KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG KHÁNG SINH HỌ TETRACYCLINE VÀ AMOXICILLINE TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI TRÊN ĐỊA BÀN TP HỒ CHÍ MINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG KHÁNG SINH HỌ
TETRACYCLINE VÀ AMOXICILLINE TRONG THỨC ĂN
CHĂN NUÔI TRÊN ĐỊA BÀN TP HỒ CHÍ MINH
BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

Họ và tên sinh viên : LÂM THỊ THẢO MY
Ngành: CÔNG NGHỆ HĨA HỌC
Niên khóa : 2006 – 2010

Tháng 09/2010 
i 
 


KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG KHÁNG SINH HỌ TETRACYCLINE VÀ
AMOXICILLINE TRONG THỨC ĂN CHĂN NI TRÊN ĐỊA BÀN
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

Tác giả

LÂM THỊ THẢO MY

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng kĩ sư ngành
Cơng Nghệ Hóa Học

GVHD :

Th.S Phùng Võ Cẩm Hồng
Th.S Nguyễn Lê Kiều Thư

Tháng 09 năm 2010
i 
 


LỜI CẢM TẠ
Tôi xin chân thành cảm ơn:
-

Ban giám hiệu trường Đại Học Nơng Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều
kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập.

-

Các Thầy Cơ trong bộ mơn Cơng Nghệ Hóa Học đã chỉ bảo, hướng dẫn tôi.

-

Các ThS. Phùng Võ Cẩm Hồng, Th.S Nguyễn Lê Kiều Thư đã trực tiếp hướng
dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp.

-

Các anh chị tại Trạm Chẩn đoán- Xét nghiệm và Điều trị( Chi Cục Thú Y Tp
Hồ Chí Minh) đã ln tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tơi.

-

Tồn thể các bạn trong lớp DH06HH đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong
suốt thời gian làm đề tài.

Con thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những người thân trong gia đình ln tạo điều kiện
và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trường.
Chân thành cảm ơn.
Tháng 09 năm 2010
Lâm Thị Thảo My

ii 
 


TÓM TẮT
Đề tài: “ Khảo sát hàm lượng kháng sinh họ tetracycline và amoxicilline trong
thức ăn chăn nuôi trên địa bàn TP HCM bằng phương pháp HPLC” được tiến hành tại
Phịng phân tích dược thuộc Bộ mơn Hóa lý- Trạm Chẩn đoán, xét nghiệm và điều trị
(Chi Cục Thú Y Tp Hồ Chí Minh), thời gian từ tháng 3/2010 đến tháng 8/2010.
Những kết quả đạt được:
•

Phân tích hàm lượng kháng sinh họ tetracycline:

-

Thiết bị sử dụng : hệ thống HPLC- UV VIS bước sóng 355 nm, dùng cột

Synergy 4u, C18, 15 cm x 4,6 mm và cột Synergy 5u, C18, 15 cm x 4,6 mm.
-

Áp dụng theo quy trình đã công bố của Bộ NN & PTNT (2006).

-

Đường chuẩn được dựng ở nồng độ từ 5 ppm đến 50 ppm.

-

LOD của kháng sinh OTC là 0,2 ppm, CTC là 0,3 ppm.

-

Hiệu suất thu hồi R của OTC từ 88,69% đến 100,34%; CTC có hiệu suất

thu hồi từ 53,133% đến 101,89%.
-

Tiến hành phân tích 61 mẫu thức ăn chăn ni, kết quả có 55,74% mẫu

thức ăn dương tính với CTC với hàm lượng từ 12,33 ppm đến 538,17 ppm. Có
34,43% mẫu vượt qua khỏi giới hạn cho phép, vượt từ 1,16 đến 10,76 lần so với
giới hạn tối đa quy định. Có 52,46% mẫu dương tính với OTC với hàm lượng
từ 8,84 ppm đến 860,71 ppm , trong đó 24,59% mẫu vượt qua mức quy định
cho phép, vượt từ 1,17 lần đến 17,21 lần so với giới hạn tối đa quy định.
•

Phân tích hàm lượng kháng sinh AMO:

-

Thiết bị sử dụng: hệ thống HPLC - FL bước sóng Ex: 358 nm, Em: 440 nm,

dùng cột Zorbax 5u, C18, 25 cm x 4,6 mm.
-

Áp dụng theo quy trình đã cơng bố của đại học Ghent, Bỉ (2006).

-

Đường chuẩn được dựng ở nồng độ từ 0,2 ppm đến 2 ppm.

-

LOD của kháng sinh AMO là 0,1 ppm.

-

Hiệu suất thu hồi R của mẫu từ 65,94% đến 129,6%.

-

Tiến hành phân tích 61 mẫu thức ăn chăn ni, kết quả có 24,59% mẫu thức

ăn dương tính với AMO với hàm lượng từ 16,40 ppm đến 368,33 ppm, vượt gấp
16,4 đến 368,33 lần so với khuyến cáo sử dụng của EU.
iii 
 

