ẢNH HƯỞNG CỦA QUÁ TRÌNH LÊN MEN ĐẾN HÀM LƯỢNG QUERCETIN TRONG CỦ HÀNH TA (ALLIUM ASCALONICUM L.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ẢNH HƯỞNG CỦA QUÁ TRÌNH LÊN MEN
ĐẾN HÀM LƯỢNG QUERCETIN TRONG CỦ HÀNH TA
(ALLIUM ASCALONICUM L.)

Ngành học:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện:

NGUYỄN THỊ THÙY TRANG

Niên khóa:

2010 – 2014

Tháng
i 1/2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ẢNH HƯỞNG CỦA QUÁ TRÌNH LÊN MEN
ĐẾN HÀM LƯỢNG QUERCETIN TRONG CỦ HÀNH TA
(ALLIUM ASCALONICUM L.)

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

TS. HUỲNH VĂN BIẾT

NGUYỄN THỊ THÙY TRANG

ThS. LÊ VĂN HUY

Tháng 1/2014
ii


LỜI CẢM ƠN
Con xin khắc ghi công ơn của cha mẹ và mọi người trong gia đình đã cho con được
sinh ra và cảm nhận cuộc sống tươi đẹp này, cảm ơn mọi người đã luôn sát cánh
bên con, quan tâm, chở che, nuôi dưỡng và giáo dục con nên người.
Tôi xin gửi lòng biết ơn đến: Ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ
Chí Minh, Ban lãnh đạo Viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường,
cùng các Thầy, Cô trong bộ môn Công nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Nông Lâm
Tp. Hồ Chí Minh đã luôn hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình
học tập cũng như trong thời gian tôi tiến hành làm đề tài tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành biết ơn Thầy TS. Huỳnh Văn Biết và Thầy ThS. Lê Văn Huy
đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, dành nhiều thời gian và công sức để truyền đạt

kiến thức, chia sẻ những kinh nghiệm quý giá, những chỉ bảo tận tình và luôn tạo
điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành đề tài tốt nghiệp của mình.
Và cuối cùng, tôi cũng xin chân thành cảm ơn các bạn trong tập thể lớp DH10SH
đã luôn sát cánh bên tôi, động viên tôi, cùng tôi chia sẻ những khó khăn mà tôi vấp
phải cũng như cho tôi những kinh nghiệm quý giá từ bản thân các bạn để tôi có thể
hoàn thành tốt đề tài của mình.

Sinh viên thực hiện
NGUYỄN THỊ THÙY TRANG

i


TÓM TẮT
Hành ta được biết đến như một loại gia vị không thể thiếu được trong gian bếp
mỗi nhà, ở Việt Nam hành còn được muối chua ăn vào dịp tết Nguyên đán. Tuy nhiên,
các nghiên cứu trên đối tượng này ở nước ta còn khá ít, do đó đề tài “Ảnh hưởng của
quá trình lên men đến hàm lượng Quercetin trong củ hành ta (Allium ascalonicum L.)”
đã được tiến hành, nhằm xác định sự hiện diện của quercetin và hàm lượng của
hợp chất này trong hành ta ở dạng tươi và lên men.
Kết quả nghiên cứu cho thấy hành ta có độ ẩm là 73,47 % (CV = 1,10 %, n = 3).
Mẫu được xay nhỏ, sấy khô, chiết bằng methanol và xác định quercetin bằng HPLC.
Kết quả cho thấy thời gian lưu của quercetin dao động từ 6 – 8 phút, với hiệu suất thu
hồi là 103,23 % (CV = 0,74 %, n = 2). Hàm lượng quercetin trong vỏ và ruột củ hành
lần lượt là 334,5 µg/g (tr = 7,47 phút) và 84,0 µg/g (tr = 7,15 phút). Khi khảo sát
ảnh hưởng của quá trình lên men đến hàm lượng quercetin, kết quả cho thấy
hàm lượng quercetin ở phần vỏ củ hành tăng gấp 3,53 lần (1181,2 µg/g, sau 5 ngày
muối ở công thức muối 2), và phần ruột củ hành tăng gấp 4,48 lần (376,5 µg/g, sau 8
ngày muối ở công thức muối 2). Cao hành tươi được thu hồi với hiệu suất là 68,46 %
(CV = 4,44 %, n = 3), cao hành muối là 82,64 % (CV = 3,21 %, n = 3) để khảo sát các

hoạt tính sinh học. Kết quả đánh giá hoạt tính chống oxy hóa bằng DPPH, giá trị IC50
của cao hành tươi là 6044,00 µg/ml (CV = 4,05 %, n = 3), của cao hành muối là
227,14 µg/ml (CV = 1,48 %, n = 3). Tuy nhiên, cả hai loại cao chiết đều không
cho thấy khả năng kháng khuẩn Staphylococcus aureus ATCC 43300 và Escherichia
coli ATCC 2592.

Từ khóa: Allium ascalonicum L, Quercetin, HPLC, chống oxy hóa, kháng khuẩn,
muối chua.

