HOÀN CHỈNH QUY TRÌNH ĐÁNH GIÁ HOẠT LỰC ENZYME MANNANASE, XÁC ĐỊNH HOẠT LỰC ENZYME MANNANASE TINH CHẤT VÀ KHI CÓ TÁC ĐỘNG CỦA CÁC MỨC NHIỆT ĐỘ, pH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH
KHOA CHĂN NUÔI - THÚ Y


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

HOÀN CHỈNH QUY TRÌNH ĐÁNH GIÁ HOẠT LỰC
ENZYME MANNANASE, XÁC ĐỊNH HOẠT LỰC
ENZYME MANNANASE TINH CHẤT VÀ KHI
CÓ TÁC ĐỘNG CỦA CÁC MỨC NHIỆT ĐỘ, pH

Sinh viên thực hiện

: LÊ THỊ MỸ LIÊN

Lớp

: DH09TA

Ngành

: CHĂN NUÔI

Niên khóa

: 2009-2013

Tháng 9/2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH
KHOA CHĂN NUÔI - THÚ Y


LÊ THỊ MỸ LIÊN

HOÀN CHỈNH QUY TRÌNH ĐÁNH GIÁ HOẠT LỰC
ENZYME MANNANASE, XÁC ĐỊNH HOẠT LỰC
ENZYME MANNANASE TINH CHẤT VÀ KHI CÓ
TÁC ĐỘNG CỦA CÁC MỨC NHIỆT ĐỘ, pH
Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Kỹ sư chăn nuôi
chuyên ngành CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT THỨC ĂN CHĂN NUÔI

Giáo viên hướng dẫn
TS. DƯƠNG DUY ĐỒNG
Th.S NGUYỄN HIẾU PHƯƠNG

Tháng 09/2013


XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN
Họ và tên sinh viên thực tập: Lê Thị Mỹ Liên
Tên luận văn: “Hoàn chỉnh quy trình đánh giá hoạt lực enzyme
mannanase, xác định hoạt lực enzyme mannanase tinh chất và khi có tác động
của các mức nhiệt độ, pH”
Đã hoàn thành luận văn đúng theo yêu cầu của giáo viên hướng dẫn và các ý
kiến nhận xét và đóng góp của hội đồng chấm thi tốt nghiệp ngày 6 tháng 9 năm
2013.
Giáo viên hướng dẫn

TS. Dương Duy Đồng

Th.S Nguyễn Hiếu Phương

i


LỜI CẢM ƠN
Sau thời gian học tập và nghiên cứu, nay tôi đã hoàn thành khóa học và luận
văn tốt nghiệp. Trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài tôi đã nhận được rất
nhiều sự giúp đỡ từ thầy cô, bạn bè.
Xin gửi lời cảm ơn đến :
Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
Ban Chủ Nhiệm Khoa cùng toàn thể quý thầy cô Khoa Chăn Nuôi Thú Y đã
tận tình chỉ dạy và hỗ trợ em trong suốt thời gian học tập tại trường và hoàn thành
luận văn tốt nghiệp này.
Kính dâng lòng biết ơn sâu sắc đến cha mẹ, những người thân trong gia đình
đã luôn tận tụy lo lắng và hy sinh để con có được ngày hôm nay.
Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Dương Duy Đồng, cô Nguyễn Hiếu
Phương, cô Nguyễn Thụy Đoan Trang đã tận tình giảng dạy, hướng dẫn và giúp đỡ
em trong những năm đại học và hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô và anh chị ở Bộ môn Dinh Dưỡng
Khoa Chăn Nuôi Thú Y Trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã
giúp đỡ tôi rất nhiều trong thời gian thực tập tốt nghiệp.
Chân thành cảm ơn công ty SunHy đã tạo điều kiện , hỗ trợ trang thiết bị cần
thiết cho việc thực hiện đề tài.
Chân thành cám ơn bạn bè, anh chị em gần xa đã chia sẻ, giúp đỡ tôi trong
suốt thời gian học cũng như khi thực hiện đề tài.

Chân thành cảm ơn!
Lê Thị Mỹ Liên

ii


TÓM TẮT
Đề tài “Hoàn chỉnh quy trình đánh giá hoạt lực enzyme mannanase, xác
định hoạt lực enzyme mannanase tinh chất và khi có tác động của các mức
nhiệt độ, pH” được tiến hành tại Bộ môn Dinh Dưỡng , Khoa Chăn Nuôi Thú Y ,
Trường Đại học Nông Lâm TP . Hồ Chí Minh, từ tháng 02 đến tháng 07/2013. Nội
dung thực hiện gồm 4 phần chính:
1. Hoàn chỉnh quy trình xác định hoạt lực enzyme mannnanse tinh chất.
2. Xác định hoạt lực của một số mẫu enzyme mannanase tinh chất khác.
3. Đánh giá hoạt lực của 03 mẫu sản phẩm enzyme ở các mức nhiệt độ

700C,

750C và 800C với thời gian lần lượt là 15s, 20s và 30s.
4. Đánh giá hoạt lực của 03 mẫu sản phẩm enzyme khi chịu tác động

bởi các

mức pH=3, pH=4 và pH=5.5.
Sau một thời gian phân tích đã xác định được quy trình hoàn chỉnh đánh giá
hoạt lực enzyme mannanase trong sản phẩm enzyme hỗn hợp.
Một số mẫu enzyme tinh chất được chọn để đánh giá có hoạt lực tương đối
ổn định nhưng thấp hơn so với hoạt lực được công bố

