XÂY DỰNG QUY TRÌNH PCR PHÁT HIỆN HAEMOPHILUS PARASUIS TRÊN HEO CAI SỮA CÓ DẤU HIỆU RỐI LOẠN HÔ HẤP

BỘ GIÁO DỤC vàĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CHĂN NUÔI - THÚ Y
*************************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PCR PHÁT HIỆN HAEMOPHILUS
PARASUIS TRÊN HEO CAI SỮA CÓ DẤU HIỆU RỐI LOẠN
HÔ HẤP

Sinh viên thực hiện : PHẠM TRƯỜNG AN
Lớp: DH08TY
Ngành: Thú y
Niên khóa : 2008 - 2013

Tháng 09/2013


BỘ GIÁO DỤC vàĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CHĂN NUÔI - THÚ Y
*************************

PHẠM TRƯỜNG AN

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PCRPHÁT HIỆN HAEMOPHILUS
PARASUISTRÊN HEO CAI SỮA CÓ DẤU HIỆU RỐI LOẠN
HÔ HẤP

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Bác sỹ thú y

Giáo viên hướng dẫn
ThS. ĐỖ TIẾN DUY
TS. LÊ THANH HIỀN

Tháng 09/2013

i


XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN
Họ và tên sinh viên thực hiện: PHẠM TRƯỜNG AN
Tên

đề

tài:

“XÂY

DỰNG

QUY

TRÌNH

PCR

PHÁT

HIỆN

HAEMOPHILUS PARASUIS TRÊN HEO CAI SỮA CÓ DẤU HIỆU RỐI
LOẠN HÔ HẤP”.
Đã hoàn thành theo đúng yêu cầu của giáo viên hướng dẫn và các ý kiến đóng
góp, nhận xét của hội đồng chấm thi tốt nghiệp ngày ……………..
Giáo viên hướng dẫn 1

Giáo viên hướng dẫn 2

ThS. Đỗ Tiến Duy

TS. Lê Thanh Hiền

ii


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên con xin gửi lời biết ơn chân thành đến Bố Mẹ đã sinh thành, không
quản nắng mưa vất vả nuôi nấng, dạy dỗ con được như ngày hôm nay. Gia đình
mình đã luôn bên con mọi lúc mọi nơi, là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho con
trong cuộc sống này.
Em chân thành cảm ơn
Ban giám hiệu trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ
nhiệm Khoa Chăn nuôi Thú y, cùng toàn thể quý thầy cô đã tận tâm truyền đạt kiến
thức trong suốt quá trình học tập tại trường cũng như tạo điều kiện thuận lợi nhất
trong thời gian thực hiện khóa luận!
Em chân thành biết ơn
ThS. Đỗ Tiến Duy và TS. Lê Thanh Hiền đã hết lòng hướng dẫn, động viên
em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận!

BSTY. Nguyễn Phạm Huỳnh vàBSTY. Lê Thị Hạnh Dung đã tận tình hướng
dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện cho em thực tập tốt nghiệp!
Xin cảm ơn
Ban quản lý Bệnh Viện Thú Y Trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM.
Các anh chị đang công tác và cùng làm đề tài tốt nghiệp tại Bệnh Viện Thú Y
đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho em trong suốt thời gian thực tập.
Tập thể lớp DH08TY đã quan tâm, giúp đỡ, động viên chia sẻ những vui buồn
cùng tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện khóa luận.
Xin chân thành cảm ơn!
PHẠM TRƯỜNG AN

iii


TÓM TẮT
Đề tài “Xây dựng quy trình PCR phát hiện Haemophilus parasuis trên heo
cai sữa có dấu hiệu rối loạn hô hấp” được thực hiện từ tháng 02/2013 đến tháng
07/2013 tại phòng xét nghiệm sinh học phân tử - tế bào thuộc Bệnh Viện Thú y,
khoa Chăn Nuôi Thú Y, Trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
Nghiên cứu này nhằm xây dựng quy trình PCRphát hiện vi khuẩn H.
parasuis một cách nhanh chóng, chính xác và hiệu quả, từ đó có những biện pháp
hữu hiệu để phòng chống và ngăn ngừa sự lây lan của bệnh.
Kết quả đạt được như sau:
•

Quy trình PCR có nồng độ primerHPF-cysS; HPR-cysS là 0,5 µM

•

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR như sau: tiền biến tính ở 95 oC trong 5 phút;

biến tính ở 94 oC trong 30 giây; bắt cặp ở 56 oC trong 1 phút; kéo dài ở 72 oC trong 1
phút; giai đoạn kéo dài cuối cùng ở 72 oC trong 7 phút.
•

