Là một trong những thuốc chống ung thư được dùng rộng rãi
nhất, đặc biệt có ích đối với các bệnh ung thư máu, thường được dùng để làm thuyên
giảm bệnh bạch cầu lympho cấp. Nó được dùng trong liệu pháp phối hợp thuốc, là lựa
chọn hàng đầu để điều trị bệnh Hodgkin, u bạch huyết không - Hodgkin, ung thư biểu
7


mô phổi, u Wilm, bạch cầu tủy bào mạn (đợt cấp tính), sarcom Ewing và sarcom cơ
vân. Phối hợp thuốc chứa Vincristin là lựa chọn hàng thứ hai cho ung thư biểu mô vú,
ung thư cổ tử cung, u nguyên bào thần kinh và bệnh bạch cầu lympho mạn tính.
Vindoline và catharanthine: được dùng trong việc điều trị bệnh bí tiểu và làm hạ
lượng đường trong máu. Từ vindoline và catharanthine người ta tổng hợp được những
alkaloid chứa nhóm dimer như vinblastine, vincristine có tác dụng trị ung thư.
Ajmalicine: là chất có biệt tính dược học mạnh, dùng để điều trị cao huyết
áp, dùng làm thuốc giảm đau và điều trị các bệnh về hệ thần kinh và các triệu chứng
lâm sàng khác. Serpentine: dùng để điều trị bệnh cao huyết áp và thuốc an thần.
2.2 Hợp chất thứ cấp
Hợp chất thứ cấp: là những hợp chất đặc trưng cho loài cây trồng và chúng
đóng vai trò quan trọng trong sự sống và sinh sản của thực vật. Các hợp chất thứ cấp là
những hợp chất được sinh tổng hợp từ chất trao đổi sơ cấp nhưng có sự phân bố giới

hạn trong thực vật (Trần Thị Lệ Minh, 2006).
2.2.1. Tình hình nghiên cứu hợp chất thứ cấp ở Việt Nam
Ở Việt Nam, công nghệ tách chiết các hợp chất thứ cấp chủ yếu gắn liền với công
nghệ nuôi cấy tế bào và chúng phát triển vào những năm 1970. Từ đó đến nay đã đạt
được nhiều thành công, đáng kể nhất đó chính là quy trình sản xuất sâm Ngọc Linh do
Học viện Quân y khai thác. Chỉ với một vài tế bào từ rễ củ sâm Ngọc Linh, bằng kỹ
thuật nuôi cấy tế bào, các nhà khoa học của Học viện Quân y đã có thể sản xuất sâm
Ngọc Linh với số lượng lớn trong vòng 10-20 ngày. Cụ thể đã hoàn chỉnh quy trình nuôi
cấy tế bào, xây dựng được quy trình định tính và định lượng các thành phần ginsenosid
trong sinh khối sâm Ngọc Linh bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC), so sánh với sâm
Ngọc Linh tự nhiên và chất chuẩn, đánh giá tính an toàn và tác dụng dược lý của sâm
Ngọc Linh, bào chế thành công một số chế phẩm từ hoạt chất chiết xuất từ sâm Ngọc
Linh sinh khối như nước uống tăng lực và viên nang mềm. Các công nghệ này đang
được Công ty Nước khoáng Tiền Hải (Thái Bình) đề xuất chuyển giao để sản xuất nước
uống tăng lực. Phương pháp sản xuất sinh khối tế bào rễ sâm Ngọc Linh được cấp bằng
độc quyền sáng chế số 7523 vào ngày 11/02/2009 (Oanh Vũ, 2009).
Việt Nam đang triển khai dự án nuôi cấy và chiết xuất taxol từ cây thông đỏ ở
Lâm Đồng. Ngoài ra còn có "Nghiên cứu sản xuất arteminisin dùng kỹ thuật nuôi cấy tế
bào từ cây thanh hao hoa vàng" của Viện sinh học Nhiệt đới trong nghị định thư hợp tác
8


