Xây dựng quy trình PCR để phát hiện virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và dưới vỏ (IHHNV) trên tôm

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, với lòng biết ơn sâu sắc, con xin gởi đến ba mẹ, người đã nuôi con
khôn lớn, là nguồn động viên, là chỗ dựa tinh thần vững chắc, luôn tạo mọi điều kiện
cho con ăn học nên người.
Em xin chân thành cảm ơn cô Phạm Thu Thủy, chị Hồ Thị Thanh Thủy, anh
Nguyễn Trọng Hiếu, anh Nguyễn Văn Hưng và anh Nguyễn Duy Khánh, đã rất tận
tình hướng dẫn em thực hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Viện Công nghệ sinh học & Môi
trường, các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học, trường Đại học Nha Trang đã
dạy dỗ, truyền đạt cho em những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong suốt 4 năm
qua.
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc và tất cả các anh chị trong công ty Cổ
phần Công nghệ Việt Á đã nhiệt tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện để em hoàn
thành tốt đồ án này.
Em cảm ơn chị Ngô Huỳnh Phương Thảo, trưởng phòng CNSH Thủy Sản – Trung
tâm CNSH TP Hồ Chí Minh đã giúp đỡ em rất nhiều trong công tác tìm mẫu làm
thực nghiệm.
Và cuối cùng, gởi lời cảm ơn đến tập thể 48 CNSH, các bạn trường ĐH Khoa học
tự nhiên, Đại học Mở và Đai học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, những người bạn đã
luôn động viên, giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian học tập ở trường và trong
thời gian thực tập vừa qua.

Nha Trang, ngày 20 tháng 6 năm 2010
Sinh viên thực hiện
Võ Thị Lƣu

i
MỤC LỤC

Danh mục các từ viết tắt iii

Danh mục bảng iv
Danh mục hình v
Đặt vấn đề 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình nuôi tôm và dịch bệnh 3
1.1.1. Trên thế giới 3
1.1.2. Ở Việt Nam 5
1.2. Virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và dƣới vỏ (IHHNV) 6
1.2.1. Hình thái cấu trúc 6
1.2.2. Cách thức lan truyền 9
1.2.3. Dấu hiệu tôm bị nhiễm IHHNV 10
1.2.4. Sự nhạy cảm của các loài tôm với IHHNV 11
1.2.5. Mô mục tiêu 12
1.3. Các phƣơng pháp phát hiện IHHNV trên tôm 12
1.3.1. Phương pháp mô bệnh học 12
1.3.2. Phương pháp lai tại chỗ 13
1.3.3. Phương pháp kháng thể đơn dòng 13
1.3.4. Kỹ thuật sinh học phân tử 14
1.3.4.1. Kỹ thuật PCR 14
1.3.4.2. Kỹ thuật Real-time PCR 15
CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu 16
2.1.1. Mẫu thí nghiệm 16
2.1.2. Cặp mồi cho phản ứng PCR 16
2.1.3. Hóa chất 17

ii
2.1.4. Thiết bị chuyên dụng 17
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 18
2.2.1. Thu mẫu 18

2.2.2. Tách chiết DNA 18
2.2.3. Nhân gen bằng kỹ thuật PCR 19
2.2.4. Điện di gel agarose 22
2.2.5. Thiết kế mồi cho phản ứng PCR 23
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tách chiết DNA 26
3.2. Xây dựng quy trình PCR chẩn đoán bệnh IHHNV 26
3.2.1. Thiết kế mồi và kiểm tra các đặc tính của cặp mồi trên lý thuyết 26
3.2.2.1. Thiết kế mồi 26
3.2.2.2. Các thông số của mồi 26
3.2.2.3. Tính đặc hiệu của mồi 30
3.2.2. Khảo sát sự hoạt động của mồi trên thực tế và các điều kiện của phản
ứng PCR 34
3.2.2.1. Sự hoạt động của mồi trên thực tế. 34
3.2.2.2. Nhiệt độ lai 36
3.2.2.3. Độ đặc hiệu của mồi 37
3.2.2.4. Độ nhạy của quy trình 39
3.3. Ứng dụng quy trình để chẩn đoán bệnh IHHNV trên tôm 40
Kết luận và kiến nghị 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO 42
PHỤ LỤC 45




iii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

µl : Microliter
µM : MicroMol

A : Adenosine
BLAST : Basic Local Alignment Search Tool
bp : Base pair
C : Cytidine
dATP : Deoxyadenosine triphosphate
dCTP : Deoxycytidine triphosphate
dGTP : Deoxyguanosine triphosphate
DNA : Deoxyribonucleic acid
dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate
dTTP : Deoxythymidine triphosphate
EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid
G : Guanosine
ha : Hecta
IHHNV : Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus (virus gây
bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và dưới vỏ)
kDa : kilodalton
mM : MilliMol
nm : Nanometer
PCR : Polymerase Chain Reaction
SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate – Polyacrylamide Gel Electrophosis
T : Thymidine
TAE : Tris - Acetic acid - EDTA
TE : Tris - EDTA
T
m
: Melting Temperature (Nhiệt độ nóng chảy)

iv

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Loài tôm nhạy cảm với IHHNV 11
Bảng 2: Các thông số của cặp mồi IHHNV 318F/R 16
Bảng 3: Cách pha mix PCR 21
Bảng 4: Các cặp mồi tham khảo để thiết kế cặp mồi IHHNV 318F/R 27
Bảng 5: Một số đặc tính của cặp mồi IHHNV 318F/R 27











v
DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Bản đồ minh họa sự xuất hiện của virus IHHNV trên thế giới 4
Hình 2: Cấu trúc của IHHNV 6
Hình 3: Cấu trúc bộ gen IHHNV hoàn chỉnh 8
Hình 4: Ảnh minh họa tôm bị nhiễm IHHNV 10
Hình 5: Thể vùi Cowdry Type A được tìm thấy trên tế bào tôm nhiễm IHHNV . 12
Hình 6: Nguyên tắc của phản ứng PCR 14
Hình 7: Cấu trúc kẹp tóc của mồi 28
Hình 8: Một số cấu trúc sefl - dimer của mồi 29
Hình 9: Một số cấu trúc hetero - dimer của mồi 30
Hình 10: Kết quả BLAST trình tự mồi xuôi và mồi ngược trên NCBI 31

