NGHIÊN CỨU THU NHẬN TẾ BÀO TIỀN THÂN NỘI MÔ TỪ MÁU CUỐNG RỐN NGƯỜI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU THU NHẬN TẾ BÀO TIỀN THÂN NỘI MÔ
TỪ MÁU CUỐNG RỐN NGƯỜI

Ngành học:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện:

LÂM THIÊN NGỌC

Niên khóa:

2006-2010

Tháng 7/2010


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU THU NHẬN TẾ BÀO TIỀN THÂN NỘI MÔ
TỪ MÁU CUỐNG RỐN NGƯỜI

Hướng dẫn khoa học
ThS. PHẠM VĂN PHÚC

Sinh viên thực hiện
LÂM THIÊN NGỌC

Tháng 7/2010


LỜI CẢM ƠN
Sau hơn 4 tháng thực hiện đề tài tốt nghiệp tại Phòng Thí nghiệm Nghiên cứu
và Ứng dụng Tế bào gốc, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia
Thành phố Hồ Chí Minh, tôi đã học tập được nhiều điều. Đó không chỉ là những kiến
thức bổ ích về tế bào gốc, không chỉ là tác phong nghiên cứu khoa học chuyên nghiệp
mà hơn hết là tình cảm gắn bó giữa các bạn sinh viên với lãnh đạo phòng cùng các anh
chị cán bộ trẻ. Trong suốt thời gian làm đề tài, tôi đã nhận được sự giúp đỡ từ mọi
phía, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:
Thầy trưởng bộ môn và các thầy cô thuộc Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học,
trường Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh,đã tạo tận tình dạy bảo tôi trong 4
năm đại học và tạo điều kiện để tôi được thực hiện đề tài tốt nghiệp theo hướng yêu
thích.
Thầy Phan Kim Ngọc, người đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện đề tài và luôn
hỏi han, động viên khiến tôi thêm vững niềm tin vào bản thân. Từ tận đáy lòng, tôi biết
ơn thầy và cầu mong thầy luôn mạnh khỏe để tiếp tục cống hiến cho nền khoa học
nước nhà.
Thầy Phạm Văn Phúc, người hướng dẫn khoa học và luôn sẵn sàng giúp đỡ
định hướng cho đề tài của tôi. Thầy là người luôn tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi
trong quá trình thực hiện đề tài và cũng là một người anh thân thiết, luôn động viên
tinh thần cho tôi, giúp tôi vượt qua những trở ngại để hoàn thành tốt đề tài.
Thầy Nguyễn Thanh Tâm, người trực tiếp chỉ dẫn tôi từ những ngày đầu tiến

hành đề tài và luôn đồng hành cùng tôi trong suốt quãng thời gian sau đó. Tôi học
được nhiều điều từ thầy sau 4 tháng làm khóa luận, trong đó, điều quan trọng nhất là
đối với mọi việc mình làm, chỉ cần có sự say mê và nỗ lực thì thành công đang chờ đợi
ta phía trước.
Các anh chị Vũ Bích Ngọc, Huỳnh Mỹ Linh, Vương Gia Tuệ, Phạm Quốc Việt
đã luôn bên cạnh tôi, hỗ trợ tôi về kiến thức chuyên môn và là nguồn động lực khiến
tôi cố gắng hơn. Các anh chị trẻ, nhiệt tình và luôn sẵn sàng giúp đỡ sinh viên. Mong
các anh chị luôn giữ mãi ngọn lửa đam mê khoa học và vững bước trên đường đời.


Các bạn Đinh Văn Long, Phan Lữ Chính Nhân, các bạn nhóm ung thư vú, tế
bào mầm và tất cả sinh viên trong phòng thí nghiệm, các bạn đã giúp đỡ tôi rất nhiều
và cho tôi hiểu thêm rằng cuộc sống thật tuyệt khi bên cạnh lúc nào cũng có những
người bạn sẵn sàng giúp đỡ mình.
Xin gửi lời biết ơn sâu sắc nhất đến ba mẹ tôi – người đã cho tôi cơ hội được có
mặt trên cuộc đời này. Con mong ba mẹ luôn khỏe. Cảm ơn người chị tuyệt vời và đứa
em bé bỏng của tôi. Chúc mọi người những điều tốt đẹp nhất.


TÓM TẮT
Ở Việt Nam, tỷ lệ mắc bệnh và tử vong do các bệnh về tim mạch khá cao với
tần suất 1 trên 100.000 dân. Hiện nay số ca đột quỵ tăng gấp 3 lần so với 10 năm trước
và tỷ lệ nhồi máu cơ tim tăng gấp 6 lần so với những năm 1960. Vì vậy việc nghiên
cứu giải pháp điều trị các bệnh về tim mạch là vấn đề cần thiết.
Tế bào tiền thân nội mô là một loại tế bào gốc đơn năng, có khả năng biệt hóa
thành các tế bào nội mô trưởng thành và có thể chuyển biệt hóa thành tế bào cơ trơn
in vitro. Chúng có vai trò quan trọng trong sự sửa chữa các mạch máu bị tổn thương và
hình thành mạch máu mới. Việc nghiên cứu sử dụng tế bào tiền thân nội mô trong điều
trị các bệnh về tim mạch sẽ mở ra những chiến lược chữa trị mới đầy hứa hẹn. Tế bào
tiền thân nội mô có thể được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau, trong đó máu cuống