Quy trình PCR sau khi tối ưu đã được ứng dụng trên mẫu thực địa.

iv


MỤC LỤC
TRANG
Trang tựa .................................................................................................................. i
Phiếu xác nhận của giáo viên hướng dẫn ................................................................. ii
Lời cảm tạ .............................................................................................................. iii
Tóm tắt ................................................................................................................... iv
Mục lục ................................................................................................................... v
Danh sách các chữ viết tắt .................................................................................... viii
Danh sách các bảng ................................................................................................ ix
Danh sách các hình .................................................................................................. x
Danh sách sơ đồ ..................................................................................................... xi
Chương 1 MỞ ĐẦU............................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề ......................................................................................................... 1
1.2 Mục tiêu và yêu cầu ........................................................................................... 2
1.2.1 Mục tiêu .......................................................................................................... 2
1.2.2 Yêu cầu ........................................................................................................... 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU..................................................................... 3
2.1 Bệnh do vi khuẩn H. parasuis gây ra ................................................................ 3
2.1.1 Khái niệm ....................................................................................................... 3
2.1.2 Lịch sử nghiên cứu ......................................................................................... 3

2.1.3 Đặc điểm của H. parasuis ............................................................................... 4
2.1.4 Dịch tễ học ..................................................................................................... 4
2.1.5 Cơ chế sinh bệnh ............................................................................................ 5
2.1.6 Triệu chứng .................................................................................................... 5
2.1.7 Bệnh tích ........................................................................................................ 7
2.2 Polymerase Chain Reaction (PCR) .................................................................... 9
2.2.1 Định nghĩa phản ứng PCR .............................................................................. 9

v


2.2.2 Các giai đoạn của phản ứng PCR .................................................................... 9
2.2.3 Các yếu tố quan trọng trong phản ứng PCR .................................................. 11
2.2.3.1 Primer ........................................................................................................ 11
2.2.3.2 DNA bản mẫu ............................................................................................ 11
2.2.3.3 Nồng độ MgCl2 .......................................................................................... 11
2.2.3.4 dNTP ......................................................................................................... 12
2.2.3.5 Taq-polymerase ......................................................................................... 12
2.2.3.6 Số chu kỳ trong phản ứng PCR .................................................................. 13
2.2.4 Đọc kết quả phản ứng PCR ........................................................................... 13
2.2.5 Ứng dụng của kỹ thuật PCR.......................................................................... 14
2.2.6 Ưu và nhược điểm của kỹ thuật PCR ............................................................ 14
2.3 Phản ứng multi PCR ........................................................................................ 15
2.4 Quy trình ly trích DNA .................................................................................... 15
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 17
3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành ....................................................................... 17
3.2 Nội dung thực hiện .......................................................................................... 17
3.3 Vật liệu và hóa chất ......................................................................................... 17
3.3.1 Vật liệu nghiên cứu ....................................................................................... 17
3.3.2 Hóa chất ........................................................................................................ 17

3.3.3 Thiết bị ......................................................................................................... 18
3.4 Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 19
3.4.1 Kiểm tra độ đặc hiệu và khả năng hình thành cấu trúc thứ cấp của primer .... 19
3.4.2 Xác định nồng độ primer tối ưu cho phản ứng PCR ...................................... 20
3.4.3 Xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho phản ứng PCR ..................................... 20
3.4.4 Xác định nồng độ Master mix tối ưu cho phản ứng PCR ............................... 22
3.4.5 Ứng dụng quy trình PCR trên mẫu thực địa .................................................. 23
3.4.6 Đánh giá mức độ thống nhất giữa kết quả của s-PCR và m-PCR................... 23
3.4.6.1 Quy trình m-PCR phát hiện H. pasasuis..................................................... 24
3.4.6.2 Hệ số Kappa .............................................................................................. 25

vi


Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 26
4.1 Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của cặp primer.................................................... 26
4.2 Kết quả xác định nồng độ primer và nhiệt độ bắt cặp tối ưu ............................. 30
4.3 Kết quả xác định nồng độ Master mix tối ưu.................................................... 33
4.4 Kết quả giải trình tự gen sản phẩm PCR .......................................................... 34
4.5 Ứng dụng quy trình PCR trên mẫu thực địa ..................................................... 36
4.5.1 Kết quả ứng dụng quy trình PCR trên mẫu thực địa ...................................... 36
4.5.2 Đánh giá mức độ thống nhất giữa kết quả của s-PCR và m-PCR................... 37
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................ 40
5.1 Kết luận ........................................................................................................... 40
5.2 Đề nghị ............................................................................................................ 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 41