, nguyên nhân có thể do

phương pháp đánh giá hoạt lực , cách tính hoạt lực enzyme khác nhau , mỗi nhà sản
xuất có chủ trương và khả năng khác nhau dẫn đến hoạt lực được công bố cũng có
sự khác biệt rất nhiều giữa các sản phẩm enzyme mannanase khác nhau.
Nhiệt độ sấy cao và các thời gian sấy khác nhau có ảnh hưởng theo hướng
giảm dần hoạt lực của enzyme với sự khác biệt hoàn toàn có ý nghĩa.
pH là yếu tố ảnh hưởng rất nhiều đến hoạt lực enzyme. Ở pH=3 các mẫu
enzyme gần như mất hoạt lực . Ở pH=4 mẫu enzyme A đã bị mất hoạt lực , 02 mẫu
còn lại có hoạt lực giảm đáng kể ; chỉ khi ở pH =5.5 thì hoạt lực enzyme tương đối
ổn định.

iii


SUMMARY
The topic “Improving the process of assessing the effect of enzyme
mannanase, identifying the enzymatic activity of pure enzyme mannanase and
enzyme mannanase affected by temperature and pH degrees” was conducted in
Nutrition Subject, Department of Veterinary Rearing, Nong Lam University of Ho
Chi Minh City, from February to July in 2013. The content consists of 4 main
points:
1. Improving the process of identifying the enzymatic activity of pure enzyme
mannanase.
2. Identifying the enzymatic activity of some samples of other pure enzyme
mannanase.
3. Assessing the enzymatic activity of 03 enzyme samples at the temperatures
of 700C, 750C và 800C with the amounts of time of 15s, 20s and 30s respectively.
4. Assessing the enzymatic activity of 03 enzyme samples affected at pH=3,
pH=4 and pH=5.
After a period of time analyzing, the process of improving the assessment of

the enzymatic activity of enzyme mannanase in mixed enzyme products was
identified. Some samples of pure enzyme which were chosen to be assessed have
relatively stable enzymatic activity but less than the degree of enzymatic activity
announced, probably due to different methods of assessing enzymatic activity,
different ways of calculating enzymatic activity, different abilities and policies of
every manufacturer which lead to the big difference in the announced enzymatic
activity of some enzyme mannanase products.
High drying temperature and different amounts of drying time make the
enzymatic activity descend with completely meaningful difference.
pH is the factor which has much influence on the enzymatic activity. At pH=3
the enzyme samples nearly lose their enzymatic activity. At pH=4 the enzyme
sample A loses its enzymatic activity, 02 other samples lose most of their enzymatic
activity; only at pH=5.5 is the enzymatic activity relatively stable.

iv


MỤC LỤC
XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN .......................................................... i
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. ii
TÓM TẮT ...................................................................................................................... iii
SUMARY ....................................................................................................................... iv
MỤC LỤC .............................................................................................................. v
DANH SÁCH BIỂU ĐỔ ....................................................................................... vii
DANH SÁCH CÁC BẢNG ........................................................................................ viii
DANH SÁCH CÁC HÌNH ........................................................................................... ix
Chương 1: MỞ ĐẦU .................................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề ...................................................................................................... 1
1.2 Mục đích yêu cầu ........................................................................................... 2
1.2.1 Mục đích ................................................................................................. 2

1.2.2 Yêu cầu ................................................................................................... 2
Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................ 3
2.1 Tổng quan về chất xơ, NSP và mannan .......................................................... 3
2.1.1 Chất xơ .................................................................................................... 3
2.1.2 NSP (Non Starch Polysaccharide) ............................................................ 3
2.1.3 Mannan.................................................................................................... 4
2.2 Enzyme .......................................................................................................... 5
2.2.1 Định nghĩa ............................................................................................... 5
2.2.2 Tính đặc hiệu của enzyme........................................................................ 5
2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hoạt động của enzyme ............................... 6
2.2.4 Các đơn vị đo hoạt lực của enzyme .......................................................... 6
2.2.5 Những điểm cần chú ý khi tiến hành thí nghiệm đo hoạt lực enzyme ....... 8

v


2.3.6 Một số phương pháp xác định hoạt lực của enzyme ................................. 8
2.3.7 NSP enzyme ............................................................................................ 9
2.2.8 Enzyme mannanase ................................................................................. 9
Chương 3:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 10
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................ 10
3.2 Phương pháp tiến hành ................................................................................. 10
3.2.1 Địa điểm và thời gian lấy mẫu ............................................................... 10
3.2.2 Đối tượng khảo sát................................................................................. 10
3.2.3 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm .................................................................. 11
3.2.4 Phương pháp phân tích .......................................................................... 11
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................... 14
4.1 Hoàn chỉnh quy trình xác định hoạt lực enzyme mannanase tinh chất .......... 14
4.1.1 Lập đường chuẩn ................................................................................... 14
4.1.2 Xác định hoạt lực enzyme mannanase tinh chất ..................................... 16