Hình 11: Kết quả sắp gióng mồi xuôi và mồi ngược với các trình tự tải về từ
GeneBank bằng phần mềm BioEdit 32
Hình 12: Kết quả kiểm tra mồi xuôi và mồi ngược bằng phần mềm Anhyb 34
Hình 13: Kết quả khảo sát khả năng hoạt động của cặp mồi 35
Hình 14: Kết quả khảo sát nhiệt độ lai của cặp mồi IHHNV 318F/R 36
Hình 15: Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của cặp mồi IHHNV 318F/R 38
Hình 16: Kết quả khảo sát độ nhạy của quy trình 39
Hình 17: Kết quả ứng dụng quy trình trên các mẫu tôm nghi ngờ nhiễm bệnh IHHNV
40


1
ĐẶT VẤN ĐỀ

Nuôi tôm thâm canh hiện đang phát triển nhanh chóng và ngày càng mang lại
nhiều lợi nhuận cho nhiều nước trên thế giới. Mặc dù vậy, rủi ro cho nghề nuôi tôm
cũng không nhỏ, dịch bệnh hiện đang là một trở ngại lớn trong sự phát triển ngành
nuôi tôm công nghiệp ở Việt Nam nói riêng và trên thế giới nói chung.
Trong khi bệnh đốm trắng do WSSV (White Spot Syndrome Virus) gây nguy
hiểm ở tôm sú (Penaeus monodon) thì bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và dưới vỏ do
IHHNV (Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus) gây ra là tác nhân
nguy hiểm nhất ở tôm Penaeus stylirostris (còn gọi là Litopenaeus stylirostris) và tôm
thẻ chân trắng Penaeus vannamei (hay Litppenaueus vannamei). Tuy virus này không
gây chết cho tôm sú (P. monodon) nhưng lại là một trong những tác nhân gây hội
chứng chậm lớn và dị hình (Runt Deformity Syndrome - RDS), đặc biệt nguy hiểm
cho tôm thẻ chân trắng P. vannamei và gây chết hàng loạt ở tôm P. stylirostris. Việc
gia tăng hội chứng RDS trong các trang trại nuôi tôm đã buộc các nhà nghiên cứu
phát triển nguồn tôm P. vannamei sạch bệnh không bị nhiễm IHHNV.
Trên thế giới, sự lây nhiễm IHHNV trên tôm có thể được phát hiện bằng nhiều
phương pháp khác nhau như phương pháp mô bệnh học, phương pháp lai tại chỗ, hay

bằng các phương pháp sinh học phân tử như PCR và Real-time PCR… Tại Việt Nam,
bộ Kit Real-time PCR nhằm phát hiện IHHNV đã được thương mại hóa bởi Trung
tâm Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh. Tuy nhiên, giá thành và các yêu
cầu về trang thiết bị phòng thí nghiệm cũng như kỹ thuật của người làm xét nghiệm
đòi hỏi rất cao, do vậy phương pháp này chưa được áp dụng rộng rãi cho các trung
tâm kiểm dịch dịch bệnh thủy sản ở các tỉnh thành trong cả nước. Vì vậy, việc xây
dựng quy trình PCR phát hiện bệnh IHHNV trên tôm nuôi ở Việt Nam là điều cần
thiết, nhằm phát hiện và xử lý kịp thời bệnh do IHHNV gây ra.
Vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng quy trình PCR để
phát hiện virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và dưới vỏ (IHHNV) trên tôm”.

2
Đề tài này nhằm thực hiện các mục tiêu chính sau đây:
- Xây dựng quy trình PCR chuẩn phát hiện IHHNV trên tôm có độ nhạy
cao, chi hợp lý.
- Khảo sát khả năng ứng dụng quy trình trên các mẫu tôm nghi ngờ
nhiễm bệnh.

3
CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tình hình nuôi tôm và dịch bệnh
1.1.1. Trên thế giới

Nuôi trồng thủy sản là ngành kinh tế quan trọng đóng góp một phần đáng kể
trong thị phần xuất khẩu của một số nước trên thế giới, đặc biệt là các nước Châu Á
như Trung Quốc, Đài Loan, Thái Lan, Ấn Độ, Indonesia và Việt Nam. Trong các đối
tượng thuỷ sản thì tôm là đối tượng nuôi đem lại lợi ích kinh tế nhiều nhất. Theo công
bố của Tổ chức Nông nghiệp và Lương thực thế giới (FAO – Food and Agriculture
Organization), sản lượng tôm thế giới trong 2 thập kỷ qua (1980 - 1998) tăng 175 %.
Theo báo cáo của hội nghị nuôi tôm toàn cầu (2003), sản lượng tôm nuôi trên thế giới
từ năm 1999 như sau: 1,084 triệu tấn (1999), 1,143 triệu tấn (2000), 1,291 triệu tấn
(2001), 1,445 triệu tấn (2002), và 1,84 triệu tấn (2003). Mức tăng bình quân khoảng
10,5 % mỗi năm
[1]

