NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ MẪU PHÂN LẬP NẤM Corynespora cassiicola (Berk. Curt.) Wei TRÊN CÂY CAO SU BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG ITS – rDNA VÀ CHỈ THỊ PHÂN TỬ ISSR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ MẪU PHÂN LẬP
NẤM Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei TRÊN CÂY CAO SU
BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG ITS – rDNA
VÀ CHỈ THỊ PHÂN TỬ ISSR

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: DƯƠNG NGỌC KIỀU THI

Niên khóa

: 2006 – 2010

Tháng 07/2010
 
 


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ MẪU PHÂN LẬP NẤM
Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei TRÊN CÂY CAO SU
BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG ITS - rDNA
VÀ CHỈ THỊ PHÂN TỬ ISSR

Hướng dẫn khoa học:

Sinh viên thực hiện:

TS. NGUYỄN ANH NGHĨA

DƯƠNG NGỌC KIỀU THI

KS. NGUYỄN VĂN LẪM

Tháng 07/2010
 
 


LỜI CẢM ƠN
 

Xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu, quý thầy cô Trường Đại học Nông
Lâm Thành phố Hồ Chí Minh và Bộ môn Công nghệ Sinh học đã tận tình dạy dỗ, tạo
điều kiện tối đa cho tôi cũng như các bạn sinh viên khác hoàn thành chương trình học
ở trường.
Xin chân thành cám ơn Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam, Bộ môn Bảo vệ
Thực vật, Bộ môn Giống đã nhiệt tình giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Xin chân thành cám ơn Tiến sĩ Nguyễn Anh Nghĩa, Kỹ sư Nguyễn Văn Lẫm,

các cô chú, anh chị trong Bộ môn Bảo vệ Thực vật và Bộ môn giống đã luôn tận tình
chỉ bảo tôi và giúp đỡ tôi để tôi có thể hoàn thành được khóa luận này.
Cám ơn các bạn của tôi ở Trường Đại Học Nông Lâm đã luôn bên tôi, san sẻ
niềm vui nỗi buồn với tôi, động viên tôi trong suốt thời gian qua.
Cuối cùng, con xin chân thành cám ơn ba mẹ đã sinh ra con, nuôi nấng con, yêu
thương con, dạy dỗ con thành người. Nếu không có ba mẹ, con tuyệt đối sẽ không
trưởng thành như ngày hôm nay.
Người thực hiện
DƯƠNG NGỌC KIỀU THI

i

 


TÓM TẮT
Bệnh rụng lá Corynespora, gây nên bởi nấm Corynespora cassiicola, là một
trong những bệnh quan trọng trên cây cao su (Hevea brasiliensis). Triệu chứng bệnh
đa dạng và biến thiên nên rất dễ nhầm lẫn với các bệnh lá khác. Bệnh gây rụng lá Corynespora trên cây cao su sẽ dẫn đến thiệt hại nặng nề cho ngành cao su. Kiểm soát
bệnh bằng thuốc hóa học ảnh hưởng đến môi trường. Kiểm soát bệnh bằng biện pháp
di truyền đang được hi vọng sẽ đem lại kết quả tốt hơn.
Do đó, 34 mẫu phân lập nấm C. cassiicola từ các vùng khác nhau trên các dòng
vô tính cao su khác nhau được tách đơn bào tử, nhân sinh khối và ly trích DNA, thực
hiện phản ứng PCR – ITS với cặp mồi ITS1 và ITS4, giải trình tự, so sánh kết quả giải
trình tự để tìm sự khác biệt. Thực hiện phản ứng PCR – ISSR với 5 mồi UBC826,
UBC835, Mj3, Mj4, Mj5, so sánh sự khác biệt của các băng DNA trên gel điện di để
phân tích đa dạng di truyền.
Đề tài phân tích đa dạng di truyền sử dụng chỉ thị phân tử ISSR và giải trình tự
vùng rDNA – ITS đã phân tách 34 mẫu phân lập nấm C. cassiicola thành hai nhóm
chính. Nhóm 1 gồm 21 mẫu phân lập thu thập từ các vùng Lai Khê, Đồng Nai, Quảng

Nam, nhóm 2 gồm 13 mẫu phân lập còn lại thu thập từ các vùng Lai Khê, Đồng Nai,
Quảng Nam, Bình Phước và Tây Nguyên. Đã phát hiện được SNPs trong vùng rDNA
– ITS trong các mẫu phân lập được nghiên cứu. Kết quả tìm kiếm BLAST cho thấy
trình tự nucleotide vùng rDNA – ITS của nấm C. cassiicola có tính bảo tồn cao. Nhìn
chung, chỉ thị phân tử ISSR là một kỹ thuật hữu hiệu để phân biệt các nhóm di truyền
nấm trong khi chỉ thị phân tử trình tự rDNA – ITS không những có thể định danh mà
còn có thể suy ra các nhóm di truyền nấm này. Nghiên cứu này khẳng định có ít nhất
hai nhóm di truyền nấm C. cassiicola xâm nhiễm vào cây cao su trồng ở Việt Nam.
Khả năng lây nhiễm trên các dòng vô tính cao su của các mẫu phân lập thuộc hai nhóm
di truyền này cần được xem xét nhằm xác định rằng có phải chúng thuộc về hai nòi
sinh lý khác nhau hay không.

ii

 


SUMMARY
“Diversity of Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei isolates in rubber
trees using ISSR markers and rDNA – ITS sequence markers”.
Corynespora leaf fall, caused by Corynespora cassiicola, is one of the most important diseases in rubber (Hevea brasiliensis) plantations. Diversified and variable
symptoms easily caused mistake for other leaf diseases. Corynespora leaf fall in rubber
trees can cause serious damage for rubber plantations. Chemical controls are effective
but could harm the environment. Genetic controls are awaiting for bringing positive
effects.
There fore, 34 C. cassiicola isolates obtained from a number of Hevea clones
growed in rubber platations in Vietnam were purified using single spore isolation method, extracted DNA, using PCR – ITS with ITS1 and ITS4 primer, sequencing, comparing the sequencing results and finding the differences. Using PCR – ISSR with 5
primers UBC826, UBC835, Mj3, Mj4, Mj5, the differences of bands generated are
compared for diversity analysis.
In this study, the ISSR and rDNA – ITS sequence analyses segregated the 34

studied isolates into two distinct groups. Group 1 includes 21 isolates from Lai Khe,
Dong Nai, Quang Nam; and group 2 includes 13 isolates obtained from Lai Khe, Dong
Nai, Quang Nam, Binh Phuoc and Tay Nguyen. Single Nucleotide Polymorphisms
(SNPs) were discovered from the rDNA – ITS region of the studied isolates. The
BLAST search results revealed that the nucleotide sequences in the rDNA – ITS region of C. cassiicola fungus are highly conserved. In conclusion, ISSR markers proved
useful to distinguish the genotype groups of the fungus while rDNA – ITS sequence
markers could not only identify but could also infer the genotype groups of this fungus. This study confirmed that at least two distinct groups of C. cassiicola infect rubber trees in Vietnam. The infectious ability on different rubber clones of the isolates
belonged to these two groups need to be considered to confirm whether they are belong to two different physiological races.

iii

 


MỤC LỤC
 

 