vii

DANH SÁCHCÁC CHỮ VIẾT TẮT
BLAST

Basic Local Alignment Search Tool

EDTA

Ethylene Diamine Tetra Acetate

DNA

Deoxyribonucleoic Acid

dNTP

Deoxyribonucleotide Triphosphate

H. parasuis

Haemophilus parasuis

K

Kappa

m-PCR

Multiplex Polymerase Chain Reaction

MWM

Molecular Weight Marker

NAD

Nicotinamide Adenin Dinucleotide

NCBI

the National Center for Biotechnology Information

NT

Nghiệm thức

OD

Optical Density

PCR

Polymerase Chain Reaction

PRRS

Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome

SDS

Sodium Dodecyl Sulfat

s-PCR

Single Polymerase Chain Reaction

TBE

Tris Borate EDTA

Ta

Annealing Temperate

TE

Tris EDTA

Tm

Melting Temperate

viii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
TRANG
Bảng 3.1 Cặp pimer sử dụng trong phản ứng PCR phát hiện H. parasuis .............. 19
Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR xác định nồng độ primer.............................. 20
Bảng 3.3 Thí nghiệm về nhiệt độ bắt cặp trong quá trình luân nhiệt ...................... 21
Bảng 3.4 Các nghiệm thức xác định nồng độ primer và nhiệt độ bắt cặp ............... 22

Bảng 3.5 Thành phần Go taq® green Master mix ................................................... 23
Bảng 3.6 Thành phần phản ứng m-PCR phát hiện H. parasuis .............................. 24
Bảng 3.7 Chu trình luân nhiệt phản ứng m-PCR phát hiện H. parasuis ................. 24
Bảng 4.1 Các đặc tínhcơ bản của cặp primer ......................................................... 26
Bảng 4.2 Kết quả cấu trúc thứ cấp mang năng lượng thấp nhất ............................. 27
Bảng 4.3 Kết quả phân tích BLAST của cặp primer .............................................. 29
Bảng 4.4 Kết quả xác định nồng độ primer và nhiệt độ bắt cặp ............................. 30
Bảng 4.5 Kết quả phản ứng s-PCR và m-PCR phát hiện H. parasuis..................... 37
Bảng 4.6 So sánh sự phù hợp giữa kết quả của s-PCR và m-PCR .......................... 38

ix


DANH SÁCH CÁC HÌNH
TRANG
Hình 2.1 Nhuộm Gram vi khuẩn H. parasuis .......................................................... 4
Hình 2.2 Triệu chứng lâm sàng của heo nhiễm H. parasuis .................................... 6
Hình2.3 Viêm phổi sợi huyết trong bệnh Glasser .................................................... 7
Hình 2.4Viêm phúc mạc và viêm màng ngoài tim sợi huyết.................................... 8
Hình 2.5 Dịch màng bao tim đục và có sợi huyết ở màng ngoài tim ........................ 8
Hình 2.6 Một chu kỳ phản ứng PCR ..................................................................... 10
Hình 3.1 Máy ly tâm – Máy điện di ...................................................................... 18
Hình 3.2 Máy luân nhiệt ....................................................................................... 18
Hình 4.1 Kết quả khảo sát nồng độ primer ở 52oC ................................................ 31
Hình 4.2 Kết quả khảo sát nồng độ primer ở 54oC ................................................ 32
Hình 4.3 Kết quả khảo sát nồng độ primer ở 56oC ................................................ 32
Hình 4.4 Kết quả khảo sát nồng độ primer ở 58oC ................................................ 33
Hình 4.5 Kết quả khảo sát nồng độ Master mix ..................................................... 34
Hình 4.6 Kết quả BLAST sản phẩm của phản ứng PCR phát hiện H. parasuis ..... 35
Hình 4.7Kết quả ứng dụng quy trình s-PCR trên mẫu thực địa .............................. 36

Hình 4.8 Xử lý số liệu với phần mềm WINEPISE 2.0 ........................................... 38

x


DANH SÁCH SƠ ĐỒ
TRANG
Sơ đồ 3.1 Bố trí khảo sát ....................................................................................... 19