. Năm 2000, xuất khẩu tôm thế giới đạt hơn 10,9 tỷ USD. Với hiệu
quả kinh tế và xã hội to lớn, nghề nuôi tôm thực sự trở thành nghề sản xuất thu hút
các nhà đầu tư.
Sự phát triển mạnh mẽ, có thể nói là bùng nổ nghề nuôi tôm trên thế giới ngoài
những mặt lợi còn có mặt trái của nó. Trong suốt 2 thập kỷ qua, nghề nuôi tôm trên
thế giới đã có rất nhiều thay đổi và trải qua nhiều khó khăn. Dịch bệnh đã liên tiếp
xuất hiện ở nhiều khu vực nuôi tôm, đặc biệt là các nước châu Á, trong đó bệnh do
virus ảnh hưởng nghiêm trọng đến nền công nghiệp nuôi tôm. Ước tính tổng thiệt hại
do virus gây ra trung bình hàng năm cho thế giới khoảng hơn 1 tỷ USD
[2, 3]
.
Bệnh hoại tử máu và vỏ do IHHNV (Infectious hypodermal and hematopoietic
necrosis virus) là một trong những bệnh virus gây nguy hiểm cho ngành nuôi tôm.
Virus này khi thâm nhập vào tôm sẽ gây hoại tử máu và nhiễm trùng dưới vỏ. Nuôi
tôm ở giai đoạn postlarvae và juvenile với mật độ cao rất dễ nhiễm virus này. Tôm
nhiễm virus có biểu hiện ít ăn, lừ đừ, nổi trên mặt nước, xoay tròn và chết. Tỷ lệ tôm

4
chết khi nhiễm bệnh khá cao: tôm P. vannamei 10-50%, tôm tự nhiên (Ecuado) 63%,
tôm nuôi (Panama) 95%
[9, 10]
.
IHHNV được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1981 ở Hawaii khi gây chết hàng
loạt tôm P. stylirostris
[10, 16, 17]
. Sau đó virus lan rộng đi khắp nơi như Tahiti, Florida,
Texas, Islands, Israel, Panama, Costa Rica, Belize, Ecuador, Brazil, Honduras, France
và Jamaica
[23]
và gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến ngành nuôi trồng thủy sản ở các

nước trên.
Theo các báo cáo khoa học của Tổ chức Thú y Thế giới (OIE – Office
International des Epizooties), IHHNV xuất hiện khắp nơi trên thế giới hoặc trong môi
trường hoang dã hoặc trong tôm Penaeid nuôi. Ở Tây bán cầu, IHHNV thường được
tìm thấy ở tôm Penaeid hoang dã ở Đông Thái Bình Dương từ Peru đến Mexico (Hình
1).

Hình1: Bản đồ minh họa sự xuất hiện của virus IHHNV trên thế giới
Những năm gần đây, bệnh do IHHNV xuất hiện ở các nước Trung Mỹ như:
Belize, Brazil, Colombia, Costa Rica, Ecuador, E1 Salvador, Honduras, Mexico, New

5
Caledonia, Panama, Peru, Mỹ và Venezuela, châu Phi có Madagascar và Tanzania,
các quốc gia châu Á có Ấn Độ, Indonesia, Malaysia, Philippines, Singapore, Đài
Loan, Trung Quốc, Thái Lan và Việt Nam.
1.1.2. Ở Việt Nam

Hoạt động nuôi tôm biển ngày càng đóng vai trò quan trọng ở nước ta. Tôm
nước lợ là đối tượng nuôi chủ lực ở các tỉnh ven biển kéo dài từ Quảng Ninh, Hải
Phòng đến tận Kiên Giang, Cà Mau. Trong đó, Cà Mau và Bạc Liêu là hai tỉnh có
diện tích nuôi tôm lớn nhất cả nước.
Trên cả nước, diện tích nuôi tôm nước lợ đạt 546.757 ha (2003), trong đó diện
tích nuôi thâm canh là trên 15.534 ha (chiếm khoảng 2,84 % tổng diện tích nuôi tôm),
nuôi bán thâm canh trên 20.116 ha (chiếm 3,67 %), còn lại là nuôi quảng canh cải tiến
và quảng canh. Các tỉnh duyên hải Nam Bộ có tổng diện tích nuôi lớn nhất, chiếm
87,17 % của cả nước với 476.528 ha. Năm 2003 sản lượng nuôi tôm nước lợ đạt hơn
200.000 tấn
[1]
.
Tuy nhiên, kỹ thuật nuôi của người dân chưa cao, độ rủi ro về dịch bệnh còn

cao. Hiện tượng tôm nuôi thường bị dịch bệnh chết trên diện rộng từ năm 1993 đến
nay đã gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng cho người nuôi tôm. Năm 2003, diện tích
nuôi tôm bị nhiễm bệnh là 32.423 ha, chiếm 3,2 % gây nhiều thiệt hại cho người nuôi
tôm
[3]
.
Theo thống kê của Bộ Thuỷ Sản (1995), từ năm 1993 - 1995 dịch bệnh tôm
trên toàn quốc đã làm thiệt hại hàng trăm tỷ đồng. Riêng năm 1994, tổng diện tích
nuôi tôm có dịch bệnh là 84.558 ha với sản lượng thiệt hại ước tính là 5.225 tấn, trị
giá khoảng 294 tỷ đồng. Đến nay dịch bệnh vẫn tồn tại và lây lan ngày càng rộng gây
tổn thất nghiêm trọng. Đồng Bằng Sông Cửu Long là khu vực bị thiệt hại lớn nhất do
nơi đây tập trung khoảng 87 % diện tích nuôi tôm của cả nước
[1, 3]
.
Theo khảo sát của các nhà khoa học, bên cạnh WSSV, MBV và YHV, IHHNV
là một trong những virus gây bệnh phổ biến có mặt tại nhiều vùng nuôi tôm trọng
điểm của cả nước
[4, 5]
.