SUMMARY
Topic:“Quantitative investigation of amoxicilline and tetracycline antibiotics in
animal feed at HCM City using HPLC" was conducted at Pharmaceutical Analysis
Room, The genres of of physiochemistry - Diagnostic Station, Testing and Treatment
(Department of Veterinary Ho Chi Minh), from March 2010 to August 2010.
The results were achieved:
• Quantitative analysis of tetracycline antibiotics:
- Equipment: HPLC-UV-VIS system, wavelength: 355 nm, Synergy 4u column,
C18, 15 cm x 4,6 mm and Synergy 5U column, C18, 15 cm x 4.6 mm.
- To apply by Ministry of Agriculture and Rural Development (2006).
- The directrix has been from 5 ppm to 50 ppm.
- LOD of the method: OTC has been 0,2 ppm, CTC has been 0,3 ppm.
- The performance of recovery: OTC has been from 88,69% to 100,34%; CTC
has been from 53,133% to 101,89%.
- Quantitive analysis of 61 samples, 55,74% samples was positive for CTC with
content from 12,33 ppm to 538,17 ppm, 34.43% of the samples overcame
beyond the permitted limits from 1.16 to 10.76 times.52,46% samples was
positive for OTC with content from 8,84 ppm to 860,71 ppm, 24,59% of the
samples overcame beyond the permitted limits from 1,17 to 17,21 times.
• Quantitative analysis of AMO:
- Equipment: HPLC- FL system - Ex: 358 nm, Em: 440 nm, Zorbax 5U
column, C18, 25 cm x 4,6 mm.
- To apply by Ghent University, Belgium (2006).
- The directrix has been from 0,2 ppm to 2 ppm.
- LOD of the method has been 0,1 ppm.
- The performance of recovery has been from 65,94% to 129,6%.
- Quantitive analysis of 61 samples, resulting in 24,59% samples was positive
for AMO with content from 16,40 ppm to 368,33 ppm, was overcome from
16,4 to 368,33 times when we compared with the recommended use of the EU.
iv 

 


MỤC LỤC
Trang
Trang tựa

i

Cảm tạ

ii

Tóm tắt

iii

Summary

iv

Mục lục

v

Danh sách các chữ viết tắt

vii

Danh sách các hình

viii

Danh sách các bảng

ix

Danh sách các biểu đồ và sơ đồ

x

CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU

1

1.1.Đặt vấn đề

1

1.2.Mục đích đề tài

2

1.3.Nội dung đề tài

3

1.4.Yêu cầu

3

CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN

4

2.1.Kháng sinh

4

2.1.1.Giới thiệu chung về kháng sinh

4

2.2.1.1.Khái niệm

4

2.2.1.2.Sử dụng kháng sinh

4

2.1.2. Kháng sinh họ tetracycline và kháng sinh AMO

5

2.1.2.1.Kháng sinh họ tetracycline

5

2.1.2.2.Kháng sinh amoxicilline

9

2.2.Phương pháp sắc ký

10

2.2.1.Giới thiệu chung về phương pháp sắc ký

10

2.2.1.1.Lịch sử phương pháp sắc ký

10

2.2.1.2.Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký

11

2.2.1.3.Phân loại các phương pháp sắc ký

11

2.2.2.Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

11

v 
 

2.2.2.1.Giới thiệu về phương pháp HPLC

11

2.2.2.2.Ưu và nhược điểm của phương pháp HPLC

15

CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

16

3.1.Thời gian, địa điểm và vật liệu nghiên cứu

16

3.1.1. Thời gian thực hiện

16

3.1.2. Địa điểm

16

3.1.3. Vật liệu

16

3.2. Hóa chất- dụng cụ và thiết bị

17

3.2.1..Đối với quy trình phân tích hàm lượng kháng sinh họ tetracycline

17

3.2.2. Đối với quy trình phân tích hàm lượng kháng sinh AMO

18

3.3. Phương pháp thí nghiệm

19

3.3.1. Quy trình phân tích kháng sinh họ tetracycline

19

3.3.2. Quy trình phân tích kháng sinh AMO

24

CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

29

4.1.Kết quả phân tích kháng sinh họ tetracycline

29

4.1.1.Kết quả xây dựng đường chuẩn kháng sinh họ tetracycline

29

4.1.2.Giới hạn phát hiện (LOD, LOQ) kháng sinh họ tetracycline của phương pháp

30

4.1.3.Kết quả xác định hiệu suất thu hồi phân tích kháng sinh họ tetracycline

31

4.1.4.Kết quả phân tích hàm lượng kháng sinh họ tetracycline trên mẫu thử

32

4.2.Kết quả phân tích kháng sinh AMO

36

4.2.1.Kết quả xây dựng đường chuẩn kháng sinh AMO

36

4.2.2.Giới hạn phát hiện (LOD, LOQ) kháng sinh AMO của phương pháp

37

4.2.3.Kết quả xác định hiệu suất thu hồi phân tích kháng sinh AMO

37

4.2.4.Kết quả phân tích hàm lượng kháng sinh AMO trên mẫu thử

38

CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

40

5.1. Kết luận

40

5.2. Đề nghị

41

TÀI LIỆU THAM KHẢO

42

PHỤ LỤC

45

vi 
 

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
ACN

: Acetonitril .

TCA

: Trichloroacetic acid.

HPLC

: High Performance Liquid Chromatography ( sắc ký lỏng hiệu năng cao)

LOD

: Limit of Detection (giới hạn phát hiện).

S/N

: Signal – to - noise ( Tỉ số tương đối của tín hiệu so với nhiễu nền).

SPE

: Solid phase extraction ( Cột chiết pha rắn).

FL

: Fluorescence ( Huỳnh quang).

UV-VIS

: Ultra-Violet/Visible ( Quang phổ tử ngoại khả kiến).

AMO

: Amoxicilline

VSATTP

: Vệ sinh an toàn thực phẩm.

TCVN

: Tiêu chuẩn Việt Nam.

CTC

: Chlotetracycline hydrochloride.

OTC

: Oxytetracycline hydrochloride.

EDTA

: Etilendiamin tetraacetic acid (Titriplex).

Ex

: Bước sóng kích thích.

Em

: Bước sóng phát quang.