rốn người là nguồn cung cấp tế bào dồi dào. Mục đích nghiên cứu này là nhằm thiết
lập phương pháp hiệu quả để thu nhận tế bào tiền thân nội mô từ máu cuống rốn
người.
Đề tài gồm 2 nội dung chính là thu nhận tế bào đơn nhân từ máu cuống rốn
người và nuôi cấy chọn lọc tế bào tiền thân nội mô. Tế bào đơn nhân từ máu cuống rốn
được thu nhận bằng phương pháp ly tâm đẳng tỷ trọng với Ficoll và nuôi cấy chọn lọc
trong 4 môi trường khảo sát: M199 + 15% FBS/KS; M199 + 15% FBS/KS + GF;
EBM-2 + 15% FBS/KS; EBM-2 + 15% FBS/KS + GF. Phương pháp chuyển dịch nổi
sau 3, 6, 9 ngày được sử dụng để đánh giá hiệu quả bám dính, tăng sinh của tế bào ở
các thời điểm chuyển dịch. Số lượng tế bào bám dính vào đĩa nuôi được đếm ở 30 thị
trường ngẫu nhiên và tính trung bình cộng các mẫu. Các số liệu trung bình này được
dùng để so sánh giữa các môi trường nhằm chọn ra môi trường tối ưu cho việc phân
lập tế bào.
Sau khi đã xác định được môi trường nuôi cấy tối ưu (EBM-2 + 15% FBS/KS +
GF), việc nuôi cấy chọn lọc tế bào tiền thân nội mô được tiến hành trong môi trường
này bằng phương pháp chuyển dịch nổi sau 0, 1, 2, 3, 4, 6, 9 ngày. Khi tế bào hấp thụ
hết chất dinh dưỡng và giải phóng các chất thải của quá trình trao đổi chất vào môi
trường, tiến hành thay môi trường mới cho đĩa nuôi. Sau khi tế bào bám trải và tạo
thành lớp tế bào đơn, tiến hành cấy chuyền để tăng số lượng tế bào và cung cấp chất

 

i


dinh dưỡng, không gian cho sự phát triển tế bào. Tế bào tiền thân nội mô được xác
định dựa vào khả năng bám dính, tăng sinh, hình thái và marker bề mặt (CD133+,
CD34+).
Kết quả thu được gồm có EBM-2 + 15% FBS/KS + GF là môi trường giúp cho
sự bám dính tăng sinh tế bào ứng viên tốt nhất trong các môi trường khảo sát; chúng

tôi cũng đã chọn lọc thành công tế bào tiền thân nội mô có khả năng tăng sinh cao
trong môi trường tối ưu và biểu hiện dương tính với các marker chọn lọc.
Chúng tôi kết luận đã thiết lập thành công quy trình thu nhận tế bào tiền thân
nội mô từ máu cuống rốn người trong môi trường tối ưu EBM-2 + 15% FBS/KS + GF
bằng phương pháp chuyển dịch sau 1 ngày.
 

 

ii


SUMMARY
In Vietnam, mortality and morbidity rate caused by cardiovascular diseases is
rather high (1 per 100.000 people). The number of people who die of stroke increases
3 times than it was 10 years ago. In addition, myocardial infarct rate increases 6 times
compared to that in 1960s. Thus, study to facilitate treatment of cardiovascular disease
has been a matter of concern.
Endothelial progenitor cell is a unipotential stem cell which has a capacity for
differentiation to mature endothelial cell and transdifferentiation to smooth muscle cell
in vitro. It plays an essential role in repairing injured vascular and promoting
neovascularization. Investigation of using endothelial progenitor cells will create a
novel and promising strategy for treatment cardiovascular diseases. Endothelial
progenitor cells can be isolated from various sources, among which human umbilical
cord blood is a tremendous source. The aim of this research is to establish a method to
efficiently isolate and culture human umbilical cord blood -derived endothelial
progenitor cells.
At first, mononuclear cells were isolated from human umbilical cord blood by
gradient centrifugation made by Ficoll. Then these cells were cultured on selective
media to isolate endothelial progenitor cells. There were 4 different media 1. M199 +

15% FBS/antibiotic-antimycotic; 2. M199 + 15% FBS/antibiotic-antimycotic + GF; 3.
EBM-2 + 15% FBS/antibiotic-antimycotic; 4. EBM-2 + 15% FBS/antibioticantimycotic + GF. Every 3 day the supernatant was changed, and the number of
attached cells was counted at 30 random fields to estimate the capacity of cell
proliferation. Then, the averages of total samples were used to compare among media
to examine which one is best for cell adhesion and proliferation. The result indicated
the most successfully selective culture of endothelial progenitor cells was the last
medium (EBM-2 + 15% FBS/KS + GF).
We used the identified medium for the next step. We changed supernatant every
0, 24, 48, 72, 96, 144, 216 hrs. When the culture dish reached to 75-80% cell
confluence, cells were harvested using Trypsin/EDTA 0,25% and then cultured in a
defined volume of medium. Endothelial progenitor cells were identified based on their

 

iii


ability to attach to culture dish, to proliferate, and on their morphology and surface
markers.
In summary, human umbilical cord blood-derived endothelial progenitor cells
were isolated successfully in optimal medium EBM-2 + 15% FBS/KS + GF by
changing supernatant after 24h. These cells displayed high potential to proliferate and
express specific markers.
 
