KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG THUỘC Streptomyces VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE
CỦA MỘT SỐ CHỦNG THUỘC Streptomyces
VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: LƯƠNG THỊ YẾN NGUYỆT

Niên khóa

: 2006 – 2010

Tháng 7/2010


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE
CỦA MỘT SỐ CHỦNG THUỘC STREPTOMYCES
VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. NGUYỄN NHƯ NHỨT

LƯƠNG THỊ YẾN NGUYỆT

KS. LÊ HỒNG THỦY TIÊN

Tháng 7/2010


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận này, ngoài sự nổ lực của bản thân là sự chỉ dẫn tận
tình của thầy cô, giúp đỡ của bạn bè và sự động viên khích lệ từ gia đình.
Bằng lòng biết ơn chân thành và sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn đến:
Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ
môn Công Nghệ Sinh Học, cùng Quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt
quá trình học tập tại trường.
ThS. Nguyễn Như Nhứt, người thầy, người anh đã tận tình hướng dẫn, động
viên, giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi để hoàn thành khóa luận này.
Các anh chị trong Công ty Gia Tường – Chi nhánh tỉnh Bình Dương đã giúp đỡ
tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện khóa luận cũng như quá trình làm quen với môi
trường làm việc.
Các bạn lớp CNSH 32 đã cùng làm việc, động viên, chia sẻ và giúp đỡ tôi trong

suốt thời gian học tập vừa qua.
Má, người luôn dõi theo từng bước đi của tôi, cùng mọi người trong gia đình đã
quan tâm, ủng hộ tôi học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Sinh viên thực hiện
Lương Thị Yến Ngyệt

TÓM TẮT
i


Ngày nay, xã hội ngày càng phát triển, mức sống của con người này càng cao. Do
đó, nhu cầu ứng dụng khoa học kỹ thuật vào vào đời sống ngày càng nhiều. Cùng với
sự phát triển của khoa học kỹ thuật nói chung và công nghệ enzyme nói riêng, các chế
phẩm enzyme mà đặc biệt là protease được ứng dụng ngày càng nhiều nhiều vào các
lĩnh vực như: công nghiệp da, công nghệ thực phẩm, công nghiệp sữa, chất tẩy
rửa…Vi sinh vật là nguồn thu nhận protease phong phú và có giá trị nhất. Vì những lý
do trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Khảo sát khả năng sinh tổng hợp protease của một
số chủng thuộc Streptomyces và ứng dụng trong sản xuất”.
Các chủng Streptomyces được xác định khả năng sinh tổng hợp protease. Trong
23 chủng Streptomyces nghiên cứu, chủng St 12 cho hoạt tính protease cao nhất.
Chủng này được nuôi cấy trong môi trường sinh protease dịch thể với các điều kiện
khác nhau để chọn ra điều kiện thích hợp nhất cho sự tổng hợp protease. Hoạt tính
protease và hàm lượng protein được xác định bằng phương pháp Anson và phương
pháp Lowry. Kết quả thu được cho thấy protease đạt hoạt tính cao nhất (0,628 đvht/ml)
tại pH = 5 và sau 7 ngày nuôi cấy. Pepton và sucrose với nồng độ 1 % là nguồn
nitrogen và carbon tốt nhất. Và sự sinh tổng hợp protease cao trong môi trường bổ
sung 5 % MgCl2. Enzyme thu được được tinh sạch sơ bộ bằng cách tủa bằng ethanol
với các tỷ lệ và thời gian khác nhau. Với tỷ lệ Venzyme : Vethanol là 1:3 trong 20 phút hiệu
suất thu hồi hoạt tính đạt tối đa.

SUMMARY

ii


The thesis: “Servey the ability of biosynthesizing protease of some Streptomyces
and application in protease production”.
Nowadays, society’s developing, the masses’s living standard becomes higher with
every passing day. Therefore, the application’s need of science and technology become
much more. Following development of science and technology, enzyme technology,
emzyme products in protease group were applied more and more, such as: bating hides,
food, dairy industry and laundry detergent…Microorganism is plentiful sources to
receive protease. Thus, we carry out this thesis.
Streptomyces strains were assayed protease production. Steptomyces strain St 12
is able to produce the highest activity protease among 23 strains be studied. This strain
cutivated in liquid protease production media and difference conditions to choose
optium condition. Enzyme was assayed by Anson and Lowry method using casein and
albumin as a substrate. The result show that protease production was optimum (0,626
UI/ml) after the incubation of 7 days at pH 5 in shaking culture. 1% pepton and
sucrose were the best nitrogen and carbon sources. In medium adding 5 % MgCl2,
protease production ability was best. Protease was received by enzyme and ethanol
with volume ratio mixing. Activity is maximum efficiency at Venzyme : 3Vethanol in 20
minutes.
Key words: Streptomyces, protease production, culture, enzyme assay.

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. III
TÓM TẮT ................................................................................................................... IV
iii