6
1.2. Virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và dƣới vỏ (IHHNV)
1.2.1. Hình thái và cấu trúc

IHHNV là một trong những virus gây bệnh ở tôm Penaeid có kích thước nhỏ
nhất. Virus này có hình khối 20 mặt (Hình 2), đường kính khoảng 20 - 22 nm, không
có màng bao icosahedron, mật độ trong CsCl là 1,40 g/ml, vật liệu di truyền là DNA
sợi đơn với kích thước bộ gen ước lượng khoảng 4,1 kb
[4, 11, 17, 18]
.

Hình 2: Cấu trúc của IHHNV
Bộ gen của IHHNV là phân tử DNA sợi đơn có trình tự đọc xuôi ngược đều như
nhau và có dạng kẹp tóc hình chữ Y ở cả 2 đầu kết thúc
Phân loại: (
Tên khoa học: Infectious hypodermal and hematopoietic necrosic virus
Tên thông thường: IHHNV

7
Tên khác: Infectious hypodermal and haematopoiectic virus
Cấp độ: Loài
Nòi: Viruses
Nhóm: ssDNA viruses (Single stranded DNA - DNA sợi đơn)
Họ: Parvoviridae
Phân họ: Densovirinae
Chi: Brevidensovirus
Vật chủ: Penaeidae (tôm Penaeid).
Trình tự bộ gen IHHNV đã được giải mã gần như hoàn toàn, bao gồm 3 khung
đọc mở ORF - Open Reading Frame (ORF1, ORF2 và ORF3) (Genbank AF218266)
[4,
6, 9, 16, 17, 18]
(Hình 3). Thành phần base của sợi DNA trên genome IHHNV là 20,68%
A, 19,00% C, 24,04% G và 36,28% T. Vì vậy, %A+T là 56,96% và %G+C là
43,04%
[9]
.
Trong số các ORF này, ORF1 chiếm khoảng 50% bộ gen, gồm 2001
nucleotide (nucleotide thứ 816-2816) và mã hóa cho một polypeptide gồm 666 amino
acid
[9, 14, 16]

. Polypeptide này là protein không cấu trúc 1 (NS1) với nhiều chức năng
khác nhau như: đóng vai trò quan trọng trong việc tái tạo DNA virus, tham gia vào
quá trình đóng gói DNA virus trong các tế bào của động vật có xương sống, tăng
cường biểu hiện gen mã hóa vỏ capside
[9]
…
ORF2 bắt đầu từ nucleotide thứ 56, tính theo chiều ngược và có đoạn chồng
lấp với ORF1. ORF này gồm 1092 nucleotide, tương đương với nucleotide từ vị trí
760-1851, mã hóa cho protein chưa biết rõ chức năng. Tuy nhiên, Shinke (2000) đã
nghiên cứu và dự đoán rằng ORF2 có thể mã hóa cho protein không cấu trúc 2 (NS2)
chưa biết chức năng cụ thể, gồm 434 amino acid
[9]
.
ORF3 gồm 990 nucleotide, bắt đầu từ nucleotide thứ 2758-3747. Đầu 5’ của
ORF3 cũng chồng lấp với ORF1 và mã hóa cho 1 polypeptide gồm 329 amino acid
[9,
17]
, là protein vỏ capsid của virus (VP). Dựa trên cấu trúc và tổ chức gen của các
Parvovirus khác, người ta thấy rằng ORF3 mã hóa cho các protein cấu trúc
[9, 14, 16]
.

8

Hình 3: Cấu trúc bộ gen IHHNV hoàn chỉnh
Bộ gen của IHHNV (GenBank, AF218266) bao gồm 4075 bp, với 3 khung đọc
mở. Trong đó, ORF1 mã hóa cho protein không cấu trúc ( từ nucleotide 816-2816),
ORF2 mã hóa cho protein chưa biết chức năng (từ nucleotide thứ 760-1851) và
ORF3 mã hóa cho protein cấu trúc (từ nucleotide 2758-3747)
Sử dụng phương pháp điện di protein (SDS-PAGE) để phân tích cấu trúc

protein của virus này, người ta tìm thấy 4 loại protein có trọng lượng 74, 47, 39 và
37,5 kDa trong các virion tinh sạch
[9, 11, 14]
. Theo trình tự amino acid từng phần,
protein cấu trúc có khối lượng phân tử 47 kDa được xác định là do gen nằm trên
ORF3 mã hóa
[14]
.
Có 2 genotype IHHNV khác nhau đã được xác định và chứng minh là xâm
nhiễm vào tôm thẻ chân trắng (P. vannamei) và tôm sú (P. monodon) là IHHNV type
1 và type 2
[4, 6, 15]
.
Ngoài ra, hai biến thể địa lý khác (geographic variants) của IHHNV cũng được
tìm thấy. Type A được tìm thấy ở Madagascar và Australia trong khi type B được tìm
thấy ở Tanzania
[4, 6, 18, 22]
. Cả Type A và B đều có chứa 3 ORF nhưng đã được chứng
minh là không gây nhiễm vào các loài thuộc họ Penaeid
[18, 22]
.