NN & PTNT : Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thơn.
S

: Diện tích peak

vii 
 


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1. Cấu trúc chung của các kháng sinh họ tetracycline

5

Hình 2.2. Cấu tạo hóa học của kháng sinh chlortetracycline và oxytetracycline

6

Hình 2.3. Cấu trúc kháng sinh amoxicilline

9

Hình 2.4. Hệ thống HPLC tại phịng phân tích dược

12

Hình 2.5. Sơ đồ hệ thống HPLC

13

Hình 3.1.Mẫu thức ăn chăn ni được sử dụng làm mẫu phân tích

16

Hình 3.2. Một số giai đoạn trong quy trình chuẩn bị mẫu phân tích CTC và OTC

22

Hình 3.3. Một số giai đoạn trong quy trình chuẩn bị mẫu phân tích AMO

26

Hình 4.1.Đồ thị đường chuẩn 4 điểm kháng sinh OTC với R2 = 0,99980

29

Hình 4.2. Đồ thị đường chuẩn 4 điểm kháng sinh CTC với R2 = 0,99963

30

Hình 4.3. Sắc kí đồ OTC tại LOD= 0,2 ppm và CTC tại LOD = 0,3 ppm

31

Hình 4.4. Đồ thị đường chuẩn 3 điểm kháng sinh AMO với R2 = 0,99971

36

Hình 4.5. Sắc kí đồ chuẩn AMO ở nồng độ 2 ppm (thời gian lưu 3,898 phút)

36

Hình 4.6. Sắc kí đồ chuẩn AMO tại giá trị LOD = 0,1 ppm

37

 

viii 
 


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Cấu trúc của một số dẫn chất tiêu biểu trong họ tetracycline

6

Bảng 2.2. Một số chỉ tiêu dược lý của các kháng sinh họ tetracycline

7

Bảng 2.3. Hàm lượng kháng sinh họ tetracycline tối đa cho phép trong thức ăn hỗn  
hợp cho lợn

8

Bảng 2.4. Hàm lượng kháng sinh họ β-lactam tối đa EU khuyến cáo trong thức ăn

10

Bảng 3.1. Địa điểm và số mẫu khảo sát trong chương trình “ VSATTP”

17

Bảng 3.2. Gradient pha động trong phân tích kháng sinh họ tetracycline

22

Bảng 3.3. Cách đưa chuẩn kháng sinh tetracycline vào mẫu thêm chuẩn xác định hiệu
suất thu hồi

23

Bảng 3.4. Gradient pha động trong phân tích AMO

26

Bảng 3.5. Cách đưa chuẩn AMO vào mẫu thêm chuẩn xác định hiệu suất thu hồi

27

Bảng 4.1. Kết quả xây dựng đường chuẩn 4 điểm kháng sinh oxytetracycline

29

Bảng 4.2. Kết quả xây dựng đường chuẩn 4 điểm kháng sinh chlortetracycline

30

Bảng 4.3. Kết quả xác định hiệu suất thu hồi kháng sinh chlortetracycline dựa vào mẫu
trắng và mẫu thêm chuẩn

31

Bảng 4.4. Kết quả xác định hiệu suất thu hồi kháng sinh oxytetracycline dựa vào mẫu
trắng và mẫu thêm chuẩn

31

Bảng 4.5. Bảng kết quả phân tích kháng sinh CTC theo từng quận, huyện

32

Bảng 4.6. Bảng kết quả phân tích kháng sinh OTC theo từng quận, huyện

32

Bảng 4.7. Kết quả xây dựng đường chuẩn 3 điểm kháng sinh AMO

36

Bảng 4.8. Kết quả xác định hiệu suất thu hồi dựa vào mẫu trắng và mẫu thêm chuẩn ở
các nồng độ 0,2 ppm; 1 ppm; 2 ppm

37

Bảng 4.9. Kết quả phân tích kháng sinh AMO theo từng quận, huyện

38

ix 
 


DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 4.1.Biểu đồ so sánh tỷ lệ dương tính CTC giữa các quận huyện

33

Biểu đồ 4.2.Biểu đồ tỷ lệ vượt ngưỡng cho phép trong các mẫu dương tính CTC

34

Biểu đồ 4.3.Biểu đồ so sánh tỷ lệ mẫu dương tính OTC giữa các quận huyện

34

Biểu đồ 4.4. Biểu đồ tỷ lệ vượt ngưỡng cho phép trong các mẫu dương tính OTC

35

Biểu đồ 4.5. Biểu đồ so sánh tỷ lệ dương tính kháng sinh AMO giữa các quận /huyện 38

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 3.1. Quy trình chuẩn bị mẫu được cơng bố bởi Bộ NN& PTNT

21

Sơ đồ 3.2. Quy trình chuẩn bị mẫu được cơng bố bởi đại học Ghent- Bỉ

25

x 
 


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Ngày nay, ngành chăn nuôi đang phát triển khá mạnh nhằm đáp ứng đầy đủ nhu
cầu sử dụng thực phẩm ngày càng cao của người tiêu dùng. Vì mục đích tăng trọng,
phịng và trị bệnh cho động vật nhằm nâng cao năng suất, đạt hiệu quả tối ưu về kinh
tế, người chăn nuôi thường sử dụng các loại kháng sinh trong q trình chăn ni.
Nhưng với kiến thức cịn hạn chế hoặc vì những lý do khác nhau, họ lại sử dụng kháng
sinh một cách khơng hợp lý.
Hiện nay, vấn đề vệ sinh an tồn thực phẩm là vấn đề được đặt lên hàng đầu.
Khi vật ni ăn thức ăn bị nhiễm kháng sinh, ít nhiều trong cơ thể chúng còn chứa
đựng lượng tồn dư kháng sinh này. Tồn dư kháng sinh trên sản phẩm động vật ( thịt,
trứng, sữa…) đe dọa đến sức khỏe người tiêu dùng như tình trạng ngộ độc hoặc dị ứng
ngay cả đối với hàm lượng thấp. Nó cịn ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm, cản
trở các quá trình chế biến các sản phẩm thứ cấp (yaourt, phomat…) [4]. Ngồi ra,
kháng sinh được thải ra mơi trường gây ảnh hưởng có hại đến mơi trường sống: phá vỡ
hệ sinh thái vi sinh vật đất, sự tồn tại và ln chuyển của nguồn gen kháng kháng sinh
trong mơi trường…[17]

Tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn ni ở Việt Nam và nước ngoài:
a. Trong nước
Khảo sát 55 cơ sở chăn ni tại Đồng Nai, Bình Dương (2008), có 13 loại
kháng sinh được dùng nhiều nhất là : Tylosine (16,39%), Amoxicilline (11,89%),
Gentamycine (8,61%), Enrofloxacine (6,56%), Penicilline (6,15%), Lincomycine
(5,74%), Tiamuline (5,74%),Colistine (5,33%), Streptomycine (4,51%), Norfloxacine
(4,51%), Tetracycline (4,1%), Ampicilline (4,1%) và Florphenicole (3,28%) [9].
b. Ngoài nước
- Theo số liệu của viện Thú y Mỹ (AHI), lượng kháng sinh được sử dụng trong
chăn ni (1999) khoảng 20,42 triệu pao, trong đó kháng sinh nhóm Ionophore
1 
 


và arsen chiếm nhiều nhất (47,5%), tetracycline (15,67%); penicilline (4,26%) và các
loại khác (32,57%) [17].
- Ở Châu Âu, (1997), tỷ lệ các loại kháng sinh được sử dụng trong chăn nuôi:
penicilline: 9%; tetracycline: 66%; macrolide: 12%; Aminoglycoside: 4%;
Fluoroquinolone: 1%; Trimethomprim/sulpha: 2% và các kháng sinh khác: 6%.
Hiện nay, nhiều quốc gia đã cấm dùng kháng sinh trong thức ăn gia súc gia
cầm (Đan Mạch, Thụy Điển…) hoặc cho phép dùng như có quy định chặt chẽ về loại
kháng sinh, liều lượng được phép sử dụng (Nhật Bản, Úc…).
Kháng sinh họ tetracycline và kháng sinh amoxicilline trong họ β - lactam là
những kháng sinh khá phổ biến và thường được sử dụng nhiều nhất trong chăn nuôi.
Các kháng sinh này được bổ sung vào trong thức ăn chăn nuôi với hàm lượng khá cao:
150 – 500 mg/kg [16]. Đối với các ngành chức năng, để quản lý tốt vấn đề này cũng
như khuyến cáo người dân sử dụng kháng sinh an tồn, việc phân tích định tính, định
lượng kháng sinh là rất cần thiết. Hiện nay, có nhiều phương pháp để phân tích hàm
lượng kháng sinh trong thức ăn chăn ni, trong đó phân tích bằng pháp sắc ký khá
hiện đại, cho kết quả nhanh, chính xác, có thể định tính lẫn định lượng hợp chất hoặc

đơn chất. Phương pháp sắc kí lỏng HPLC thích hợp để phân tích mẫu thức ăn chăn
ni có hàm lượng kháng sinh lớn.
Từ những vấn đề đáng quan tâm trên, được sự phân công của BM CNHH, dưới
sự hướng dẫn của ThS. Phùng Võ Cẩm Hồng (Viện nghiên cứu Công Nghệ Sinh Học
và Môi Trường, Đại học Nông Lâm - TP HCM) và Th.S Nguyễn Lê Kiều Thư (Bộ
mơn Hóa Lý- Trạm chẩn đốn, xét nghiệm và điều trị, Chi Cục Thú Y TP HCM), tôi
thực hiện đề tài “Khảo sát hàm lượng kháng sinh họ tetracyclin và amoxicillin trong
thức ăn chăn nuôi trên địa bàn TP Hồ Chí Minh bằng phương pháp HPLC”.
1.2.Mục đích
- Khảo sát hàm lượng kháng sinh họ tetracyline trong thức ăn chăn nuôi trên
địa bàn TP HCM bằng phương pháp HPLC (đầu dò quang phổ tử ngoại khả kiến).
- Khảo sát hàm lượng kháng sinh amoxicilline trong thức ăn chăn nuôi trên địa
bàn TP HCM bằng phương pháp HPLC (đầu dò huỳnh quang).
- Đưa ra một số khuyến cáo về việc sử dụng kháng sinh trong chăn ni góp
phần thực hiện VSATTP và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.
2 
 


1.3.Nội dung đề tài
- Dựng đường chuẩn 4 điểm (nồng độ 5 ppm; 10 ppm; 25 ppm và 50 ppm)
kháng sinh họ tetracycline ( chlortetracycline và oxytetracycline).
- Tìm giới hạn phát hiện (LOD, LOQ) của phương pháp phân tích kháng sinh
họ tetracycline.
- Xác định hiệu suất thu hồi của họ tetracycline trên nền thức ăn chăn nuôi.
- Dựng đường chuẩn 3 điểm (nồng độ 0,2 ppm, 1 ppm, 2 ppm) AMO.
- Tìm giới hạn phát hiện (LOD, LOQ) của phương pháp phân tích kháng sinh
AMO.
- Xác định hiệu suất thu hồi của AMO trên nền thức ăn chăn nuôi.
- Tiến hành phân tích các mẫu thử để xác định hàm lượng kháng sinh họ

tetracycline và AMO, so sánh với ngưỡng tối đa cho phép kháng sinh sử dụng bổ sung
trong thức ăn chăn nuôi.
-

Đưa ra một số khuyến cáo về việc sử dụng kháng sinh trong chăn ni góp
phần thực hiện VSATTP và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.