Trang
Lời cảm ơn ............................................................................................................................. i
Tóm tắt .................................................................................................................................. ii
Summary ..............................................................................................................................iii
Mục lục ................................................................................................................................ iv
Danh sách các chữ viết tắt .................................................................................................. vii
Danh sách các bảng ............................................................................................................. ix
Danh sách các hình .............................................................................................................. ix
Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ..................................................................................................................... 1
1.2. Yêu cầu của đề tài......................................................................................................... 2

1.3. Nội dung thực hiện ....................................................................................................... 3
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................ 4
2.1. Sơ lược về cây cao su Hevea brasiliensis .................................................................... 4
2.1.1. Nguồn gốc cây cao su ở Việt Nam ............................................................................ 4
2.1.2. Bệnh hại trên cây cao su ............................................................................................ 4
2.2. Sơ lược về nấm Corynespora cassiicola ...................................................................... 5
2.2.1. Lịch sử phát hiện nấm Corynespora cassiicola ........................................................ 5
2.2.2. Phân loại học ............................................................................................................. 5
2.2.3. Phạm vi phân bố, phổ ký chủ và khả năng gây bệnh ................................................ 5
2.3. Bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su ................................................................... 6
2.4. Đặc tính gây bệnh của nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei ................. 7
2.5. Tình hình bệnh do nấm Corynespora cassiicola gây ra ở Việt Nam ........................... 7
2.6. Phân tích đa dạng di truyền dựa trên các kỹ thuật sinh học phân tử ............................ 8
2.6.1. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ...................................................... 8
2.6.2. ISSR (Inter Simple Sequence Repeat)..................................................................... 10
2.6.3. Ribosomal DNA – ITS (rDNA – ITS) sequencing ................................................. 13
2.7. Những nghiên cứu về Corynespora cassiicola trong và ngoài nước ........................ 15
2.7.1. Những nghiên cứu về Corynespora cassiicola ngoài nước ................................... 15
iv

 


2.7.1.1. Tình hình bệnh hại Corynespora .......................................................................... 15
2.7.1.2. Những nghiên cứu về Corynespora cassiicola trên thế giới ................................ 16
2.7.2. Những nghiên cứu về Corynespora cassiicola trong nước .................................... 18
2.7.2.1. Tình hình bệnh hại trong nước ............................................................................. 18
2.7.2.2. Các nghiên cứu đã thực hiện ................................................................................ 19
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................... 20
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .............................................................................. 20

3.1.1. Thời gian.................................................................................................................. 20
3.1.2. Địa điểm .................................................................................................................. 20
3.2. Vật liệu ....................................................................................................................... 20
3.2.1. Các mẫu phân lập nấm Corynespora cassiicola ..................................................... 20
3.2.2. Hóa chất ................................................................................................................... 21
3.2.2.1. Hóa chất dùng để ly trích DNA nấm .................................................................... 21
3.2.2.2. Hóa chất để thực hiện phản ứng PCR .................................................................. 21
3.2.2.3. Hóa chất để điện di sản phẩm PCR ...................................................................... 22
3.2.3. Máy móc và thiết bị ................................................................................................. 22
3.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................ 22
3.3.1. Ly trích DNA các mẫu phân lập nấm Corynespora cassiicola ............................... 22
3.3.2. Phân tích đa dạng di truyền bằng giải trình tự vùng rDNA – ITS .......................... 23
3.3.2.1. Khuếch đại vùng rDNA – ITS bằng kỹ thuật PCR .............................................. 23
3.3.2.2 Giải trình tự vùng rDNA – ITS ............................................................................. 24
3.3.2.3. Phân tích đa dạng di truyền từ kết quả giải trình tự ............................................. 24
3.3.3. Phân tích đa dạng di truyền bằng phương pháp khuếch đại vùng ISSR ................. 24
3.3.3.1. Khuếch đại vùng ISSR ......................................................................................... 24
3.3.3.2. Phân tích kết quả .................................................................................................. 25
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................................... 26
4.1. Kết quả ........................................................................................................................ 26
4.1.1. Kết quả ly trích DNA nấm Corynespora cassiicola................................................ 26
4.1.2. Nhận diện và phân tích đa dạng di truyền dựa trên vùng rDNA – ITS ................... 26
4.1.3. Phân tích đa dạng di truyền dựa trên kỹ thuật ISSR ............................................... 28
4.2. Thảo luận .................................................................................................................... 31
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 35
v

 

5.1. Kết luận....................................................................................................................... 35
5.2. Đề nghị ....................................................................................................................... 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................... 37 
PHỤ LỤC

vi

 


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
µg

: Microgram

µl

: Microlitre

µM

: Micromolar

AFLP

: Amplified Fragment Length Polymorphism

BLAST

: Basic Local Alignment Search Tool

bp

: base pair

CFC

: Common Fund for Commodities

CTAB

: hexacetyltrimethyl ammonium bromide

DNA

: deoxyribonucleic acid

dNTPs

: deoxynucleotides

EDTA

: ethylenediaminetetraacetic acid

g

: gram

IMI

: International Mycological Institute

ISSR

: Inter Simple Sequence Repeat

ITS

: Internal Transcribed Spacer

kp

: kilo base – pair

LSU

: Large subunit

mM

: Milimolar

MW

: molecular weight

NCBI

: National Center for Biotechnology Information

ng

: nanogram

PCR

: Polymerase Chain Reaction

PDA

: Potato Dextrose Agar

RAPD

: Random Amplified Polymorphic DNA

rDNA

: ribosomal deoxyribonucleotide acid

RFLPs

: Restriction Fragment Length Polymorphisms

RNA

: ribonucleic acid

RNase A

: ribonuclease A

RRIM

: Rubber Research Institute of Malaysia
vii

 


RRIV

: Rubber Research Institute of Vietnam

SALB

: South American Leaf Blight

SNPs

: Single Nucleotide Polymorphism

SSR

: Simple Sequence Repeat

SSU

: Small subunit

TAE

: Tris acetate EDTA

TE

: Tris – EDTA

U

: Unit

UBC

: University of British Columbia

UPGMA

: unweighted paired group method with arithmetic mean

UV

: Ultra Violet

V

: Volts

viii

 


DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang
Bảng 3.1 Danh sách các mẫu nấm phân lập từ các vùng địa lý khác nhau........................ 21
Bảng 3.2 Danh sách các mồi, trình tự và nhiệt độ bắt cặp ................................................. 23

DANH SÁCH CÁC HÌNH
 
Trang
Hình 2.1 Các vết bệnh do nấm Corynespora cassiicola gây ra trên lá cao su .................... 6
Hình 2.2 Các trình tự mồi bảo tồn cho phản ứng PCR khuếch đại và sự giải trình tự ..... 15
Hình 2.3 Vùng các mồi Internal Transcribed Spacer (ITS) ............................................... 15
Hình 4.1 Gel điện di sản phẩm PCR của 34 mẫu phân lập Corynespora cassiicola ........ 27
Hình 4.2 Đa hình nucleotide ở vị trí 135 trong vùng ITS1 của 34 mẫu phân lập ............. 27
Hình 4.3 Gel điện di sản phẩm khuếch đại DNA nấm Corynespora cassiicola ............... 28
Hình 4.4 Gel điện di sản phẩm khuếch đại DNA nấm Corynespora cassiicola ............... 29
Hình 4.5 Gel điện di sản phẩm khuếch đại DNA nấm Corynespora cassiicola ............... 30
Hình 4.6 Cây phân loài thu được từ phân tích UPGMA, sử dụng hệ số tương đồng ........ 31

ix

 


Chương 1 MỞ ĐẦU
 

1.1.