SUMMARY ................................................................................................................... V
MỤC LỤC ................................................................................................................... VI
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................ X
DANH SÁCH CÁC BẢNG ........................................................................................ XI
DANH SÁCH CÁC HÌNH ........................................................................................ XII
CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU .................................................................................................. 1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................. 1
1.2. Yêu cầu của đề tài..................................................................................................... 2
1.3. Nội dung thực hiện ................................................................................................... 2
CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 3
2.1. Tổng quan về protease .............................................................................................. 3
2.1.1. Giới thiệu chung về protease ................................................................................. 3
2.1.1.1. Định nghĩa .......................................................................................................... 3
2.1.1.2. Cấu tạo ................................................................................................................ 3
2.1.1.3. Chức năng sinh học của protease ....................................................................... 4
2.1.2. Phân loại protease .................................................................................................. 4
2.1.3. Ứng dụng ............................................................................................................... 6
2.1.3.1. Trong sản xuất bột giặt và chất tẩy rửa .............................................................. 6
2.1.3.2. Trong công nghiệp thực phẩm ............................................................................ 6
2.1.3.3. Trong công nghiệp da ......................................................................................... 7
2.1.3.4. Trong các lĩnh vực khác ..................................................................................... 7
2.1.4. Nguồn thu nhận protease ....................................................................................... 7
2.1.4.1. Động vật ............................................................................................................. 7
2.1.4.2. Thực vật .............................................................................................................. 7
2.1.4.3. Vi sinh vật........................................................................................................... 8
2.2. Giới thiệu chung về Streptomyces ............................................................................ 8
2.2.1. Hình thái và phân loại Streptomyces ..................................................................... 8
2.2.1.1. Hình thái ............................................................................................................. 8
2.2.1.2. Phân loại ............................................................................................................. 9

2.2.2. Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên .................................................................. 10
2.2.3. Chu trình đời sống của Streptomyces .................................................................. 10
2.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp protease ở Streptomyces................ 12
iv


2.2.4.1. Thành phần môi trường .................................................................................... 12
2.2.4.2. Điều kiện nuôi cấy ............................................................................................ 13
CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ........................................................ 14
3.1. Thời gian và đại điểm nghiên cứu .......................................................................... 14
3.2. Vật liệu ................................................................................................................... 14
3.2.1. Giống xạ khuẩn.................................................................................................... 14
3.2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị ............................................................................... 14
3.2.2.1. Hóa chất ............................................................................................................ 14
3.2.2.2. Dụng cụ và thiết bị ........................................................................................... 14
3.2.3. Các công thức môi trường ................................................................................... 14
3.2.3.1. Môi trường cấy chuyền và giữ giống ............................................................... 14
3.2.3.2. Môi trường thử khả năng sinh protease ............................................................ 15
3.3.3.3. Môi trường tăng sinh dịch thể .......................................................................... 15
3.3.3.4. Môi trường đếm khuẩn lạc ............................................................................... 16
3.3.3.5. Môi trường nuôi cấy dịch thể sinh tồng hợp protease ...................................... 16
3.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 16
3.3.1. Phương pháp cấy chuyền giữ giống .................................................................... 16
3.3.2. Phương pháp định tính khả năng sinh protease ................................................... 16
3.3.3. Phương pháp tăng sinh ........................................................................................ 17
3.3.4. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc................................. 17
3.3.5. Phương pháp nuôi cấy trên môi trường dịch thể ................................................. 17
3.3.6. Phương pháp thu dịch chiết enzyme.................................................................... 18
3.3.7. Phương pháp xác định hoạt tính protease............................................................ 18
3.3.7.1. Nguyên tắc ........................................................................................................ 18

3.3.7.2. Hóa chất ............................................................................................................ 18
3.3.7.3. Dựng đường chuẩn Tyrosine ............................................................................ 18
3.3.7.4. Xác định hoạt tính enzyme ............................................................................... 19
3.3.7.5. Tính kết quả ...................................................................................................... 19
3.3.8. Phương pháp xác định hàm lượng protein .......................................................... 20
3.3.8.1. Nguyên tắc ........................................................................................................ 20
3.3.8.2. Hóa chất ............................................................................................................ 20
3.3.8.3. Dựng đường chuẩn albumin ............................................................................. 21
v


3.3.8.4. Xác định hàm lượng protein dung dịch mẫu .................................................... 21
3.3.8.5. Tính kết quả ...................................................................................................... 21
3.3.9. Phương pháp xác định khối lượng sinh khối Streptomyces ................................ 21
3.3.10. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp protease ......................... 22
3.3.10.1. Thời gian nuôi cấy .......................................................................................... 22
3.3.10.2. pH ................................................................................................................... 22
3.3.10.3. Nguồn nitrogen ............................................................................................... 22
3.3.10.4. Nguồn carbon ................................................................................................. 22
3.3.10.5. Các loại muối .................................................................................................. 23
3.3.10.6. Vai trò của các thành phần môi trường nuôi .................................................. 23
3.3.11. Phương pháp tinh sạch sơ bộ protease .............................................................. 23
3.3.11.1. Khảo sát tỷ lệ tủa ............................................................................................ 23
3.3.11.2. Khảo sát thời gian tủa ..................................................................................... 23
3.3.12. Xác định hiệu suất thu hồi hoạt tính protease và hàm lượng protein ................ 23
3.3.13. Phương pháp đánh giá khả năng giặt tẩy của enzyme....................................... 24
3.1.14. Sơ đồ nghiên cứu ............................................................................................... 25
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................... 26
4.1. Kết quả .................................................................................................................... 26
4.1.1. Chọn giống .......................................................................................................... 26

4.1.1.1. Định tính khả năng sinh protease của các chủng Streptomyces ....................... 26
4.1.1.2. Thời gian nuôi cấy ............................................................................................ 28
4.1.2. Kết quả ảnh hưởng của một số yếu tố ................................................................. 28
4.1.2.1. pH ..................................................................................................................... 28
4.1.2.2. Nguồn nitrogen ................................................................................................. 29
4.1.2.3. Nguồn carbon ................................................................................................... 30
4.1.2.4. Các loại muối .................................................................................................... 31
4.1.2.5. Vai trò của các thành phần trong môi trường nuôi cấy .................................... 32
4.1.3. Tinh sạch sơ bộ protease ..................................................................................... 33
4.1.3.1. Tỷ lệ tủa ............................................................................................................ 33
4.1.3.2. Thời gian tủa ..................................................................................................... 34
4.1.4. Thử nghiệm chế phẩm protease ........................................................................... 35
4.2. Thảo luận ................................................................................................................ 37
vi


Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................... 40
5.1. Kết luận................................................................................................................... 40
5.2. Đề nghị ................................................................................................................... 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 41
PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DIFP

:

Diisopropyl Fluorophosphate

EDTA :

Ethylenediaminetetraacetic Acid

EGTA :

Ethylene Glycol Tetraacetic Acid

ISP

:

International Streptomyces Project

Kbs

:

Không bổ sung

MT

:

Môi trường

p-CMB :

p-chloromercuribenzoic acid

PMSF :

Phenylmethanesulfonylfluoride

TCA

:

Tricloroacetic Acid

Đvht

:

Đơn vị hoạt tính
vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1 Các bước tiến hành dựng đường chuẩn Tyrosine .......................................... 19
Bảng 3.2 Các bước tiến hành xác định hoạt tính protease ............................................ 19
Bảng 3.3 Các bước tiến hành dựng đường chuẩn Albumin .......................................... 21
Bảng 4.1 Kết quả đường kính vòng phân giải casein của 23 chủng Streptomyces....... 26
Bảng 4.2 Hoạt độ protease sau các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau ................... 28
Bảng 4.3 Hoạt độ protease và sinh khối khi nuôi cấy ở các pH khác nhau ................. 29
Bảng 4.4 Hoạt độ protease và sinh khối với các nguồn nitrogen khác nhau ............... 30
Bảng 4.5 Hoạt độ protease và sinh khối với các nguồn carbon khác nhau................... 31
Bảng 4.6 Hoạt độ protease và sinh khối với các loại muối khác nhau ......................... 31
viii

Bảng 4.7 Các môi trường nuôi cấy khiếm khuyết các thành phần khác nhau .............. 32
Bảng 4.8 pH, hoạt tính protease và sinh khối ở các môi trường khác nhau ................. 33
Bảng 4.9 Hiệu suất thu hồi với các tỷ lệ ....................................................................... 34
Bảng 4.10 Hiệu suất thu hồi hoạt tính và hàm lượng protein..................................................35

DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Cấu trúc không gian của renin ......................................................................... 3
Hình 2.2 Sơ đồ phân loại protease .................................................................................. 5
Hình 2.3 Khuẩn lạc Streptomyces ................................................................................... 8
Hình 2.4 Một số loại bào tử xạ khuẩn............................................................................. 9
Hình 2.5 Sơ đồ chu trình đời sống của Streptomyces coelicolor .................................. 11
Hình 4.1 Biểu đồ đường kính vòng phân giải casein của 23 chủng Streptomyces ....... 27
Hình 4.2 Vòng phân giải casein của một số chủng Streptomyces ................................ 27
Hình 4.2a Vết máu trước và sau thử nghiệm ở khay 1 ................................................. 36
Hình 4.2b Vết máu trước và sau thử nghiệm ở khay 2 ................................................. 36
Hình 4.2c Vết máu trước và sau thử nghiệm ở khay 3 ................................................. 36
Hình 4.2d Vết máu trước và sau thử nghiệm ở khay 4 ................................................. 37

ix


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề
Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật nói chung và công nghệ sản xuất

enzyme và protein nói riêng, các chế phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và
được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, chăn nuôi,

trồng trọt, thủy sản, thú y, y tế…Việc sử dụng enzyme làm tăng hiệu quả đáng kể trong
các ngành sản xuất, đồng thời hạn chế ô nhiễm môi trường nhờ thay thế sử dụng các
loại hóa chất độc hại.
Trong số các enzyme thương mại, protease là enzyme quan trọng nhất và chiếm
đa số với hơn 65% tổng số giá trị các enzyme ứng dụng trong công nghiệp (Jignasha T.
Thumar và Satya P. Singh, 2007). Protease là nhóm các enzyme tham gia xúc tác các
phản ứng thủy phân các phân tử protein thành các peptid hoặc amino acid. Chúng được
ứng dụng nhiều nhất trong một số ngành công nghiệp như: sản xuất các chất tẩy rửa,
thuộc da, trong chế biến thực phẩm, sản xuất thức ăn gia súc, xử lý chất thải…
Protease có thể được thu nhận từ động vật, thực vật, vi sinh vật. Tuy nhiên, nguồn
enzyme từ vi sinh vật là phong phú nhất và có nhiều giá trị kinh tế. Protease có ở hầu hết
các vi sinh vật như: vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn (gồm nhiều loài thuộc các giống
Clotridium, Bacillus, Aspergillus, Penicillium, Streptomyces) và một số loại nấm men.
Vi sinh vật có khả năng sinh sản rất nhanh, khả năng trao đổi chất lớn nên có thể chuyển
hóa một lượng lớn vật chất môi trường và tổng hợp một lượng lớn protease. Vì thế, các
chế phẩm protease trên thị trường có nguồn gốc chủ yếu từ vi sinh vật.
Mặc dù các sản phẩm protease được sản xuất chủ yếu từ nấm và vi khuẩn, nhưng
gần đây xạ khuẩn cũng được nghiên cứu và sử dụng để sản xuất protease. Điển hình là
một số chủng Streptomyces như: S. clavuligerus, S. erythreus, S. griseus, S. Moderatus
và S. rimosus… (Shang-Shyng Yang và Chiou-Mei Lei, 2000). Streptomyces thuộc
nhóm vi khuẩn Gram dương, dạng sợi và được biết nhiều nhất với khả năng tổng hợp
nhiều loại chất kháng sinh và enzyme thủy phân có giá trị thương mại.
Do đó, việc nghiên cứu và sản xuất protease, từ vi sinh vật nói chung và
Streptomyces nói riêng, để phục vụ trong các ngành công nghiệp có ý nghĩa thực tiễn to
1


lớn. Từ ý nghĩa thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Khảo sát khả năng sinh tổng
hợp protease của một số chủng thuộc Streptomyces và ứng dụng trong sản xuất”.
1.2. Yêu cầu của đề tài