 
 
 
 
 
 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 

iv


MỤC LỤC
Bìa chính
Bìa phụ
Lời cảm ơn
Tóm tắt ............................................................................................................................... i
Summary .......................................................................................................................... iii
Mục lục.............................................................................................................................. v
Danh mục các bảng ....................................................................................................... vii
Danh sách các biểu đồ .................................................................................................... viii
Danh mục các chữ viết tắt ................................................................................................ ix
Danh sách các hình........................................................................................................... xi

Danh sách các sơ đồ ........................................................................................................ xii
Chương 1: MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................................. 1
1.2. Yêu cầu....................................................................................................................... 2
1.2.1. Mục tiêu ......................................................................................................... 2
1.2.2. Yêu cầu .......................................................................................................... 2
1.2.3. Ý nghĩa của đề tài .......................................................................................... 2
1.3. Nội dung thực hiện ..................................................................................................... 2
Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................... 4
2.1. Tế bào gốc ................................................................................................................. 4
2.2.1. Định nghĩa...................................................................................................... 4
2.2.2. Phân loại ........................................................................................................ 4
2.2.3. Ứng dụng ....................................................................................................... 5
2.2. Sinh học cuống rốn..................................................................................................... 7
2.2.1. Cấu tạo và sự phát triển cuống rốn ................................................................ 7
2.2.2. Ưu thế sử dụng nguồn tế bào gốc từ máu cuống rốn ..................................... 8
2.3. Tế bào tiền thân nội mô.............................................................................................. 9
2.3.1. Định nghĩa...................................................................................................... 9
2.3.2. Lịch sử nghiên cứu tế bào tiền thân nội mô................................................. 10
2.3.3. Đặc điểm ...................................................................................................... 13

 

v


2.3.4. Nguồn thu nhận............................................................................................ 16
2.3.5. Nuôi cấy EPC............................................................................................... 20
2.3.6. Ứng dụng ..................................................................................................... 22
Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 25

3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu............................................................................ 25
3.1.1. Thời gian ...................................................................................................... 25
3.2.2. Địa điểm nghiên cứu .................................................................................... 25
3.2. Vật liệu ..................................................................................................................... 25
3.2.1. Mẫu vật. ...................................................................................................... 25
3.2.2. Dụng cụ ........................................................................................................ 26
3.2.3. Thiết bị ......................................................................................................... 27
3.2.4. Hóa chất ....................................................................................................... 28
3.3. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................................... 30
3.3.1. Nội dung 1: Thu nhận tế bào đơn nhân từ máu cuống rốn người................ 30
3.3.1. Nội dung 2: Nuôi cấy chọn lọc EPC ............................................................ 32
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................... 39
4.1. Hiệu quả bám dính, tăng sinh tế bào tiền thân nội mô trong môi trường khảo sát .. 39
4.2. So sánh tương quan số lượng tế bào tối ưu trong 4 môi trường .............................. 48
4.3. Khảo sát phương pháp nuôi cấy tối ưu EPC ứng viên trong EGM-2 ...................... 49
4.4. Khẳng định tế bào tiền thân nội mô ứng viên là tế bào tiền thân nội mô ................ 52
Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ........................................................................ 54
5.1. Kết luận .................................................................................................................... 54
5.2. Đề nghị ..................................................................................................................... 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 55
Phụ lục
 
 
 
 
 

 

vi

DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Phân biệt tế bào gốc và tế bào tiền thân ............................................................ 10
Bảng 3.1. Một số dụng cụ được sử dụng trong đề tài........................................................ 26
Bảng 3.2. Một số thiết bị được sử dụng trong đề tài ......................................................... 27
Bảng 3.3. Tỉ trọng các loại tế bào trong máu .................................................................... 32
Bảng 4.1. Trung bình số tế bào bám dính và tăng sinh trong 4 môi trường ...................... 39
Bảng 4.2. So sánh tương quan số lượng tế bào giữa 4 môi trường nuôi cấy .................... 48
Bảng 4.3. Sự tăng sinh EPCs ứng viên qua các ngày nuôi cấy ......................................... 49

 

vii


DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 4.1. Số lượng tế bào EPCs ứng viên bám dính và tăng sinh trong 4 môi trường
tại các thời điểm khảo sát .................................................................................................. 40
Biểu đồ 4.2. So sánh tương quan số lượng tế bào bám dính và tăng sinh trong 4 môi
trường nuôi cấy .................................................................................................................. 48
Biểu đồ 4.3. Sự tăng sinh của EPCs ứng viên qua các ngày nuôi cấy .............................. 51

 

viii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ALDH

Aldehyde dehydrogenase

CEC

Circulating endothelial cell

Tế bào nội mô tuần hoàn

EBM-2

Endothelial basal medium

Môi trường nuôi nội mô cơ bản

EC

Endothelial cell

Tế bào nội mô

ECFC

Endothelial colony-forming cell

Tế bào tạo tập đoàn nội mô

ECGS

Endothelial cell growth supplement

Chất bổ sung tăng trưởng tế bào
nội mô

EGM-2

Endothelial growth medium

Môi trường tăng trưởng nội mô

EPC

Endothelial progenitor cell

Tế bào tiền thân nội mô

ES

Embryonic stem cell

Tế bào gốc phôi

FBS

Fetal bovine serum

Huyết thanh bào thai bò

FGF

Fibroblast growth factor

Nhân tố tăng trưởng nguyên bào
sợi

GF

Growth factor

Nhân tố tăng trưởng

GFP

Green fluorescent protein

GVHD

Graft versus host disease

Bệnh ký chủ chống mảnh ghép

HBV

Hepatitis B virus

Virus viêm gan B

HCV

Hepatitis C virus

Virus viêm gan C

HIV

Human immunodeficiency virus

Virus gây suy giảm miễn dịch
người

HSC

Hematopoietic stem cell

Tế bào gốc tạo máu

HUVEC

Human umbilical vein endothelial

Tế bào nội mô tĩnh mạch cuống

cell

rốn người
Kháng sinh

KS
IGF

Insulin - like growth factor

Nhân tố tăng trưởng giống
insulin

 