Đặt vấn đề
Bệnh rụng lá Corynespora gây ra bởi nấm Corynespora cassiicola (Berk. &

Curt.) Wei là một trong những bệnh quan trọng đang gây hại trên cây cao su. Triệu
chứng biểu hiện của bệnh hiện nay rất biến thiên và rất dễ nhầm lẫn với các bệnh về lá
khác. Bệnh ảnh hưởng lên lá non lẫn lá già và có thể làm rụng lá quanh năm. Điều này
có thể làm kéo dài thời gian kiến thiết cơ bản đối với cây cao su non, hay làm giảm
năng suất và sản lượng của cây trưởng thành, và thậm chí gây chết cây ở các dòng vô
tính mẫn cảm.
Hiện nay, bệnh rụng lá Corynespora đã có mặt ở hầu hết các quốc gia trồng cao
su. Các nghiên cứu về loại nấm này đang được thực hiện ở nhiều nơi trên thế giới.
Cách phòng chống dịch bệnh hiện đang được ứng dụng phổ biến là dùng hóa chất để
phòng trị. Việc này không những đòi hỏi nhiều nhân công lao động mà còn ảnh hưởng
đến môi trường. Một trong những biện pháp hiệu quả hiện nay là trồng những dòng vô
tính cao su kháng bệnh. Nhưng các dòng vô tính cũng ngày càng mẫn cảm với bệnh và
sự mẫn cảm của mỗi dòng vô tính tùy thuộc vào vùng địa lý. Điều này cho thấy có sự
tồn tại nhiều nòi sinh lý khác nhau của loài nấm này. Do đó, kiểm soát bệnh bằng biện
pháp di truyền (Genetic control) đang được mong đợi sẽ đem lại hiệu quả tích cực hơn.
Những nghiên cứu trên thế giới cho thấy, nấm C. cassiicola có sự phân hóa
trong cùng loài, C. cassiicola lây nhiễm trên các dòng vô tính cao su khác nhau có thể
có sự khác biệt về di truyền, nhờ đó có thể nhận biết nòi C. cassiicola qua khả năng
gây bệnh cho các dòng vô tính cao su khác nhau (CFC/INRO Project Proposal, 1999;
Safia và Noor Hisham, 2003). Việc nghiên cứu đa dạng di truyền của nấm C. cassiicola trên cây cao su ở nước ta là một việc làm cần thiết nhằm tìm hiểu mối quan hệ di
truyền của C. cassiicola với tính kháng của một số dòng vô tính cao su. Hiểu biết về
đa dạng di truyền của nấm C. cassicola đang gây hại trên cây cao su Việt Nam là một
công cụ hỗ trợ đắc lực cho việc kiểm soát bệnh có hiệu quả.
Silva (1995, 1998) đã dùng RFLP phân tích vùng ribosomal Internal Transcribed Spacer (ITS), kết quả chỉ cho một dạng đồng hình giữa các nguồn nấm được

phân lập. Trong một nghiên cứu khác, khi sử dụng RFLP – PCR với các enzyme cắt
1

 


giới hạn EcoRI, CfoI, MspI, HaeIII, RsaI, Sau3AI, Vũ Thị Quỳnh Chi (2005) không
tìm thấy bất cứ sự đa hình nào trong vùng ITS của các mẫu nấm nghiên cứu.
Các nghiên cứu RAPD cho thấy sự chuyên biệt ký chủ trên các dòng vô tính
cao su khác nhau và trên cây đu đủ nhưng không chỉ ra được mối quan hệ giữa các
nguồn nấm và các vùng địa lý (Silva, 1995). Kỹ thuật RAPD sử dụng 3 mồi (OPL –
08, OPM – 05, OPD – 18) cũng đã được sử dụng để phát hiện sự đa dạng di truyền
trên 11 nguồn nấm thu được từ các vùng địa lý khác nhau và trên các dòng vô tính
khác nhau ở Việt Nam đã chia các nguồn nấm thành 2 nhóm lớn. Cây phả hệ thu được
có hệ số đa dạng di truyền từ 0,43 – 0,94. Điều này cho thấy có sự đa dạng di truyền
giữa các nguồn nấm được nghiên cứu.Tuy nhiên sự khác biệt về hình thái thì dường
như không liên quan đến các nhóm RAPD trong nghiên cứu này (Lê Văn Huy, 2006).
Sử dụng chỉ thị ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) và giải trình tự vùng
rDNA – ITS, kết hợp với nghiên cứu lây nhiễm trên lá cắt rời, Nguyễn Anh Nghĩa và
ctv (2008) đã nghiên cứu sự đa dạng di truyền của các nguồn nấm C. cassiicola được
thu thập từ nhiều vùng trồng cao su khác nhau của Malaysia. Kết quả nghiên cứu cho
thấy có 2 nòi C. cassiicola khác nhau. Phân tích cho thấy có sự phân nhóm di truyền
theo vùng địa lý.
Cho đến nay, Việt Nam vẫn chưa sử dụng kỹ thuật ISSR và giải trình tự vùng
ITS để nghiên cứu đa dạng di truyền cho loài nấm này. Hiện vẫn chưa xác định được
có bao nhiêu nhóm di truyền C. cassiicola, và chúng thuộc nòi nào trong 2 nòi trên hay
là một nòi nào khác. Vì vậy, những nghiên cứu về bệnh rụng lá Corynespora trên cây
cao su tại Việt Nam không những tạo thêm nguồn tư liệu cho các nghiên cứu về bệnh
này trong nước mà còn bổ sung thêm tư liệu để cùng với các quốc gia khác mở rộng
hiểu biết về tác nhân gây bệnh, giúp ích cho việc phát triển các phương pháp phòng

chống và quản lý bệnh có hiệu quả.
Trên cơ sở đó, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu đa dạng di truyền một
số mẫu phân lập nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei trên cây cao su
bằng phương pháp giải trình tự vùng ITS – rDNA và chỉ thị phân tử ISSR”.
1.2.

Yêu cầu của đề tài

−

Tìm hiểu tính đa dạng và mối quan hệ di truyền của một số mẫu phân lập nấm
C. cassiicola được thu thập tại một số vùng trồng cao su tại Việt Nam bằng
phương pháp giải trình tự vùng ITS – rDNA và chỉ thị phân tử ISSR.
2

 


−

Nắm vững kỹ thuật ly trích DNA từ nấm.

−

Nắm vững kỹ thuật PCR khuếch đại trình tự vùng ITS dùng cặp mồi ITS1 và
ITS4.

−

Nắm vững kỹ thuật PCR dùng chỉ thị phân tử ISSR và sử dụng các phần mềm

để phân tích đa dạng di truyền của các mẫu phân lập nấm C. cassicola (Bioedit,
BLAST, FreeTree, TreeView,…).

1.3.

Nội dung thực hiện

−

Ly trích DNA các mẫu phân lập.

−

Đo nồng độ DNA ly trích được.