4.2 Hoạt lực enzyme từ các mẫu của những công ty khác .................................. 16
4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt lực enzyme .............................................. 19
4.4 Ảnh hưởng của pH đến hoạt lực enzyme ...................................................... 23
Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................... 25
5.1 Kết luận ....................................................................................................... 25
5.2 Đề nghị ........................................................................................................ 25
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 26
Phần tiếng việt ................................................................................................... 26
Phần tiếng nước ngoài........................................................................................ 26
Tài liệu tham khảo từ internet ............................................................................ 27
PHỤ LỤC ..................................................................................................................... 28

vi


DANH SÁCH BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 4.1: Hoạt lực của các mẫu enzyme mananase tinh chất với cùng một
phương pháp đánh giá ......................................................................................... Trang17

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1: Hàm lượng β-mannan trong thức ăn ............................................................ 5
Bảng 2.2: Hoạt lực enzyme mannanase trong một số sản phẩm khác....................... 7
Bảng 4.1: Xác định hoạt lực enzyme F ...................................................................16
Bảng 4.2: Kết quả hoạt lực các loại enzyme .............................................................. 16
Bảng 4.3: Hoạt lực enzyme khi xác định với các độ pha loãng khác nhau ..............18
Bảng 4.4: Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ sấy lên enzyme A.................................. 19

Bảng 4.5: Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ sấy lên enzyme B .................................. 20
Bảng 4.6: Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ sấy lên enzyme C .................................. 22
Bảng 4.7: Kết quả ảnh hưởng của pH đến hoạt lực enzyme ....................................23

viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 3.1: Đường chuẩn được lập ngày 17/06/13 (DNS ngày 10/06/2013) ............. 12
Hình 4.1: Đường chuẩn được lập ngày 4/3/2013 (DNS ngày 22/2/2013) ............... 14
Hình 4.2: Đường chuẩn được lập ngày 12/7/2013 (DNS ngày 25/6/2013) ............. 15

ix


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Hiện nay, trong thức ăn chăn nuôi người ta đã và đang sử dụng nhiều loại sản
phẩm để tăng khả năng tận dụng dưỡng chất trong thức ăn. Trong đó, enzyme là
một sản phẩm được dùng khá phổ biến. Các loại enzyme được sử dụng rộng rãi
trong chăn nuôi như phytase, NSP enzyme, amylase, protease, lipase…
Trong chăn nuôi chi phí thức ăn chiếm đến 60 - 70% giá thành sản phẩm. Vì
vậy để nâng cao hiệu quả chăn nuôi thì việc hạ thấp giá thức ăn đóng một vai trò
quan trọng. Một trong những biện pháp đang được quan tâm và ứng dụng là sử
dụng các nguyên liệu thực vật mới, rẻ tiền như các loại hạt, khô dầu, …để tổ hợp
khẩu phần thức ăn. Nhưng vấn đề đặt ra là trong các nguyên liệu này chứa một hàm
lượng lớn chất xơ khó tiêu hóa. Vì thế cần được bổ sung thêm enzyme ngoại sinh để
hỗ trợ việc tiêu hóa.

Để khắc phục những hạn chế trên thì việc bổ sung enzyme tiêu hóa NSP vào
trong thức ăn là biện pháp đang được sử dụng phổ biến và bước đầu cho thấy những
kết quả khả quan. Nhiều chế phẩm enzyme tiêu hóa NSP đã được sử dụng rộng rãi
trong chăn nuôi gia cầm như beta-glucanase, xylanase, cellulase, mannanase, …Hầu
hết các chế phẩm này chứa hỗn hợp nhiều enzyme.
Công việc của các công ty sản xuất thức ăn thường là nhập enzyme về sau đó
dựa theo khuyến cáo từ phía công ty sản xuất, xác định tỉ lệ trộn enzyme vào trong
thức ăn nhưng các công ty thức ăn cũng như người chăn nuôi khi sử dụng enzyme
vẫn chưa xác định được hoạt lực của enzyme đó.
Việc cần thiết khi sử dụng enzyme là phải đo lường, đánh giá đúng hoạt lực
của enzyme, enzyme rất nhạy cảm với điều kiện bên ngoài, như nhiệt độ, pH, các
kim loại nặng, …. Ngoài ra khi sử dụng enzyme, cũng cần quan tâm đến hoạt lực
của enzyme khi trộn vào thức ăn, ép viên ở nhiệt độ khoảng 75 - 85oC thì sẽ thay

1


đổi như thế nào, dưới điều kiện pH khác nhau trong đường tiêu hóa của thú thì
enzyme có còn hoạt động hay đã bị bất hoạt.
Vì vậy, việc xác định hoạt lực của enzyme, sử dụng nhiều enzyme để đo
lường, đánh giá, so sánh sản phẩm enzyme này với các sản phẩm khác là cần thiết.
Nếu xác định được quy trình hoàn chỉnh có thể hỗ trợ cho các nhà dinh dưỡng thuận
lợi hơn trong việc tổ hợp khẩu phần thức ăn.
Được sự cho phép của Bộ môn Dinh Dưỡng Gia Súc, khoa Chăn Nuôi - Thú
Y, Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh với sự hướng dẫn của TS.
Dương Duy Đồng chúng tôi tiến hành đề tài “Hoàn chỉnh quy trình đánh giá hoạt
lực enzyme mannanase, xác định hoạt lực enzyme mannanase tinh chất và khi
có tác động của các mức nhiệt độ, pH”.
1.2 Mục đích yêu cầu
1.2.1 Mục đích