với Malaysia (2007 - 2010) hay đại học Huế "Nghiên cứu khả năng tích lũy
glycoalkaloid ở callus cây cà gai leo Solanum hainanense". Tuy nhiên, những dự án nói
trên vẫn còn ở quy mô phòng thí nghiệm. Phát triển các kỹ thuật nuôi cấy trong các
bioreactor ở quy mô công nghiệp để sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học vẫn còn
là con đường đầy tiềm năng chưa được khai phá hết của nền công nghệ tách chiết các
hợp chất thứ sinh từ thực vật ở Việt Nam. (Oanh Vũ, 2009).
2.2.2. Vai trò của hợp chất thứ cấp
Các hợp chất thứ cấp đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau:

Một số các hợp chất có tác dụng mạnh lên hệ thần kinh của người và động vật,
được sử dụng trong y học làm thuốc giảm đau, giảm huyết áp như nicotin ở cây thuốc
lá, atropin ở cây cà độc dược.
Một số chất có mùi thơm đặc trưng được sử dụng trong y học, trong công nghệ
thực phẩm như tinh dầu của cây khuynh diệp, bạch đàn, long não, thông, mù tạc, cam,
chanh, bưởi. Một số chất vừa tạo ra được tế bào sử dụng để sinh tổng hợp các chất khác,
một số chất đóng vai trò điều hòa sinh trưởng ở thực vật (Ngô Xuân Mạnh, 2006).
Ngoài ra chúng còn được ứng dụng trong lĩnh vực thuốc trừ sâu, thuốc diệt côn
trùng do các chất chiết từ một số loài thực vật có đặc tính kháng khuẩn, kháng nấm,
kháng virus, vì có nguồn gốc từ tự nhiên nên không làm ảnh hưởng đến sức khỏe con
người và môi trường sinh thái. Bởi vì có hoạt tính sinh học cao, nên các hợp chất thứ
cấp từ lâu đã được sử dụng làm thuốc trong y học cổ truyền và ngày nay chúng vẫn là
nguồn nguyên liệu có giá trị trong bào chế dược phẩm. Một số hợp chất thứ cấp như
glucosinolate, alkaloid gây độc có chọn lọc đối với tế bào tiền ung thư được dùng để
bào chế thuốc chống ung thư, hoặc một số chất có tác dụng trên tim như ajmalin,
quinidin được dùng làm thuốc chữa loạn nhịp tim.
2.2.3. Sự phân loại hợp chất thứ cấp
Các hợp chất thứ cấp có trong thực vật với một số lượng khá lớn và phong phú
về chủng loại. Có thể phân loại hợp chất thứ cấp theo con đường sinh tổng hợp hoặc
theo cấu tạo hóa học.
Phân loại theo con đường sinh tổng hợp. Có thể chia ba nhóm chủ yếu:
phenolic, terpene và steroid, alkaloid (Milesi và ctv, 2001).
Phân loại dựa vào cấu tạo hóa học có thể chia thành các nhóm: axit hữu cơ,
hợp chất phenol, hợp chất hydroxy aromatic, glucoside, tinh dầu, cao su và nhựa gutta,
hợp chất alkaloid và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (Ngô Xuân Mạnh, 2006).
9