ii


SUMMARY
Hanh ta (Allium ascalonicum L.) is known as an indispensable in every kitchen,
Hanh ta is also fermented for use in Lunar New Year, in VietNam. However, it
appears to be the limitted numbers of researches on this subject in VietNam, so the
thesis " Effect of fermentation to content of quercetin in hanh ta (Allium ascalonicum
L.)" was conducted to determine the presence of quercetin and concentration of this
compound in Hanh ta in both the form of fresh and fermented Hanh ta.
The study results showed that the moisture of Hanh ta was 73.47 % (CV = 1.10 %,
n = 3). Material was crushed, dried, extracted with methanol and Quercetin was
determined by HPLC. The retention time of Quercetin varied from 6 - 8 minutes, with
the recovery performance of 103.23 % (CV = 0.74 %, n = 2). Quercetin contented in
onion case and core were 334.5 µg/g (tr = 7.47 minutes) and 84.0 µg/g (tr = 7.15
minutes), respectively.The investigation of the effectiveness of the fermentation to
Quercetin concentration also demonstrated that Quercetin content in onion case was
increased to 3.53 times (1181.2 µg/g after 5 days fermented as formula 2), and in
onion core incrediblely up to 4.48 times (376.5 µg/g after 8 days fermentedas formula
2). The recovery performance of the fresh onion was 68.46 % (CV = 4.44 %, n = 3)
and the fermentedonion was 82.64 % (CV = 3.21 %, n = 3). In the evaluation

ofbioactivity, the estimation of the antioxidant activity by DPPH proven that the IC50
value of the fresh onion and fermented oninon extracted in methanol were
6044.00µg/ml (CV = 4.05%, n = 3), and 227.14 µg/ml (CV = 1.48 %, n = 3),
respectively. However, extracts did not experienced antibacterial activities in the
experiments with Staphylococcus aureusATCC 43300 and Escherichia coli ATCC
2592.
Keywords: Allium ascalonicum L., Quercetin, HPLC, antioxidant, antibacterial,
fermentation.

iii


MỤC LỤC
 
Trang
Lời cảm ơn .......................................................................................................................i
Tóm tắt ........................................................................................................................... ii
Sumamry ........................................................................................................................ iii
Mục lục .......................................................................................................................... iv
Danh sách các chữ viết tắt ............................................................................................ vi
Danh sách các hình ...................................................................................................... vii
Danh sách các bảng, biểu đồ ...................................................................................... viii
Chương 1 MỞ ĐẦU .......................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................................1
1.2. Yêu cầu của đề tài.....................................................................................................2
1.3 Nội dung thực hiện ....................................................................................................2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...............................................................................3
2.1. Tổng quan về hành ta được sử dụng trong nghiên cứu ............................................3
2.2. Tổng quan về Quercetin ...........................................................................................3
2.2.1. Cấu trúc..................................................................................................................4

2.2.2 Tính chất hóa học ...................................................................................................5
2.3. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao dùng để định lượng quercetin ..................5
2.4. Tổng quan về phương pháp lên men lactic...............................................................6
2.5. Phương pháp thu hồi cao chiết bằng hệ thống chiết Soxhlet ...................................7
2.6. Các giống vi sinh vật được sử dụng để thử hoạt tính kháng khuẩn .........................8
2.6.1. Sơ lược về giống tụ cầu khuẩn (Staphylococcus)..................................................8
2.6.2. Sơ lược về giống Escherichia................................................................................9
2.6.3 Phương pháp khoanh giấy kháng sinh khuếch tán ................................................9
2.7. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa bằng DPPH .................................9
2.8 Một số công trình nghiên cứu trong và ngoài nước ...............................................10
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................13
3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành nghiên cứu ..........................................................13
3.2. Vật liệu được sử dụng để tiến hành nghiên cứu .....................................................13
iv


3.2.1. Mẫu thí nghiệm...................................................................................................13
3.2.2. Hóa chất được sử dụng trong quá trình nghiên cứu ...........................................13
3.2.3 Thiết bị và dụng cụ được sử dụng để thực hiện những nghiên cứu .....................13
3.3. Các phương pháp được sử dụng để tiến hành những nghiên cứu ..........................13
3.3.1. Phương pháp xác định độ ẩm nguyên liệu theo tiêu chuẩn Việt Nam ................13
3.3.2. Xác định hàm lượng quercetin bằng hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao ...........14
3.3.3. Khảo sát sự ảnh hưởng của quá trình muối chua đến hàm lượng quercetin .......15
3.3.4. Phương pháp thu hồi cao chiết bằng hệ thống soxhlet ........................................16
3.3.5. Đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết ..................................................17
3.3.6 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết bằng DPPH .......18
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................................19
4.1. Kết quả xác định độ ẩm nguyên liệu ......................................................................19
4.2. Kết quả xác định hàm lượng quercetin trong hành ta ............................................20
4.3. Khảo sát sự ảnh hưởng của quá trình lên men đến hàm lượng quercetin ..............21

4.3.1. Sự ảnh hưởng của công thức thứ nhất đến hàm lượng quercetin ........................21
4.3.2 Sự ảnh hưởng của công thức thứ hai đến hàm lượng quercetin ...........................23
4.4. Kết quả của quá trình thu hồi cao chiết ..................................................................24
4.5. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ..........................................26
4.6. Kết quả đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết bằng DPPH ...................27
4.7 Thảo luận .................................................................................................................31
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..........................................................................33
5.1. Kết luận...................................................................................................................33
5.2 Đề nghị ....................................................................................................................33
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................34

v


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ACN: Aceton nitrile
ACSOs: Ank(en)yl sulphoxides cysteine .
Amp: Ampicillin
BHA: Butylated Hydroxyl Anisole
DMSO: Dimethylsulfuoxid
DPPH: 1,1-diphenyl-1-picrylhydrazine
FDA: Food and Drug Administration
HPLC: High Pressure Liquid Chromatography
HT22: Mouse hippocampal cells
IC50: Inhibitory Concention 50
MeOH: Methanol
OD: Optical Density
OH: Hydroxyl
TSA: Trypticase Soy Agar