9
Các kết quả nghiên cứu cho thấy rằng IHHNV phân lập từ Philippine có độ
tương đồng cao nhất với IHHNV ở Hawaii, chỉ sai khác 0,2% trình tự các nucleotide.
IHHNV phân lập từ Thái Lan lại thể hiện sự sai khác cao hơn so với IHHNV ở
Hawaii, chỉ tương đồng 96,2%. IHHNV phân lập từ Đài Loan rất giống với IHHNV ở
Thái Lan, tương đồng tới 99,7%, chỉ khác nhau 9 nucleotide. Dịch chiết DNA từ
P.monodon ở vùng Tanzania, Madagascar và Mauritius có chứa trình tự tương đồng
với IHHNV. Trong số đó, trình tự tương đồng ở Tanzania giống tới 91,8% so với

IHHNV ở Hawaii. Trình tự ở Madagascar thể hiện sự tương đồng thấp hơn, 85,9% so
với IHHNV ở Hawaii. Trình tự ở Mauritius chỉ khác trình tự ở Madagascar 1
nucleotide
[6, 14, 16]
.
1.2.2. Cách thức lan truyền
IHHNV lan truyền theo chiều ngang hoặc chiều dọc. Sự lan truyền theo chiều
ngang là do tập tính ăn thịt lẫn nhau hoặc do nguồn nước bị nhiễm, lan truyền theo
chiều dọc do trứng bị nhiễm mầm bệnh
[4]
.
Sau khi xâm nhập vào tế bào vật chủ, virus cởi áo trong không bào của tế bào
chất và DNA được vận chuyển đến nhân, nơi nó được phiên mã thành RNA thông tin.
Giống nhiều virus DNA khác, chu trình nhân lên của IHHNV có thể chia thành hai
giai đoạn: giai đoạn khởi đầu sao chép DNA virus và giai đoạn sau, tổng hợp các
protein chức năng của virus. Các gen tham gia vào giai đoạn đầu và giai đoạn sau tập
trung ở hai vùng khác nhau trên bộ gen của virus. Sự biểu hiện của chúng được điều
hòa bởi hai promoter phiên mã độc lập
[9]
.


1.2.3. Dấu hiệu tôm bị nhiễm IHHNV
Các dấu hiệu tôm bệnh phát triển chậm và biến dạng vỏ do IHHNV thường
xuất hiện ở giai đoạn hậu ấu trùng ở 35 ngày tuổi. Trước giai đoạn này tôm có thể
mang mầm bệnh nhưng không có biểu hiện ra bên ngoài
[8, 21]
.

10

Một số biểu hiện bệnh có thể gặp bao gồm: giảm ăn, đôi khi tôm bơi chậm trên
mặt nước rồi xoay tròn và chìm xuống đáy. Tôm non giảm tăng trưởng và phát triển
bất thường. Tôm giai đoạn tiền trưởng thành có hiện tượng biến dạng chủy
[4, 9]
. Ở tôm
sú có hiện tượng tôm ngả màu xanh, dấu hiệu biến dạng chủy ở tôm sú xảy ra chậm so
với tôm thẻ chân trắng, quan sát được ở những tôm có kích thước lớn, xuất hiện đốm
trắng hoặc vàng trên vỏ kitin, đặc biệt là ở các phiến vỏ nối giữa lưng và bụng, tôm
sắp chết thường có màu xanh nhợt và phần bụng có màu trắng đục, chủy bị biến dạng
và phát triển lệch về một bên
[4, 9]
(Hình 4).

Hình 4: Ảnh minh họa tôm bị nhiễm IHHNV
Mũi tên chỉ các vị trí xuất hiện đốm trắng hoặc vàng trên tôm P. stylirostris nhiễm bệnh
Ngoài ra, IHHNV còn gây ra các triệu chứng cận lâm sàng như giảm tốc độ
phát triển và làm giảm hiệu suất nuôi trên tôm sú, có thể giảm 10-50% so với mùa vụ
tôm không nhiễm bệnh IHHNV
[8]
.

1.2.4. Sự nhạy cảm của các loài tôm với IHHNV

Hầu hết các loài thuộc họ Penaeid có thể bị IHHNV xâm nhiễm, bao gồm cả
những loài P. monodon, P.vannamei và P. stylirostris là những loài được nuôi nhiều.
Trong đó P. stylirostris là loài bị ảnh hưởng nhiều nhất (Bảng 1). Tôm P. stylirostris

11
có tỉ lệ chết rất cao khi bị nhiễm IHHNV, trong khi đó ở một số loài khác như P.
vannamei hay P. monodon, IHHNV chỉ làm chậm khả năng tăng trưởng của tôm và

làm lớp vỏ ngoài bị dị dạng
[4, 9, 14, 18]
. Những nghiên cứu cho thấy rằng IHHNV có mối
liên hệ mật thiết với bệnh đục cơ tôm và có ảnh hưởng đến tỉ lệ sống.
Bảng 1: Loài tôm nhạy cảm với IHHNV
Tên loài
Xuất hiện bệnh
Farantopanaeus aztecus
Farantopanaeus californiensis
Penaeus duorarum
Penaeus japonicus
Penaeus monodon
Penaeus semisulcatus
Litopenaeus setiferus
Penaeus stylirostris
Penaeus vannamei
Chứng minh bằng thực nghiệm
Xuất hiện bệnh trong tự nhiên
Chứng minh bằng thực nghiệm
Xuất hiện bệnh trong tự nhiên
Xuất hiện bệnh trong tự nhiên
Xuất hiện bệnh trong tự nhiên
Chứng minh bằng thực nghiệm
Xuất hiện bệnh trong tự nhiên
Xuất hiện bệnh trong tự nhiên