L-EPC

Large - endothelial progenitor cell

Tế bào tiền thân nội mô lớn

M199

Medium 199

Môi trường 199

ix


MNC

Mononuclear cell

Tế bào đơn nhân

MOMCs

Monocyte – derived multipotential

Tế bào đa năng thu nhận từ bạch

cells

cầu đơn nhân to

MSC

Mesenchymal stem cell

Tế bào gốc trung mô

PBSA

Phosphate –buffered saline A

rhEGF

Recombinant human epidermal

Nhân tố tăng trưởng biểu mô

growth factor

người tái tổ hợp

SC

Stem cell

Tế bào gốc

SCI

Spinal cord injury

Chấn thương tủy sống

S-EPC

Small - endothelial progenitor cell

Tế bào tiền thân nội mô nhỏ

VEGF

Vascular endothelial growth factor

Nhân tố tăng trưởng nội mô
mạch

 

x


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1. Cấu tạo nhau thai và hệ mạch máu trong cuống rốn ......................................... 7

Hình 2.2. Phân biệt tế bào gốc vả tế bào tiền thân ............................................................ 10
Hình 2.3. Hình thái tế bào tiền thân nội mô ...................................................................... 13
Hình 2.4. Nguồn gốc và định hướng phát triển của EPC .................................................. 15
Hình 3.1. Túi máu TERUFLEXTM .................................................................................... 25
Hình 3.2. Một số dụng cụ sử dụng trong đề tài ................................................................. 26
Hình 3.3. Một số thiết bị được sử dụng trong đề tài.......................................................... 27
Hình 3.4. Minh họa phương pháp chuyển dịch nổi tế bào ................................................ 34
Hình 3.5. Minh họa nguyên tắc kỹ thuật flow cytometry.................................................. 37
Hình 4.1. Tế bào bám dính khi nuôi trong môi trường M199 bổ sung 15% FBS/KS sau
3 ngày trong các giếng ....................................................................................................... 40
Hình 4.2. Tế bào bám dính khi nuôi trong môi trường M199 bổ sung 15% FBS/KS
trong 3 thời điểm khảo sát ở giếng 1, 2, 3 ......................................................................... 42
Hình 4.3. Tế bào bám dính khi nuôi trong môi trường M199 bổ sung 15% FBS/KS +
GF trong 3 thời điểm khảo sát ở giếng 1, 2, 3 ................................................................... 44
Hình 4.4. Tế bào bám dính khi nuôi trong môi trường EBM-2 bổ sung 15% FBS/KS
trong 3 thời điểm khảo sát ở giếng 1, 2, 3 ......................................................................... 45
Hình 4.5. Tế bào bám dính khi nuôi trong môi trường EBM-2 bổ sung 15% FBS/KS +
GF trong 3 thời điểm khảo sát ở giếng 1, 2, 3 ................................................................... 47
Hình 4.6. Sự tăng sinh của EPCs ứng viên theo thời gian nuôi cấy .................................. 50
Hình 4.7. Sự tăng sinh của EPCs ứng viên trước và sau khi cấy chuyền .......................... 51
Hình 4.8. Kết quả phân tích flow cytometry tế bào tiền thân nội mô ứng viên sau khi
thu nhận với 2 marker CD133 và CD34 ............................................................................ 53

 

xi


DANH SÁCH SƠ ĐỒ
Sơ đồ 3.1. Quy trình tổng quát thí nghiệm .................................................................... 30

 

xii


Chương 1. MỞ ĐẦU
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Năm 2004, khoảng 17,1 triệu người chết vì bệnh tim mạch chiếm 29% số tử
vong của cả thế giới, trong đó bệnh nghẽn mạch vành làm chết 7,2 triệu người và 5,7
triệu người chết do đột quỵ (WHO, 2010). Theo WHO, dự đoán đến năm 2030,
khoảng 23,6 triệu người sẽ chết vì các bệnh liên quan đến tim mạch, chủ yếu là do
bệnh tim và đột quỵ. Đây là căn bệnh gây tỷ lệ tử vong hàng đầu trên thế giới. Bệnh do
sự rối loạn chức năng tim và mạch máu làm máu không được cung cấp đủ đến tim, não
và các cơ quan khác, gây nguy cơ thiếu máu cục bộ tại các cơ quan này, dễ dẫn đến tử
vong. Mặc dù y học đã có nhiều tiến bộ trong điều trị nội khoa cũng như ngoại khoa
nhất là những kỹ thuật nong động mạch hoặc giải phẫu bắt cầu mạch vành. Tuy nhiên
cho đến nay, những kỹ thuật này vẫn tốn kém một chi phí lớn, bệnh nhân vẫn phải
dùng thuốc suốt đời và cuối cùng nguy cơ tái hẹp vẫn là điều phải lo ngại.
Sự ra đời của tế bào gốc đã mở ra niềm hy vọng to lớn về khả năng ứng dụng
trong liệu pháp chữa trị bệnh cho con người. Với tiềm năng tự làm mới, tăng sinh
mạnh và có thể biệt hóa thành nhiều loại tế bào có chức năng in vitro khác nhau, tế bào
gốc là nguồn nguyên liệu để sử dụng trong việc chữa trị các căn bệnh hiểm nghèo.
Trong đó, tế bào tiền thân nội mô mặc dù được phát hiện gần đây (Asahara và ctv,
1997) nhưng cũng cho thấy có tiềm năng trong chữa trị các bệnh về mạch máu, đặc
biệt là bệnh lý thiếu máu cục bộ. Sự huy động EPC khi có các tổn thương mạch máu sẽ
góp phần nhanh chóng sửa chữa và tạo mạch máu mới. EPC có khả năng di chuyển
trong hệ tuần hoàn, tăng sinh và biệt hóa thành tế bào nội mô trưởng thành. Chúng là
nguồn tế bào mới được sử dụng trong liệu pháp chữa trị các bệnh lý tim mạch cũng
như trong nghiên cứu hiện nay.