vi


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1Hành ta được sử dụng trong nghiên cứu ..................................................... 3
Hình 2.2 Cấu trúc của Quercetin ............................................................................... 4
Hình 2.3 Mô tả tổng quát các bộ phận của máy sắc kí lỏng ..................................... 6
Hình 2.4 Hệ thống chiết soxhlet ............................................................................... 8
Hình 2.5 Cơ chế của phản ứng DPPH ...................................................................... 10
Hình 3.1 Quy trình xác định độ ẩm nguyên liệu ....................................................... 14
Hình 3.2 Quy trình tiến hành chiết mẫu để phân tích ............................................... 15
Hình 3.3 Quy trình thu hồi cao chiết bằng dung môi MeOH ................................... 16
Hình 3.4 Hình ảnh minh họa về kháng sinh đồ ........................................................ 18
Hình 4.1Dụng cụ và hệ thống xác định độ ẩm nguyên liệu ...................................... 20
Hình 4.2Sắc ký đồ của một số mẫu sau khi phân tích bằng HPLC .......................... 21
Hình 4.3 Đường chuẩn quercetin dùng để định lượng quercetin trong mẫu ............ 22
Hình 4.4 Cao chiết thu được sau khi chiết Soxhlet và cô quay ................................ 26
Hình 4.5Hình ảnh quan sát được sau khi tiến hành ................................................... 27
Hình 4.6Hình ảnhquan sát được sau khi tiến hành .................................................... 27
Hình 4.7 Hình ảnh sau 30 phút phản ứng với DPPH của vitamin C ......................... 28
Hình 4.8 Mối tương quan giữa hoạt tính chống oxy hóa và nồng độ ....................... 29
Hình 4.9 Hình ảnh sau 30 phút phản ứng với DPPH của cao hành tươi .................. 29
Hình 4.10 Mối tương quan giữa hoạt tính chống oxy hóa và nồng độ ...................... 30
Hình 4.11 Hình ảnh sau 30 phút phản ưng với DPPH ............................................... 30
Hình 4.12 Mối tương quan giữa hoạt tính chống oxy hóa và nồng độ ...................... 31

vii

DANH SÁCH CÁC BẢNG, BIỂU ĐỒ
Trang
Bảng 3.1Cách bố trí thí nghiệm để khảo sát ............................................................. 16
Bảng 3.2 Nồng độ các mẫu dùng để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn ....................... 17
Bảng 3.3 Nồng độ các mẫu dùng để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa ................... 18
Bảng 4.1 Kết quả xác định độ ẩm nguyên liệu ......................................................... 20
Bảng 4.2 Kết quả thu hồi cao chiết trên hành tươi .................................................... 25
Bảng 4.3 Kết quả thu hồi cao chiết trên hành muối .................................................. 26
Bảng 4.4 Hoạt tính chống oxy hóa trung bình của các mẫu.............................................28
Bảng 4.5 Kết quả tổng hợp của các phản ứng đánh giá hoạt tính chống oxy hóa ..... 31
Biểu đồ 4.1 Hàm lượng quercetin ở công thức muối thứ nhất................................... 23
Biểu đồ 4.2 Hàm lượng quercetin ở công thức muối thứ hai..................................... 24

viii


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Hành thuộc họ Hành (Alliaceae) là cây thảo có tính nóng, các bộ phận của hành
đều được sử dụng (củ, lá) để xào nấu hoặc ăn sống. Theo một số nghiên cứu cho thấy
trong hành có chứa hợp chất quercetin có khả năng chống oxy hóa, kháng ung thư,
kháng khuẩn, kháng viêm, tác động đến quá trình chuyển hóa lipid,… (Ramos và ctv,
2006; Naidu và ctv, 2012). Ở các nước phương tây, hành tây được sử dụng phổ biến,
và quá trình lên men đã làm cho hàm lượng quercetin trong hành tây tăng lên, từ đó
tăng cường khả năng chống oxy hóa và bảo vệ thần kinh (Yang và ctv, 2012).
Ở Việt Nam, hành tây không được dùng phổ biến như một số loại hành khác: hành
ta, hành hương, hành nén; có thể do khác nhau về kích thước, hương vị, màu sắc.
Trong các loại hành ở Việt Nam, hành ta được xem là loại hành được sử dụng phổ
biến nhất, là gia vị không thể thiếu được trong gian bếp của mỗi nhà. Hành ta
thường được trồng nhiều ở miền Trung (huyện đảo Lý Sơn, tỉnh Quảng Ngãi) và

miền Nam (huyện Vĩnh Châu, Sóc trăng). Hàng năm, nhu cầu của loại gia vị này rất
lớn, đặc biệt là vào dịp tết Nguyên đán, ngoài việc được dùng làm gia vị, hành ta
còn được dùng để muối chua ăn kèm với thịt muối hay bánh chưng, bánh tét; thể hiện
không khí của ngày xuân sum vầy.
Tuy nhiên ở Việt Nam, lại chưa có nhiều nghiên cứu về hợp chất quercetin này trên
hành ta, quercetin có trong hành ta hay không và với hàm lượng là bao nhiêu, và
món dưa hành ở Việt Nam ta cũng trải qua quá trình lên men, vậy hàm lượng và hoạt
tính chống oxy hóa có được cải thiện như ở hành tây được lên men hay không. Xuất
phát từ thực tế này, đề tài “Ảnh hưởng của quá trình lên men đến hàm lượng quercetin
trong củ hành ta (Allium ascalonicum L.)” đã được tiến hành.

1


1.2. Yêu cầu của đề tài
-

Xác định hàm lượng quecerin trong củ hành ta (Allium ascalonicum L.) ở nước
ta ở dạng tươi và lên men.

-

Đánh giá được hoạt tính sinh học của cao hành tươi và hành muối.

-

Khảo sát sự ảnh hưởng của quá trình lên men đến hàm lượng quercetin.

1.3 Nội dung thực hiện
Để đạt được yêu cầu đã đặt ra của đề tài cần thực hiện các nội dung sau:

-

Xác định độ ẩm nguyên liệu.

-

Xác định hiệu suất thu hồi cao chiết.

-

Đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết trên hai chủng vi sinh vật:
Staphylococcus aureus, Escherichia coli.

-

Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết bằng DPPH

-

Định lượng quecertin bằng HPLC.