Chọn lọc chủng Streptomyces có khả năng sinh tổng hợp protease có hoạt tính
cao nhất trong các chủng Streptomyces do phòng thí nghiệm Công ty TNHH Gia
Tường – Chi nhánh tỉnh Bình Dương cung cấp.
Khảo sát và nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy và thành phần
môi trường đến sự sinh tổng hợp protease của chủng Stretomyces đã chọn, chọn lọc môi
trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy thích hợp để tiến hành nuôi cấy thu nhận protease.
Nghiên cứu các phương pháp tinh sạch protease từ dịch nuôi cấy, chọn lọc
phương pháp tinh sạch cho hiệu suất hoạt tính protease cao nhất.
1.3. Nội dung thực hiện
Định tính khả năng phân giải protein của các chủng Streptomyces nghiên cứu,
chọn lọc sơ bộ một số chủng Streptomyces cho vòng phân giải protein lớn nhất.
Tiến hành nuôi cấy các chủng chọn lọc trên môi trường nuôi cấy sinh protease,
chọn lọc chủng Streptomyces có khả năng sinh tổng hợp protease có hoạt tính cao nhất.
Nghiên cứu một số điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp
protease của chủng Streptomyces đã lựa chọn.
Nghiên cứu ảnh hưởng của một số thành phần môi trường lên khả năng sinh tổng
hợp protease của chủng Streptomyces đã chọn.
Tiến hành nuôi cấy chủng Streptomyces đã lựa chọn trong môi trường nuôi
cấy và điều kiện nuôi cấy thích hợp, nghiên cứu tinh sạch sơ bộ để thu nhận
protease từ dịch nuôi cấy.
Thử nghiệm chế phẩm protease thu được để thủy phân protein có trong vết
máu trên vải.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về protease
2.1.1. Giới thiệu chung về protease
2.1.1.1. Định nghĩa

Protease là nhóm các enzyme thủy phân, tham gia xúc tác các phản ứng cắt liên
kết peptid (-CO-NH-) trong phân tử protein và polypeptide thành các amino acid hoặc
các peptid phân tử thấp.
2.1.1.2. Cấu tạo
Protease là các phân tử protein có khả năng xúc tác thủy phân các liên kết peptid
và có chứa tâm hoạt động trong cấu tạo phân tử. Đây là vị trí gắn với cơ chất trong quá
trình thủy phân. Riêng mỗi loại protease đều có cấu tạo khác nhau, đặc biệt là cấu tạo
của tâm hoạt động vì thế chúng thực hiện những chức năng sinh học khác nhau.
Một ví dụ về cấu tạo phân tử của renin, một protease thuộc nhóm aspartic
protease. Trong cấu tạo, renin có tâm hoạt động nằm sâu trong khe giữa hai thùy
(lobe) tương đồng. Hoạt động thủy phân của tâm hoạt động gồm hai acid aspartic, mỗi
acid aspartic nằm trong mỗi thùy (lobe) của phân tử renin. Một thành phần chính của
tâm hoạt động là một subpocket riêng biệt (S3sp), là điểm đặc trưng của renin và cũng
là duy nhất trong nhóm các aspartate protease (Alan H. Gradman và ctv, 2008).

Hình 2.1 Cấu trúc không gian của renin
(Alan H. Gradman và ctv, 2008).
3


Khác với cấu tạo của renin, tâm hoạt động của các cysteine protease nói chung
thường được cấu tạo bởi bốn pocket (S1, S2, S3 và S1’). S1 là pocket được xác định ít
rõ ràng nhất trong các cysteine protease, thường giữ glutamin của “oxyanion hole”.
Pocket được xác định rõ ràng nhất là S2, chi phối đặc trưng của các gốc kết hợp. Mặc
dù, hầu hết những phần còn lại ở đây đều là kỵ nước, nhưng đôi khi có phần có cực
như glutamic hoặc acid aspartic thì hiện diện ở phần rỗng của cuối pocket. Một trong
những phần còn lại bảo tồn khá cao trong S1’ là tryptophan, được biết với khả năng
tương tác kỵ nước với cơ chất. Các khu vực giàu glycine của các vị trí kết hợp thì biểu
trưng cho S3 (Yogesh A. Sabnis và ctv, 2003).
2.1.1.3. Chức năng sinh học của protease

Protease đóng vai trò quan trọng và cần thiết cho các sinh vật sống. Vì thế, với
những chức năng khác nhau, chúng được tìm thấy ở hầu hết các sinh vật sống. Trong
cơ thể, protease đảm nhận nhiều chức năng như hoạt hóa zymogen, đông máu, phân
hủy sợi fibrin của cục máu đông, hoạt hóa bổ thể, sản xuất hormon, trong thụ tinh và
tiêu hóa thức ăn… Protease hoạt hóa các zymogen bằng cách cắt một liên kết peptid
trong phân tử của chúng làm chúng trở thành các phân tử hoạt động. Ngoài ra, protease
còn tăng sự phân chia tế bào và tổng hợp DNA nên được xem là yếu tố làm phát triển
tế bào bình thường cũng như tế bào ác tính (Hans Neurath và Keneth A. Walsh, 1976).
Ở một số vi sinh vật, các protease ngoại bào giúp phân hủy nguồn cơ chất ngoài môi
trường thành những chất dễ hấp thu mà vi sinh vật có thể sử dụng. Do đó, các vi sinh
vật này có thể sử dụng nhiều nguồn cơ chất giàu protein trong môi trường xung quanh.
Các protease nội bào được xem là có vai trò quan trọng hơn so với các protease ngoại
bào. Chúng thực hiện nhiều chức năng như: phân hủy các peptid đưa từ môi trường
vào thành các amino acid để sử dụng và đồng thời cũng loại bỏ một số peptide gây độc
cho tế bào, phân hủy các protein tổng hợp sai, tham gia vào quá trình tự chết của tế bào…
2.1.2. Phân loại protease (A. Sumantha và ctv, 2006)
Protease là một nhóm lớn, phức tạp và có các đặc tính khác nhau như tính đặc hiệu
cơ chất, vị trí hoạt động cũng như cơ chế xúc tác, nhiệt độ và pH tối ưu, sự ổn định…
Nét đặc trưng của các enzyme thủy phân protein là chúng phụ thuộc vào bản chất của
các amino acid và các nhóm chức khác có liên kết với những liên kết bị thủy giải.