Sau những nghiên cứu gần đây, máu cuống rốn người được khám phá những
giá trị mới đối với khoa học (Hua-xin Duan và ctv, 2006; Zhang L và ctv, 2006).
Nguồn tế bào trong máu cuống rốn dồi dào, có khả năng tăng sinh mạnh và có thể biệt
hóa thành nhiều dạng tế bào khác nhau. Các dòng tế bào có trong máu cuống rốn là
các tế bào gốc và tế bào tiền thân, bao gồm tế bào gốc trung mô, tế bào gốc tạo máu, tế
bào tiền thân nội mô và tế bào gốc thu nhận từ bạch cầu đơn nhân. Tế bào tiền thân nội
1
 
 


mô là quần thể tế bào ưu việt nhất trong máu cuống rốn về tiềm năng sửa chữa và tạo
mạch. Chúng được ứng dụng trong việc cấy ghép lâm sàng trên các bệnh nhân bị bệnh
lý tim mạch, mang lại hiệu quả cao, chữa trị dứt khoát bệnh. Tuy nhiên sự khan hiếm
của quần thể tế bào gốc và đặc biệt là các tế bào tiền thân nội mô trong máu cuống rốn
đã hạn chế đáng kể những khả năng ứng dụng của nó. Do đó, việc thu nhận và nuôi
cấy tăng sinh tế bào gốc thu nhận từ máu cuống rốn ứng dụng trong chữa trị bệnh là
một chiến lược mới đầy hứa hẹn.
Ở Việt Nam, nghiên cứu về tế bào gốc vẫn còn khá mới mẻ, đặc biệt chưa có
báo cáo khoa học nào về tế bào tiền thân nội mô. Trên thế giới hiện có nhiều cách thu
nhận và nuôi cấy tế bào tiền thân nội mô khác nhau bởi vì sự không đồng nhất trong
khái niệm về tế bào tiền thân nội mô. Vì vậy, trong phạm vi đề tài này, chúng tôi tìm
hiểu phương pháp thu nhận và nuôi cấy tế bào tiền thân nội mô hiệu quả nhất nhằm
thu nhận tế bào tiền thân nội mô với số lượng nhiều và sức sống tốt để ứng dụng cho
những nghiên cứu trên mô hình động vật bệnh lí tim mạch hay những nghiên cứu lâm
sàng trên người.
Đây cũng là hướng nghiên cứu phù hợp với sự phát triển khoa học công nghệ,
đặc biệt là lĩnh vực nghiên cứu tế bào gốc cả trong nước và trên thế giới.
1.2. YÊU CẦU CỦA ĐỀ TÀI
1.2.1. Mục tiêu

Xây dựng được quy trình thu nhận và nuôi cấy tăng sinh tế bào tiền thân nội mô
từ máu cuống rốn người đạt hiệu quả cao.
1.2.2. Yêu cầu
- Thu nhận được quần thể tế bào đơn nhân từ máu cuống rốn người.
- Nuôi cấy tăng sinh các tế bào tiền thân nội mô ứng viên.
1.2.3. Ý nghĩa của đề tài
Đề tài có ý nghĩa lớn trong việc khai thác nguồn tế bào tiền thân nội mô từ máu
cuống rốn, góp phần làm giàu nguồn tế bào gốc nội mô.
Đây là bước đi quan trọng tiếp cận liệu pháp tế bào gốc trong điều trị các bệnh
về tim mạch.

2
 
 


1.3. NỘI DUNG THỰC HIỆN
a. Khảo sát sự bám dính và tăng sinh của tế bào tiền thân nội mô ứng viên trong
4 loại môi trường:
- M199 bổ sung 15% FBS/KS
- M199 bổ sung 15% FBS/KS + GF (Growth Factors)
- EBM-2 bổ sung 15% FBS/KS
- EBM-2 bổ sung 15% FBS/KS + GF
Các nhân tố tăng trưởng (growth factors - GF) gồm:
¾

Nhân tố tăng trưởng biểu mô người (Human epidermal growth factor –

hEGF)
¾

Chất bổ sung tăng trưởng tế bào nội mô (Endothelial cell growth

supplement – ECGS)
¾

Nhân tố tăng trưởng nguyên bào sợi người (Human fibroblast growth

factor – FGF)
b. Khảo sát thời gian chuyển dịch nổi để thu nhận quần thể tế bào tiền thân nội
mô biểu hiện dương tính cao với các marker chọn lọc.

3
 
 


Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. TẾ BÀO GỐC
2.1.1. Định nghĩa
Tế bào gốc (SCs_Stem Cells) là những tế bào không (hoặc chưa) chuyên hóa
trong mô sống, chúng có khả năng trở thành các tế bào chuyên hóa với các chức phận
sinh lí. Trong điều kiện in vivo hoặc in vitro, mỗi tế bào gốc có thể tự làm mới với các
tính năng riêng biệt mới. Chẳng hạn, các tế bào gốc tủy xương hoàn toàn chưa được
chuyên hóa, chúng có thể biệt hóa thành các tế bào máu chuyên hóa (tế bào bạch cầu,
tế bào hồng cầu …) và những kiểu tế bào mới này có các chức năng chuyên biệt như
khả năng sản xuất kháng thể, vận chuyển các chất khí … mà trước đó tế bào gốc
không có. Do đó, một kiểu tế bào xuất thân từ một tế bào khác thì tế bào khác đó cũng
có thể được gọi là “tế bào gốc” (Phan Kim Ngọc và ctv, 2009).
Từ tế bào gốc sẽ phát sinh ra nhiều loại tế bào khác nhau tạo nên cơ thể sinh