1.4.Yêu cầu
- Các mẫu thức ăn được lấy trong chương trình: “ VSATTP” do Chi Cục Thú
Y TP HCM tiến hành.
- Tạo được mẫu đưa vào phân tích có độ tinh sạch cao.
- Thao tác thực hiện thí nghiệm chính xác.
- Sử dụng thiết bị HPLC (đầu dò UV và FL) của Phịng phân tích dược- Bộ
Mơn Hóa lý thuộc Trạm chẩn đoán, xét nghiệm và điều trị ( Chi Cục Thú Y Tp Hồ Chí
Minh) và một số dụng cụ, thiết bị khác để tiến hành phân tích định lượng kháng sinh
họ tetracycline và kháng sinh amoxicilline trên nền mẫu thức ăn chăn nuôi.

3 
 


Chương 2
TỔNG QUAN
2.1.Kháng sinh
2.1.1.Giới thiệu chung về kháng sinh
2.1.1.1.Khái niệm
Kháng sinh là những chất chuyển hóa vi sinh vật hay chất tương đồng tổng hợp,
hoặc chất tổng hợp không liên quan đến những chất thiên nhiên; ở liều nhỏ các chất
này ức chế sự phát triển và sống sót của vi sinh vật mà khơng có độc tính trầm trọng
trên ký chủ.

Độc tính chọn lọc là điểm quan trọng để phân biệt thuốc kháng sinh (antibiotic)
với các thuốc sát khuẩn (antiseptic). [7]
2.1.1.2. Sử dụng kháng sinh
a.Tình hình sử dụng kháng sinh ở Việt Nam và một số nước trên thế giới: [5]
Ở Việt Nam, có 143 loại biệt dược chứa kháng sinh đang được sử dụng trong
chăn ni, trong đó có 36 loại kháng sinh đang được sử dụng phổ biến như: colistin,
enrofloxacin, sulfamide, trimethoprim, norfloxacin, gentamycin, nhóm tetracycline,
nhóm β-lactam….
Ở Úc, từ giai đoạn 1992 - 1997 có khoảng 55,8% lượng kháng sinh nhập khẩu
được sử dụng ; 36,4% sử dụng cho người và 7,8% cho thú y. Tại Mỹ, có khoảng 6
triệu pound kháng sinh được sản xuất ra mỗi năm; trong đó 60% sử dụng cho người,
40% dùng cho chăn ni(32% dùng cho phịng bệnh, 8% dùng điều trị bệnh gia súc
gia cầm). ( Barton, 2000)
Tại Châu Âu ( 1996 - 1997): 52% kháng sinh được sử dụng cho người, 33%
cho thú y và 15% cho mục đích kích thích tăng trưởng bằng cách bổ sung trong chăn
ni thú y. Năm 1999, số lượng kháng sinh sử dụng tại EU và Switzeland ước tính là
13,288 tấn, trong đó có 65% dùng cho người, 29% dùng trong thú y và 6% dùng trong
kích thích tăng trưởng. (Nicole, 2008)
b. Các trường hợp sử dụng kháng sinh [8]
4 
 


- Sử dụng kháng sinh trong điều trị.
- Sử dụng kháng sinh trong phòng bệnh.
- Sử dụng kháng sinh với mục đích tăng trọng (đối với vật ni).
c.Việc lựa chọn kháng sinh dựa vào
- Sự hiểu biết về mức độ nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh.
- Sự hiểu biết về tác động dược lý để đánh giá khả năng mà kháng sinh đi tới ổ
bệnh với nồng độ đủ ức chế hoặc tiêu diệt vi khuẩn.

- Sự hiểu biết về độc tính của kháng sinh và các yếu tố làm tăng độc tính của nó.
- Sự hiểu biết về chi phí của việc điều trị, đi kèm với hiệu quả điều trị .
d. Các vấn đề tồn tại khi sử dụng kháng sinh không đúng
Vi khuẩn gây bệnh tiếp xúc thường xuyên với kháng sinh liều thấp sẽ tạo thích
ứng. Một số biến chủng thay đổi cấu trúc ADN để chống lại kháng sinh, dần dần,
chúng biến kháng sinh thành yếu tố cần thiết để tránh sự tấn công của vi khuẩn khác.
- Đối với vật ni và con người: gây rối loạn tiêu hóa, cơ thể mất đi sức đề
kháng bản thân, sức chống chọi với bệnh tật ngày càng yếu. Sử dụng kháng sinh thời
gian dài làm tăng hiện tượng kháng kháng sinh, làm cho việc điều trị bệnh khơng cịn
hiệu quả.
- Đối với chất lượng sản phẩm chăn nuôi: vật nuôi ăn thức ăn bị nhiễm kháng
sinh trong thời gian dài sẽ để lại lượng tồn dư kháng sinh trong sữa, gây ức chế vi
khuẩn sử dụng trong chế biến các sản phẩm từ sữa như phomat, sữa chua...
- Đối với môi trường: kháng sinh do vật ni đào thải ra ngồi mơi trường trong
thời gian dài, gây ảnh hưởng có hại đến môi trường sống: phá vỡ hệ sinh thái vi sinh
vật đất, sự tồn tại và luân chuyển của nguồn gen kháng kháng sinh trong môi trường…
2.1.2. Kháng sinh họ tetracycline và kháng sinh AMO
2.1.2.1. Kháng sinh họ tetracycline
a. Giới thiệu chung về họ tetracycline :

Hình 2.1. Cấu trúc chung của các kháng sinh họ tetracycline
5 
 


Bảng 2.1. Cấu trúc của một số dẫn chất tiêu biểu trong họ tetracycline
Tên

R1

R2

R3

R4

R5

R6

Thiên nhiên
Oxytetracycline

H

CH3

OH

OH

NH2

H

Clorotetracycline

Cl

CH3

OH

H

NH2

H

Tetracycline

H

CH3

OH

H

NH2

H

CH3

OH

NH2

H

Tổng hợp
Doxycycline

H

H

Đây là họ kháng sinh có hoạt phổ rộng, rất thơng dụng. Chất đầu tiên là
Clorotetracycline cịn gọi là aureomycin, do Benjamin Duggar ly trích được năm 1948
từ môi trường nuôi cấy Streptomyces aureofaciens. Sau đó, năm 1950, Finlay đã ly
trích oxytetracycline từ Streptomyces rimosus và năm 1952 mới tìm ra chất cơ bản là
tetracycline. Những năm sau, doxycycline, minocycline, metacycline, amicycline là
các chất bán tổng hợp được tìm ra.