−

Pha loãng DNA các mẫu phân lập ở nồng độ 10 ng/µl và trữ ở 40C sử dụng cho
các phản ứng PCR.

−

Dùng kỹ thuật PCR khuếch đại vùng ITS của các mẫu phân lập sau đó đem giải
trình tự. So sánh kết quả giải trình tự với các trình tự trong ngân hàng gen bằng
BLAST. Dùng phần mềm Bioedit chỉnh sửa lại các trình tự, và so sánh sự khác
biệt của các trình tự này.

−

Dùng kỹ thuật PCR với chỉ thị phân tử ISSR khuếch đại DNA của các mẫu

phân lập. So sánh sự khác biệt của các băng được khuếch đại trên gel điện di để
phân tích đa dạng di truyền.

3

 


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1.

Sơ lược về cây cao su Hevea brasiliensis

2.1.1. Nguồn gốc cây cao su ở Việt Nam
Cây cao su (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới,
lưu vực sông Amazone (Nam Mỹ), được du nhập vào Việt Nam lần đầu tiên năm 1877
do Pierre trồng tại Thảo Cầm Viên (Sài Gòn). Vườn cao su đầu tiên được bác sĩ Yersin
trồng tại Suối Dầu – Nha Trang. Đầu thế kỷ XX, các vườn cao su được trồng tại vùng
Đông Nam bộ và đến đầu thập kỉ 50, cây cao su được trồng tại một số vùng Tây
Nguyên, miền Trung và một số vùng ở phía Bắc (Đặng Văn Vinh, 2000).
2.1.2. Bệnh hại trên cây cao su
Cây cao su là cây công nghiệp dài ngày, có giá trị kinh tế cao. Diện tích trồng
loại cây này ở nước ta đang tăng dần qua các năm. Hiện nay, cây cao su đang được mở
rộng ra trồng ở những vùng có điều kiện bất thuận (vùng ngoài truyền thống) như các
tỉnh ở vùng Tây Bắc, và được xem xét thay thế cho một số cây lâm nghiệp ít mang lại
hiệu quả kinh tế hơn. Với diện tích ngày càng được mở rộng và giá trị kinh tế ngày
càng tăng, vấn đề bệnh hại trên cây cao su hiện là mối quan tâm lớn, vì bệnh hại không
những làm kéo dài thời kỳ kiến thiết cơ bản mà còn ảnh hưởng đến sản lượng của
vườn cây nếu đang ở độ tuổi khai thác.
Cây cao su bị nhiễm rất nhiều loại bệnh và chủ yếu là do nấm gây ra. Theo

Chee (1987) đã liệt kê có hơn 550 loài vi sinh vật có liên quan đến cây cao su, và
trong đó có 24 loài có tầm quan trọng về kinh tế. Tùy theo vị trí bị hại, chúng được
chia ra thành các nhóm sau: bệnh lá, bệnh thân cành, bệnh mặt cạo và bệnh rễ. Các
loại bệnh có thể kiểm soát được bằng các biện pháp phòng trị khác nhau. Riêng bệnh
lá được xem là có tác hại lớn nhất và cũng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát
triển và mở rộng diện tích cao su trên toàn thế giới. Các bệnh lá được quan tâm là bệnh
cháy lá Nam Mỹ (SALB) do nấm Microcyclus ulei, phấn trắng do nấm Oidium hevea,
héo đen đầu lá do nấm Colletotrichum gloeosporioides, đốm mắt chim do nấm Drechslera heveae, và rụng lá Corynespora do nấm Corynespora cassiicola gây ra. Trong
các loại bệnh trên, bệnh Corynespora hiện đang được hầu hết các nước trồng cao su tại
Châu Á và Châu Phi, nơi sản xuất 98% lượng cao su thiên nhiên, quan tâm hàng đầu
4

 


do khả năng lây lan của loài nấm này. Số lượng dòng vô tính cao su bị nhiễm bệnh này
càng tăng và đặc biệt là những thiệt hại do nấm này gây ra đã được ghi nhận tại các
nước trồng cao su cũng như nguy cơ bùng phát dịch trong tương lai.
2.2.

Sơ lược về nấm Corynespora cassiicola

2.2.1. Lịch sử phát hiện nấm Corynespora cassiicola
Năm 1896, Cooke ghi nhận Corynespora melonis là tác nhân gây đốm lá dưa
hấu và dưa leo ở Mỹ. Năm 1906, Gusgow ghi nhận loại nấm tương tự trên dưa leo ở
Đức và đặt tên nó là Corynespora maizei. Năm 1908, Lindau khẳng định các tác nhân
nêu trên là cùng một loài và đặt tên là Corynespora melonis (Cooke) Lindau. Ở Trung
Quốc, nhiều tác giả đã ghi nhận loại nấm này trên cây đậu nành, đậu đũa và đặt tên là
Corynespora vignicola Kawamura. Vào năm 1948, Liu cho rằng loại nấm gây bệnh tại
Trung Quốc tương tự như loại nấm gây bệnh trên cùng ký chủ tại Mỹ đã được Olive và

cộng sự đặt tên là Helminthosporum vignae Olive Bain và Lefebrve (Olive và ctv,
1945; Phan Thành Dũng dẫn nhập, 1995). Sau đó trong báo cáo của IMI (International
Mycological Institute) tại Anh cho biết Helminthosporum cassiicola (Berk. and Curt.)
là ký chủ của 11 loài cây vùng nhiệt đới, trong đó có cao su và đu đủ.
Năm 1950, Wei thu thập tất cả các tài liệu liên quan đến nấm này và phân tích
để đi đến kết luận rằng chúng là tác nhân gây bệnh duy nhất thuộc loài Corynespora
cassiicola và đặt tên là Corynespora cassiicola (Berk. and Curt.) Wei, tên này được
các nhà nghiên cứu bệnh cây chấp nhận cho đến nay.
2.2.2. Phân loại học
Giới:

Fungi

Ngành (Phylum):

Ascomycota

Lớp (class):

Ascomycetes

Bộ (Order):

Pleosporales

Họ (Family):

Corynesporascaceae

Giống (Genus):

Corynespora.

2.2.3. Phạm vi phân bố, phổ ký chủ và khả năng gây bệnh
Wei được ghi nhận trên hơn 70 quốc gia và hơn 300 loài thực vật được biết là
ký chủ của loài nấm này bao gồm cây ăn quả, rau màu, ngũ cốc, cây lâu năm, cây lâm
nghiệp, cây cảnh (Farr và ctv, 2009).

5

 


2.3.

Bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su
Bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su được ghi nhận lần đầu tiên tại vườn

ươm Sierra Leon năm 1936 (Wei, 1950). Sau đó, bệnh tiếp tục được ghi nhận ở Ấn
Độ (Ramakrishnan và Pillay, 1961), Sri Lanka và Cameroon (Liyanage, 1986; Jayasingle, 1997), Malaysia (Newsam, 1961), Nigeria (Awoderu, 1969), Indonesia (Situmorang và Budiman, 1984), Brazil (Junqueria và ctv, 1985), Thái Lan (Pongthep,
1987) và Bangladesh (Rahman, 1988). Đến nay, bệnh đã xuất hiện ở hầu hết các nước
trồng cao su. Năm 2006, bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su cũng đã được phát
hiện ở đảo Hải Nam, Trung Quốc (Pu và ctv, 2007).
Ban đầu, C. cassiicola gây bệnh không đáng kể trên cây cao su. Tuy nhiên, từ
thập niên 1980, bệnh rụng lá Corynespora có xu hướng tăng dần trên nhiều quốc gia
trồng cao su. Các dòng vô tính cao su ngày càng trở nên mẫn cảm với bệnh theo thời
gian và tính nhạy cảm biến thiên theo các vùng địa lý. Từ những quan sát này có thể
suy luận ra sự tồn tại của nhiều nòi sinh lý khác nhau của nấm C. cassiicola gây bệnh
trên cây cao su và/ hoặc sự phát triển của bệnh có thể sinh ra những nòi nấm mới. Một
số nòi C.cassiicola gây bệnh trên cây cao su đã được xác định và thiết lập mối quan hệ

về di truyền giữa các mẫu nấm được phân lập. Do vậy các dòng vô tính cao su mới
được lai tạo cần được tuyển chọn về tính kháng các nòi nấm bệnh trước khi được
khuyến cáo ra sản xuất. Vì thế hiểu biết về sự đa dạng di truyền của loài nấm bệnh này
sẽ rất hữu ích trong công tác tạo tuyển giống cây cao su.
Mức độ nghiêm trọng của bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su tăng dần
theo thời gian ở nhiều quốc gia dẫn đến sự quyết tâm thực hiện các dự án nghiên cứu
để làm sáng tỏ về bệnh hại và có được những hiểu biết tường tận về nguyên nhân gây
bệnh (Nguyễn Anh Nghĩa và ctv, 2008).

Hình 2.1 Các vết bệnh do nấm Corynespora cassiicola gây ra trên lá cao su.

6

 


2.4.

Đặc tính gây bệnh của nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei

trên cây cao su
Nấm thường tấn công trên cả lá già lẫn lá non, cuống lá, và chồi non, gây rụng
lá và chết chồi, đôi khi chết toàn bộ cây. Bào tử nấm được phóng thích vào ban ngày,
cao điểm từ 8 – 11 giờ và phát tán nhờ gió. Nấm có khả năng tồn tại trên các vết bệnh
hoặc trong đất với thời gian dài. Trên lá cao su khô, nấm vẫn tồn tại và giữ nguyên khả
năng gây bệnh trong khoảng thời gian đến 3 tháng. Nấm thường xâm nhập chủ yếu ở
mặt dưới lá qua biểu bì và khí khổng. Ngoài ra, nấm còn tiết ra men celluloza giúp
phân hủy màng tế bào. Trong quá trình sinh trưởng, nấm còn tiết ra độc tố (cassiicolin), hợp chất này rất độc cho cây cao su, cho nên chỉ với một vết bệnh nhỏ trên gân
chính của lá cũng đủ gây rụng lá. Nấm có khả năng tồn tại và phát triển trong phạm vi
nhiệt độ lớn, nhưng thích hợp nhất ở 28 ± 20C và ẩm độ bão hòa. Hơn nữa, bệnh

thường xảy ra quanh năm và suốt chu kỳ sống của cây cao su nên có tác hại lớn, nhất
là cho các dòng vô tính mẫn cảm (Phan Thành Dũng, 2004).
2.5.

Tình hình bệnh do nấm Corynespora cassiicola gây ra ở Việt Nam
Tại Việt Nam, bệnh được phát hiện lần đầu tiên vào tháng 8/1999, gây hại nặng

cho các dòng vô tính RRIC 103, RRIC 104 và LH 88/372. Đến tháng 9/1999, bệnh
cũng được phát hiện tại những vùng trồng cao su khu vực Đông Nam bộ và vào tháng
1/2000 bệnh bộc phát mạnh trên dòng vô tính RRIC 104 ở Công ty Cao su Lộc Ninh
với hơn 200 ha cao su kiến thiết cơ bản và cao su khai thác bị rụng lá gần như hoàn
toàn (Dung và Hoan, 2000).
Kết quả ghi nhận được qua điều tra vào năm 2007cho thấy, bệnh Corynespora
đã xuất hiện ở hai Công ty Bình Thuận, Hà Tĩnh thuộc khu vực miền Trung và ở tất cả
các Công ty thuộc khu vực Đông Nam Bộ. Trong đó, tại Hà Tĩnh bệnh xảy ra ở mức
nặng nhất (3,3) và nhẹ nhất là tại Tân Biên (0,5). Phần lớn các công ty khác bệnh chủ
yếu ở mức nhẹ. Tại các Công ty Quảng Nam, Quảng Ngãi, Quảng Trị, Thanh Hóa và
toàn bộ khu vực Tây Nguyên chưa thấy có sự xuất hiện của bệnh trên bất kỳ dòng vô
tính nào, kể cả dòng vô tính RRIC.
Điều khác biệt của bệnh này so với các loại bệnh khác là tại các địa điểm được
điều tra, nếu địa điểm nào xuất hiện bệnh thì trên toàn bộ các dòng vô tính được điều
tra tại địa điểm đó đều có bệnh. Ở khu vực miền Trung bệnh trên các dòng vô tính biến
động từ rất nhẹ đến trung bình trong khi ở khu vực Đông Nam Bộ các dòng vô tính chỉ
7

 


bị nhiễm bệnh ở mức nhẹ. Trong các dòng vô tính, RRIC 110 bị nhiễm bệnh nặng nhất
ở cả hai khu vực và đây cũng là dòng vô tính mẫn cảm đối với loại bệnh này. Qua kết

quả diều tra bệnh cũng cho thấy rằng, đây là điều đáng lo ngại đối với bệnh Corynespora, nếu không có biện pháp ngăn ngừa kịp thời có thể bệnh sẽ trở thành mối nguy
hại lớn cho ngành trồng cao su trong nước.
Tuy nhiên hiện nay bệnh đã được ghi nhận xuất hiện tại vùng Tây Nguyên và cả
vùng Tây Bắc, là vùng mới phát triển cao su chỉ mới một vài năm gần đây. Đồng thời
bệnh đang có chiều hướng gia tăng và xâm nhiễm trên nhiều dòng vô tính khác nhau.
Vì đây là bệnh khá mới mẻ đối với những người trồng cao su ở Việt Nam nên
việc theo dõi thời điểm bắt đầu và kết thúc đối với loại bệnh này gặp nhiều khó khăn
và hiện vẫn chưa thực hiện được (Nguyễn Thái Hoan và ctv, 2009).
2.6.