vật. Chúng có thể phát triển thành tế bào trưởng thành mang đặc điểm hình dạng và
chức năng chuyên biệt, như tế bào cơ tim, da, thần kinh ... Chúng có khả năng phân
chia hoặc tự sao chép trong thời gian dài. Sự sao chép này có thể tiếp tục suốt cuộc đời
sinh vật. Khả năng phân chia và hình thành tế bào khác của chúng gọi là sự biệt hóa,
hoặc “tính mềm dẻo”.
Tế bào gốc có 2 đặc tính quan trọng phân biệt với các loại tế bào khác:
Đó là những tế bào không chuyên hóa có khả năng tự làm mới trong một thời
gian dài nhờ quá trình phân chia tế bào.
Tế bào gốc làm phát sinh những tế bào chuyên biệt với chức phận sinh lý, quá
trình này gọi là sự biệt hóa. Ví dụ như từ các tế bào gốc xương biệt hóa thành các tế
bào máu chuyên hóa như tế bào bạch cầu, tế bào hồng cầu với các chức năng chuyên
biệt như sản xuất kháng thể, vận chuyển chất khí ... mà tế bào gốc không có.
2.1.2. Phân loại
Tế bào gốc có thể được phân loại dựa vào tính mềm dẻo hoặc tính đa năng của
chúng trong quá trình phát triển, gồm: tế bào gốc toàn năng, tế bào gốc vạn năng, tế
4
 
 


bào gốc đa năng, tế bào gốc đơn năng. Nhiều tác giả có cách phân loại khác nhau, hiện
tại tế bào gốc được đề nghị chia thành 5 nhóm chính:
Tế bào gốc phôi: thu nhận từ phôi giai đoạn tiền làm tổ.
Tế bào gốc nhũ nhi: thu nhận từ nhau thai, mô cuống rốn, máu cuống rốn …
Tế bào gốc trưởng thành: thu nhận từ cơ thể trưởng thành.
Tế bào gốc vạn năng cảm ứng: có tiềm năng như là các tế bào gốc phôi.
Tế bào gốc ung thư: được coi là nguồn gốc của khối u và chỉ có trong khối u.
2.1.3. Ứng dụng
2.1.3.1. Cấy ghép tế bào gốc
Mặc dù các tế bào gốc thần kinh nội sinh vẫn có trong não động vật hữu nhũ

nhưng hoạt động tự sửa chữa những vùng bị tổn thương thì không hiệu quả. Việc nuôi
cấy tế bào gốc thần kinh và cấy ghép vào vùng tổn thương có thể khắc phục những hạn
chế này. Do đó, chúng là niềm hy vọng trong việc chữa trị các rối loạn như bệnh
Alzheimer, Parkinson, Huntington, chấn thương tủy sống và đột quỵ.
Chấn thương tủy sống (SCI_Spinal Cord Injury) là một vấn đề y khoa nan giải
vì hiện tại chưa có biện pháp để sửa chữa hệ thần kinh trung ương và phục hồi chức
năng. Tế bào gốc phôi (ES_Embryonic Stem Cells) có những đặc tính rất quan trọng
cho sự sửa chữa cột sống. Sử dụng tế bào ES cho cấy ghép thần kinh vẫn còn khá mới
mẻ và chỉ có vài công trình thành công chứng minh rằng tế bào ES có khả năng sát
nhập vào vùng bị thương của cột sống và biệt hóa theo hướng phù hợp.
Tế bào cơ tim có thể được cấy ghép vào tim người trưởng thành bình thường
hoặc bị tổn thương một cách ổn định. Các nghiên cứu gần đây chứng minh rằng những
tế bào cho được cấy ghép có thể hình thành hợp bào có chức năng như tế bào cơ tim
vật chủ (Rubart và ctv, 2003). Tế bào gốc phôi có thể biệt hóa thành các tế bào cơ tim
có chức năng in vitro; những tế bào cơ tim thu nhận từ tế bào ES sẽ hình thành các
mảnh ghép ổn định trong tim khi được cấy ghép. Vì thế, tế bào ES có thể là nguồn
thích hợp với liệu pháp cấy ghép tế bào nhằm phục hồi lượng cơ tim mất đi khi bị
bệnh tim.
Bỏng và loét da là nguyên nhân chính gây ra tỷ lệ tử vong cao ở cả nước phát
triển và đang phát triển. Tế bào biểu mô đã được sử dụng trong liệu pháp qua nhiều
thập kỷ dưới dạng mảnh ghép da tự thân. Trong 20 năm gần đây, những kỹ thuật nuôi
5
 