-

Khảo sát sự ảnh hưởng của quá trình lên men đến hàm lượng quercetin trong
hành.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Tổng quan về hành ta được sử dụng trong nghiên cứu
Hành ta (Allium ascalonicum L.) thuộc họ hành Alliaceae là cây thảo sống dai,
cao 15 – 50 cm; hành to 2 – 3 cm, có cạnh, vẩy mỏng như giấy, thường có màu đỏ hay
màu trắng. Lá hình trụ nhọn, rỗng, tròn, màu xanh mốc. Cụm hoa rộng cách mặt đất
20 - 25 cm; tán hoa hình cầu; hoa có 6 phiến hoa rời, màu trắng, hường hay tim tím;
cuống hoa 1 – 1,5 cm.
Hành ta được trồng làm rau ăn từ lâu đời, cây
chịu được lạnh vào mùa đông, thường trồng ở rẫy
và ở vùng đồng bằng. Hành ta thường được dùng
làm gia vị; lá dùng ăn sống hoặc xào nấu với các
loại rau, thịt; củ dùng để xào nấu. Nhân dân ta
thường dùng củ hành vào dịp Tết Nguyên đán.
Trong dưa hành, có nhiều loại men và acid lactic
có tác dụng ngăn cản quá trình lên men thối ở ruột
giúp cho cơ trể tránh đầy hơi, nhiễm độc. Trong y
học dân gian, thường dùng hành chữa thương hàn

Hình 2.1 Củ hành ta
(Allium ascalonicum L.)

trúng phong, nhức đầu nóng lạnh, vú sưng, trẻ em
trúng ác và sưng thũng (Võ Văn Chi, 2003).
2.2. Tổng quan về Quercetin
Theo tài liệu từ website của WHO, 1999 thì quercertin có
 Tên hệ thống IUPAC: 3,3 ', 4',5,7-Pentahydroxyflavone
 Công thức phân tử: C15H10O7
 Khối lượng phân tử khối tương đương: 302.24
 Điểm nóng chảy: 316,5 ° C (Lide, 1997)

3

Hình 2.2 Cấu trúc của hợp chất quercetin. (WHO, 1999)
Quercetin là một flavonol có trong trái cây và rau quả, là hợp chất có trong thực
phẩm đã được chứng minh là có tác động mang lại lợi ích về sức khỏe. Nó là một
trong những chất chống oxy hóa mạnh nhất trong số các polyphenol. Quercetin
cũng đã được chứng minh có khả năng kháng khuẩn, tác dụng kháng virus,
chống ung thư và kháng viêm (Walle T., 2004). Các thuộc tính chống ung thư của
quercetin được thể hiện rõ thông qua tác động đáng kể của nó trên sự gia tăng quá
trình apoptosis (chết theo chu trình) của các tế bào đột biến, ức chế tổng hợp DNA,
ức chế sự tăng trưởng tế bào ung thư, giảm và biến đổi của con đường truyền tín
hiệu tế bào (Naidu và ctv, 2012). Trong thực phẩm, quercetin tồn tại chủ yếu dưới
dạng tạo liên kết với các gốc đường, axit phenolic, rượu,…(Williams và ctv,
2004). Sau khi được ăn vào, các dẫn xuất của quercetin phần lớn bị thủy phân ở
đường tiêu hóa, sau đó được hấp thụ và chuyển hóa (Naidu và ctv, 2012).
2.2.1. Cấu trúc của hợp chất quercetin
Một phân tử của quercetin (hình 2.1), có năm nhóm OH, sự hiện diện của năm
nhóm OH này xác định hoạt tính sinh học của hợp chất và số lượng có thể có
của các chất dẫn xuất. Các nhóm chính trong các dẫn xuất quercetin là glycosid và
ete (Harborne, 1994; Williams và Grayer, 2004). Dẫn xuất glycosid được hình
thành với ít nhất một liên kết O - glycosid, dẫn xuất này phân bố rộng rãi trong giới
thực vật. Dẫn xuất ete có thể được hình thành giữa mỗi nhóm hydroxyl của một
phân tử quercetin và một phân tử rượu, chủ yếu là methanol. Hành tây chứa

4


phần lớn các dẫn xuất glycosid với các hình thức khác nhau, chủ yếu là Quercetin
3,4’-diglucoside (Materska, 2008).
2.2.2 Tính chất hóa học của hợp chất quercetin

Mặc dù có sự hiện diện của năm nhóm OH, nhưng phân tử quercetin lại có một
nhân ưa dầu. Do đó, các dẫn xuất của quercetin có thể ưa dầu lẫn ưa nước, tùy thuộc
vào loại nhóm thế trong phân tử (Materska, 2008).
Qua những thông tin tìm hiểu được trên đối tượng hành tây cho thấy, các phương
pháp thường được sử dụng để nghiên cứu hợp chất quercetin trên đối tượng này là
định lượng quercetin bằng HPLC (Kim và Kim, 2006; Gorinstein S. và ctv, 2008), thu
hồi cao chiết bằng hệ thống soxhlet (Siti và ctv, 2011), sử dụng Staphylococcus aureus
(Kim và Kim , 2006), Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens và Bacillus
cereus (Škerget và ctv, 2009) để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn,đánh giá họat tính
chống oxy hóa bằng DPPH (Kim và Kim, 2006; Gorinstein và ctv, 2008; Siti và ctv,
2011; Chang và ctv, 2013).
2.3. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao dùng để định lượng quercetin
Các nghiên cứu về nguyên tắc của máy sắc ký khí đã được hai tác giả Martin và
Synge đề xuất từ năm 1950. Đến năm 1955, máy được bán ra thị trường và càng được
hoàn thiện, đến thập niên 1980 máy đạt đến độ hoàn hảo. Tuy nhiên, khó khăn gặp
phải là mỗi cấu tử của hỗn hợp phải có áp suất hơi phù hợp với nhiệt độ hoạt động của
cột sắc ký.
Để khắc phục khó khăn người ta thực hiện phản ứng hóa hơi để biến đổi hợp chất
kém hoặc không bay hơi, thành các chất dẫn xuất có tính bay hơi. Tuy nhiên, còn gặp
phải một số vấn đề khó giải quyết như: các phản ứng khó xảy ra hoàn toàn dần đến sự
sai lệch, có thể tạo thành các dẫn xuất khác nhau, một số chất dù đã được điều chế
nhưng vẫn không thể bay hơi được, mà còn bị nhiệt phân hủy.
Việc cần thiết phân tích các hợp chất là nhu cầu bức thiết trong cuộc sống, nhưng
trong các hợp chất đã biết, chỉ có khoảng 20% là phù hợp cho việc phân tích bằng sắc
ký khí. Để có thể đáp ứng cho nhu cầu nói trên, kỹ thuật sắc ký lỏng (liquid
chromatography, LC) được phát triển, hoàn thiện để có được ký thuật sắc ký lỏng hiệu
năng cao (hight performance liquid chromatography, HPLC).

