Sàng lọc tác dụng in vitro trên sỏi tiết niệu của một số loài thuộc chi ficus l

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN NGỌC HIẾU

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN
HÓA HỌC CỦA CÂY HƯƠNG NHU TÍA
(OCIMUM SANCTUM L.)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2013


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN NGỌC HIẾU

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN
HÓA HỌC CỦA CÂY HƯƠNG NHU TÍA
(OCIMUM SANCTUM L.)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn :
1. TS. Nguyễn Văn Tài
2. TS. Đỗ Quyên
Nơi thực hiện :
1. Khoa Hóa thực vật - Viện
Dược liệu
2. Bộ môn Dược liệu - trường
Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI - 2013


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

LỜI CẢM ƠN
Khóa luận này là kết quả của quá trình học tập tại trường Đại học Dược Hà
Nội và quá trình nghiên cứu của em tại Viện Dược liệu.
Với tình cảm chân thành, em xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô tại khoa
Hóa Thực vật - Viện Dược liệu và các thầy cô ở bộ môn Dược liệu, trường Đại học
Dược Hà Nội đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện cho em trong quá trình học tập,
nghiên cứu để hoàn thành khóa luận này.
Đặc biệt em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và tri ân đến Tiến sỹ Nguyễn Văn
Tài và Tiến sỹ Đỗ Quyên, dù bận rất nhiều công việc nhưng đã tận tình hướng dẫn,
giúp đỡ, dìu dắt em trong quá trình nghiên cứu đề tài và hoàn chỉnh khóa luận.

Mặc dù bản thân đã rất cố gắng trong lần đầu tiên nghiên cứu khoa học nhưng
chắc chắn khóa luận không tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận được
những ý kiến đóng góp quý giá của các thầy cô.
Hà Nội, tháng 5 năm 2013
Sinh viên

Nguyễn Ngọc Hiếu


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN.......................................................................................... 2
1.1 Đặc điểm thực vật chi Ocimum L............................................................................ 2
1.2. Thành phần hóa học của Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) ......................... 5
1.3 Tổng quan về acid ursolic ........................................................................................ 6
CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 12
2.1 Đối tượng nghiên cứu............................................................................................. 12
2.2 Phương pháp nghiên cứu....................................................................................... 13
CHƯƠNG 3 : THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................ 15
3.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học .................................. 15
3.2 Định tính acid ursolic trong cành lá Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.)
bằng SKLM................................................................................................................... 22
3.3 Phân lập acid ursolic từ cành lá Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) bằng
sắc ký cột ....................................................................................................................... 23
3.4 Xây dựng quy trình chiết tách acid ursolic từ Hương nhu tía (Ocimum
sanctum L.) .................................................................................................................... 29
BÀN LUẬN ................................................................................................................... 37
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ......................................................................................... 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 40
PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 43

Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU,
CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CTCT

công thức cấu tạo

DCM

dichloromethan

dd

dung dịch

EtOAc

ethyl acetat

EtOH

ethanol

IR

Phổ hồng ngoại

kl

khối lượng

MeOH

methanol

NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

MS

Phổ khối

Rf

hệ số lưu

SKLM

sắc ký lớp mỏng

tt

thể tích

TT

thuốc thử


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 : Hàm lượng acid ursolic trong lá của các loài thuộc chi Ocimum L. ....... 6
Bảng 3.1 : Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong cành, lá Hương nhu
tía (Ocimum sanctum L.) bằng phản ứng hóa học. ................................................... 21
Bảng 3.2 : Phổ 1H, 13C-NMR của D1 và acid ursolic. ............................................... 27
Bảng 3.3 : Hàm lượng acid ursolic thô (%) khi chiết bằng các dung môi khác nhau... 32
Bảng 3.4 : Hàm lượng acid ursolic thô (%) khi chiết ở các nhiệt độ khác nhau. .......... 34
Bảng 3.5 : Hàm lượng acid ursolic thô (%) khi chiết với tỷ lệ dung môi/dược
liệu khác nhau. .............................................................................................................. 34
Bảng 3.6 : Hàm lượng acid ursolic thô (%) với số lần chiết khác nhau. ................. 35