Bệnh do IHHNV thường xảy ra nghiêm trọng cho hầu hết tôm ở vùng Thái
Bình Dương, virus có thể gây dịch cấp và có thể gây chết trên 90% tôm P. stylirostris
trong vòng 20 ngày. Đối với P. stylirostris, ở giai đoạn tôm non và giai đoạn gần
trưởng thành bị ảnh hưởng nghiêm trọng

[9, 10, 20]
. Tuy nhiên, đối với P. vannamei,
IHHNV thường gây hội chứng còi cọc, dị dạng (RDS), dẫn tới tôm bị giảm trọng
lượng, phát triển không đều và làm dị dạng biểu bì, là những tác động chính hơn là
gây chết
[4, 19, 20, 21]
. Ở hầu hết các giai đoạn vòng đời của tôm như: trứng, ấu trùng, hậu
ấu trùng, tôm non và tôm trưởng thành của tôm thẻ chân trắng, P. vannamei đều nhạy
cảm với virus này. Trứng được sinh ra từ tôm mẹ bị nhiễm IHHNV với hàm lượng
cao sẽ không nở được. Naupli được sinh ra từ bố mẹ bị nhiễm IHHNV sẽ bị nhiễm
bệnh
[13]
.
1.2.5. Mô mục tiêu


12
IHHNV xâm nhiễm và sao chép trong các mô có nguồn gốc ngoại bì và trung
phôi bì. Tuy nhiên, mô mục tiêu chủ yếu bao gồm: mang, biểu bì (hay còn gọi là dưới
vỏ), mô liên kết, cơ quan tạo máu, cơ quan bạch huyết, tuyến râu, tuyến sinh dục và
dây thần kinh bụng bao gồm nhánh và trung tâm thần kinh bụng
[9, 10, 22]
.
1.3. Các phƣơng pháp phát hiện IHHNV trên tôm
1.3.1. Phƣơng pháp mô bệnh học
Phân tích mô học cho thấy tế bào nhiễm IHHNV xuất hiện các thể nhân phồng
lên, thể Cowdry type A (Hình 5). Khi nhuộm lát cắt với hematoxylin và eosin,
IHHNV thường được thấy trên các tế bào có nguồn gốc ngoại bì và trung bì, ít khi gặp
trên các tế bào có nguồn gốc nội bì. IHHNV cũng được tìm thấy trên màng nhầy của
các tế bào biểu mô, dạ dày, manh tràng và tế bào gan tụy

[8, 9, 10, 12, 13, 10, 21]
.

Hình 5: Thể vùi Cowdry Type A đƣợc tìm thấy trên tế bào tôm nhiễm IHHNV
Mũi tên hướng lên chỉ nhân của tế bào tôm bị nhiễm IHHNV, mũi tên hướng xuống chỉ
nhân của tế bào tôm bình thường
Nghiên cứu mô học thường được sử dụng để phát hiện những tổn thương ở vỏ,
mang, tế bào biểu bì, mô máu, dây thần kinh… Đây là phương pháp phổ biến nhất

13
trong chẩn đoán bệnh thủy sản
[10, 20]
nhưng thường chỉ cho kết quả chính xác khi tôm
nhiễm bệnh nặng.
1.3.2. Phƣơng pháp lai tại chỗ
Lai tại chỗ (in situ hybidrization) là một kiểu lai phân tử trong đó trình tự
nucleic acid cần tìm (trình tự đích) nằm ngay trong tế bào hoặc trong mô. Lai tại chỗ
cho phép nghiên cứu nucleic acid mà không cần qua giai đoạn tách chiết chúng ra
khỏi mô, tế bào.
Phương pháp lai tại chỗ cũng được phát triển để chẩn đoán bệnh IHHNV
[8]
.
Mặc dù phương pháp này nhạy và mang tính đặc hiệu cao nhưng tốn nhiều thời gian
để hoàn thành (2-3 ngày).
1.3.3. Phƣơng pháp kháng thể đơn dòng
Kháng thể đơn dòng được ứng dụng thành công trong y học từ lâu, đặc biệt gần
đây nó được sử dụng để chẩn đoán bệnh YHV, WSSV và IHHNV trên tôm
[9]
.
Trước tiên, kháng nguyên GP3 protein của IHHNV được trộn với tá dược rồi

tiêm vào chuột cái dòng BAL/C để sản xuất kháng thể. Dòng tế bào P3X myeloma
được sử dụng trong quá trình sản xuất kháng thể đơn dòng. Đầu của tôm nhiễm
IHHNV được ngâm trong dung dịch Davidson trước khi cố định trong paraffin. Mẫu
được cắt thành từng lát mỏng, cho phản ứng miễn dịch với kháng thể IHHNV và
GAM-HRP, sau đó ủ với DAB và hydrogen peroxide trong PBS, nhuộm màu với
eosinY, loại bỏ nước với ethanol, rửa trong xylene và cuối cùng dán mẫu bằng
permount. Phản ứng dương tính sẽ biểu hiện với những vệt có màu nâu vàng khi quan
sát dưới kính hiển vi có vật kính 40X hay 100X.
Tuy nhiên, phương pháp này phải thông qua một số phương pháp như dot blot,
lai Western hoặc hóa mô miễn dịch để kiểm tra kết quả, do vậy, tiêu tốn nhiều thời
gian (khoảng 10 ngày).