5

Hình 2.3 Mô tả tổng quát các bộ phận của máy sắc ký lỏng hiệu năng cao
(HPLC). Bình chứa dung môi giải ly cột, bộ phận chích mẫu vào máy, đầu
dò, máy bơm, cột sắc ký (và cột bảo vệ).
Năm 1967, Horvath là tác giả đầu tiên đã chế tạo máy HPLC để nghiên cứu về
nucleotide. Ngày nay, với các ưu điểm như áp suất cao, độ phân giải cao, vận tốc sắc
ký nhanh… HPLC được áp dụng trong rất nhiều lĩnh vực nghiên cứu đa dạng như
phân tích dược phẩm, các dung dịch sinh lý, polymer thiên nhiên hoặc tổng hợp, các
loại dư lượng trong môi trường, nhiều loại hợp chất vô cơ, các loại nguyên tố hiện diện
trong mẫu phân tích ở dạng vết… Hơn nữa, các loại đầu dò dùng cho HPLC không
làm hư hại mẫu phân tích, nên sau khi phân tích, có thể thu hồi mẫu để thực hiện các
các loại nghiên cứu khác như phân tích phổ, thử nghiệm hoạt tính sinh học…
(Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).
2.4. Tổng quan về phương pháp lên men lactic
Các quá tình lên men có thể khác nhau về hình thức, cơ chế, tiến trình phản ứng, hệ
vi sinh vật tham gia,… nhưng các quá trình lên men có bản chất cơ bản giống nhau.
Thực chất các quá trình lên men là các quá trình oxy hóa - khử sinh học để thu năng
lượng và các hợp chất sinh học. Năng lượng này rất cần thiết cho mọi hoạt động sống
của vi sinh vật sinh trưởng, phát triển, sinh sản,…Một trong những thành phần chủ
chốt của môi trường lên men là gluxit. Gluxit không những là nguồn cung cấp năng
lượng mà còn là một nguồn nguyên liệu cần thiết để sinh tổng hợp các cấu tử cần thiết
cho tế bào. Monose gluxit là loại dễ lên men nhất, đặc biệt là gluco, fructo,…
6


Lên men lactic đã được biết đến rất sớm thông qua các ứng dụng lâu đời trong dân
gian như muối chua rau quả, làm sữa chua,… Thông thường lên men lactic trong
trường hợp này là phối hợp cả lên men đồng hình (sản phẩm chính là axit lactic) và
dị hình (ngoài axit lactic còn có nhiều sản phẩm khác chiếm tỉ lệ khá cao), tận dụng
vi khuẩn lactic trên rau quả để tiến hành lên men. Môi trường trong quá trình

muối chua có pH nằm trong khoảng axit, ức chế các loài vi sinh vật gây thối hỏng rau
quả, do đó rau quả được giữ lâu hơn, đồng thời quá trình lên men này còn tạo ra một
số sản phẩm như chất thơm, vitamin, kháng sinh,…đều này sẽ kích thích vị giác, ăn
ngon miệng, dễ tiêu hóa, cải thiện sức khỏe. Quá trình muối chua rau quả chia làm ba
thời kỳ:
 Thời kỳ I: đường và các chất dinh dưỡng từ rau quả khuếch tán vào môi trường
(nước muối). Lúc này vi khuẩn lactic chỉ chiếm 5 – 10 %, còn vi sinh vật gây
thối chiếm 85 – 90 %.
 Thời kỳ II: vi khuẩn lactic bắt đầu phát triển mạnh mẽ, làm cho pH môi trường
là axit và ức chế vi sinh vật gây thối.
 Thời kỳ III: khi axit lactic đạt đến nồng độ cao sẽ tiêu diệt các vi sinh vật gây
thối đồng thời ở nồng độ này chính vi khuẩn lactic cũng bắt đầu bị ức chế; giai
đoạn muối chua coi như kết thúc. Thường thì sản phẩm có hương vị tốt nhất khi
hàm lượng axit lactic đạt từ 0,8 – 1,2 %, và dừng lại khi hàm lượng axit lactic là
1,5 – 2,4 % (Đồng Thị Thanh Thu, 2003).
2.5. Phương pháp thu hồi cao chiết bằng hệ thống chiết Soxhlet
Có lẻ vì những ưu điểm như tiết kiệm dung môi, ít tốn công lọc và châm dung môi
mới, bột cây được chiết liên tục nên chiết kiệt các hợp chất trong cây nên phương pháp
chiết Soxhlet được nhiều người áp dụng để tiến hành thu hồi cao chiết.