2.3. Alkaloid
2.3.1. Khái niệm về alkaloid

Từ đầu thế kỷ 19, các nhà khoa học đã phân lập được một số chất có tính kiềm
từ cây cỏ và được đặt tên khác nhau theo loài tên thực vật tách chiết ra hợp chất đó.
Năm 1819, dược sĩ Wilhelm Messner đề nghị xếp những chất có tính kiềm lấy được từ
thực vật ra một nhóm riêng gọi là alkaloid và đưa ra định nghĩa “Alkaloid là những
hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, có phản ứng kiềm và được lấy ra từ thực vật”.
Sau này các nhà khoa học đã chiết được nhiều hợp chất có tính kiềm từ thực vật
như: piperin (1819), cafein (1819), colchicin (1820), coniin (1826), codein (1832),
narcein (1832), papaverin (1848) đồng thời cũng tìm thấy trong động vật loài cóc Bufo
và loài ếch độc Phyllosbates aurotaenia. Ngoài tính kiềm, alkaloid còn một số đặc tính
khác như hoạt tính sinh học mạnh và phản ứng với một số thuốc thử chung của
alkaloid. Sau này Polonopski đã đưa ra định nghĩa: Alkaloid là những hợp chất chứa
nitơ, đa số có nhân dị vòng, có phản ứng kiềm, thường gặp ở thực vật và đôi khi trong
động vật, có đặc tính sinh học mạnh và có một số thuốc thử gọi chung là thuốc thử của
alkaloid.
2.3.2. Phân bố alkaloid trong tự nhiên
Alkaloid phổ biến trong thực vật. Ngày nay đã biết khoảng trên 16000 loại
alkaloid từ trên 5000 thực vật, hầu hết ở thực vật bậc cao chiếm khoảng 15% - 20%
tổng số các loài cây. Có những họ chứa trên 50% các loài cây chứa alkaloid như:
Ranunculaceae, Berberidacea, Papaveraceae, Buxaceae, Cactaceae.
Ở nấm, alkaloid có trong nấm Cựu khỏa mạch Claviceps pupurea và nấm
Amanita phalloides. Ở động vật tìm thấy các chất như: bufotenin, bufotenidin, erotonin
từ loài cóc Bufobufo gagorizans, Bufobufo, asiaticus, Bufo melanciticus và loài ếch
độc Phyllosbates aurotaeni; Ngoài ra còn tìm thấy samandarins, samandacidin trong
da của loài kì nhông Salamandra maculosa và Salamandra altra.
Hàm lượng alkaloid trong cây là rất thấp, trừ một số trường hợp như Canhkina
hàm lượng alkaloid khoảng 6 - 10%, trong nhựa thuốc phiện là 20 - 30%. Một dược
liệu chứa 1 - 3% được coi là có hàm lượng khá cao.
Trong cây, alkaloid ít khi ở trạng thái tự do mà thường ở dạng muối của các axit
hữu cơ như citrate, tartrate, malate, oxalate, acetate đôi khi ở dạng muối vô cơ tan
trong dịch tế bào.

10


2.3.3. Tính chất chung của alkaloid
* Tính chất vật lý: hầu hết alkaloid là không màu ở dạng tinh thể rắn và có
nhiệt độ nóng chảy cao. Tuy nhiên, một vài alkaloid ở dạng nhựa vô định hình, một vài
alkaloid ở dạng lỏng như nicotine hay có màu như berberine.
* Tính tan: phần lớn alkaloid là ở dạng bazơ tự do nên tan được trong dung môi
hữu cơ và không tan được trong nước ở pH cao, các muối của alkaloid thì tan trong
nước, alcol và hầu như không tan trong dung môi hữu cơ. Ở pH thấp alkaloid sẽ thêm
vào một proton và trở nên tan trong nước, không tan trong dung môi hữu cơ. Tính tan
của alkaloid rất quan trọng trong việc ly trích các alkaloid ra khỏi cây, trong phân tích
các loại alkaloid và trong việc bào chế các alkaloid thành các dạng thuốc phù hợp.
* Tính chất hóa học: alkaloid với những nhóm chức liền kề chủ yếu là cho điện
tử. Những hợp chất thu điện tử (như nhóm amide carbonyl) là trung tính hay mang tính
acid yếu. Những alkaloid ở dạng bazơ tự do không ổn định như ở dạng muối.
Các alkaloid cho một số phản ứng chung thường dùng để xác định chúng:
alkaloid tạo tủa với kim loại nặng hay acid hữu cơ. Có nhiều loại thuốc thử tạo tủa với
alkaloid như thuốc thử Mayer, thuốc thử Dragendoff.
Nói chung, alkaloid là hợp chất tương đối bền. Tuy vậy, một số hợp chất thuộc
loại dẫn xuất của indol sẽ dễ bị phân hủy hoặc biến chất khi gặp ánh sáng và các tác
nhân oxi hóa.
2.3.4. Phân loại alkaloid
Căn cứ vào cấu tạo hóa học alkaloid trong cây Dừa cạn làm ba nhóm chính:
Nhóm alkaloid có nhân indol: perivine, peviridine, perosine, catharanthine,
cavicine, ajmalicine.