4


Theo sự phân loại của Ủy ban enzyme (Enzyme Commission, EC), protease
thuộc nhóm 3 (hydrolase, EC 3), phân nhóm 4 (thủy phân các liên kết peptide, EC
3.4). Protease có thể được chia thành hai nhóm chính: exopeptidase và endopeptidase.
Exopeptidase được chia thành hai nhóm nhỏ dựa trên vị trí tác động trên mạch
polypeptide. Aminopeptidase xúc tác phản ứng thủy phân liên kết peptid ở đầu C-. Và
carboxypeptidase: xúc tác phản ứng thủy phân liên kết peptid ở đầu N-.

Endopeptidase được chia thành 4 nhóm dựa trên tâm hoạt động và tính nhạy cảm với
các chất ức chế khác nhau. Aspartic protease hay carboxyl protease (EC 3.4.23) chứa
aspartate hoặc cysteine ở tâm hoạt động và bị ức chế bởi pepstatin. Cysteine protease hay
thiol protease (EC 3.4.22) chứa aspartate hoặc cysteine ở tâm hoạt động và bị ức chế bởi
indoacetamide, p-chloromercuribenzoic acid (p-CMB). Metallo protease (EC 3.4.24) chứa
phenylalanine hoặc leucine ở tâm hoạt động và bị ức chế bởi các chất
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA)…
Serine protease (EC 3.4.21) chứa serine hoặc histidine và aspartate ở tâm hoạt động, bị ức
chế bởi các chất phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF), Diisopropyl fluorophosphate
(DIFP), EDTA, indole, phenol, triamino acetic acid, các dung dịch đệm phosphate.

Hình 2.2 Sơ đồ phân loại protease.
5


Protease cũng được phân biệt dựa vào sự có mặt hay vắng mặt của các nhóm tích
điện ở những vị trí nhạy cảm và cũng được phân loại dựa vào một số cách như: nơi hiện
diện (có protease ngoại bào và protease nội bào), pH tối ưu (có các protease acid, trung
tính hay kiềm), sự đặc hiệu về cơ chất (có collagenase, keratinase, elastase…), dựa vào
nguồn thu nhận protease (có protease động vật, protease thực vật và protease vi sinh vật.
2.1.3. Ứng dụng
Protease là enzyme rất đa dạng về chức năng, có nhiều ứng dụng quan trọng
thuộc lĩnh vực công nghệ sinh học. Chúng là một trong 3 nhóm enzyme công nghiệp
lớn nhất và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: sản xuất các chất tẩy rửa, công
nghiệp da, công nghiệp thực phẩm…
2.1.3.1. Trong sản xuất bột giặt và chất tẩy rửa
Protease nói chung và protease kiềm nói riêng là thành phần quan trọng không thể
thiếu trong các chất tẩy rửa. Chúng có mặt ở hầu hết các chất tẩy rửa như kem đánh
răng, thuốc tẩy kính, bột giặt… Việc sử dụng protease trong thành phần bột giặt đã có
lịch sử gần 100 năm và là loại chất tẩy rửa sử dụng nhiều protease nhất (Nguyễn Tiến

Thắng, 2008). Các chất tẩy rửa có protease sẽ tẩy dễ dàng các vết bẩn, đặc biệt loại bỏ
dễ dàng vết máu từ vải cotton (Mohsen Fathi Najafi và ctv, 2005). Các loại protease bổ
sung vào chất tẩy rửa thường có tính đặc hiệu cơ chất rộng để có thể tẩy sạch nhiều loại
chất bẩn có nguồn gốc khác nhau. Ngoài protease, người ta còn bổ sung vào thành phần
bột giặt nhiều loại enzyme khác như: cellulase, lipase… Enzyme sử dụng trong sản xuất
bột giặt thường ở dạng hạt chứa 0,1 – 2 đơn vị Anson (Nguyễn Tiến Thắng, 2008).
2.1.3.2. Trong công nghiệp thực phẩm (A. Sumantha và ctv, 2006)
Protease được sử dụng trước nhất trong ngành công nghiệp sữa như renin, pepsin,
là yếu tố đông tụ sữa trong sản xuất phó mát, sữa đông tụ. Ngoài ra, protease được ứng
dụng rộng rãi trong các ngành chế biến thực phẩm khác như: sản xuất nước mắm,
tương, chao… Một số sản phẩm protease sử dụng trong công nghiệp thực phẩm như:
Alcalase®, Neutrase®, Esperase®, Protamex™ và Novozym® FM. Những protease có
nguồn gốc vi sinh vật này được sử dụng để cải thiện dinh dưỡng và mùi vị của những
thức ăn giàu protein. Chúng có tác dụng làm mềm thịt, dậy mùi phó mát, cải thiện kết
cấu bột, hương vị và màu sắc của bánh qui.