Nghiên cứu, phân tích hoạt lực của enzyme tinh chất.Lập được một quy trình
xác định hoạt lực enzyme hoàn chỉnh sau đó so sánh, đánh giá hoạt lực của các
enzyme tinh chất với enzyme đã có tác động của các mức nhiệt độ, pH.
1.2.2 Yêu cầu
Phân tích, theo dõi và thu thập các số liệu về hoạt lực của các loại enzyme
tinh chất, so sánh, đánh giá hoạt lực của các enzyme này sau khi chịu ảnh hưởng bởi
nhiệt độ, pH.

2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tổng quan về chất xơ, NSP và mannan
2.1.1 Chất xơ
Thuật ngữ chất xơ được định nghĩa là lignin cộng với polysaccharide khó
tiêu hóa được bởi enzyme nội sinh đối với động vật dạ dày đơn. Do tính chất của
chất xơ trong khẩu phần ăn rất khó xác định nên được thay thế bằng thuật ngữ nonstarch polysaccharide (NSP) (McDonald, 2002). Theo Dương Thanh Liêm và
ctv.(2002), ưu điểm của chất xơ là kích thích nhu động ruột, lôi cuốn các chất độc ra
ngoài, tăng dung tích ống tiêu hóa và hạn chế sự cắn mổ, ăn lông lẫn nhau trên gia
cầm; khuyết điểm là giá trị năng lượng khẩu phần thấp, giảm khả năng tiêu hóa các
dưỡng chất khác trong thức ăn.
2.1.2 NSP (Non Starch Polysaccharide)
NSP gồm một số chất như beta-glucan, arabinoxylan, cellulose,
hemicellulose và lignin. NSP có thể được phân loại bằng nhiều cách khác nhau dựa
trên đặc tính sinh học như độ nhớt, khả năng giữ nước, lên men và khả năng kết hợp
phân tử hữu cơ và vô cơ (Scharama và ctv., 2005,trích dẫn bởi Mai Anh Tuấn,
2011). NSP trong hạt ngũ cốc có chứa beta-glucan và arabinoxylan. Chất này có
khả năng hút nước tạo nên độ nhớt ở thành ruột bao phủ các chất dinh dưỡng trong
đường ruột, làm ngăn cản phản ứng thủy phân của enzyme với cơ chất, ảnh hưởng

tiêu cực tới các chất dinh dưỡng làm giảm khả năng tiêu hóa, hấp thu các chất dinh
dưỡng và làm giảm hiệu quả sử dụng thức ăn của vật nuôi (Choct và Annison, 1992,
trích dẫn bởi Mai Anh Tuấn, 2011).
Theo Vũ Duy Giảng (2009), nhóm NSP được chia thành 2 nhóm NSP tan
trong nước và không tan.
- Nhóm NSP tan trong nước hiện diện nhiều trong các loại rau cải và quả, có
khả năng giữ nước cao gấp đôi nhóm NSP không tan. Theo Vũ Duy Giảng (2009),
1g NSP tan giữ 13,5g nước trong khi NSP không tan chỉ giữ được 6,15g. NSP tan

3


trong nước sẽ làm tăng độ nhớt trong ruột, cản trở tế bào vách ruột hấp thu các chất
dinh dưỡng, làm chậm quá trình di chuyển thức ăn trong ống tiêu hóa, giảm sự hấp
thu glucose trong ruột (Lê Thanh Hùng, 2008).
- Nhóm NSP không tan có trong vách tế bào thực vật hiện diện nhiều trong
ngũ cốc và rau cải, làm tăng tốc độ di chuyển thức ăn qua đường tiêu hóa, cản trở
các enzyme nội sinh tiếp cận với các chất dinh dưỡng như protein, tinh bột và lipid
có trong bào chất, từ đó cũng làm giảm sự tiêu hóa, hấp thu các dưỡng chất (Lê
Thanh Hùng, 2008).
2.1.3 Mannan
2.1.3.1 Định nghĩa
Mannan thuộc nhóm hemicellulose. Nó còn được gọi là galactomannan có
công thức phân tử (C6H12O6)n, tan trong nước, là một thành phần chất xơ trong thức
ăn. Cấu trúc mannan là một chuỗi polysaccharide lặp đi lặp lại với các đơn vị đường
1,4-mannose và 1,6-galactose và glucose nối tiếp nhau tạo thành mạch mannan.
Trong tự nhiên thường gặp galactose hoặc glucose gắn vào mannan. Tính hòa tan
của mannan trong nước sẽ làm tăng số lượng galactose hoặc glucose trên chuỗi
mannan. Tỉ lệ trong thức ăn khoảng 2-4% sẽ làm chậm sự phát triển và giảm hiệu
quả sử dụng thức ăn ở gia cầm (Ray và ctv., 1982; Verma và McNab, 1982, trích

dẫn từ Mai Anh Tuấn, 2011).
Công thức cấu tạo của đường mannan:

(Nguồn: )