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ

Hình 1.1 : CTCT của acid ursolic. ................................................................................ 7
Hình 1.2 : CTCT của acid corosolic. ............................................................................ 9
Hình 1.3 : Sơ đồ bán tổng hợp acid corosolic từ acid ursolic..................................... 9
Hình 1.4 : Sơ đồ chiết xuất và tinh chế acid ursolic từ lá Hồng (Diospyros kaki). . 10
Hình 1.5 : Sơ đồ chiết xuất và tinh chế acid ursolic từ vỏ táo (Malus domestica) .. 11
Hình 3.1 : Sắc ký đồ của cắn MeOH toàn phần với acid ursolic đối chứng trên
các hệ dung môi khai triển. ......................................................................................... 22
Hình 3.2 : Tóm tắt quy trình chiết xuất các phân đoạn từ cành, lá Hương nhu
tía (Ocimum sanctum L.) .............................................................................................. 24
Hình 3.3 : Sắc ký đồ các cắn phân đoạn với acid ursolic đối chứng. ...................... 25
Hình 3.4 : Sắc ký đồ acid ursolic thô và sau khi kết tinh với chất đối chứng......... 31
Hình 3.5 : Sắc ký đồ acid ursolic thô của các mẻ chiết bằng các dung môi khác nhau ... 33


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Hương nhu tía từ lâu đã được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền làm
thuốc điều trị cảm nắng, cảm hàn, sốt nóng sợ rét, nhức đầu, đau bụng ... Dược điển
Việt Nam IV có chuyên luận về Hương nhu, xem hai loài Hương nhu trắng
(Ocimum gratissimum L.) và Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) được sử dụng
như nhau trong điều trị. Thực tế, cây Hương nhu trắng là nguồn nguyên liệu chiết
xuất tinh dầu Hương nhu và điều chế eugenol, còn cây Hương nhu tía chủ yếu dùng
trong Y học cổ truyền.
Trên thế giới, Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) được dùng như một nguồn
nguyên liệu giàu acid ursolic, do có chứa hàm lượng acid ursolic cao [19, 22]. Acid
ursolic là một saponin thuộc nhóm ursan đã được chứng minh có nhiều tác dụng
sinh học đáng chú ý như chống viêm, bảo vệ gan, hạ lipid máu, chống khối u [10,
15]. Đặc biệt acid ursolic còn là một chất trung gian quan trọng để bán tổng hợp
nhiều chất có hoạt tính sinh học cao như acid corosolic (một chất ức chế glycogen

phosphorylase được nghiên cứu nhiều trong điều trị đái tháo đường) [20, 24].
Xuất phát từ thực tế cây Hương nhu tía ở Việt Nam chưa được nghiên cứu
nhiều về thành phần acid ursolic, chúng tôi đã thực hiện đề tài : "Nghiên cứu
thành phần hóa học của cây Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.)"
với các nội dung chính như sau :
- Định tính các nhóm chất hữu cơ trong cành, lá Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.).
- Chiết xuất, phân lập acid ursolic từ cành lá Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.).
- Xây dựng quy trình chiết xuất acid ursolic từ Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.).
- Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng acid ursolic chiết từ dược liệu.


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1 Đặc điểm thực vật chi Ocimum L.
1.1.1. Vị trí phân loại chi Ocimum L.
Theo hệ thống phân loại của Takhtajan 1987, chi Ocimum L. thuộc :
• Giới thực vật (Plantae)
• Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)
• Lớp Ngọc lan (Magnoliidae)
• Phân lớp Bạc hà (Lamidae)
• Bộ Bạc hà (Lamiales)
• Họ Bạc hà (Lamiaceae)

• Chi Ocimum L. [4]
1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Ocimum L.
Chi Ocimum L. thuộc họ Bạc hà (Lamiaceae), tên gọi có thể bắt nguồn từ ozo,
ozein nghĩa là toát mùi thơm, liên quan đến mùi thơm phảng phất của các cây thuộc
chi này; hoặc do chữ okimon, okys nghĩa là nhanh, cấp tốc vì các cây này mọc rất
nhanh. Tên khác của chi : Hương nhu, Húng, É.
Cỏ hay cây bụi nhỏ, sống hằng năm hay sống nhiều năm. Thân thường vuông,
nhẵn hay có lông. Lá mọc đối, mép nguyên hay xẻ răng cưa, có lông hay nhẵn,
thường có các điểm tuyến tròn trên phiến. Cụm hoa dạng chùy hay hình tháp, gồm
các xim bó tạo thành các vòng giả, mỗi vòng thường có 6 hoa. Lá bắc tồn tại hay
sớm rụng. Đài hình chuông, thường có lông và điểm tuyến ở phía ngoài, 2 môi; môi
trên có một thùy lớn ít nhiều men xuống ống; môi dưới 4 thùy, với 2 thùy bên nhọn
ngắn, 2 thùy dưới nhọn, dài. Tràng có ống thò khỏi đài, nhẵn hay có lông, 2 môi :
môi trên 4 thùy ngắn; môi dưới một thùy dài và lớn hơn môi trên, hơi cong và lõm
hình thuyền. Nhị 4, hướng xuống môi dưới, chỉ nhị ít nhiều thò khỏi ống tràng, bao
phấn hình trứng hay hình thận, 1 ô. Bầu nhẵn, vòi nhụy xẻ 2 thùy ở đỉnh. Đĩa mật