 


cấy tế bào tiến bộ đã cho phép sự phát triển các phương pháp nhận dạng và phân lập tế
bào gốc da còn sống, chúng có tiềm năng trong việc chữa trị bỏng và loét da.Tế bào
gốc biểu mô nằm trong lớp nền và được xác định nhờ khả năng tự duy trì và tự làm
mới. Ngoài việc tạo ra nhiều tế bào gốc hơn, tế bào gốc cũng tạo ra các tế bào thay đổi

tạm thời có thể phân chia 3 - 5 lần trước khi tạo ra tế bào sừng biệt hóa in vivo. Hiện
tại, người ta dùng ghép tự thân (autografts) hoặc ghép cùng loài (allografts) để chữa trị
bỏng da.
2.1.3.2. Công nghệ mô
Theo truyền thống, việc tiếp cận phục hồi chức năng mô liên quan đến sự cho
cơ quan. Tuy vậy, vẫn thiếu các mô người cho cấy ghép như tủy xương, tim, thận, gan,
tụy. Hiện nay, hơn 74.000 bệnh nhân ở Mỹ đang chờ được cấy ghép cơ quan, chỉ có
khoảng 21.000 người nhận được cơ quan cấy ghép mỗi năm.
Liệu pháp dựa trên công nghệ mô sẽ là sự lựa chọn để giảm việc thiếu người
cho cơ quan. Tế bào gốc phân lập từ người trưởng thành và phôi đang phát triển hiện
đang là nguồn tế bào cho công nghệ mô. Tuy vậy, chúng đều có những khó khăn liên
quan đến các ứng dụng lâm sàng. Tế bào gốc trưởng thành có thể được phân lập trực
tiếp từ bệnh nhân, chúng lại rất khó để phân lập và tăng trưởng khi nuôi cấy. Tế bào
ES dễ dàng phát triển trong điều kiện nuôi cấy và biệt hóa thành nhiều dạng tế bào,
chúng lại dễ bị loại thải và những tế bào ES không biệt hóa có thể hình thành khối u.
Có 3 hướng tiếp cận trong công nghệ mô: (a) Sử dụng các tế bào được phân lập;
(b) Sử dụng vật liệu không có nguồn gốc tế bào (acellular) có khả năng cảm ứng sự tái
tạo mô; (c) Sử dụng sự kết hợp tế bào và vật liệu (scaffold).
2.1.3.3. Chữa trị bệnh
Với tiềm năng biệt hóa thành các loại tế bào chức năng trong cơ thể, liệu pháp
tế bào gốc là một lựa chọn hứa hẹn cho việc chữa trị bệnh. Từ khi ra đời đến nay, tế
bào gốc đã được ứng dụng rất rộng rãi, nhiều bệnh đã được phục hồi. Các bệnh nan y
khác cũng đang được nghiên cứu nhằm ứng dụng tế bào gốc vào điều trị. Điển hình là
bệnh tiểu đường. Mặc dù insulin được khám phá hơn 75 năm về trước, những biến
chứng bệnh này vẫn còn tạo nên những hệ quả tai hại. Mối tương quan giữa lượng
glucose máu cao và những biến chứng của bệnh võng mạc, bệnh thận, bệnh thần kinh
đã trở nên rất rõ ràng. Con đường để ngăn chặn những biến chứng này là liệu pháp
6
 
 

thay thế những tế bào beta nhờ cấy ghép. Tế bào gốc phôi có khả năng tạo ra bất cứ
dạng tế bào chuyên biệt nào trong cơ thể nên chúng phải có khả năng tạo ra tế bào với
kiểu hình tế bào beta. Phải có sự kết hợp của môi trường với nhân tố tăng trưởng hoặc
biệt hóa mới có thể thực hiện được điều đó. Hiện tại, không có phương pháp nào đơn
giản để đạt được mục tiêu này. Tuy nhiên, các nghiên cứu tiếp theo về tế bào ES hy
vọng sẽ hiểu rõ hơn cơ chế điều khiển sự phát triển của tuyến tụy nội tiết và mục đích
cuối cùng là giúp các nhà nghiên cứu đi đúng hướng.
2.1.3.4 Liệu pháp gen tế bào gốc
Liệu pháp gen có thể được phát huy bằng cách sử dụng tế bào gốc như là một
công cụ vận chuyển sản phẩm gen liệu pháp vào vật chủ thay vì sử dụng vector virus
hoặc tế bào. Hai khiếm khuyết lớn của liệu pháp gen là các rủi ro do hệ thống mang
gen có thể gây ra và sự đáp ứng loại thải miễn dịch. Trong khi đó, tế bào gốc được
phân lập từ chính cơ thể bệnh nhân, được sửa chữa những lỗi di truyền, nuôi cấy tăng
sinh ex vivo rồi cấy ghép trở lại bệnh nhân sẽ tạo ra những tế bào bình thường in vivo.
Sự biến đổi di truyền tế bào gốc được chỉ định để sửa chữa hoặc bù đắp cho các khiếm
khuyết di truyền.
2.2. SINH HỌC CUỐNG RỐN
2.2.1. Cấu tạo và sự phát triển cuống rốn

Hình 2.1. Cấu tạo nhau thai và hệ mạch máu trong cuống rốn
(www.umm.edu/pregnancy/000247.htm)

Cuống rốn người được hình thành vào ngày 26 quá trình mang thai, là sợi dây
liên kết giữa phôi và nhau thai, cung cấp chất dinh dưỡng, oxy… đến thai nhi.
7
 
 