4


2.1.3.2 Các nguồn cung cấp mannan trong thức ăn chăn nuôi
Mannan hiện diện nhiều trong ngô, lúa mì, lúa mạch, cám gạo, cám mì, đặc
biệt trong các loại khô dầu như khô dầu cọ, khô dầu vừng, vỏ đậu nành, khô dầu
đậu phộng, khô dầu cải.
Bảng 2.1: Hàm lượng β-mannan trong thức ăn
Nguyên liệu

β-mannan %

Nguyên liệu

β-manan %

Khô cọ

30 - 35

Khô cải

0,49

Khô dừa

20 - 25

Khô bông

0,36

Vỏ đậu nành

6-7

Lúa mạch

0,49

Khô vừng (mè)

2,8 - 3,5

Cám gạo

0,32

Khô đậu nành (44% CP)

1,5 - 1,6

Lúa mì

0,10

Khô đậu nành (48% CP)

1,2 - 1,3

Bắp

0,09

Khô hướng dương

0,57

Lúa miến

0,09

Khô lạc

0,51

Cám mì

0,07

(Nguồn Dierick, 1989)
2.2 Enzyme
2.2.1 Định nghĩa
Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein.Nhờ có enzyme mà
các phản ứng sinh hoá học xảy ra một cách nhanh chóng, nhịp nhàng, chính xác,

hiệu quả cao và tiết kiệm năng lượng.
2.2.2 Tính đặc hiệu của enzyme
Đa số các enzyme có tính chọn lọc đối tượng tác động một cách rõ rệt, mỗi
enzyme chỉ tác động lên một cơ chất, một kiểu phản ứng hoặc một loại phản ứng,
nghĩa là tác dụng của enzyme có tính đặc hiệu.Hiện tượng này có liên quan đến cấu
trúc phân tử và trung tâm hoạt động của enzyme.
Enzyme có 04 tính đặc hiệu là đặc hiệu tuyệt đối ; đặc hiệu tương đối ; đặc
hiệu theo kiểu phản ứng; và đặc hiệu theo kiểu hình học không gian.

5


2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hoạt động của enzyme
Nhiệt độ
Do enzyme có bản chất là protein nên nó không bền với nhiệt. Mỗi loại
enzyme có một nhiệt độ tối thích khác nhau tùy vào nguồn gốc của enzyme và tùy
theo từng điều kiện hoặc sự khác nhau về tính nhạy cảm với nhiệt độ của phân tử
protein-enzyme. Đa số các enzyme mất hoạt lực xúc tác ở nhệt độ cao
(>800C).Nhiệt độ tối ưu của các enzyme có nguồn gốc thực vật khoảng 50-600C,
enzyme nguồn gốc động vật khoảng 40-500C.
Ảnh hưởng của pH
Mỗi enzyme có một trị số pH tối thích có thể rất acid (trong khoảng từ 1,5-2
đối với pepsin), hoặc rất kiềm (trong khoảng 9,5-10 đối với arginase), nhưng pH tối
ưu của đa số các enzyme ở vào khoảng chung quanh giá trị trung tính.
Ảnh hưởng của các chất xúc tác
Chất hoạt hóa có khả năng làm tăng hoạt lực xúc tác của enzyme. Các chất
hoạt hóa có bản chất khác nhau chúng có thể là các ion kim loại, dẫn xuất của các
vitamin.
Sự hoạt động của enzyme cũng có thể bị kìm hãm bởi các tác nhân gây biến
tính protein. Các chất gây kìm hãm hoạt động của protein như muối của các kim

loại nặng, chất tanin…
Nồng độ cơ chất và nồng độ enzyme
Ở nồng độ cơ chất thấp tốc độ phản ứng tỉ lệ thuận với nồng với nồng độ cơ
chất.Nhưng nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng tăng chậm dần, và
khi nồng độ cơ chất đạt đến một giá trị nào đó thì vận tốc phản ứng không tăng
nữa.Trong những điều kiện đó thì nồng độ enzyme quyết định tốc độ phản ứng.
2.2.4 Các đơn vị đo hoạt lực của enzyme
Mục đích xác định hoạt lực enzyme là xác định số đơn vị hoạt lực. Một đơn
vị hoạt lực enzyme được định nghĩa theo nhiều phương pháp.
2.2.4.1 Đơn vị quốc tế
Enzyme unit , viết tắt là U do Hiệp Hội Hóa sinh Quốc Tế

6

(International


Union of Biochemistry – IUB) định nghĩa: Một đơn vị chuẩn của enzyme (1 U) là
lượng enzyme xúc tác chuyển hóa được 1 µmol cơ chất sau 1 phút ở điều kiện tiêu
chuẩn.
U = 1 µmol sản phẩm = 1 µmol cơ chất (10-6 mol)/phút
2.2.4.2Katal
Năm 1979, Hội đồng danh pháp của IUB khuyến cáo nên sử dụng Katal làm
đơn vị cơ bản của hoạt lực enzyme.
Một Katal là lượng enzyme xúc tác chuyển hóa được 1 mol cơ chất sau 1
giây ở điều kiện tiêu chuẩn.
1 Kat = 1 mol cơ chất/ giây = 60 mol/ phút = 60 x 106 µmol/ phút = 6 x 107 U
1 U = 1/60 x 10-6 Kat = 16,67 nKat (nanokatal)
Đơn vị Katal được khuyến cáo vì nằm trong hệ đơn vị đo lường Quốc tế (SI).
2.2.4.3 Đơn vị tự đặt