1.3.4. Kỹ thuật sinh học phân tử

14
1.3.4.1. Kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) – phản ứng tổng hợp dây chuyền
nhờ polymerase do Karry Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Đây là một phương
pháp tạo dòng in vitro không cần sự hiện diện của tế bào, cho phép khuếch đại đặc
trưng một đoạn DNA nằm giữa hai trình tự oligonucleotide đã biết trước. Hai trình tự
oligonucleotide này được gọi là mồi xuôi (forward primer) và mồi ngược (reverse
primer). Nguyên tắc của phản ứng PCR được minh họa trong hình 6:

Hình 6: Nguyên tắc của phản ứng PCR
Trên thế giới, kỹ thuật PCR đã được ứng dụng rộng rãi để phát hiện nhiều bệnh
do vi khuẩn và virus gây ra trên tôm trong đó có bệnh do IHHNV gây ra
[17, 22]
. Kỹ
thuật này được xem là một trong những phương pháp hiện đại, nhanh chóng và cho
kết quả chính xác trong chẩn đoán IHHNV.

15
1.3.4.2. Kỹ thuật Real-time PCR
Realtime PCR là phản ứng PCR mà quá trình nhân bản DNA diễn ra theo từng
chu kỳ và được theo dõi trực tiếp. Hệ thống Realtime PCR gồm máy luân nhiệt (PCR)
được nối với máy quang phổ huỳnh quang và máy vi tính. Realtime PCR gồm hai quá
trình diễn ra đồng thời đó là nhân bản DNA bằng phản ứng PCR và đo độ phát huỳnh
quang tỷ lệ thuận với số lượng đoạn DNA tạo thành. Để có được tín hiệu Real-time
phản ứng đang diễn ra, người ta sử dụng chất phát huỳnh quang (fluorophores), hoặc
các mẫu dò đánh dấu (labeled probes) như: Beacon, TaqMan,… có gắn chất phát
huỳnh quang (FAM, TAMRA, …). Các phẩm nhuộm như SYBR Green, Hoechst khi
chèn vào sợi đôi DNA sẽ phát huỳnh quang. Mix PCR có chứa phẩm nhuộm phát
huỳnh quang, khi gắn vào mạch đôi DNA sẽ thể hiện cường độ màu tương ứng với
nồng độ ban đầu của DNA bản mẫu.
Đối với tôm, kỹ thuật Real-time PCR đã được sử dụng để phát hiện các bệnh
do virus gây ra như bệnh đỏ đuôi (Taura), bệnh hoại tử (IHHNV)…
[2]
. Kỹ thuật Real-
time PCR phát hiện và định lượng IHHNV cho kết quả nhanh và có độ nhạy cao
[4]
. Để
tăng cường kiểm soát khả năng tạp nhiễm, người ta sử dụng thêm mẫu chứng là DNA
được tách chiết từ tôm, chứa những trình tự đã biết trước, chẳng hạn như gene β-actin,
để khuếch đại song song với DNA của virus. Cài đặt chu kỳ nhiệt cho phản ứng, xây
dựng đường chuẩn và dựa vào giá trị chu kỳ ngưỡng (C
T
) để kết luận mẫu có nhiễm
IHHNV hay không.
So với phương pháp PCR truyền thống thì phương pháp này đòi hỏi phòng thí
nghiệm được đầu tư trang thiết bị hiện đại hơn, cán bộ phụ trách xét nghiệm phải

được đào tạo bài bản hơn và chi phí cho mỗi phản ứng Real-time PCR là cao hơn rất
nhiều nên khó có thể ứng dụng rộng rãi cho tất cả các hộ nuôi tôm.






16


CHƢƠNG 2

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên vật liệu
2.1.1. Mẫu thí nghiệm
Mẫu chứng dương là dịch chiết DNA của IHHNV và mẫu tôm postlarvae đã
được xác định mang bệnh IHHNV được cung cấp bởi Phòng chẩn đoán bệnh thủy
sản, Trung tâm Công nghệ sinh học, TP. Hồ Chí Minh.
Mẫu tôm nghi ngờ nhiễm bệnh IHHNV dùng để khảo sát quy trình được cung
cấp bởi các trại nuôi tôm ở Cam Ranh – Khánh Hòa.
2.1.2. Cặp mồi cho phản ứng PCR
Cặp mồi IHHNV318F/R được thiết kế dựa trên tham khảo cặp mồi
IHHNV309F/R và được đặt tổng hợp bởi công ty Intergrated DNA Technologies
(IDT – Hoa Kỳ) (Bảng 2).
Bảng 2: Các thông số của cặp mồi IHHNV318F/R
Tên mồi
Trình tự
Độ

dài
(bp)
Độ dài
sản
phẩm
khuếch
đại
(bp)
Nhiệt
độ biến
tính
(T
m,
0
C)
IHHNV
318F
5’-TATGACTACCTCCAACACTTAGTCA-3’

25

318
54.8
IHHNV
318R
5’-GTCTGCTACGATGATTATCCAAGC -3’

24
55.5

17
2.1.3. Hóa chất
a) Hóa chất tách chiết DNA
Dung dịch Trizol (Phenol pH4 38%, Guanidium thyocianate 0,8 M,
Glycerol 5%, Sodium acetate 0,1 M, pH 8,0)
Chloroform
Isopropanol tuyệt đối có chứa chất trợ tủa
Ethanol 70%
Đệm TE 1X (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM)
b) Hóa chất PCR
Enzyme Taq DNA polymerase
Deoxynucleotide triphosphate: dATP, dTTP, dGTP, dCTP
MgCl
2