6


2.1.3.3. Trong công nghiệp da
Trong công nghiệp da, protease được sử dụng để loại bỏ lông, làm mềm da nhờ
thủy phân collagen của da, thành phần làm cho da bị cứng. Quá trình thủy phân này
phải được kiểm soát để tránh làm ảnh hưởng đến chất lượng da. Trong đó, quá trình
tẩy lông được thực hiện trong khoảng pH từ 8-10 (Mohsen Fathi Najafi và ctv, 2005).
Protease sử dụng trong công nghiệp chế biến da gồm: protease tuyến tụy, protease
acid, trung tính, kiềm từ vi khuẩn và nấm mốc, papain và bromelain từ thực vật
(Nguyễn Tiến Thắng, 2008). Thông thường các phương pháp thuộc da trước đây
thường dùng các hóa chất độc hại như natri sulfide, làm ảnh hưởng rất nghiêm trọng
đến môi trường. Việc sử dụng enzyme protease thay thế cho phương pháp sử dụng các
hóa chất truyền thống đã làm tăng chất lượng da, đồng thời làm giảm lượng hóa chất

độc hại thải ra ngoài môi trường (P. Mitra và P. K. Chakrsbartty, 2005).
2.1.3.4. Trong các lĩnh vực khác
Protease còn được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác như: dùng để sản
xuất môi trường dinh dưỡng nuôi vi sinh vật và sản xuất huyết thanh miễn dịch (Đồng
Thị Thanh Thu, 1996), trong y học, xử lý phim X-quang đã qua sử dụng để thu hồi
bạc, làm thức ăn gia súc, dùng trong các loại mỹ phẩm để loại bỏ các tế bào già
(Mohsen Fathi Najafi và ctv, 2005)… Sản phẩm protease thương mại Clear-Lens Pro®
của Novozymes (Đan Mạch) là thành phần của các chất rửa kính sát tròng
(A. Sumantha và ctv, 2006).
2.1.4. Nguồn thu nhận protease
2.1.4.1. Động vật
Protease có thể được thu nhận từ tuyến tụy của động vật, đây là nguồn thu nhận
enzyme sớm nhất. Được thu nhận từ ngăn thứ tư của dạ dày bê, renin là loại protease
được ứng dụng từ rất sớm và phổ biến trong công nghệ sản xuất phó mát nhờ
khả năng đông tụ sữa.
2.1.4.2. Thực vật
Bromelin, Papain và Ficin là 3 loại protease được thu nhận từ thực vật. Bromelin
được thu từ quả và chồi của cây dứa. Chúng có nhiều ở phần chồi trên quả. Papain là loại
enzyme được thu từ nhựa của lá, thân và quả đu đủ. Trong thành phần quả đu đủ có 2
thành phần protease chiếm khối lượng lớn là papain và chymopapain. Những enzyme này
7


được ứng dụng nhiều trong công nghệ làm mềm thịt. Từ dịch ép lá và thân của cây sung
(Ficus glomerata), người ta thu được một loại protease có tính chất giống papain là ficin.
2.1.4.3. Vi sinh vật
Trong các nguồn thu nhận protease thì vi sinh vật là nguồn thu nhận protease đầy
hứa hẹn để ứng dụng trong công nghiệp. Vì chúng có khả năng tổng hợp được nhiều
loại protease với số lượng lớn. Một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp protease cao
như: Bacillus subtilis, Streptomyces griseus, Aspergillus oryzae.

2.2. Giới thiệu chung về Streptomyces
2.2.1. Hình thái và phân loại Streptomyces
2.2.1.1. Hình thái
Streptomyces là chi được nghiên cứu và mô tả nhiều nhất trong các giống xạ
khuẩn. Điển hình là vào tháng 5 năm 2002, Bentley SD và ctv công bố đã giải mã
thành công bộ gen của Streptomyces coelicolor. Đại diện của các chi này thường có
khuẩn ty khí sinh và khuẩn ty cơ chất phát triển phân nhánh. Đường kính sợi xạ khuẩn
khoảng 1 – 10 µm, khuẩn lạc thường không có đường kính lớn, khoảng 1 – 5 mm.
Khuẩn lạc chắc, dạng da đâm sâu vào cơ chất. Bề mặt khuẩn lạc thường phủ bởi khuẩn
ty khí sinh dạng nhung dày hơn cơ chất, đôi khi có tính kỵ nước. Màu sắc của khuẩn
lạc và hệ sợi khí sinh cũng rất khác nhau tùy theo nhóm Streptomyces, màu sắc này
cũng có thể biến đổi khi nuôi cấy trên môi trường khác nhau (Bùi Thị Hà, 2008).

Hình 2.3 Khuẩn lạc Streptomyces.
(Nguồn: Phòng thí nghiệm Công ty TNHH Gia Tường).
8


Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản vô tính bằng cách sinh bào tử. Bào tử được
hình thành trên cuống sinh bào tử. Cuống sinh bào tử có các hình dạng khác nhau: thẳng,
cong, xoắn lò xo… Bào tử được hình thành từ cuống sinh bào tử theo 2 kiểu: phân đoạn
và cắt khúc. Bào tử xạ khuẩn có hình bầu dục, hình lăng trụ, hình cầu với đường kính
khoảng 1,5 μm. Màng bào tử có thể nhẵn, gai, khối u, nếp nhăn... tùy thuộc vào loài xạ
khuẩn và môi trường nuôi cấy (Bùi Thị Hà, 2008; Đoàn Kim Thuận, 2007).