xi


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Xã hội Việt Nam đang trên đà phát triển, đời sống con người ngày càng được
nâng cao, nhu cầu về thực phẩm có nguồn gốc động vật của người tiêu dùng ngày
càng phong phú và đa dạng. Trước những nhu cầu thực tế của xã hội, ngành chăn
nuôiđã và đang chiếm một vị trí quan trọng trong nền kinh tế cả nước, đặc biệt chăn
nuôi heo là một trong những ngành chăn nuôi chủ chốt. Ngành chăn nuôi heo không
ngừng phát triển nhằm cung cấp nguồn thực phẩm dồi dào cho thị trường và mang
lại hiệu quả kinh tế cho nhà chăn nuôi.
Tuy nhiên, khó khăn gây trở ngại lớn cho ngành chăn nuôi heo hiện nay là tình
hình các bệnh trên đường hô hấp thường xuyên xảy ra, gây thiệt hại đáng kể về mặt
kinh tế và xã hội. Với đặc thù khí hậu nhiệt đới ở Việt Nam, cùng với sự gia tăng
mật độ đàn heo và việc chưa xem trọng vấn đề an toàn sinh học trong chăn nuôi,
càng làm tình trạng này trở nên nghiêm trọng hơn. Bệnh hô hấp trên đàn heo có thể
do một hay nhiều vi khuẩn hoặc virus gây ra như Mycoplasma hyopneumoniae,
Actinobacillus pleuropneumoniae, Streptococcus suis, Haemophilus parasuis, hội
chứng rối loạn hô hấp và sinh sản trên heo (PRRS - Porcine Reproductive and

Respiratory Syndrome),…trong đó Haemophilus parasuis là một tác nhân gây bệnh
phổ biến. Heo nhiễm H. parasuis thường có biểu hiện ho, thở khó, thở thể bụng;
viêm phổi sợi huyết, dính sườn, viêm khớp, viêm tràn dịch, viêm màng não và có
thể dẫn đến chết.
Các phương pháp phát hiện H. parasuis như đánh giá bệnh tích đại thể, phân
lập nuôi cấy,…đạt hiệu quả chưa cao.H. parasuis là loài vi khuẩn khó nuôi cấy, đòi
hỏi nhiều yếu tố cho sự phát triển, do đó tỉ lệ phân lậpH. parasuis từ mẫu bệnh

1


phẩm khá thấp. Theo Nguyễn Trung Ngoan (2005) tỷ lệ phân lập thành công H.
parasuis trên mẫu phổi heo mắc bệnh hô hấp là 1,92%, Bùi Thị Hương Linh (2013)
tỷ lệ này là 0%. Do vậy việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử nhằm phát hiện
nhanh và chính xác mầm bệnh là một yêu cầu cần thiết, có ý nghĩa rất quan trọng
trong công tác phát hiện sớm và điều trị bệnh kịp thời, giúp giảm thiệt hại kinh tế
cho nhà chăn nuôi.
Xuất phát từ thực tiễn trên, được sự đồng ý Khoa Chăn nuôi – Thú y, Bệnh
viện Thú y trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh và dưới sự hướng
dẫn của ThS. Đỗ Tiến Duy và TS. Lê Thanh Hiền, chúng tôi thực hiện đề tài “Xây
dựng quy trình PCR phát hiện Haemophilus parasuis trên heo cai sữa có dấu
hiệu rối loạn hô hấp”.
1.2 Mục tiêu và yêu cầu
1.2.1 Mục tiêu
Xây dựngquy trình PCR phát hiện H. parasuis và phục vụ cho nhu cầu chẩn
đoán mầm bệnh này ở phòng xét nghiệm.
1.2.2 Yêu cầu
Xác định nồng độ primer tối ưu cho phản ứng PCR phát hiện H. parasuis.
Xác định nhiệt độ bắt cặp của chu trình luân nhiệt cho phản ứng PCR phát
hiện H. parasuis.

Xác định nồng độ Master mix tối ưu cho phản ứng PCR phát hiện H. parasuis.
Áp dụng quy trìnhPCR phát hiệnH. parasuis trên 30 mẫu thực địa. Đánh giá
mức độ thống nhất giữa quy trình s-PCR và m-PCR.