Phân tích đa dạng di truyền dựa trên các kỹ thuật sinh học phân tử
Một số kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng phổ biến để nghiên cứu đa dạng

di truyền các loài nấm bệnh như RFLPs (Rectriction Fragment Length Polymorphisms), RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), AFLP (Amplified Fragment
Length Polymorphism), SSR (Simple Sequence Repeat), ISSR (Inter Simple Sequence
Repeats), rDNA – ITS (ribosomal DNA – ITS sequencing), SNPs (Single Nucleotide
Polymorphisms) (Bridge và ctv, 2005; Carter và ctv, 2004; Gil – Lamaignere và ctv,
2003; Maclean và ctv, 1993; Bruns và ctv, 1991). Trong đó, ba kỹ thuật được sử dụng
để phân tích các mẫu phân lập nấm C. cassiicola là RAPD, ISSR, và giải trình tự vùng
rDNA – ITS sẽ được giới thiệu trong khóa luận này.
2.6.1. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
Kỹ thuật RAPD được mô tả lần đầu tiên bởi William và ctv năm 1990. Đây là
chỉ thị phân tử đơn giản nhất dựa trên kỹ thuật PCR. Các Oligonucleotide khoảng 10
cặp base bất kỳ được dùng như là các mồi có thể bắt cặp bổ sung với các trình tự trong
bộ gen. Các đoạn DNA trong bộ gen dài từ 300 tới 2000 bp sẽ được khuếch đại bằng
cách sử dụng duy nhất một mồi đơn của các trình tự bất kỳ. Sản phẩm PCR riêng biệt
được khuếch đại khi mồi nối vào cả 2 mạch của đoạn DNA nằm trên các chuỗi DNA
đối diện trong vùng được khuếch đại. Sự có mặt hoặc vắng mặt của các sản phẩm
chuyên biệt phản ánh các đột biến ở vị trí bắt cặp giữa mồi và DNA. Thông thường có
từ 3 đến 10 đoạn DNA khác nhau được khuếch đại trong phản ứng RAPD. Sản phẩm

PCR là các đoạn có kích thước khác nhau này sẽ được phân tách trên gel agarose bằng
8

 


phương pháp điện di, sau đó đem nhuộm với ethidium bromide và quan sát dưới đèn
UV. Kỹ thuật nhuộm bạc cho gel polyacrylamide cũng được sử dụng với mục đích
này. Sự đa hình giữa các sản phẩm được khuếch đại sau đó sẽ được kiểm tra và đánh
dấu di truyền.
Sử dụng phương pháp này có một vài thuận lợi như không cần thiết phải biết
trước trình tự; chỉ cần sử dụng một lượng DNA nhỏ; thao tác đơn giản; việc phát hiện
không dính đến phóng xạ; các kết quả có thể được thấy nhanh chóng; một lượng lớn
các chỉ thị tiềm năng có thể được tổng hợp dùng các chỉ thị có giá trị sẵn; tính đa hình
cao và chi phí tương đối thấp so với các kỹ thuật khác như allozyme và RFLP (Maluszynki và ctv, 2002; Bardakci, 2001).
Tuy nhiên, kỹ thuật này cũng có nhiều bất lợi. Do các mồi được sử dụng ngắn
(chỉ khoảng 10 bp) nên nhiệt độ bắt cặp trong phản ứng PCR phải thấp (35 – 400C) thì
mồi mới có thể bắt cặp được. Khi nhiệt độ bắt cặp thấp như vậy, sự bắt cặp sẽ không
chuyên biệt, điều này có nghĩa là các mồi có thể bắt cặp với các trình tự mà không
hoàn toàn bổ sung với nó. Thêm vào đó, các dạng RAPD có thể bị tác động bởi một
vài các yếu tố kỹ thuật như loại máy luân nhiệt được sử dụng, nhiệt độ bắt cặp và nồng
độ của Polymerase chịu nhiệt (Johns và ctv, 1997; Penner và ctv, 1993). Đây có thể là
nguyên nhân dẫn đến độ lập lại kết quả thấp giữa các phòng thí nghiệm và thậm chí là
trong cùng phòng thí nghiệm, trong trường hợp thay đổi các thiết bị, vật dụng hay yếu
tố con người (Jones và ctv, 1997). Do đó, mặc dù đánh dấu di truyền RAPD có thể
được dùng để chỉ ra đa dạng di truyền trong 1 phòng thí nghiệm, nó không thích hợp
nghiên cứu đa dạng di truyền trong một vài phòng thí nghiệm cần có sự trao đổi hay
đối chiếu số liệu. Mặt khác, kỹ thuật RAPD là kỹ thuật chỉ thị phân tử trội đa vị trí nên
không phân biệt được đồng hợp tử và dị hợp tử ở các vị trí chuyên biệt (William và
ctv, 1990). Nó có thể dẫn đến tiềm năng đánh giá lượng đa dạng di truyền thấp hay

không chính xác.
Đánh dấu RAPD được ứng dụng rộng rãi trong lập bản đồ gen, di truyền quần
thể, tiến hóa di truyền phân tử và trong chọn giống thực vật và động vật. Điều này
chính là nhờ vào những thuận lợi của kỹ thuật này. Do đó, nó có thể được thực hiện
trong các phòng thí nghiệm vừa phải cho hầu hết các ứng dụng (Bardakci, 2001). Tuy
nhiên, phương pháp RAPD đang dần bị từ bỏ vì sinh sản phẩm ít.

9

 


Trong lĩnh vực nghiên cứu cao su, kỹ thuật này cũng được sử dụng để nhận
dạng và phân nhóm di truyền giữa các mẫu phân lập nấm C. cassiicola. Một vài nòi
nấm C. cassiicola xâm nhiễm trên cây cao su đã được phát hiện và mối quan hệ giữa
các mẫu phân lập cũng đã được báo cáo (Romruensukharom và ctv, 2005; Safia và
Noor, 2003; Saha và ctv, 2000; Silva và ctv, 2003, 1998, 1995; Darmono và ctv,
1996).
2.6.2. ISSR (Inter Simple Sequence Repeat)
Nghiên cứu đầu tiên về kỹ thuật chỉ thị phân tử ISSR được xuất bản năm 1994
(Zietkiewicz và ctv, 1994; Gupta và ctv, 1994). ISSRs, là sự cải tiến của RAPD, sử
dụng sự khác biệt của số lượng các vùng trình tự đơn lặp lại được phân phối trong suốt
hầu hết bộ gen (Zietkiewicz và ctv, 1994). SSRs (Simple sequence repeats) (Tautz,
1989), cũng được biết đến như các vi vệ tinh (Litt và Luty, 1989) là sự lặp lại của 1 – 6
nucleotide nằm phổ biến trong khắp bộ gen bao gồm cả vùng mã hóa hay không mã
hóa cho các protein ở các sinh vật bậc cao.
Kỹ thuật ISSR cũng dựa trên phương pháp PCR, cũng liên quan đến sự khuếch
đại các đoạn DNA nằm ở vị trí khuếch đại là khoảng giữa của hai vi vệ tinh tương
đồng lặp lại được định hướng trong các hướng trái ngược. Một mồi đơn SSR điển hình
được gắn neo thêm 1 – 4 bp chọn lọc ngẫu nhiên (Zietkiewicz và ctv, 1994) được dùng