Hình 2.4 Một số loại bào tử xạ khuẩn. (a) Bào tử có màng nhẵn;(b) Bào tử có màng khối
u;(c) Bào tử có màng gai; (d) Bào tử có màng nhăn (Alma Dietz và Jonh Mathews, 1971).
2.2.1.2. Phân loại
Theo tổ chức Global Biodiversity Information Facility thì Streptomyces được
phân loại như sau:

Giới

:

Bacteria (vi khuẩn)

Ngành

:

Actinobacteria (khuẩn tia)

Lớp

:

Actinobacteria

Bộ

:

Actinomycetales

Họ

:

Streptomycetaceae

Giống

:

Streptomyces
9


Qua nhiều năm, sự phân loại này đã được nghiên cứu và thảo luận bởi vì sự đa
dạng và chu trình sống phức tạp của xạ khuẩn. Các cá thể được đưa vào trong lớp này
được dựa trên sự đặc điểm hóa phân loại, chúng có hàm lượng G + C cao và có trình tự
RNA 16S tương đồng.
Bằng phương pháp phân loại số (Numerical taxonomy) người ta chia xạ khuẩn
chi Streptomyces thành 2 nhóm lớn, 37 nhóm nhỏ và 13 cụm với những đại diện nhất
định (Bùi Thị Hà, 2008).
Dựa vào hình dạng bề mặt màng bào tử, Alma Dietz và John Mathews (1971)
chia Streptomyces thành 5 nhóm: màng bào tử nhẵn, gai, khối u, nhăn và nhóm màng
bào tử có nhiều sợi như tóc.
2.2.2. Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên
Xạ khuẩn (Actinobacteria) thuộc nhóm vi khuẩn Gam dương, phân bố rất rộng rãi
trong tự nhiên. Chúng có trong đất, nước, rác, phân chuồng, các cây chết, thậm chí
trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được. Trong mỗi gam đất, nói
chung thường có trên một triệu xạ khuẩn. Xạ khuẩn thường hoại sinh nhưng có thể kí
sinh trên thân cây, gây bệnh ở củ và rễ cây. Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào
các yếu tố như: khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác, thảm thực vật… và phụ
thuộc nhiều vào pH của môi trường. Chúng có nhiều trong các lớp đất trung tính và
kiềm yếu hoặc acid yếu nhưng rất ít trong các lớp đất kiềm và acid. Có khả năng sử
dụng nhiều hợp chất hữu cơ làm nguồn carbon duy nhất. Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là
25 - 35 oC, pH tối ưu là 6,5 - 8,0 (Bùi Thị Hà, 2008).
Xạ khuẩn có thể được phân lập từ nhiều loại đất khác nhau, nước và bùn cửa

sông. Trong đó, có đến 90% xạ khuẩn được phân lập từ đất thuộc nhóm Streptomyces
(M. Anupama và ctv, 2007). Xạ khuẩn có khả năng tổng hợp nhiều hợp chất có hoạt
tính sinh học như chất kháng ký sinh, chất kháng ung thư, các enzyme, các kháng sinh,
các chất dùng trong nông nghiệp, các chất ức chế miễn dịch. Có tới 80% tổng số các
sản phẩm kháng sinh hiện được biết trên thế giới có nguồn gốc từ xạ khuẩn (Kavitha
and M. Vijayalakshmi, 2007). Ngoài ra, một số ít xạ khuẩn kỵ khí hoặc vi hiếu khí có
thể gây ra các bệnh cho người, cho động vật và cho cây trồng.
2.2.3. Chu trình đời sống của Streptomyces
Từ một bào tử đơn (spore) nẩy mầm thành sợi có chứa nhiều nhiễm sắc thể
(germinating spore). Sợi này kéo dài và phân nhánh đi vào môi trường dinh dưỡng gọi
10


là khuẩn ty cơ chất (vagetative mycelium). Hệ khuẩn ty này tăng trưởng theo cấp số
mũ. Chúng ngày càng cắm sâu vào bên trong môi trường để sử dụng các chất dinh
dưỡng dễ hấp thu có sẵn hoặc nhờ vào các enzyme ngoại bào phân giải các cơ chất khó
hấp thu. Khả năng vận động của hệ khuẩn ty cơ chất của Streptomyces là một lợi thế
lớn của chúng so với các loài vi khuẩn ít vận động hơn khi chúng chiếm hữu các cơ
chất rắn trong đất. Đáp ứng các điều kiện thích hợp, người ta tin rằng bao gồm cả việc
cạn kiệt nguồn dinh dưỡng của môi trường xung quanh như oxygen, các sợi phát triển
phá vỡ rào cản bề mặt và thành hệ khuẩn ty khí sinh (aerial hyphae) để hấp thụ nguồn
oxygen trong không khí. Hệ khuẩn ty khí sinh này kéo dài liên tục nhờ tận dụng dưỡng
chất của hệ khuẩn ty cơ chất. Khi sự phát triển của khuẩn ty khí sinh dừng lại thì chúng
trải qua giai đoạn phân ngăn ở các đầu mút của sợi, tạo thành các ngăn chứa cùng các
gen giống nhau gọi là tiền bào tử. Các ngăn này sau đó sẽ phát triển thành bào tử gọi là
ngoại bào tử và được gắn với nhau thành chuỗi khoảng 50 bào tử (spore chain). Các
bào tử sau đó sẽ chuyển sang màu xám khi trưởng thành. Các bào tử trưởng thành sau
đó sẽ được phát tán và bắt đầu một chu trình sống mới. Không giống với nội bào tử
của các vi khuẩn Gram dương khác, ngoại bào tử Streptomyces không có sức đề kháng
với nhiệt độ cũng như pH và ở trạng thái ngủ ngắn hơn, tuy nhiên, chúng có tính kháng

tốt khi làm khô.