Đơn vị hoạt lực dựa vào sự thay đổi đặc tính hỗn hợp phản ứng, ví dụ sự thay
đổi độ đục, độ nhớt… trong một đơn vị thời gian. Trường hợp cơ chất và sản phẩm
là một hỗn hợp phức tạp thì áp dụng đơn vị hoạt lực này.
Như vậy, có nhiều đơn vị hoạt lực enzyme. Điều quan trọng nhất là cần định
nghĩa rõ ràng đơn vị hoạt lực.
Bảng 2.2: Hoạt lực enzyme mannanase trong một số sản phẩm khác nhau
Enzyme

Hoạt lực

Hemicell HT ( Bayer)

16.000 UI/g

NSP 500 (Sunhy)

28.000UI/g

Hemicell lỏng

720.000UI/ml

Enzyme hỗn hợp

3.000 UI/g

Mannanase (CTC Bio)

80.000UI/g

Sunzyme

1000UI/g

7


2.2.5 Những điểm cần chú ý khi tiến hành thí nghiệm đo hoạt lực enzyme
-

Cần tránh những yếu tố có thể biến tính protein enzyme.

-

Các thông số nhiệt độ, pH, nồng độ ion và thành phần dung dịch đệm ảnh
hưởng lên hoạt lực enzyme. Thử hoạt lực enzyme phải được tiến hành trong
điều kiện thích hợp như điều kiện sinh lý, điều kiện tồn trữ thực phẩm hoạt
điều kiện mà hoạt lực có thể đạt tối ưu.

-

Với những enzyme cần chất hoạt hóa hoặc chất ổn định thì phải cho các chất
này vào enzyme trước khi cho cơ chất vào hỗn hợp phản ứng.

-

Nồng độ cơ chất trong phản ứng enzyme phải ở trong giới hạn thích hợp , đủ
thừa để bão hòa enzyme, nhưng không quá cao để kìm hãm enzyme. Sau khi
dừng phản ứng lượng cơ chất được chuyển hóa 20 - 30%

-

Thời gian xác định hoạt lực thường 5- 30 phút. Tốt nhất là xác định tốc độ
ban đầu của phản ứng (30 - 60 giây), vì giai đoạn này tốc độ phản ứng lớn
nhất, sau đó bắt đầu giảm.

-

Khi xác định hoạt lực phải làm mẫu đối chứng song song với mẫu thí
nghiệm. Trong mẫu đối chứng enzyme phải bị bất hoạt trước khi tiếp xúc với
cơ chất.

2.3.6 Một số phương pháp xác định hoạt lực của enzyme
2.3.6.1 Xác định hoạt lực enzyme bằng cách đo đường kính vòng thủy phân
Cho enzyme tác dụng lên cơ chất trong môi trường thạch, cơ chất bị phân
hủy, độ đục của môi trường bị giảm, môi trường trở nên trong suốt. Độ trong của
môi trường trong suốt phản ánh hoạt động của enzyme.
2.3.6.2 Phương pháp nhuộm cơ chất
Phương pháp nhuộm cơ chất là phương pháp sử dụng các cơ chất đã được
nhuộm màu, do vậy khi nó bị enzyme làm rã ra, màu sẽ được giải phóng. Đây là
một phương pháp đơn giản nhưng tương đối mới và chưa được sử dụng rộng rãi
trong quá trình phân tích enzyme.
2.3.6.3 Xác định hoạt lực enzyme dựa vào lượng đường khử tạo thành

8


Phương pháp đo độ đường khử chỉ xác định số vết cắt của enzyme lên một
cơ chất cụ thể nào đó mà không chú ý tới vết cắt đó ở đâu. Phương pháp này đã
được chứng minh, tương đối chính xác và được chấp nhận là một phương pháp

thường được sử dụng.
2.3.6.4 Xác định hoạt lực enzyme dựa vào sự giảm độ nhớt của dung dịch cơ
chất
Phương pháp đo độ nhớt về cơ bản gần giống như phương pháp trên nhưng
chỉ chú trọng vào những enzyme tạo ra những vết cắt ở giữa của cơ chất. Phương
pháp này phản ánh một cách trung thực hơn hoạt lực của enzyme trong cơ thể con
vật nhưng quá trình thử nghiệm rất tốn thời gian và tương đối phức tạp
2.3.7 NSP enzyme
Theo Đỗ Hữu Phương (2004), enzyme NSP được sử dụng khá rộng rãi trong
chăn nuôi do những tác động tích cực mà nó mang lại như giúp vật nuôi tiêu hóa tốt
hơn, vừa hạn chế được những tác hại do bản thân nó gây ra, vừa giải phóng một
phần năng lượng và acid amin thặng dư. NSP enzyme tạo điều kiện phóng thích các
acid amin, cải thiện khả năng tiêu hóa từng loại acid amin từ 1,7-7,9%, giúp tiết
kiệm các acid amin khi bổ sung vào khẩu phần làm giảm giá thành sản xuất. Sử
dụng enzyme giúp cải thiện thành tích vật nuôi. Các cải thiện này có được là sự
phối hợp của nhiều yếu tố khác nhau gồm sự cải thiện môi trường ruột ; sự cải thiện
khả năng tiêu hóa; và sử dụng các thực liệu kinh tế hơn.
2.2.8 Enzyme mannanase
Mannanase là một enzyme đơn thể với khối lượng phân tử 65 kDa. Nhiệt độ
tối đa mà enzyme vẫn hoạt động khoảng 90-920C, có thời gian bán hủy là 34 giờ tại
nhiệt độ 850C, 13 giờ tại 900C (Dufaud và ctv., 1997, trích dẫn từ Mai Anh Tuấn,
2011).
Beta-mannanase là sản phẩm lên men bởi Bacillus lentus. Beta-mannanase là
enzyme phân giải beta-mannan, một polysaccharide có cấu tạo là đường D-mannose
và D galactose gắn kết nhau bằng liên kết 1,4 glucoside, với tỉ lệ mannose/galactose
là 2/1 (www.scientificpsychic.com). Mannan có mặt trong hầu hết nguyên liệu thức