để tổng hợp nên nhiều dạng băng trên gel. Di (2)– nucleotide, tri (3)– nucleotide, tetra
(4)– nucleotide và penta (5)– nucleotide lặp lại được dùng như là các mồi. Các mồi
được sử dụng cũng có thể không gắn neo (Bornet và Branchard, 2001; Gupta và ctv,
1994; Wu và ctv, 1994). Tuy nhiên, khi dùng các mồi không được gắn neo (chỉ đối với
SSRs), các mồi có xu hướng trượt trong các đơn vị lặp lại trong suốt sự khuếch đại dẫn
đến hình thành các vết mờ thay vì các băng rõ. Kéo dài với neo ở đầu 3’ hay 5’ sẽ đảm
bảo cho các mồi bắt cặp duy nhất vào các đoạn vi vệ tinh trên DNA mẫu từ đó sẽ hạn
chế được sự tự bắt cặp của mồi hay tình trạng tạo ra các vết mờ. Thứ hai, neo cho phép
duy nhất một tập hợp con của các vi vệ tinh cung cấp như là vị trí dẫn đường (Reddy
và ctv, 2002). Khi mồi định vị thành công vào vùng hai vi vệ tinh trong vùng khuếch
đại DNA mẫu, phản ứng PCR sẽ sinh ra 1 băng với kích thước chuyên biệt cho vị trí
này. Thông thường, chỉ một vài cặp vùng vi vệ tinh tồn tại trong bộ gen, do đó sẽ dẫn
đến rất nhiều băng với các kích thước khác nhau. Đánh dấu phân tử ISSR được phát
hiện trên gel agarose bằng nhuộm với ethidium bromide. Tuy nhiên, việc phát hiện
10

 


trên gel acrylamide nhuộm bạc hay phóng xạ sẽ cho độ nhạy cao hơn (Reddy và ctv,
2002). Gần đây, những giới thiệu mới về mồi đánh dấu huỳnh quang gắn với các đoạn
được phân tích trên trình tự DNA sẽ gia tăng độ nhạy và và số lượng của các chỉ thị
phân tử rất lớn (Yasodha và ctv, 2004). Các đoạn được phát hiện được đánh giá bằng
phương pháp phổ biến nhất là đánh dấu hai allen trội (có hoặc không) (Wang và ctv,
1998; Ratnaparkhe và ctv, 1998; Tsumura và ctv, 1996; Gupta và ctv, 1994). Tuy
nhiên, trong một vài trường hợp chúng cũng cho thấy sự phân tách như là chỉ thị phân
tử đồng trội do đó có thể phân biệt được đồng hợp tử và dị hợp tử (Sankar và Moore,
2001; Davila và ctv, 1999; Wang và ctv, 1998; Akagi và ctv, 1996; Wu và ctv, 1994).
Một phản ứng ISSR điển hình sẽ cho từ 20 – 100 băng cho mỗi phản ứng tùy thuộc
vào mỗi loài và loại mồi được sử dụng (Goldwin và ctv, 1997). Sự đa hình các chỉ thị

phân tử ISSR cũng cao hơn các chỉ thị phân tử khác (Virk và ctv, 2000; Salimath và
ctv, 1995).
Vì mồi ISSR dài hơn mồi RAPD, khoảng 16 – 25 bp so với 10 bp, nên nhiệt độ
bắt cặp cao hơn (45 – 650C) như vậy sẽ cho nhiều chỉ thị phân tử ổn định hơn. Vì
ISSRs có nhiều sản phẩm chỉ thị phân tử hơn so với RAPD (Han và ctv, 2002; Reddy
và ctv, 2002; Zietkiewicz và ctv, 1994). Thực ra, những chỉ thị phân tử này gắn với sự
phổ biến của RAPD giúp ích cho SSRs và AFLP (Reddy và ctv, 2002).
Trong chọn giống thực vật, chỉ thị phân tử ISSR được dùng để nghiên cứu về
các vùng của đối tượng bao gồm in dấu di truyền của bộ gen, đánh giá đa dạng di
truyền và phân tích sự phát sinh loài, lập bản đồ gen, xác định tần số của các vi vệ tinh
trong bộ gen, gen tagging và các chỉ thị phân tử giúp ích cho việc chọn lọc và sự phát
triển sinh học (Reddy và ctv, 2002). Trong nghiên cứu di truyền nấm, kỹ thuật ISSR –
PCR được ứng dụng thành công trong xác định tính đa dạng di truyền của một số nấm
bệnh như Beauveria bassiana (Estrada và ctv, 2007), Fusarium graminearum (Mishra
và ctv, 2004); Serpula lacrymans (Kauserud, 2004); Corynespora casiicola (Nguyen
Anh Nghia và ctv, 2009), … Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào sử dụng phương pháp
ISSR cho nấm C. cassiicola ở Việt Nam.
RAPD và ISSR đều dựa trên kỹ thuật PCR để phân tích mức độ phân tử. Vì các
mồi không được thiết kế dựa trên trình tự DNA biết trước, nên chúng được coi như các
mồi tùy ý hay ngẫu nhiên. Điều này có nghĩa là không phải mất thời gian cho việc thiết
kế mồi. Đó là các phản ứng giữa các mồi đơn sinh ra các đánh dấu phân tử trội đa vị
11

 


trí. Các chỉ thị phân tử sẽ được điện di và quan sát bằng đèn UV sau đó sẽ đánh giá các
băng có hay không xuất hiện. Cách phân tích số liệu của hai kỹ thuật này là như nhau.
RAPD và ISSR được phổ biến bởi chúng nhanh, kinh tế, thao tác đơn giản và tần số đa
hình cao.

Như đã đề cập bên trên, phản ứng RAPD thông thường khuếch đại từ 3 đến 10
băng DNA trong khi ISSR thường khuếch đại được từ 20 tới 100 băng DNA trong 1
phản ứng. Do đó, chỉ cần tốn ít mồi ISSR hơn mà vẫn có lượng thông tin di truyền
nhiều. Ít mồi hơn cũng có nghĩa là tiết kiệm được thời gian nhiều hơn, tiết kiệm được
DNA, dễ ứng dụng hơn và rẻ tiền hơn. Thêm vào đó, vì phương pháp ISSR và RAPD
sử dụng cùng loại DNA, các thiết bị và phương pháp thống kê, nên việc chuyển đổi từ
ISSR sang RAPD rất đơn giản. Yêu cầu duy nhất là mua mồi mới và sau đó thực hiện
các quy trình tối ưu hóa tương tự. Thêm nữa, những nghiên cứu đã thực hiện với
RAPD có thể tiếp tục với ISSR và những số liệu của chúng có thể liên hệ với nhau
trong thống kê. Vì tất cả các lý do trên, kỹ thuật ISSR là một sự lựa chọn thay thế cho
RAPD ở các phòng thí nghiệm quy mô vừa.
Trình tự mồi được sử dụng trong phản ứng PCR được thiết kế dựa trên những
đoạn trình tự nucleotide lặp lại đơn giản gồm 2 nucleotide như (CA)n, (AT)n, (AG)n
hay những đoạn trình tự gồm 3 nucleotide được lặp lại nhiều lần như (AGC)n,
(TAT)n. Mỗi primer gồm 16 – 18 bp là đoạn trình tự lặp lại có đầu 5’ hoặc 3’ kết thúc
bằng 1 đến 3 bp bất kì khác với bộ nucleotide được lặp lại. Vì thế chúng dễ thao tác,
mang lại nhiều thông tin và có tính lặp lại cao. Vì các trình tự lặp lại được phân bố rất
phong phú trong bộ gen nên các vi vệ tinh gắn vào một vài vùng đặc trưng và tạo ra
các kiểu khuếch đại đa dạng và thường đa hình giữa các cá thể khác nhau. Sản phẩm
khuếch đại được điện di trên gel agarose 2%. Sự xuất hiện của những đọan DNA có
kích thước khác nhau ở các cá thể được mã hóa dưới dạng có xuất hiện (1) hay không
xuất hiện (0) và được xử lý bằng các phần mềm chuyên dụng như Freetree, Treeview
để phân tích và đánh giá các thông số về di truyền.
ISSR – PCR được thực hiện với 8 mồi (UBC826, UBC828, UBC835, UBC840,
UBC850, Mj3, Mj4 và Mj5) đã được sử dụng thành công trong việc phân tích đa dạng
di truyền các nguồn nấm C. cassiicola ở Malaysia (Nguyễn Anh Nghĩa và ctv, 2008).