2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Bệnh do vi khuẩn Haemophilus parasuis gây ra
2.1.1 Khái niệm
H. parasuislà vi khuẩn gây bệnh truyền nhiễm trên đường hô hấpxảy ra trên
heo ở mọi lứa tuổi, nguyên nhân gây nên bệnh Glasservới cácdấu hiệu lâm sàng bao
gồm sốt, chán ăn, sưng khớp với sự di chuyển khó khăn, khó thở và các dấu hiệu
thần kinh. Bệnh tích đặc trưng do xâm nhiễm có hệ thống, nhiễm khuẩn huyết và
hậu quả là gây ra hội chứng “polyserositis” (viêm đa xoang dạng sợi huyết có mủ,
viêm phúc mạc, viêm màng ngoài tim, viêm màng phổi, viêm màng não và viêm
khớp).
2.1.2 Lịch sử nghiên cứu
Bệnh do H. parasuis đã được Glasser phát hiện đầu tiên vào năm 1910, trên
heo bệnh có biểu hiện viêm đa khớp – viêm thanh dịch. Năm 1931, vi khuẩn được
phân lập từ heo bị cúm và được đặt tên Haemophilus influenzae suis. Đến năm
1943, bệnh đã được Hiare và Wramby nghiên cứu về căn bệnh và đặt tên
làHaemophilus suis.Sau đó, vào năm 1976, qua những nghiên cứu đáng tin cậy, vi
khuẩn được đặt tên như hiện nay là Haemophilus parasuis.Ngoài ra theo Tô Minh
Châu và Trần Thị Bích Liên (2001) trước đó căn bệnh do Haemophilus đã được
Pleiffer phân lập lần đầu tiên trong những bệnh phẩm từ bệnh nhân bị cúm trong
thời gian có dịch cúm vào năm 1892. Đến 1918 người ta mới phát hiện ra chúng là
những nguyên nhân thứ hai sau virus cúm và thường xuyên xuất hiện cùng với virus
cúm ở heo. Bệnh xảy ra ở hầu hết đàn heo trên thế giới, tỉ lệ mắc bệnh có thể lên

đến 100% nhưng tỉ lệ chết dao động từ 5 – 10%.H. parasuis là nguyên nhân gây
viêm phổi và viêm đa thanh mạc (viêm màng phổi, viêm màng bao tim, viêm
khớp,…kèm sợi huyết) trên heo.

3


2.1.3 Đặc điểm của Haemophilus parasuis
H. parasuislà vi khuẩn có hình trực khuẩn, Gram âm, có tiêm mao và giáp mô,
hiếu khí hay yếm khí tùy nghi, nhiệt độ thích hợp là 37oC và pH 7,4–7,8. Khác với
những loài Haemophilus khác, sự phát triển của H. parasuis chỉ cần yếu tố V
(Nicotinamide Adenine Dinucleotide – NAD) mà không cần yếu tố X (Hemin).15
serovar của H. parasuis đã được xác định, serovar 4 và 5 được phân lập nhiều nhất.

Hình 2.1 Nhuộm Gram vi khuẩn H. parasuis
(Nguồn: Theo Virginia Aragón, 2009)
Vi khuẩn có sức đề kháng kém, dễ bị tiêu diệt bởi các chất sát trùng thông
thường, nhạy cảm với sự khô hạn và ánh sáng mặt trời.
2.1.4 Dịch tễ học
H. parasuis gây viêm màng phổi, viêm phế quản phổi, viêm đa thanh dịch trên
heo, làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức sống và sức tăng trọng của heo. Căn
bệnh lây lan khá mạnh, việc lây truyền có thể qua tiếp xúc trực tiếp, qua những giọt
khí dung và cũng có thể lây truyền gián tiếp qua công nhân trong trại. Bệnh cấp tính
có thể xảy ra ở nhiều ô chuồng, do khí dung và không khí chuyển động làm lan
truyền mầm bệnh, chỉ cần một lượng nhỏ H. parasuis khoảng 102-104tế bào cũng đủ
để gây nhiễm.

4

Miễn dịch từ mẹ truyền giảm sau 2-4 tuần, vì vậy thời kỳ này bệnh có thể xảy
ra trên heo 2-15 tuần, nhưng heo thời kỳ cai sữa 5-8 tuần tuổi thường mắc phải, tỷ lệ
tử vong là 5–10% nhưng có thể lên tới 50%. Vi khuẩn có nhiều serovar nên có thể
có nhiều hơn một serovar gây bệnh cho một đàn và có nhiều serovar không độc lực
ở mũi heo. Miễn dịch thường chỉ chống với serovars nhiễm, đối với serovar khác thì
không có, hoặc nếu có thì cũng rất kém.
2.1.5 Cơ chế sinh bệnh
Các yếu tố gây stress như thay đổi thời tiết đột ngột, ẩm độ cao kết hợp với độ
thông thoáng kém, vận chuyển, thay đổi thức ăn, cai sữa,.. là những yếu tố mở
đường cho bệnh phát triển nhanh. Bệnh phát triển mạnh trên đàn heo khi thời tiết
khắc nghiệt.H. parasuis định cư ở xoang mũi và khí quản mà không gây bệnh hoặc
ở dạng độc lực yếu làm hư hại lông rung và phá hủy tế bào biểu mô.
Sau khi xâm nhập qua đường hô hấp vào phổi, vi khuẩn cư trú và nhân lên ở
phế nang, sau 12 giờ vi khuẩnbị thực bào nhanh chóng bởi đại thực bào phế nang và
sản sinh độc tố dung giải tế bàovào máu và gây nhiễm trùng huyết, H. parasuis đặc
biệt ưa thích phát triển trên bề mặt màng thanh dịch (màng bụng, màng phổi, màng
ngoài tim, màng não, khớp) và hậu quả là gây viêm thanh dịch, viêm dính sườn,
viêm màng phổi sợi huyết, viêm màng não có mủ,… Khi nhiễm qua đường phế
quản có thể gây viêm khí quản phổi, H. parasuis nhân lên ở niêm mạc phế quản hơn
là tế bào có tiêm mao đường hô hấp.
2.1.6 Triệu chứng
Triệu chứng bệnh có thể thay đổi tùy theo sức khỏe và khả năng miễn nhiễm
của thú, môi trường và mức độ bộc phát của yếu tố gây bệnh.Triệu chứng bệnh xuất
hiện rất sớm sau khi nhiễm với biểu hiện sốt và suy hô hấp.
Thể cấp tính bệnh có thể xảy ra trên heo 5-8 tuần tuổi, ở một hay nhiều heo
trong cùng một bầy hoặc khác bầy thú đột nhiên yếu ớt, sốt với thân nhiệt 4041,5oC. Heo bỏ ăn, có triệu chứng hô hấp, ho, khó thở, thở thể bụng, nhịp tim tăng
(160 nhịp/phút) đặc biệt heo bị khập khiễng hoặc ngồi kiểu chó (tư thế ngồi để dễ