9

ăn, đặc biệt có nhiều trong khô dầu cọ (30-35%), khô dầu dừa (20-25%), khô dầu
đậu nành…
Vai trò của enzyme beta-mannanase là làm loãng chất nhầy trong đường
ruột, giúp vật nuôi ăn khỏe hơn và hấp thu thức ăn tốt hơn. Cải thiện hệ số chuyển
đổi thức ăn, trọng lượng, tăng tỉ lệ sống và tỉ lệ đồng đều của heo, gà (Vũ Duy
Giảng, 2009).
Enzyme mannanase cũng giúp phân cắt chất xơ khác của vách tế bào, tạo
điều kiện cho enzyme nội sinh của ống tiêu hóa như amylase, protease, lipase tiếp
cận và phân giải các chất như tinh bột, protein và lipid thành những phân tử nhỏ dễ
hấp thu. Nhờ vậy giá trị dinh dưỡng của thức ăn tăng lên (tăng lên khoảng 100-150
kcal ME/kg). Tỷ lệ tiêu hóa acid amin tăng 1,5-2,3% (Vũ Duy Giảng, 2009).
Enzyme mannanase phân cắt beta-mannan thành những phân đoạn đường
manose ngắn hơn, đó là những manose oligosaccharide (MOS). MOS lúc này giữ
vai trò là các prebiotic, có tác dụng loại bỏ các vi khuẩn bám dính vào thượng bì
ruột và kích thích hệ miễn dịch ruột hoạt động, từ đó tăng sức khỏe của ruột, hạn
chế rối loạn tiêu hóa.
Enzyme mannanase khi được bổ sung vào thức ăn chứa những nguyên liệu
giàu mannan có tác dụng phân cắt mạch 1,4- glucosid của polimer mannan, làm cho
chúng ngắn lại, từ đó giảm độ nhớt của dịch ruột, tạo điều kiện cho niêm mạc ruột
hấp thu các chất dinh dưỡng dễ dàng hơn và có thể làm đảo ngược lại những tác hại
gây ra bởi galactomannan (Ghesquiere, 2004).

10


Chương 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện tại Bộ môn Dinh Dưỡng Khoa Chăn nuôi

- Thú y ,

Trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 02 đến tháng 07/2013.
3.2 Phương pháp tiến hành
3.2.1 Địa điểm và thời gian lấy mẫu
3.2.1.1 Địa điểm
Do đây là bước đầu khảo sát và phân tích hoạt lực của mannanse với điều
kiện còn hạn chế nên ngoài mẫu enzyme tinh chất do công ty Sunhy cung cấp,
chúng tôi sẽ lấy thêm mẫu enzyme cũng như NSP ở một số công ty khác như Bio,
Bayer,… Tuy nhiên do các số liệu thu thập được trong quá tr ình thực hiện là những
thông tin nhạy cảm nên trong các kết quả sau này , tên các sản phẩm sẽ được mã hoá
bằng các ký tự A, B, C… Mẫu được phân tích tại phòng thí nghiệm enzyme Sunhy Bộ Môn Dinh Dưỡng, Khoa Chăn Nuôi Thú Y, Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ
Chí Minh.
3.2.1.2 Thời gian
Thời gian lấy mẫu được tiến hành từ tháng 05 đến cuối tháng 06.
3.2.2 Đối tượng khảo sát
3.2.2.1 Chọn mẫu
Mẫu enzyme tinh chất được các công ty sản xuất thức ăn chăn nuôi và các
công ty sản xuất enzyme cung cấp bao gồm:
- Sản phẩm enzyme mannanase tinh chất
- Sản phẩm Men tiêu hóa NSP 500 là phức hợp đa enzyme gồm xylanase, βglucanase, mannanase, cellulase, pectinase
- Sản phẩm Hemicell HT
- Sản phẩm Hemicell lỏng