3

có thùy trước lớn. Quả hình trứng hay gần hình cầu, nhẵn, nằm trong đài đồng
trưởng.
Có khoảng 150 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Phi và Nam Mỹ.
Ở Việt Nam có 4 loài [5].
1.1.3 Chi Ocimum L. ở Việt Nam
Ở Việt Nam, chi Ocimum L. có 4 loài :
• Ocimum americanum L. - É hoang, É châu Mỹ. Ở nước ta có gặp tại Hà Nội
và vùng Cam Ranh tỉnh Khánh Hòa.
• Ocimum basilicum L. - Húng quế, Húng giổi, Húng chó, É tía, É quế. Ở
nước ta, có gặp từ Hà Giang, Hà Nội, Thừa Thiên Huế, Ninh Thuận, thành

phố Hồ Chí Minh và Long An. Cũng được trồng ở nhiều nơi.
Ocimum basilicum L. var. pilosum (Willd.) Benth. - Húng trắng, É trắng, Trà
tiên. Ở nước ta, thứ này có gặp từ Hà Giang, Hòa Bình, Hà Nội vào Quảng
Nam, Kon Tum, Đắc Lắc, Khánh Hòa, thành phố Hồ Chí Minh và Long An.
Cũng được trồng ở nhiều nơi.
• Ocimum gratissimum L. - Hương nhu trắng, É lá lớn. Ở nước ta, có gặp từ
Hà Giang, Sơn La, Lạng Sơn, Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Hà Nội vào tới thành phố
Hồ Chí Minh.
• Ocimum sanctum L. (tên khác O. tenuiflorum L.) - Hương nhu tía, É tía, É
đỏ, É rừng. Ở nước ta, có gặp từ Hòa Bình, Bắc Giang, Hà Nội, Ninh Bình
vào Khánh Hòa, Ninh Thuận, thành phố Hồ Chí Minh cho đến An Giang.
Cũng được trồng ở nhiều nơi [5].
1.1.4 Đặc điểm thực vật loài Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.)
1.1.4.1 Tên gọi
• Tên khoa học : Ocimum sanctum L. (tên khác : O. tenuiflorum) - họ Bạc hà
(Lamiaceae).
• Tên khác : É đỏ, é tía.


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
4

• Tên nước ngoài : Monk's basil, sacred basil, holy basil, rough basil, tulsi,
mosquito plant of South Africa (Anh), basilic saint, basilic sacré (Pháp) [7].

1.1.4.2 Đặc điểm thực vật
Cây nhỏ, sống hằng năm hay sống dai, cao đến gần 1m. Thân, cành màu đỏ
tía, có lông mịn. Lá mọc đối, có cuống dài, hình mác hoặc thuôn, dài 2 - 5 cm, rộng
1 - 3 cm, mép khía răng, hai mặt màu tím tía, có lông mềm.
Cụm hoa mọc ở đầu cành thành chùm xim phân nhánh; lá bắc nhỏ; hoa màu
trắng hoặc tím tía, xếp thành từng vòng 5 - 6 cái trên cụm hoa; đài hoa dài 3 - 5 mm,
thùy trên hình mắt chim, thùy dưới hình giùi dài hơn, những thùy bên rất ngắn;
tràng hoa có cánh hơi lượn sóng ở mép; nhị 4, vượt ra ngoài tràng.
Quả bế tư, gần hình cầu, hơi dẹt, màu nâu nhạt hoặc đỏ có đốm đen nhỏ, nằm
trong đài tồn tại.
Mùa hoa quả : tháng 5 - 7 [7].