5

thở). Khi vi khuẩn xâm nhiễm vào não, màng não, tủy sống sẽ gâyrối loạn thần kinh
hầu với các biểu hiện co giật, mất vận động, sau cùng là ngã vật xuống, nằm
nghiêng sang một bên.Hầu hết các khớp đều sưng phồng và đau đớn, đi lại khó
khăn, có thể thấy thủy thũng ở mi mắt, ở tai và mặt. Thú sẽ chết trong vòng 2-5
ngày, heo chết thường có biểu hiện đỏ đến tím xanh trên da.
Ở thể mãn tính, bệnh sẽ phát triển khi biểu hiện bệnh cấp tính biến mất sau 5
ngày, những heo sống sót sẽ chuyển qua viêm khớp mãn tính, viêm nội tâm mạc,
viêm dính ruột, viêm màng não. Heo mãn tính có thể chết đột ngột.

Hình 2.2 Triệu chứng lâm sàng của heo nhiễm H. parasuis: thở khó,
ngồi kiểu chó, khớp sưng, xuất huyết trên da
(Nguồn: Bùi Thị Hương Linh, 2013)
2.1.7 Bệnh tích
Thể cấp tính: Khí quản, phế quản chứa đầy chất nhầy, phổi bị phù và xuất
huyết, biểu hiện rõ viêm màng phổi nhiều sợi huyết, viêm kẽ, thủy thũng, viêm dính
giữa phổi và thành ngực, cơ hoành và màng ngoài tim, xoang ngực chứa đầy dịch

6


viêm. Ngoài ra, có thể thấy viêm phế quản phổi, viêm khớp có dịch khớp đục, viêm
màng não cũng thường xảy ra.

Hình 2.3 Viêm phổi sợi huyết trong bệnh Glasser
(Nguồn: Theo Virginia Aragón, 2009)
Thể mãn tính: thường xuất hiện với những dạng bệnh tích kết dính có sợi
huyết, viêm màng ngoài tim cùng với biểu hiện suy tim, thủy thũng phổi, xoang
ngực chứa nhiều dịch.

7


Hình 2.4 Viêm phúc mạc và viêm màng ngoài tim sợi huyết
(Nguồn: Theo Virginia Aragón, 2009)

Hình 2.5 Dịch màng bao tim đục và có sợi huyết ở màng ngoài tim
(Nguồn: Tổ chức Hợp tác Quốc tế Nhật Bản, 2001)