Hình 2.4 Công thức cấu tạo của ajmalicine
(Nguồn: )

11


Nhóm alkaloid có nhân indoline: lochnericine, lochneridin, lochrovine,
vindoline, ajmaline.

Hình 2.5 Công thức cấu tạo của vindoline
(Nguồn: />
Nhóm alkaloid có hai vòng indol hoặc một vòng indol và một vòng indoline
như leurosine và leurosidine đặc biệt trong nhóm này có những alkaloid có tác dụng
chữa bệnh ung thư như vinblastine nhưng có hàm lượng rất thấp: 0,005 - 0,015% trong
lá và vincristine: 0,003 - 0,005% trong lá.

Hình 2.6 Công thức cấu tạo của vinblastine và vincristine
(Nguồn: ).

2.3.5. Ứng dụng của alkaloid
Các loại cây chứa alkaloid có giá trị kinh tế lớn. Nhiều alkaloid được sử dụng
rộng rãi trong y học dùng làm thuốc. Vinblastine, vincristine dùng trị bệnh ung thư;
vindolin và catharanthin dùng trong điều trị bệnh bí tiểu và làm hạ đường huyết trong
máu; ajmalicine dùng trong trị bệnh cao huyết áp, làm thuốc giảm đau; serpentin dùng
trong trị bệnh cao huyết áp và làm thuốc an thần.
Atropine là một trong những alkaloid quan trọng tác dụng lên hệ thần kinh, sử
dụng để làm giãn cơ con ngươi, giải độc khi ngộ độc nicotine, liều điều trị 0,001
0,003 g, liều cao hơn sẽ độc. Cocain làm tê liệt đầu mút dây thần kinh cảm giác, được
dùng làm chất gây tê bộ não.
12


Morphin là thứ thuốc rất có giá trị trong y học: làm giảm đau, thuốc ngủ. Giá trị