7


Nguyên liệu được gói kín bằng giấy lọc và cho vào
ống D, sau đó cho dung môi cần chiết vào (lưu ý rằng
lượng dung môi rót vào cần phải đủ để chạy qua ống
thông nhau B1 và chảy xuống bình cầu C một ít). Bật
bếp, dung môi trong bình cầu A sẽ được làm nóng sau
đó sẽ bốc hơi và theo ống thông nhau B2 đưa hơi dung
môi lên cao, nhưng tại đây hơi dung môi bị ống ngưng

hơi làm lạnh, ngưng tụ thành thể lỏng, rớt thẳng xuống
ống D đang chứa bột cây. Dung môi sẽ ngấm vào bột
cây và chiết những hợp chất hữu cơ có thể hòa tan
trong dung môi. Theo quá trình đun nóng, lượng dung
môi rớt vào ống D càng nhiều, làm cho mức dung môi
trong ống D và B1 tăng lên vì chúng thông với nhau.
Đến thời điểm dung môi vượt qua ngưỡng của ống B1,
dung môi sẽ bị hút về bình cầu A. Bếp vẫn tiếp tục đun
và một qui trình mới vận chuyển dung môi như mô tả Hình 2.4 Hệ thống chiết
lúc đầu. Các hợp chất được hút xuống bình cầu và nằm soxhlet. A: bình cầu; B1, B2:
ống thông nhau; C:ống ngưng

lại ở đây, chỉ có dung môi tinh khiết mới bay hơi lên để hơi; D: ống chứa bột cây.
tiếp tục quá trình, do đó các hợp chất trong cây được
chiết kiệt (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).
2.6. Các giống vi sinh vật được sử dụng để thử hoạt tính kháng khuẩn
2.6.1. Sơ lược về giống tụ cầu khuẩn (Staphylococcus)

Vi khuẩn Staphylococcus bắt màu Gram dương, có hình cầu, kích thước 0,7 – 1,0
µm, không có lông, không di động, thường tụ thành từng nhóm nhỏ hình chùm nho.
Staphylococcus aureus là loại gây bệnh thường hay gặp nhất, gây nên các nhiễm trùng
ở các loài vật nuôi và người (da, nội tạng,…) gây mưng mủ, một số trường hợp chuyển
sang chứng nhiễm trùng huyết, chứng bại huyết. Ngoài ra Staphylococcus aureus còn
có khả năng sinh độc tố khi nhiễm trong thực phẩm nên có thể gây chứng nhiễm độc
(Lương Đức Phẩm, 2000). Trong đề tài sử dụng chủng Staphylococcus aureus ATCC
43300.
8


2.6.2. Sơ lược về giống Escherichia

Giống Escherichia thuộc tộc Escherichia gồm những tộc khuẩn nhỏ, ngắn, không có
nha bào, Gram âm, phần lớn di động, đa số lên men glucoza, lactoza, có sinh hơi do
Escherich phân lập năm 1885 từ phân trẻ em.
E. coli thường xuất hiện rất sớm ở đường ruột của người và động vật sơ sinh, chúng
thường có ở ruột già, ít khi ở dạ dày hay ruột non. Vi khuẩn E. coli theo phân của động
vật và người ra ngoài và reo rắc ở môi trường. Theo Kauffman, những chủng E. coli
phổ thông về mặt huyết thanh học được chia thành một số typ dựa trên cấu tạo kháng
nguyên (O, H và K) (Lương Đức Phẩm, 2000). Chủng Escherichia coli ATCC 2592 đã
được sử dụng trong đề tài.
2.6.3 Phương pháp khoanh giấy kháng sinh khuếch tán để đánh giá hoạt tính
kháng vi sinh vật
Phương pháp khoanh giấy kháng sinh khuếch tán là một trong 2 phương pháp chính
và được sử dụng rộng rãi trong việc thực hiện kháng sinh đồ, nhằm mục đích xác định
sự nhạy cảm của vi sinh vật đối với các loại kháng sinh, hay xác định lượng tối thiểu
của chất kháng sinh có thể ngăn cản sự phát triển của vi sinh vật. Phương pháp này rất
quan trọng trong việc chọn loại kháng sinh phù hợp trong điều trị.
Kháng sinh được tẩm vào các khoanh giấy tiệt trùng với hàm lượng xác định. Khi
được đặt lên bề mặt môi trường thạch đĩa, kháng sinh sẽ khuếch tán ra xung quanh và
ngăn cản không cho vi sinh vật mọc, tạo nên vòng vô khuẩn (trong trường hợp vi sinh
vật bị tác động bởi loại kháng sinh được thử).
2.7. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa bằng DPPH
Có nhiều phương pháp dùng để đánh giá hoạt tính chống oxy, mỗi phương pháp có
một cơ chế, ưu và nhược điểm riêng. Tùy vào đối tượng mà lựa chọn phương pháp phù
hợp nhất.Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH, là phương pháp thường
được sử dụng nhất, vì phương pháp này tiến hành đơn giản, nhanh chóng và dễ ổn
định.
Phương pháp này được tiến hành dựa trên tính bền của gốc tự do 1,1 - diphenyl - 2 picrylhydrazyl (DPPH) hòa tan trong dung dịch methanol bão hòa, dung dịch có màu
tím. Khi cho mẫu vào môi trường này, nếu mẫu có khả năng bắt các gốc tự do thì
cường độ hấp thụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH sẻ giảm, màu tím
9

của dung dịch chuyển sang màu vàng cam. Hoạt tính kháng oxy hóa được đánh giá
thông qua giá trị hấp thu ánh sáng ở bước sóng 517 nm, đọc trên máy quang phổ.
(Shela và ctv, 2003).