8


2.2 Polymerase chain reaction (PCR)
2.2.1 Định nghĩa phản ứng PCR
Kỹ thuật PCR là một phương pháp tổng hợp DNAdựa trên mạch khuôn là một
trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượngbản sao của khuôn này thành
hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzym DNApolymerase và một cặp primer
đặc hiệu cho đoạn DNA này. Nhờ enzym DNApolymerase xúc tác trên các mạch
khuôn DNA tổng hợp nên các mạch đơn mới. Cácmạch đơn mới được tổng hợp lại
được sử dụng làm khuôn cho quá trình tổng hợpmạch mới của chu kỳ tiếp theo. Sự
tổng hợp mạch đơn DNA mới cần có sự tham gia của các primer tạo các nhóm 3’
OH tự do. Các nucleotid được gắn ở vị trí nhóm OHkéo dài tạo thành mạch đơn
mới (Khuất Hữu Thanh, 2006).
2.2.2 Các giai đoạn của phản ứng PCR
Giai đoạn biến tính (denaturation): nhiệt độ được nâng lên 95oC. Liên kết
hydro bị phá vỡ, các đoạn xoắn kép của DNA đều được tách ra, DNA biến tính từ
mạch đôi thành mạch đơn. Có thể biến động trong khoảng từ 93 – 100oC.
Giai đoạn bắt cặp (hybridization): hạ nhiệt độ phản ứng xuống (thấp hơn
nhiệt độ nóng chảy Tmcủa primer được sử dụng) cho phép các primer tìm kiếm và
bắt cặp bổ sung đặc hiệu với DNA khuôn mẫu, dao động vào khoảng 40 – 70oC, tùy

thuộc Tmcủa các primer và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút.
Giai đoạn kéo dài (extention): nâng nhiệt độ lên 72oC đểTaq-polymerase hoạt
động tổng hợp tốt nhất, kéo dài các mạch DNA.Taq-polymerase sẽ lấy các dNTP từ
môi trường phản ứng để gắn vào đầu 3’ của primer theo nguyên tắc bổ sung với
trình tự DNA đích. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào kích thước của DNA
mẫu, thường kéo dài từ 1 giây đến nhiều phút.

9


Hình 2.6 Một chu trình phản ứng PCR
Giai đoạn 1: Biến tính ở 94oC/1 phút
Giai đoạn 2: Bắt cặp ở 54oC/45 giây
Giai đoạn 3: Kéo dài ở 72oC/2 phút
(Nguồn: Ghent University, 1999)
Sau mỗi chu kỳ, số bản sao của DNA mẫu lại được tăng gấp đôi. Đây là sự
nhân bản theo cấp số nhân. Như vậy cứ 1 phân tử DNA mẫu, sau phản ứng PCR với
n chu kỳ sẽ tạo thành 2n bản sao phân tử DNA.

10


2.2.3 Các yếu tố quan trọng trong phản ứng PCR
2.2.3.1

Primer

Primer là những đoạn DNA đơn (oligonucleotide),cần thiết cho việc xúc tiến
phản ứng dây truyền tổng hợp DNA. Chúng bắt cặp bổ sung với một đầu của DNA
mẫu và tạo ra vị trí bắt đầu tái bản. Các primer này có chiều ngược nhau, bao gồm

một primer xuôi (F: forward) và một primer ngược (R: reverse). Xuôi và ngược là
so với chiều sao mã.
Primer là một trong những yếu tố quan trọng nhất, ảnh hưởng trực tiếp đến
hiệu quả cũng như độ chuyên biệt của phản ứng PCR.Chọnprimer là giai đoạn quyết
định của phản ứng PCR, cần tuân thủ một số nguyên tắc nhất định: trình tự của
primer được chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa hai primer hay giữa
một primer với chính nó (trình tự của chúng không được bổ sung nhau); Tm của
haiprimer không quá cách xa nhau; thành phần nucleotic củaprimer cần tránh các
cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần; trình tự của primer phải đặc trưng cho trình tự DNA
cần khuếch đại, không trùng với trình tự lặp lại trên gene; trình tự giữa hai primer
không quá lớn, phản ứng PCR thường tối ưu với những đoạn trình tự nhỏ hơn 1kb,
kích thước khoảng 18 – 24 base (Phan Cự Nhân, 2001).
2.2.3.2

DNA bản mẫu (DNA template)

Hàm lượng đủ nhưng không quá cao, tinh sạch – không chứa các chất ức chế
phản ứng: SDS, chất ức chế từ mẫu (hemoglobin, sắc tố, heparin…). PCR vẫn cho
kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ tế bào hay những mẫu DNA không được
bảo quản tốt.
2.2.3.3

Nồng độ MgCl2

Nồng độ MgCl2 là yếu tố ảnh hưởng mạnh đến phản ứng PCR, cần cho hoạt
động của Taq-polymerase. Nồng độ Mg2+ trong hỗn hợp phản ứng cuối cùng
thường biến thiên trong khoảng từ 0,5 – 5 mM. Nồng độ MgCl2từ 1,5 – 2 mM được