Cấu tạo cuống rốn đơn giản, gồm 2 động mạch và 1 tĩnh mạch, là nguồn dự trữ
chính của máu cuống rốn. Chúng được bao quanh bởi mô nhầy và mô liên kết gelatin
được gọi là chất nhầy Wharton. Năm 1656, Thomas Wharton là người đầu tiên mô tả
cụ thể về chúng. Chất nhầy Wharton được bao bọc trong lớp biểu mô màng ối, có
những đặc tính vật lý giống với đệm polyurethane nhằm bảo vệ đường mạch máu quan
trọng kết nối nhau thai và phôi. Cấu trúc tuy đơn giản nhưng lớp mô liên kết này có
vai trò sinh lý đặc biệt quan trọng nhằm ngăn chặn sự xoắn vặn mạch trong suốt quá
trình vận động của phôi đang phát triển. Vì vậy, hầu hết tế bào của lớp nhầy Wharton
là nguyên bào sợi cơ (Takechi và ctv, 1993), Takechi cũng phỏng đoán rằng chúng có
thể biệt hóa từ những cơ chất trung mô nguyên thủy để đáp ứng với môi trường rung
động trong cuống rốn. Vì vậy, “tế bào nền” đã được tách ra từ chất nhầy Wharton nền cuống rốn, sử dụng nhiều kỹ thuật bao gồm làm nhỏ hoặc tiêu hóa bằng enzyme
mô chất nhầy Wharton (Friedman và ctv, 2007; Lund và ctv, 2007; Wang và ctv,
2004) và nuôi cấy ở môi trường ngoài (Mitchell và ctv, 2003).
Cuống rốn phát triển từ cuống phôi, hệ mạch của rốn phát triển từ tế bào trung
mô trong cuống phôi và ở thành cuống noãn hoàng. Vào ngày thứ 35 – 40, ống noãn
hoàng và niệu nang thoái hóa. Niệu nang được cho là định hướng sự tạo các mạch máu
trong dây rốn.
Gần đây, tế bào gốc đã được phân lập một cách riêng biệt từ tĩnh mạch cuống
rốn và chất nhầy Wharton (McElreavey và ctv, 1991; Naughton và ctv, 1997; Purchio
và ctv, 1999; Romanov và ctv, 2003).
2.2.2. Ưu thế sử dụng nguồn tế bào gốc từ máu cuống rốn
Máu cuống rốn là lượng máu còn lại trong cuống rốn và nhau thai sau khi sinh.
Trong quá khứ, nó được xem như là rác thải y tế và thường bị vứt bỏ. Tuy nhiên, gần
đây, máu cuống rốn đã được chấp nhận rộng rãi như là một nguồn dồi dào nhiều loại tế
bào gốc với các thuận lợi trong việc thu nhận cũng như không vi phạm đạo đức, không
gây nguy hiểm đối với người cho mẫu. Từ khi ca cấy ghép máu cuống rốn đầu tiên
được thực hiện vào năm 1988 cho đứa trẻ bị thiếu máu Fanconi, nó đã trở thành nguồn
an toàn và được chấp nhận cho cấy ghép tế bào gốc tạo máu vì ít có khả năng nhiễm
virus và giảm thiểu trường hợp bệnh vật chủ chống lại mảnh ghép (GVHD_Graft

Versus Host Disease) trong khi cấy ghép tủy xương đòi hỏi sự tương thích mô nghiêm
8
 
 


ngặt giữa người cho và người nhận. Ngoài tế bào gốc tạo máu, trong máu cuống rốn
còn chứa nhiều tế bào gốc khác có tiềm năng biệt hóa thành nhiều dạng tế bào khác
nhau và có thể được sử dụng để sửa chữa những tế bào và mô bị tổn thương trong cơ
thể người.
Giáo sư Hal Broxmeyer, trường đại học Indiana, lần đầu tiên sử dụng cấy ghép
máu cuống rốn như một cách chữa trị bệnh, dựa trên việc sử dụng nguồn nguyên liệu
mà trước kia được xem như là chất thải.
Từ năm 1989, hơn 5000 người với nhiều rối loạn di truyền và ác tính đã nhận
được sự cấy ghép từ máu cuống rốn của tế bào gốc tạo máu và tế bào tiền thân. Từ
những nghiên cứu lâm sàng ban đầu, ngân hàng máu cuống rốn được phát triển rộng
khắp, cho phép mở rộng việc cấy ghép từ người cho có quan hệ họ hàng cho người
không có quan hệ họ hàng, thời gian chờ đợi cho cấy ghép cũng đã được giảm xuống
đáng kể so với trước đây nhờ các mẫu được bảo quản sẵn trong ngân hàng cuống rốn.
2.3. TẾ BÀO TIỀN THÂN NỘI MÔ
2.3.1. Định nghĩa
Thông thường, tế bào gốc tạo ra một loại tế bào trung gian trước khi đạt được
trạng thái biệt hóa hoàn toàn, những tế bào gốc đó được gọi là tế bào tiền thân
(progenitor cell). Tế bào tiền thân được xem là tế bào gốc do nó có khả năng biệt hóa
cho ra nhiều loại tế bào có liên quan với nhau. Ví dụ: tế bào tiền thân dòng tủy có thể
biệt hóa tạo thành nhiều loại tế bào máu như tế bào hồng cầu hay tế bào bạch cầu trung
tính.
Tế bào tiền thân nội mô (EPC_Endothelial Progenitor Cells) là một dạng tế bào
định hướng cho sự hình thành mạch máu sau khi sinh, có trong tủy xương, máu ngoại
vi và máu cuống rốn. Do đó, EPC là tế bào “cho” hứa hẹn trong việc điều trị cơ tim ở

tình trạng nguy hiểm. Sự tái sinh mạch nhờ trung gian EPC được xem là phương pháp
mới để chữa trị bệnh thiếu máu tim cục bộ. Gần đây, máu cuống rốn người được tìm
thấy có chứa lượng lớn tế bào tiền thân nội mô hoặc tế bào tiền thân trung mô. Sự cấy
ghép EPC thu nhận từ máu cuống rốn người có thể dẫn đến việc sửa chữa thành công
mô thiếu máu cục bộ nhờ cải thiện sự lưu thông máu (Patricia Pranke và Raquel
Canabarro, 2009). Điều này cho thấy tính khả thi trong việc sử dụng tế bào máu cuống
rốn người cho liệu pháp tái tạo mạch. Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh rằng tế bào
9