12

 

2.6.3. Ribosomal DNA – ITS (rDNA – ITS) sequencing
Gen ribosomal DNA (được biết đến như là ribosomal DNA hay rDNA) được
mã hóa trong DNA của cả nhân và ty thể. Vùng rDNA nhân thường bao gồm 3 gen,
gen small subunit (18S), gen 5,8S và gen large subunit (28S), phân tách nhau bởi vùng
Internal Transcribed Spacer (ITS), trong một đơn vị lặp lại nhiều lần. Một vài rDNAs
được bảo tồn cao trong suốt quá trình tiến hóa và những phần khác (như các vùng
spacer ) rất biến thiên thậm chí trong cùng loài. Tính bảo tồn của những vùng này cho
phép thiết kế các mẫu dò (probes) hay mồi từ các loài, giống, họ hay thậm chí giới
khác được dùng để phát hiện các gen ribosom tương đương. Mặt khác, thông tin các
đoạn DNA được phát hiện trong các sinh vật đa dạng có sự biến động số lượng trình tự
rất lớn để có thể định danh (McCartney và ctv, 2003).
Các trình tự nucleotide của các gen rDNA được ứng dụng để nghiên cứu mối
quan hệ phát sinh loài trên một diện rộng các mức độ phân loại với nhiều loài sinh vật
khác nhau. Các trình tự rDNA small – subunit trong nhân tiến hóa tương đối chậm và
rất hữu ích để nghiên cứu các sự quan hệ giữa các loài, trong khi vùng ITS của rDNA
nhân lặp lại các đơn vị tiến hóa nhanh nhất và và có thể rất biến động trong loài và
quần thể (White và ctv, 1990).
Trước tiên, các trình tự gen rDNA thu được bằng cách phân lập và giải trình tự
gen từng dòng vô tính riêng. Trực tiếp giải trình tự rDNA cũng được thực hiện để thu
được kết quả trình tự nhanh chóng. Tuy nhiên, phương pháp này cần một lượng RNA
tương đối lớn và có thể dẫn đến sai lệch bởi vì chỉ duy nhất 1 chuỗi được giải trình tự.
Thực hiện phản ứng PCR và giải trình tự DNA trực tiếp cho một vài thuận lợi hơn so
với dòng hóa và giải trình tự RNA trực tiếp. Phương pháp này dùng DNA tổng số từ
bộ gen với một lượng rất nhỏ (0,1 – 10 ng cho một phản ứng khuếch đại); cả hai mạch
đơn của gen đều có thể được dùng để giải trình tự nhằm hạn chế bớt sai sót; và phương
pháp này có thể thích hợp với các thiết bị giải trình tự DNA tự động sử dụng các trình
tự mồi có đánh dấu huỳnh quang hay di – deoxynucleotide triphosphate (White và ctv,
1990).

Một vài loại mồi phổ biến được thiết kế dùng cho việc khuếch đại nhiều đoạn
khác nhau của gen rDNA nhân sao cho các mồi ITS được dùng để khuếch đại các đoạn
khác nhau của vùng ITS nằm giữa gen 18S, 5,8S, và 28S (White và ctv, 1990). Trong
số các mồi ITS, cặp mồi ITS1 và ITS4 đã khuếch đại từ đầu 3’ của rDNA 18S tới đầu
13

 


5’ của rDNA 28S, bao gồm cả vùng ITS1, 5,8S rDNA và ITS2 (được biết đến như là
vùng rDNA – ITS) đã được sử dụng rộng rãi (Vilgalys, 2008).
Vùng rDNA – ITS được khuếch đại bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi ITS.
Sản phẩm PCR sau đó được đem đi giải trình tự và sau đó trình tự nucleotide sẽ được
so sánh với các trình tự trên GenBank (Benson và ctv, 2008) và FASTA (Pearson và
Lipman, 1988). Những chương trình này sẽ nhận diện được nấm có mối quan hệ gần
nhất với loài nấm chưa được biết tên. Chúng còn có thể tìm ra mối quan hệ tương đồng
của các loài giữa nấm không biết tên với các loài sinh vật khác và do đó có thể xác
nhận được vị trí phân loại. Điều này có một thuận lợi là cùng một phương pháp này có
thể được sử dụng cho bất kỳ loài nấm nào mà không cần phải biết thông tin hay đặc
điểm nhận dạng của chúng.
Trong nghiên cứu các trình tự về nấm, vùng rDNA – ITS là vị trí phổ biến nhất
để định danh các loài và suy ra các nhóm phụ (Nilsson và ctv, 2008). Các đoạn này
gắn liền với những thuận lợi để giải quyết các mức độ biến động khác nhau (ITS1: tiến
hóa nhanh, 5,8S: rất bảo tồn, ITS2: tốc độ tiến hóa từ vừa đến nhanh) (Hershkovitz và
Lewis, 1996; Hillis và Dixon, 1991). Vì số lượng bản sao cao và kích thước của chúng
tương đối nhỏ (khoảng chừng 550 bp), các mồi chung được thiết kế từ các vùng bảo
tồn bên sườn các vùng ITS cho phép khuếch đại các vùng này một cách dễ dàng
(White và ctv, 1990). Các phân tử đánh dấu trình tự vùng rDNA – ITS được ứng dụng
rộng rãi trong xác định mối quan hệ di truyền giữa và trong các loài nấm cũng như
phát hiện và định danh nấm (Bridge và ctv, 2008, 2005; Nelson và ctv, 2008, 2005;

Horton và Bruns, 2001; Cullings và Vogler, 1998; Hershkovitz và Lewis 1996; White
và ctv, 1990). Đã có nhiều báo cáo trên các giống và loài nấm khác nhau được xuất
bản như Trichophyton spp. (Kanbe, 2008; Abdel – Rahman, 2008); Rhizoctonia solani
(Godoy – Lutz và ctv, 2008); Peronospora spp. (Choi và ctv, 2008),…
Ngày nay, từ những thuận lợi mà phương pháp giải trình tự tự động mang lại,
các trình tự nucleotide có thể được phân tích dễ dàng và các kết quả thu được một cách
nhanh chóng với giá cả có thể chấp nhận được. Vùng rDNA – ITS được khếch đại
bằng PCR, tinh sạch để thu được các băng sau đó đem đi giải trình tự những đoạn này
rất dễ dàng, nhanh chóng và đáng tin cậy. Hơn nữa, trình tự vùng rDNA – ITS có một
thuận lợi rất quan trọng đó là nó có thể được dùng làm cơ sở dữ liệu chung và có thể
dễ dàng tìm kiếm và phân tích so sánh bằng sử dụng BLAST (Altschul và ctv, 1990)
14