11

xem là tối ưu, nhưng nồng độ tối ưu phải được xác định cho từng phản ứng qua
nhiều thí nghiệm (Hồ Quỳnh Thùy Dương, 2008).
Nồng độ Mg2+ cao sẽ làm phân tử dây đôi ổn định hơn, kiềm hãm sự biến tính
hoàn toàn các sợi đôi, làm cho kết quả PCR ít đi. Sự dư thừa Mg2+còn làm cho hiện
tượng bắt cặp không đặc hiệu xảy ra nhiều hơn,hiện tượng này làm primer bắt cặp ở
những vị trí không chuyên biệt trên DNA khuôn tạo ra các sản phẩm không mong
muốn với số lượng lớn.
Ngược lại nếu nồng độ Mg2+ quá thấp (<0,5 mM) thì quá trình kéo dài xảy ra
không hoàn toàn, tạo ra những sản phẩm DNA ngắn hơn bình thường. Đó là do
trong phản ứng PCR, Mg2+đóng vai trò Co-factor của Taq-polymerase nên nếu
lượng Mg2+quá thấp thì Taq-polymerase sẽ không hoạt động bình thường trong giai
đoạn kéo dài (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lan, 1999).
2.2.3.4

dNTPs

Là nguyên liệu cần thiết cho phản ứng tổng hợp DNA. Hỗn hợp dNTPs gồm 4
loại: dATP, dTTP, dGTP, dCTP và thường được sử dụng ở nồng độ 20 – 200μM
cho mỗi nucleotide.
Điều quan trọng là thành phần 4 loại dNTP phải cân bằng, sự mất cân bằng
thành phần các nucleotide làm tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase.
2.2.3.5

Taq-polymerase

Là một DNA polymerase chịu nhiệt, được tách chiết từ một vi khuẩn suối
nước nóng có tên Thermus aquaticus do nhà vi sinh vật học Thomas Brock phát
hiện. Taq-polymerase không bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính của phản ứng PCR và
hoạt động tối ưu ở 68 –72oC.

Nồng độ enzyme Taq-polymerase được sử dụng thông thường là 0,5 – 5 đơn
vị trên 100μl dung dịch phản ứng. Nếu nồng độ Taq quá cao có thể tạo ra những sản
phẩm không chuyên biệt, làm sai lệch kết quả. Nếu nồng đọ Taq quá thấp, phản ứng

12


sẽ không có đủ lượng enzyme cần thiết để tạo ra sản phẩm PCR theo mong muốn.
(Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999)
2.2.3.6

Số chu kỳ trong phản ứng PCR

Số chu kỳ cho 1 phản ứng tùy thuộc vào số lượng bản sao ban đầu của mẫu.
Ví dụ nếu lượng bản mẫu ban đầu là 105 thì cần 25 – 30 chu kỳ, nếu lượng ban mẫu
là 102 – 103 thì số chu kỳ là 35 – 40.
Trong thực tế, không nên thiết lập số chu kỳ quá lớn cho một phản ứng PCR,
vì phản ứng PCR diễn biến qua 2 giai đoạn, ở giai đoạn đầu số lượng bản sao tăng
lên theo cấp số nhân của lượng mẫu, sau đó hiệu quả khuếch đại giảm hẳn vì những
nguyên nhân sau: sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng; Sự xuất
hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng; Các bản sao vừa được tổng hợp không kết
hợp với primer mà bắt cặp với nhau (Phan Cự Nhân, 2001).
2.2.4 Đọc kết quả phản ứng PCR
Sản phẩm của phản ứng PCR sẽ được phát hiện bằng phương pháp điện di.
Nguyên tắc của phương pháp điện di được dựa trên đặc tính cấu trúc DNA. DNA là
các đại phân tử điện tích âm, DNA sẽ di chuyển về điện cực dương của từ trường.
Dưới tác động của điện trường, sự di chuyển của các phân tử trong bản gel phụ
thuộc vào khối lượng phân tử (số nucleotide) và nồng độ các chất cấu thành gel,
điện thế của điện trường. Điện di được thực hiện theo phương nằm ngang hoặc
thẳng đứng. Để nhận biết phân tử DNA di chuyển đến đâu trong bản gel, người ta

có thể sử dụng một dung dịch có màu (loading dye) được nhuộm chung với sản
phẩm PCR khi cho chúng vào những lỗ nhỏ trên gel (gọi là giếng-well). Trong một
số dung dịch đệm vẫn có thể có màu, khi đó không cần dùng đến loading dye.
Trong quá trình điện di, phân tử có màu này sẽ di chuyển nhanh hơn phân tử DNA
và ta có thể nhìn thấy một vạch dài có màu này. Sau khi điện di, bản gel sẽ được
nhuộm với dung dịch ethidium bromide. Ethidium bromide có khả năng gắn xen
giữa các base của nucleic. Chất này sẽ phát huỳnh quang dưới tác dụng của tia UV
(bước sóng λ=300nm) tạo thành vạch đỏ da cam (Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí

13