Hình 2.5 Cơ chế phản ứng của DPPH.
Trong một nghiên cứu xem xét về phương pháp DPPH, Sharma và Bhat, 2009, đã
chỉ ra nồng độ của DPPH khi dùng dung môi methanol là 25 µM – 70 µM, thích hợp
nhất là 50 µM và nồng độ của vitamin C là 1 mM, để có được khoảng tuyến tính tốt
khi tiến hành đo quang phổ (Sharma và Bhat, 2009). Để đánh giá khả năng kháng oxy
hóa cao hay thấp, ta thường dựa vào chỉ số IC50 (Inhibitory Concention 50) là nồng độ
của mẫu mà tại đó có thể ức chế 50 % các gốc tự do (Siti và ctv, 2011). Giá trị IC50
càng thấp thể hiện hoạt tính oxy hóa càng cao.
2.8 Một số công trình nghiên cứu trong và ngoài nước đã công bố có liên quan với
nội dung nghiên cứu
Trong những năm gần đây, việc tiêu thụ hành tây đã tăng lên, gần 47 triệu tấn năm
2000 và đang gia tăng trên toàn thế giới (Rune và ctv, 2007) nhờ vào hương vị và lợi
ích sức khỏe của nó. Những đặc tính có lợi này dường như liên quan đến hàm lượng
lớn các hợp chất lưu huỳnh và flavonoid có trong hành, bởi vì các hợp chất này hoạt
động như một chất chống oxy hóa, kháng ung thư, tác động đến quá trình chuyển hóa
lipid,… (Ramos và ctv, 2006).
Các flavonoid chính được tìm thấy trong hành tây là quercetin aglycone và
glucosides (3,4 '-di-và 4'-glucoside). Theo như báo cáo của Hertog và ctv, 1992, hành
được xếp hạng cao nhất về hàm lượng quercetin trong một cuộc khảo sát của 28 loại
rau và 9 trái cây (Škerget, 2009).

10

Khi phân tích hợp chất querceitn trong hành, phương pháp chiết soxhlet được sử
dụng để chiết hợp chất trong hành (Siti và ctv, 2011), dung môi được sử dụng để chiết
mẫu thường là MeOH, HCl, BHA (Kim và Kim, 2006; Gorinstein và ctv, 2008), pha
động thường được sử dụng là MeOH, ACN, H2O (Lombard và ctv, 2002; Kim và Kim,
2006; Phani, 2010).
Khi xác định hợp chất quercetin trong các phần khác nhau của hành bằng HPLC,
cho thấy hàm lượng cao nhất của quercetin là 85,91µg/ml (Kim và Kim, 2006), hàm
lượng quercetin trong củ hành đỏ là 110,6 mg/100g vật liệu khô (Gorinstein và ctv,
2008).
Khi đánh giá khả năng kháng khuẩn trên các phần khác nhau cảu hành cho thấy
rằng, các phần của hành đều kháng Staphylococcus aureus (Kim và Kim, 2006).
Ngoài ra Škerget và ctv còn cho biết, hành tây còn thể hiện tính kháng khuẩn trên
Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens và Bacillus cereus và tính kháng nấm trên
Aspergillus niger, Trichoderma viride và Penicillium cyclopium (Škerget và ctv,
2009). Theo Liu và ctv, 2010 khi tiến hành nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn ở bảy
hợp chất flavonoid, thì trong bảy flavonoid này đáng chú ý là quercetin, hợp chất có
hoạt tính ức chế cao nhất trên Staphylococcus aureus, với MIC và giá trị IC50 tương
ứng là 6,25 mg/ml và 5,68 mg/ml (Liu và ctv, 2010).
Khi đánh giá hoạt tính chống oxy hóa bằng DPPH trong các phần khác nhau của
hành, % hoạt tính chống oxy hóa đạt được cao nhất là 91,96 % (Kim và Kim, 2006),
Cũng trong một nghiên cứu về so sánh họat tính chống oxy hóa trên tỏi và hành đỏ
bằng DPPH. Giá trị IC50 của hành đỏ thì không được biểu thị trực tiếp theo đồ thị,
nhưng dự đoán là trên 1 mg/ml (Siti và ctv, 2011). Năm 2013, Chang và ctv, 2013
cũng đã đưa ra kết luận giống như Benkeblia, 2005 rằng, Allium spp có khả năng
chống oxy hóa mạnh và chính các hợp chất lưu huỳnh dễ bay hơi và một số flavonoid
trong Allium spp. đã đem đến khả năng chống oxy hóa này cho Allium spp (Chang và
ctv, 2013).
Trong nghiên cứu đánh giá sự ảnh hưởng của quá trình lên men đến hàm lượng
quercetin trong hành tây,Yang và ctv, 2012 đã đưa ra kết luận trong số các hợp chất
tăng lên, chỉ quercetin cho thấy hoạt động chống oxy hóa mạnh mẽ trong việc khảo

nghiệm DPPH (tăng 4,3 lần). Ngoài ra, tác dụng bảo vệ chống lại độc thần kinh
11


glutamate cũng tăng lên. Nguyên nhân được lý giải là quá trình lên men làm tăng hàm
lượng quercetin trong hành tây, và sau đó tăng các hoạt động chống oxy hóa và bảo vệ
thần kinh (Yang và ctv, 2012).
Qua những tìm hiểu trên ta thấy phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
đem đến hiệu quả cao khi dùng để xác định hàm lượng quercetin trong hành với pha
động sử dụng các dung môi như MeOH, ACN (acetonnitrile), H2O (Lombard và ctv,
2002; Kim và Kim, 2006; Phani, 2010) và quá trình lên men có thể làm tăng hàm
lượng quercetin có trong hành và hoạt tính chống oxy hóa (Yang và ctv, 2012).
Phương pháp chiết soxhlet được sử dụng để chiết hợp chất trong hành (Siti và ctv,
2011). Một số chủng vi sinh vât như Staphylococcus aureus, Escherichia coli,
Pseudomonas fluorescens, Bacillus cereus được sử dụng để đánh giá hoạt tính kháng
khuẩn (Škerget và ctv, 2009; Liu và ctv, 2010) và một số giống nấm như Aspergillus
niger, Trichoderma viride và Penicillium cyclopium được sử dụng để tiến hành đánh
giá hoạt tính kháng nấm (Škerget và ctv, 2009). Phương pháp DPPH được sử dụng để
đánh giá khả năng chống oxy hóa (Kim và Kim, 2006; Gorinstein và ctv, 2008).