quý của morphin là tác dụng giảm đau theo kiểu tiêu cảm giác đau, tác dụng lên trung
tâm xác định bán cầu não. Sự tác động lên trung tâm này là cực kỳ quý báu vì với liều
lượng nhỏ làm giảm đau mà không làm xáo trộn ý thức. Nếu lượng morphin lớn sẽ có
hại, làm người chết do tình trạng tê liệt trung tâm thở.
Quinin cùng với nhiều alkaloid khác có chứa trong vỏ cây Quinquina thường
mọc ở vùng nhiệt đới. Quinin được dùng trong y học dưới dạng muối clohidrat hoặc
sunfat. Nó là một loại thuốc tốt chống bệnh sốt rét và hạ sốt. Với liều lượng lớn quinin
là chất độc.
Các alkaloid có giá trị lớn trong y học nhưng bên cạnh chúng cũng có tác dụng
gây độc hại đối với cơ thể con người. Vì thế việc sử dụng alkaloid trong điều trị bệnh
cần được tìm hiểu kỹ, không nên quá lạm dụng gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe.
(hppt://www.baigiang.bachkim.vn/presentation/show/pr_id/31195)
2.4. Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
2.4.1 Nguồn gốc phân loại
Giới: Bacteria; Ngành: Proteobacteria; Lớp: Alphaproteobacteria; Bộ:
Rhizobiales; Họ: Rhizobiaceae; Chi: Agrobacterium; Loài: Agrobacterium rhizogenes
(Nguồn: Conn, 1942).
2.4.2. Đặc điểm chung
Chi Agrobacterium là nhóm vi khuẩn có tính chất sinh sản trong đất, cùng một họ với
Rhizobium. Agrobacterium gồm có 4 loài: A. tumfaciens, A. rhizogenes, A. rubi, A. radiobacter.
A. rhizogenes là vi khuẩn hình que, Gram âm, có tính di động, không sinh bào
tử. Thuộc chi Agrobacterium. A. rhizogenes có quan hệ rất gần với A. tumefaciens. Nó
gây ra bệnh trên tầng lông hút của rễ cây Song tử điệp (Bùi Chí Bửu, 2000).
Cơ chế lây nhiễm của A. rhizogenes đối với cây cũng tương tự như A.
tumefaciens, nhưng trong vùng T-DNA của A. rhizogenes chỉ có gen sản xuất ra auxin,
vì thế sự thay đổi hình thái chính của thực vật nếu do A. tumefaciens gây bệnh mụn tán
còn A. rhizogenes gây bệnh rễ tóc (hairy roots) (Nguyễn Hoàng Lộc, 2008).
Từ vùng bị nhiễm sẽ tạo ra những rễ nhánh bất thường gọi là rễ tóc (hairy root).
Những rễ này có đặc điểm là phát triển ăn nghiêng, phân nhánh nhiều, tăng trưởng
nhanh và đặc biệt là chúng có khả năng phát triển in vitro trong điều kiện không có các

13


yếu tố kích thích tăng trưởng (Taylor. V and Christopher, 2007). Do những đặc điểm
trên mà rễ tóc trở thành công cụ được sử dụng rộng rãi trong việc sản xuất các hợp
chất thứ cấp như các nghiên cứu của Trần Thị Lệ Minh (2009); Lê Thị Nhàn (2009);
Nguyễn Vũ Phong (2010); Nguyễn Sĩ Tuấn (2010); Vũ Thị Đào (2011).
2.4.3. Ri plasmit và T - DNA
A. rhizogenes có chứa 1 plasmid lớn (từ 200 - 800 kb) gọi là Ri - plasmid (root
inducing plasmid) chính là tác nhân gây bệnh cho cây (Bùi Chí Bửu, 2000).

Hình 2.7 Plasmid của vi khuẩn A. rhizogenes
(Nguồn: Taylor. V and Christopher 2007).

Ri plasmid được chia thành hai loại chính tùy theo sản phẩm opine mà nó tổng
hợp ra trong quá trình cảm ứng tạo rễ tóc. Thứ nhất là agropine Ri plasmid tổng hợp
opine agropine và mannopine, thứ hai là mannopine Ri plasmid tổng hợp opine
mannopine. Hầu hết các nghiên cứu về Ri plasmid là thuộc agropine Ri plasmid (Trích
theo Lê Thị Nhàn, 2009).
A. rhizogenes gây nhiễm vào tế bào thực vật ở vị trí vết thương, do A.
rhizogenes bị hấp dẫn bởi hợp chất phenol được phóng ra từ các tế bào bị tổn thương.
A. rhizogenes không trực tiếp xâm nhập vào tế bào thực vật mà Ri plasmid (root
inducing plasmid) sẽ xâm nhập vào tế bào thực vật và một đoạn nhỏ T - DNA
(tranferred DNA) của Ri plasmid sẽ được chuyển và gắn vào bộ gen của tế bào thực
vật. Ri plasmid của A. rhizogenes và Ti plasmid của A. tumefaciens thì tương tự nhau
về cấu trúc. Cả Ri và Ti plasmid gần vùng biên của T - DNA có 1 chuỗi mã có tính
chất lặp lại gồm 24bp, được gọi là trình tự biên (boder sequences). T - DNA nguyên
thủy mang một nhóm gen gây ung thư và dị hóa opine, biểu hiện ở những tế bào thực
14