Dung dịch đệm 10X tương ứng
Nước cất hai lần
c) Hóa chất điện di
Agarose
Ethidium bromide
Dung dịch điện di TAE 50X (Tris- HCl, EDTA 0,5 M pH8, acetic acid)
Dung dịch nạp mẫu 6X (glycerol 40%, bromophenol blue 0,25%)
Thang DNA chuẩn 100 bp
2.1.4. Thiết bị chuyên dụng
 Tủ sấy, nồi hấp khử trùng (Hirayama, Nhật)
 Tủ đông - 20
0
C và tủ lạnh - 4
0

C (Sanyo, Nhật)
 Tủ vô trùng để tách chiết và đặt phản ứng PCR (Việt Á, Việt Nam)
 Máy ly tâm (Eppendorf, Đức)
 Máy vortex (IKA, Hàn Quốc)
 Máy PCR (Stratagene, New Zealand)
 Bồn ủ nhiệt khô (Việt Á, Việt Nam)

18
 Bộ điện di (UVP, USA)
 Bàn đèn tử ngoại (UVP, USA)
 Máy chụp hình kỹ thuật số (Canon, Nhật)
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1 Thu mẫu
- Mẫu thu từ các trung tâm nghiên cứu, xét nghiệm bảo quản nguyên con hoặc
từng bộ phận (ví dụ đầu tôm bị nhiễm virus) trong ethanol 95%.
- Đối với các mẫu thu nhận từ trại tôm còn tươi sống, có thể bảo quản trong đá
lạnh để vận chuyển về phòng thí nghiệm rồi tiến hành các thao tác lưu mẫu
trong dung dịch bảo quản mẫu như trên hoặc bảo quản mẫu ở nhiệt độ - 80
0
C
đến - 20
0
C trong tủ đông.
2.2.2. Phƣơng pháp tách chiết DNA
2.2.2.1. Nguyên tắc
DNA từ các mẫu tôm được tách chiết bằng phương pháp kết tủa (Chomozynski
và Sacchi, 1987). Nguyên tắc cơ bản của phương pháp này là dùng các tác nhân biến
tính mạnh để phá vỡ màng tế bào và loại bỏ các thành phần không mong muốn
(protein, màng tế bào…). DNA sẽ được tủa bởi isopropanol ở điều kiện lạnh và thu
hồi qua các lần ly tâm. Cặn DNA được hòa tan trong đệm TE 1X và bảo quản ở -

20
0
C.
2.2.2.2. Các bƣớc tiến hành
- Đánh dấu các eppendorf vô trùng bằng ký hiệu mẫu.
- Cho vào mỗi eppendorf 200 µl dung dịch TE 1X.
- Đối với mẫu bảo quản trong cồn trên 95
0
, phải làm khô hết ethanol (cả trên
bề mặt lẫn trong mô cơ của tôm) trước khi cho vào dung dịch TE 1X để
nghiền.
- Đối với mẫu bảo quản trong tủ đông phải để rã đông trước khi tiến hành
nghiền mẫu.

19
- Lót lớp giấy thấm bên dưới, đặt mẫu tôm lên trên, dùng chày để cố định và
panh kẹp để gắp những bộ phận là cơ quan đích, nơi khu trú của IHHNV
(đối với mẫu tôm postlarvae thì gắp khoảng 15-20 con), cho vào eppendorf
có sẵn 200 µl TE 1X rồi nghiền nhuyễn mẫu. (Lưu ý: mỗi mẫu dùng 1 chày
khác nhau để nghiền, trong suốt quá trình xử lý mẫu luôn có 1 đèn cồn và 1
cốc cồn 96
0
để khử trùng panh kẹp, tránh trường hợp lây nhiễm từ mẫu này
sang mẫu khác).
- Bổ sung thêm 300 µl dung dịch TE 1X vào, vortex để trộn đều dịch.
- Lấy 200 µl dịch chiết trên cho vào eppendorf 1,5 ml có 900 µl dung dịch
Trizol, vortex 30s để trộn đều hỗn hợp và tan lớp tủa tạo thành ở phía trên,
sau đó để yên hỗn hợp trong 10 phút.
- Cho thêm vào 200 µl dung dịch chloroform, trộn đều, đem ly tâm 13000
vòng/phút trong 10 phút.

- Thu 600 µl dịch nổi có chứa DNA vào eppendorf sạch khác có sẵn 600 µl
dung dịch isopropanol đã bổ sung chất trợ tủa, trộn đều, để yên 10 phút
trong tủ lạnh, sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
- Loại bỏ dịch nổi, thu cặn màu xanh (hoặc hồng), cho từ từ 900 µl dung dịch
ethanol 70% vào, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút.
- Loại bỏ dịch nổi, thu cặn và làm khô ở 60
0
C trong 10-15 phút.
- Hòa tan trong 50 µl dung dịch TE 1X.
2.2.3. Nhân gen bằng kỹ thuật PCR
2.2.3.1. Nguyên tắc
Phản ứng PCR bao gồm một chuỗi những chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ
thường gồm 3 giai đoạn:
Giai đoạn biến tính (denaturation): Trong một dung dịch phản ứng bao
gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ
cao hơn nhiệt độ nóng chảy (T
m
) của phân tử, thường là 94 - 95
0
C trong vòng 30 giây