12


Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu bắt đầu từ 7/2013 và kết thúc 12/2013, được thiện hiện tại Phòng
Hóa lí và Vi sinh thuộc Viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường,
Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, Khu phố 6, phường Linh Trung, Quận
Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh.
3.2. Vật liệu được sử dụng để tiến hành nghiên cứu

3.2.1. Mẫu thí nghiệm
Mẫu hành ta(Allium ascalonicum L.) thuộc họ hành Alliaceae được mua từ chợ
Chùa, thị trấn Chợ Chùa, huyện Nghĩa Hành, tỉnh Quảng Ngãi.
3.2.2. Hóa chất được sử dụng trong quá trình nghiên cứu
- Methanol (98 – 100 %)

- DMSO (prolabo)

- Ampiciline

- Vitamin C

- Môi trường TSB (Tryptic Soy Broth) - Acetonitrile
3.2.3 Thiết bị và dụng cụ được sử dụng để thực hiện những nghiên cứu
- Cân điện tử Bp 210S - SAG (Đức)

- Tủ sấy Memmert (Đức)

- Máy cô quay Buchi Rotavapor

- Máy Vortex (Đức)

R200 (Đức)

- Máy xay mẫu Philip (Mỹ)

- Cân phân tích

- Bồn siêu âm Power sonic 510 Hwashin

- Tủ mát Darling (Việt Nam)

(Hàn Quốc)

- Giấy bạc, giấy lọc, bình định mức, -

Đèn cồn, ống nghiệm, đĩa petri, que cấy

chén nghiền mẫu
3.3. Các phương pháp được sử dụng để tiến hành những nghiên cứu
3.3.1. Phương pháp xác định độ ẩm nguyên liệu theo tiêu chuẩn Việt Nam
Trong phạm vi đề tài này, chúng tôi sử dụng tiêu chuẩn Việt Nam 7040 : 2002, Gia
vị - Xác định độ ẩm - Phương pháp chưng cất lôi cuốn, để xác định độ ẩm nguyên liệu.
(xem phụ lục 3)
Tiến hành xác định độ ẩm nguyên liệu dựa theo TCVN 7040 : 2002 theo qui trình như
ở hình 3.1
13


Mẫu hành tươi đã được xay nhuyễn và cân chính xác đến 0,01 g. Trước khi tiến
hành đun, cho một ít nước cất vào trong ống, nơi sẽ chứa nước thu được trong quá
trình chưng cất (mục đích để đọc được chính xác thể tích nước thu được sau cuối
quá trình)
Cân 5 g mẫu + 60 ml hexan cho vào bình cầu.

Đun sôi trong khoảng 3 giờ
Tắt bếp, đợi 30 phút, sau đó đọc thể tích nước
sau khi đun
Hình 3.1 Quy trình xác định độ ẩm nguyên liệu.
3.3.2. Xác định hàm lượng quercetin bằng hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao

Dựa vào các tài liệu đã tìm hiểu được khi sử dụng HPLC, chúng tôi đã tiến hành thử
nghiệm và đã chọn được quy trình chạy máy dùng để xác định sự hiện diện cũng như
định lượng quercetin có trong mẫu với các thông số
 Tốc độ dòng 0,6 ml/phút
 Thời gian chạy máy: 40 phút
 Dung môi ACN : H20 : MeOH tỉ lệ tương ứng 25 : 35 : 40
 Cột: 5C18, MS – II 4,6 ID x 250 mm, code 38020.
Sau khi xác định được đối tượng nghiên cứu có độ ẩm cao, và phương pháp sấy đã
được lựa chọn để hạn chế ảnh hưởng của độ ẩm đến kết quả phân tích. Mẫu hành (tươi
và lên men) được chiết theo quy trình như trong hình 3.2
Dịch chiết mẫu sau đó được lọc qua giấy lọc và định mức trong bình định mức 5 ml,
tiếp theo lọc qua màng lọc 0,22 µm. Mẫu được bảo quản ở tủ -20 0C cho đến khi được
phân tích trên hệ thống HPLC.

14


10 g Hành

Cắt nhỏ, sấy
(75 0C, 42 giờ)

Nghiền và lấy
0,5 g mẫu

Cho 2,5 ml MeOH,
ngâm trong 1 giờ

Thu dịch chiết, ly tâm
10000 vòng/phút, trong

10 phút, lấy phần trên

Bã + 1,5 ml MeOH,
ngâm trong 5 phút

Thu dịch chiết, ly tâm
10000 vòng/phút, trong
5 phút, lấy phần trên
Dịch
chiết
mẫu

Bã + 1 ml MeOH,
ngâm trong 5 phút

Thu dịch chiết, ly tâm
10000 vòng/phút, trong
5 phút, lấy phần trên

Hình 3.2 Quy trình tiến hành chiết mẫu để phân tích.
3.3.3. Khảo sát sự ảnh hưởng của quá trình muối chua đến hàm lượng quercetin
Sau khi tiến hành tham khảo công thức muối chua thường dùng của mọi người
trong gia đình cũng như của bạn bè, chúng tôi tiến hành chọn hai công thức muối chua,
một theo công thức thông thường và một công thức thử nghiệm. Thông thường tỉ lệ
giấm và đường là 1 : 1. Giấm được đun sôi sau đó cho đường vào, khuấy để đường tan
hoàn toàn, tắt bếp, đợi cho hổn hợp nguội hẳn và tiến hành muối hành.
15