Hình 2.5 Sơ đồ chu trình đời sống của Streptomyces coelicolor
( />du-ction_to_Streptomyces).
11


2.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp protease ở Streptomyces
Qua kết quả đã công bố của các tác giả đã nghiên cứu về Streptomyces trước đây,
cho thấy có nhiều yếu tố ảnh đến sự sinh tổng hợp protease ở Streptomyces như: thành
phần môi trường và điều kiện nuôi cấy.
2.2.4.1. Thành phần môi trường
Các chủng Streptomyces được nuôi cấy ở các môi trường khác nhau thì hoạt tính
của protease cũng khác nhau trong cùng điều kiện nuôi cấy. Theo nghiên cứu của
Jignasha T. Thumar và Satya P. Singh (2007), khi nuôi cấy chủng Streptomyces
clavuligerus trên các môi trường khác nhau nhưng cho hoạt tính protease cao nhất trên
môi trường gelatin broth.
Ảnh hưởng của nguồn nitrogen
Trong các thành phần môi trường, nguồn nitrogen là yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến sự
sinh tổng hợp protease ở Streptomyces vì nó vừa là nguồn cung cấp nitrogen và vừa là
chất cảm ứng cho sự tổng hợp protease. Nghiên cứu của G. Vothotini và ctv (2008), trên
Streptomyces roseiscleroticus cho thấy hoạt tính protease cao nhất với nguồn nitrogen là
cao thịt bò so với các nguồn nitrogen gen khác như cao men, casein, pepton hay KNO3.
Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Jignasha T. Thumar và Satya P. Singh (2007), pepton và
gelatin thì thích hợp cho sự tổng hợp protease của Streptomyces clavuligerus.
Ảnh hưởng của nguồn carbon
Nguồn carbon cũng ảnh không nhỏ đến sự tổng hợp protease. Các nguồn carbon
thường sử dụng trong nuôi cấy Streptomyces trong môi trường dịch thể như: glucose,
sucrose, xylose, lactose, maltose, tinh bột tan. Sucrose cho thấy là nguồn carbon cho
hoạt tính protease cao nhất khi nuôi cấy Streptomyces clavuligerus theo nghiên cứu

của Jignasha T. Thumar và Satya P. Singh (2007).
Ảnh hưởng của các loại khoáng
Tuy cho vào môi trường nuôi cấy với lượng rất ít nhưng các chất khoáng rất quan
trọng tới sự sinh trưởng và tổng hợp protease của Streptomyces. Theo nhiều nghiên
cứu trước đây, các loại khoáng khác nhau với các nồng độ khác nhau thì cho khả năng
sinh tổng protease khác nhau. Theo D. S. Chahal và S. K. Nanda (1975), môi trường
nuôi cấy có thêm MgSO4.7H2O 0,05%, MnCl2 0,001%, FeCl3 0,001% cho hoạt tính
protease cao hơn khi cho thêm riêng lẻ mỗi loại.
12


2.2.4.2. Điều kiện nuôi cấy
Các điều kiện nuôi cấy như: pH ban đầu, nhiệt độ và thời gian nuôi cấy… khác
nhau, đều ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của Streptomyces.
Ảnh hưởng của pH
Theo nghiên cứu của Jignasha T. Thumar và Satya P. Singh (2007), khi nuôi cấy
trong môi trường có pH ban đầu là 9 thì chủng Streptomyces clavuligerus cho hoạt tính
protease cao nhất. Trong khi, ở các môi trường có pH ban đầu là 7, 8 và 10 thì lại cho
hoạt tính protease thấp hơn. Trong quá trình nuôi cấy, do quá trình trao đổi chất giữa vi
sinh vật và môi trường, pH có thể sẽ dịch chuyển về acid hoặc kiềm, và điều này có thể
ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp protease.
Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Ở mỗi thời điểm nuôi cấy khác nhau, hoạt tính protease được tổng hợp cũng khác
nhau. Cũng theo nghiên cứu của Jignasha T. Thumar và Satya P. Singh (2007), thời
gian nuôi cấy thích hợp nhất cho sự tổng hợp protease của Streptomyces clavuligerus
là 110 giờ. Theo thời gian nuôi cấy, hoạt tính protease tăng dần và cao nhất sau 110
giờ rồi giảm dần.

13

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian: từ tháng 2 đến cuối tháng 6 năm 2010.
- Địa điểm: đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công ty TNHH
Gia Tường – Chi nhánh tỉnh Bình Dương.
3.2. Vật liệu
3.2.1. Giống xạ khuẩn
Các chủng Streptomyces (23 chủng): St 01, St 02, St 03, St 04, St 05, St 06, St 07,
St 08, St 09, St 10, St 11, St 12, St 13, St 14, St 17, St 18, St 19, St 20, St 21, St 22, St
32, St 33, St 34 do phòng thí nghiệm Công ty TNHH Gia Tường – Chi nhánh tỉnh
Bình Dương cung cấp.
3.2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
3.2.2.1. Hóa chất
Một số hóa chất thông dụng như: glucose công nghiệp, agar, tinh bột tan, casein,
sucrose, xylose, pepton, cao men, KH2PO4, KNO3, NaCl, FeSO4.7H2O, Na2HPO4, HCl...
3.2.2.2. Dụng cụ và thiết bị
- Các dụng cụ thông thường của phòng thí nghiệm vi sinh, sinh hóa: ống nghiệm,
erlen, becher, bình định mức, đĩa Petri.
- Các thiết bị: nồi hấp, máy ly tâm, cân điện tử, máy đo mật độ quang, máy lắc,
máy đo pH, máy vortex.
3.2.3. Các công thức môi trường
3.2.3.1. Môi trường cấy chuyền và giữ giống Streptomyces
ƒ Môi trường PGA (MT2)
Khoai tây

200 g

Glucose

20 g

Agar

24 g

Nước cất vừa đủ

1000 ml

(Khoai tây nấu lấy dịch chiết)

14