10


- Sản phẩm Enzyme hỗn hợp là p

hức hợp đa enzyme gồm β-glucanase,

mannanase, protase, xylanase, pectinase, cellulase.
- Sản phẩm Enzyme Mannanase
3.2.2.2 Lấy mẫu
Mẫu được lấy từ các nhà máy chế biến thức ăn và các công ty cung cấp chất
bổ sung . Tất cả có 05 mẫu sản phẩm enzyme

có chứa mannanase thuần hoặc

mannanase kết hợp với các enzyme tiêu hoá khác . Do tính chất tế nhị của sự cạnh
tranh thương mại trên thị trường nên các mẫu sản phẩm enzyme thu được sẽ được
mã hoá theo quy luận tự đặt bằng cá c ký tự A , B, C, … không có liên quan gì đến
tên sản phẩm và trong phần kết quả sẽ chỉ trình bày số liệu theo tên sản phẩm đã
được mã hoá.
3.2.3 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm
Các thiết bị , dụng cụ , hoá chất cần thiết cho quy trình đánh giá hoạt lực
enzyme mannanase và quy trình chi tiết được trình bày trong phần phụ lục.
3.2.4 Phương pháp phân tích
3.2.4.1 Lập đường chuẩn và phân tích hoạt lực enzyme tinh chất
 Nguyên tắc
Mannan được thủy phânoligosaccharide và monosaccharide bởi mannanase,
cả oligosaccharide và lượng đường khử bị tác động bởi DNS (3-5 dinitrosalicylic
acid) trong nước sôi. Trong phản ứng tạo màu này, mức độ màu tỷ lệ thuận với
lượng đường được khử bởi mannanase, vì vậy có thể xác định được hoạt lực của
mannanase. Phân tích cường độ màu sắc, từ đó hoạt lực của mannanase có thể được
tính toán.
Định nghĩa đơn vị enzyme: một đơn vị mannanase được định nghĩa là lượng
enzyme cần thiết để giải phóng 1µmol đường khử từ 3 mg/ml dung dịch Mannan
trong một phút với điều kiện pH= 5,5 và 37oC.
 Chuẩn bị hóa chất được sử dụng

 Lập đường chuẩn

11


Nồng độ

Độ hấp phụ

Hình 3.1: Đường chuẩn được lập ngày 17/06/2013 (DNS ngày 10/06/2013)
 Xác định hoạt lực enzyme tinh chất
Chuẩn bị mẫu enzyme cần phân tích
Đo hoạt lực enzyme ghi nhận kết quả
3.2.4.2 Phương pháp phân tích hoạt lực enzyme mannanase dưới ảnh hưởng
của ba mức nhiệt độ
Vì trong phạm vi phòng thí nghiệm , không thể đưa enzyme vào thức ăn sản
xuất như thực tế ở nhà máy sản xuất thức ăn nên chúng tôi sử dụng tủ sấy để tạo ra
các điều kiện nhiệt độ 70, 75 và 800C, mỗi mức nhiệt độ này sẽ kéo dài trong ba
quãng thời gian 15s, 20s và 30s (thí nghiệm hai yế u tố) là những điều kiện thường
hay diễn ra trong dây chuyền sản xuất thức ăn viên của nhà máy thức ăn (ở khâu hồ
hoá và ép viên ). Chọn 3 mẫu sản phẩm enzyme được sử dụng phổ biến trên thị
trường. Cho các mẫu enzyme vào tủ sấy sấy ở 03 mức nhiệt độ 70, 75 và 800C. Mỗi
mức nhiệt độ sấy với 03 mức thời gian khác nhau là 15s, 20s và 30s. Sau đó đem
các mẫu enzyme ra và phân tích hoạt lực giống như phân tích hoạt lực ở enzyme
thuần. Với mỗi mẫu tiến hành lặp lại 05 lần và ghi nhận kết quả.

12


3.2.4.3 Phương pháp phân tích hoạt lực enzyme mannanase dưới sự ảnh hưởng

của 03 mức pH
Khi sử dụng enzyme trong thức ăn chăn nuôi thì sản phẩm enzyme này sẽ
phải chịu tác động của các mức pH khác nhau trong đường tiêu hoá . Có thể là pH
khoảng 3 ở dạ dày trước khi lên đến 4 - 5 ở tá tràng là nơi mà xem như các enz yme
sẽ có tác động mạnh nhất trên cơ chất và liên quan nhiều nhất đến khả năng tiêu hoá
thức ăn. Vì vậy trong thí nghiệm nhỏ này chọn 03 mức pH tác động vào sản phẩm
enzyme để đánh giá hoạt lực là pH

= 5,5; pH = 4; và pH = 3. Chọn 03 mẫu sản

phẩm enzyme đang được dùng phổ biến ở thị trường để đưa vào thí nghiệm . Dùng
dung dịch buffer(dung dịch đệm acetate-sodium acetate) đã được chuẩn độ về các
mức pH là 3,4 và 5.5 để tạo các môi trường khác nhau, cho enzyme vào các dung
dịch buffertrên và cho tác động trong 30 phút trên máy lắc. Sau đó phân tích hoạt
lực của các mẫu enzyme này giống phương pháp phân tích hoạt lực enzyme thuần,
ghi nhận kết quả.
3.2.4.4 Phương pháp xử lý số liệu
Tất cả số liệu thu thập được lưu trữ bằng phần mềm excel , rồi sau đó dùng
phần mềm thống kê Minitab 16 tính toán các tham số thống kê , cũng như dùng trắc
nghiệm F và trắc nghiệm Tukey để so sánh các số liệu trung bình từ những thí
nghiệm nhỏ nêu trên.

13