Chlortetracycline

Oxytetracycline

Hình 2.2. Cấu tạo hóa học của kháng sinh chlortetracycline và oxytetracycline
b. Tính chất lý hóa
- Các tetracycline có màu vàng nhạt đến vàng sậm, vị đắng.
- Dạng base ít tan trong nước, tan trong alcol và các dung mơi hữu cơ. Dạng muối có
tính tan ngược lại.
- Nhóm dimethylamin ở vị trí 4 làm cho sản phẩm có tính kiềm, trong khi đó các
nhóm phenol và enol có tính acid nhẹ.
- Các tetracycline cho phản ứng alcaloid với acid picric, iodomercuric, iodoiodid...
- Tan được trong dung dịch kiềm và phản ứng tạo tạo màu với Fe3+.
- Kết hợp với các ion hóa trị 2 và 3, thường nhất là Fe3+, Cu2+, Fe2+, Co2+, Zn2+, tạo
6 

 


các phức chelat không tan, kém hấp thu qua ruột.
- Kém bền với nóng ẩm và ánh sáng chiếu trực tiếp, dẫn đến sự phân hủy thuốc, tạo
thành một số dẫn chất như anhydrotetracycline 4 - epitetracycline, anhydro 4 epitetracycline có độc tính cao trên thận.
c.Cơ chế tác động
Tất cả kháng sinh họ tetracycline đều có tác dụng kiềm khuẩn, ngoại trừ
minicycline có tác động diệt khuẩn. Tuy nhiên, ở nồng độ cao, các tetracycline có thể
diệt khuẩn. Các kháng sinh họ tetracycline kết dính với tiểu thể 30S của ribosome sau
khi đi qua màng tế bào của vi khuẩn. Sự kết dính dẫn đến ngăn cản ARN –t gắn vào
ARN-m, cuối cùng acid amin khơng được phóng thích tại ribosome, do vậy sự tổng
hợp protein bị ức chế.
d. Dược động học
- Dạng muối (hydrocloride) được hấp thu nhanh qua hệ tiêu hóa, tốt nhất là mơi
trường acid dạ dày, kém hơn ở ruột non.
- Hấp thu tốt nhất là minocycline (100%), doxycycline (95%); hấp thu trung bình là
tetracycline, oxytetracycline (60-80%); hấp thu thấp nhất là clotetracycline (30%).
- Thức ăn ảnh hưởng rất nhiều đến sự hấp thu của các tetracyclin trừ minocyclin và
doxycycline. Các yếu tố làm giảm sự hấp thu của thuốc ở ruột như pH kiềm, các ion
kim loại hóa trị II và III. Gốc phosphat làm tăng sự hấp thu.
- Tích lũy trong hệ võng mạc nội mô, lách, tủy xương, ngà răng, men răng, qua được
nhau thai, sữa mẹ, các mô và dịch cơ thể nhưng kém vào dịch não tủy.
- Đào thải chủ yếu qua nước tiểu.
Bảng 2.2. Một số chỉ tiêu dược lý của các kháng sinh họ tetracycline
Hấp thu theo

Độ thanh thải

đường uống

của thận

(%)

(ml/phút)

Chlotetracycline

30

35

6-8

Oxytetracycline

60-70

90

-

Tetracycline

-

65

-

Doxycyline

90-100

16

16-18

Minocycline

-

10

-

Tên thuốc

7 
 

Thời gian bán

Phân loại tác

hủy ( h)

dụng
Tác dụng

ngắn
Tác dụng dài


e. Phổ kháng khuẩn
Nhóm tetracycline có tác động kìm khuẩn (bacteriostatic), độ nhạy cảm và sự
đề kháng giữa các chất trong cùng nhóm, nói chung tương tự nhau.
Các tetracycline có hoạt phổ rộng không chỉ trên vi khuẩn gram dương và gram
âm, mà còn trên một số mầm nội bào khác: Rickettsia, Chlamydia, Mycoplasma,
Plasmodium, có hoạt tính yếu trên vi nấm Candida, tác động ức chế gián tiếp sự phát
triển của amib ruột.
Kháng sinh nhóm này tác động trên vi khuẩn gram dương ở liều thấp hơn so với
vi khuẩn gram âm, nhưng thực tế ít dùng điều trị nhiễm khuẩn gram dương do các
chủng này đề kháng nhanh với thuốc.
Bảng 2.3. Hàm lượng kháng sinh họ tetracycline tối đa cho phép trong thức ăn hỗn
hợp cho lợn [2]
Tên kháng sinh

Hàm lượng tối đa cho phép (ppm)

Chlotetracycline

50

Oxytetracycline

50

f.Các kháng sinh cụ thể:
• Chlotetracycline:

- Cơng thức tổng qt của Chlotetracycline: C22H23ClN2O8
- Phân tử lượng : 478,5
- Tên khoa học: (4S, 4aS, 5aS, 6S, 12aS)-7-cloro-4-dimethylamino1, 4, 4a, 5,
5a, 6, 11, 12a-octahydro-3, 6, 10, 12, 12a – pentahydroxy - 6- methyl -1, 11dioxo naphthacen - 2- carboxamid.
- Điều chế: Phân lập từ môi trường nuôi cấy Streptomyces aureofaciens.
Người ta cũng đã phân lập được bromtetracyclin từ mơi trường ni cấy
Streptomyces aureofaciens, chất này có tác dụng tương tự clotetracyclin.
- Tính chất: Bột vàng, tan nhẹ trong nước và alcol, tan trong dung dịch kiềm và
carbonat.
• Oxytetracycline:
- Cơng thức tổng qt của Oxytetracycline: C22H24N2O9
- Phân tử lượng : 460,4
8 
 


- Tên khoa học: (4S, 4aS, 5aS, 6S, 12aS) - 4-dimethylamino - 1, 4, 4a, 5, 5a, 6,
11, 12a-octahydro-3, 5, 6, 10, 12, 12a – pentahydroxy - 6- methyl -1, 11-dioxo
naphthacen - 2- carboxamid.
- Điều chế: Phân lập từ môi trường ni cấy Streptomyces rimosus.
- Tính chất:
+ Dạng base ít tan trong nước, dạng hydroclorid có vị đắng hơn, tan trong
nước
+ Kết hợp với K+ tạo các phenolat ở các oxy 1, 12a, 12 và 11.
+ Tạo muối hydroclorid với acid hydrocloric ở nhóm 4-dimethylamino.
+ Hai dạng mất hoạt tính trong môi trường kiềm và các dung dịch pH < 2.
2.1.2.2. Kháng sinh amoxicilline
- Công thức tổng quát của amoxicilline: C16H19 N3O5S
- Phân tử lượng: 365,41

Hình 2.3. Cấu trúc kháng sinh amoxicilline
- Tên khoa học: Acid (2S,5R,6R)-6-[(R)-2-amino-2-(parahydroxyphenyl) acetamido]3, 3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3,2,0]heptan-2-carboxylic.
- Tính chất
+ Amoxicilline là dẫn xuất bán tổn hợp của penicillin.
+ Bột kết tinh trắng, vị đắng.
+ Độ ẩm cao và nhiệt độ > 37 oC ảnh hưởng bất lợi đến độ bền.
+ Độ tan: 1 g/370 ml nước hoặc 1000 ml alcol.
- Cơ chế tác động :
Amoxicilline ức chế sự tổng hợp vách tế bào vi khuẩn bằng cách tấn công vào
những protein đặc biệt bên trong màng tế bào vi khuẩn. Trên tế bào tăng trưởng, sự

9 
 


liên kết amoxicilline trong vách tế bào gây trở ngại cho việc sản xuất peptidoglycan
của vách tế bào và tiêu hủy tế bào. Xâm nhập qua vách tế bào vi khuẩn gram âm.
- Sự hấp thu của thuốc : Amoxicilline bền vững trong dịch dạ dày.
- Sự phân bố của thuốc :
Sau khi được hấp thu, amoxicilline có thể phân bố rộng rãi đến hầu hết các mô:
gan, phổi, mô cơ, túi mật, máng phổi và hoạt dịch, nồng độ rất thấp trong nước mắt,
mồ hôi, nước bọt.
- Sự bài tiết của thuốc
Amoxicilline chủ yếu được bài tiết qua thận, khoảng 10 – 25% liều cấp của
amoxicilline.
Bảng 2.4.Hàm lượng kháng sinh họ β-lactam tối đa EU khuyến cáo trong thức ăn [16]
Kháng sinh họ β-lactam

Hàm lượng tối đa nên sử dụng (ppb)

Amoxicilline

100

Ampicilline

100

Penicilline G (benzylpenicilline)

100

Penicilline V (phenoxymethylpenicilline)

100

Oxacilline

100

Cloxacilline

100

Dicloxacilline

100

Nafcilline

100

2.2.Phương pháp sắc ký
2.2.1. Giới thiệu chung về phương pháp sắc ký
2.2.1.1. Lịch sử phương pháp sắc ký [21]
Nhà thực vật học người Nga Mikhail Tsvet (Mikhail Semyonovich Tsvet) phát
minh ra kĩ thuật sắc kí vào năm 1903 khi ông đang nghiên cứu về chlorophyll. Chữ sắc
trong sắc kí có nghĩa là màu; nó vừa là tên của Tsvet trong nghĩa tiếng Nga, và vừa là
màu của các sắc tố thực vật ơng phân tích vào lúc bấy giờ. Tên này vẫn tiếp tục được
dùng dù các phương pháp hiện đại khơng cịn liên quan đến màu sắc.
Năm 1952 Archer John Porter Martin và Richard Laurence Millington Synge
được trao giải Nobel Hoá học cho phát minh của họ về sắc ký phân bố.
10 
 


Kĩ thuật sắc ký phát triển nhanh chóng trong suốt thế kỉ 20. Các nhà nghiên cứu
nhận thấy nguyên tắc nền tảng của sắc ký Tsvet có thể được áp dụng theo nhiều cách
khác nhau, từ đó xuất hiện nhiều loại sắc ký khác nhau. Đồng thời, kĩ thuật thực hiện
sắc kýcũng tiến bộ liên tục, cho phép phân tích các phân tử tương tự nhau.
2.2.1.2.Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký [20]
Sắc ký (Chromatography) là phương pháp tách, phân ly, phân tách các chất dựa
vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và tĩnh.
Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và
pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan, …). Trong hệ
thống sắc ký chỉ có các phân tử pha động mới chuyển động dọc theo hệ sắc ký. Các
chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình
chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi
lặp lại quá trình hấp phụ, phản hấp phụ. Hệ quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ
chuyện động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn pha này.

Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc ký.
2.2.1.3. Phân loại các phương pháp sắc ký
Trong phương pháp sắc ký, pha động phải là các lưu thể (các chất ở dạng khí
hay lỏng), cịn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn. Dựa vào trạng thái
tập hợp của pha động, người ta có thể chia sắc ký thành hai nhóm lớn: sắc ký khí (gas
chromatography- GC) và sắc ký lỏng (liquid chromatography - LC). Dựa vào cơ chế
trao đổi của các chất giữa hai pha động và tĩnh người ta lại chia các phương pháp sắc
ký thành các nhóm nhỏ hơn.
2.2.2. Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC [11], [12], [19]
2.2.2.1. Giới thiệu về phương pháp HPLC
HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao ( High Performance Liquid
Chromatography), trước kia gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure
Liquid Chromatography). Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát
triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển .

11 
 


Hình 2.4. Hệ thống HPLC tại phịng phân tích dược
a. Khái niệm
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là phương pháp chia tách trong đó pha động là chất
lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đó được phân chia dưới dạng tiểu phân
hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn ,hay một chất mang đó được biến đổi
bằng liên kết hố học với các nhóm chức hữu cơ .Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ
chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ ( Rây phân tử).
b. Nguyên tắc
Nguyên tắc của phương pháp HPLC dựa trên sự phân bố của chất tan giữa hai
chất lỏng không trộn lẫn vào nhau khi cho một chất lỏng di chuyển (pha động) qua
chất lỏng đứng im (pha tĩnh). Pha tĩnh bị hấp phụ trên bề mặt chất rắn (chất mang).

c. Cấu tạo và các bộ phận của HPLC
Hệ thống HPLC gồm các bộ phận cơ bản được tóm tắt theo sơ đồ sau :

12 
 


(2)

(1)

(3)
(4)

(5)

(6)

(7)
Hình 2.5. Sơ đồ hệ thống HPLC
(1).Bình chứa dung mơi pha động.
(2). Bộ khử khí Degasse.
(3).Hệ thống bơm mẫu (bơm cao áp).
(4).Cột sắc ký (pha tĩnh)(để ngồi mơi trường hay trong bộ điều nhiệt).
(5).Đầu dị ( detector) (nhận tín hiệu).
(6).Bộ phận tiêm mẫu (bằng tay hay autosample).
(7).Hệ thống xử lý dữ liệu.
o Pha động:
Tùy vào mơ hình của HPLC mà pha động có thể thay đổi. Đối với pha thuận,
dung môi thường không phân cực. Đối với pha đảo, sử dụng pha trộn giữa nước và

dung môi hữu cơ phân cực như acetonitrile (CH3CN).
o Hệ thống khử khí Degasse
- Mục đích của bộ khử khí: loại trừ bọt nhỏ sót lại trong dung mơi pha động.
- Nếu trong q trình phân tích, dung mơi pha động cịn sót các bọt khí, một số
hiện tượng sau đây sẽ sảy ra:
+ Tỷ lệ pha động của các đường dung môi lấy không đúng sẽ làm cho thời
gian lưu của Peak thay đổi .
+ Trong trường hợp bọt quá nhiều, bộ khử khí khơng thể loại trừ hết được, có
thể bơm sẽ khơng hút được dung mơi, khi đó áp suất khơng lên và máy sắc ký sẽ
ngừng hoạt động .
13 
 


- Trong bất cứ trường hợp nào nêu trên cũng cho kết quả phân tích sai .
o Bơm cao áp
- Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký. Bơm
phải tạo được áp suất cao khoảng 3000 - 6000 PSI hoặc 250 - 500 at ( 1at = 0,98 Bar)
và bơm phải tạo dòng liên tục. Lưu lượng bơm từ 0,1 đến 9,999 ml/phút.
- Máy sắc ký lỏng hiện nay thường có áp suất tối đa 412 Bar. Tốc độ dòng 0,1 9,999 ml/phút .
- Tốc độ bơm là hằng định theo thông số đã được cài đặt. Hiện tại bơm có 2
Pistone để thay phiên nhau đẩy dung môi liên tục .
o Bộ phận tiêm mẫu (injection):
- Để đưa mẫu vào cột phân tích theo phương pháp khơng ngừng dịng chảy.
Với thể tích là 5 - 100μl .
- Có 02 cách lấy mẫu vào trong cột : Bằng tiêm mẫu thủ công (tiêm bằng tay)
và tiêm mẫu tự động (Autosample) .
- Vấn đề cần lưu ý :
+ Sử dụng dụng cụ tiêm ( injector) cho nhiều cột.
+ Có chế độ rửa dụng cụ tiêm cho phù hợp.

+ Xác định thể tích tối đa cho việc tiêm mẫu.
o Cột sắc ký :
Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột khoảng 10 30cm , đường kính trong 1 - 10mm, hạt chất nhồi cỡ φ = 5 - 10 μm. (Ngồi ra cịn có
một số trường hợp đặc biệt về kích thước và kích cỡ hạt....)

.

o Detector (đầu dị) : Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và
cho các tín hiệu ghi trên săc ký đồ để có thể định tính và định lượng .Tùy theo tính
chất của các chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại đầu dị thích hợp và phải thoả
mãn điều kiện trong một vùng nồng độ nhất định của chất phân tích.
- Trên cơ sở đó người ta chế tạo các lọai đầu dò sau :
+ Đầu dò quang phổ tử ngoại 200 - 380 nm để phát hiện UV.
+ Đầu dò quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS): 190 - 900 nm để phát hiện
các chất hấp thụ quang. Đây là loại thông dụng nhất.
+ Đầu dò huỳnh quang (FL) để phát hiện các chất hữu cơ phát huỳnh quang tự
14