1.1.4.3 Phân bố, sinh thái
Hương nhu tía vốn là cây cổ nhiệt đới châu Á, được trồng rải rác ở Trung
Quốc, Lào, Thái Lan để làm thuốc và làm rau gia vị. Ở Việt Nam, Hương nhu tía
mới được trồng hạn chế trong vườn các gia đình hoặc các cơ sở chữa bệnh theo y
học cổ truyền. Cây ưa khí hậu nhiệt đới nóng và ẩm; nhiệt độ trung bình năm
khoảng 25 - 300C; lượng mưa 1800 - 2600 mm/năm. Ở các vùng núi cao có khí hậu
cận nhiệt đới và hơi lạnh, không thấy trồng.
Hương nhu tía mọc từ hạt vào khoảng cuối mùa xuân, sinh trưởng nhanh trong
mùa hè, đến cuối mùa thu hay đầu mùa đông thì tàn lụi. Cây ra hoa quả nhiều. Quả
chín tự mở, hạt rơi xuống đất và nảy mầm sau 5 - 6 tháng. Cây trồng dễ dàng bằng
hạt [7].


5

1.2. Thành phần hóa học của Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.)
Tinh dầu : đây là thành phần đáng chú ý và có giá trị cao trong cây Hương nhu
tía, theo Dược điện Việt Nam IV, dược liệu phải chứa ít nhất 0,5% tinh dầu (tính

theo dược liệu khô tuyệt đối) [3].
Về thành phần hóa học,tinh dầu hương nhu tía Việt Nam chứa các thành phần
chính là eugenol (trên 70%), methyleugenol (trên 12%) và β-caryophylen [7].
Thành phần hóa học khác trong cây :
- Hương nhu tía chứa các hợp chất thuộc nhóm flavonoid như apigenin, luteolin,
apigenin-7-glucuronid, luteolin-7-glucuronid, orientin và nhóm polyphenol như :
acid galic, acid galic methylester, acid galic ethylester, acid protocatechic, acid
rosmarinic. [7].
- Acid ursolic là một thành phần quan trọng và có hàm lượng cao trong Hương nhu
tía.
+ Năm 2008, Silva MG và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu hàm lượng acid
ursolic trong lá của 8 loài thuộc chi Ocimum L., đó là : O. americanum, O.
basilicum, O. basilicum var purpurascens, O. basilicum var. minimum, O.
gratissimum, O. micranthum, O. selloi và O. tenuiflorum bằng phương pháp phân
tích HPLC. Nghiên cứu đã chỉ ra Ocimum tenuiflorum là loài có hàm lượng acid
ursolic trong lá cao nhất (lên đến 2,02%) trong các loài thuộc chi Ocimum L. Kết
quả của nghiên cứu được trình bày ở bảng 1.1 [19].
+ Năm 2013, Mangesh D và cộng sự đã khảo sát các yếu tố trong quá trình
chiết xuất acid ursolic từ lá Ocimum sanctum L. bằng sóng siêu âm. Nghiên cứu đã
xác định điều kiện chiết xuất tối ưu trên một mẻ 2 g dược liệu là sử dụng dung môi
MeOH, tỷ lệ dung môi/dược liệu là 1/30, nhiệt độ 45 0C, tần số sóng siêu âm 25
kHz và trong thời gian 12 phút, lượng acid ursolic được chiết ra ở điều kiện này là
1,647% (sử dụng phương pháp định lượng HPLC) [22].


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien

mien phi
phi
6

Bảng 1.1 : Hàm lượng acid ursolic trong lá của các loài thuộc chi Ocimum L.
STT

Loài

Hàm lượng (%)

1

Ocimum americanum

1,03

2

Ocimum basilicum

0,29

3

Ocimum basilicum var. purpurascens

0,38

4

Ocimum basilicum var. minimum

0,27

5

Ocimum gratissimum

1,04

6

Ocimum micranthum

1,05

7

Ocimum selloi

0,45

8

Ocimum tenuiflorum

2,02

1.3 Tổng quan về acid ursolic

1.3.1 Công thức hóa học, tính chất lý hóa của acid ursolic
Công thức phân tử : C30H48O3.
Khối lượng phân tử : 456,7 (g/mol).
Công thức cấu tạo (hình 1.1)
Tên khoa học : 3β-hydroxyurs-12-en-28-oic acid.
Hình dạng tinh thể : Kết tinh dạng tinh thể lăng trụ to từ cồn tuyệt đối, dạng kim từ
cồn loãng.
Nhiệt độ nóng chảy : 2840C.
Độ tan : 1/88 (MeOH, kl/tt), 1/178 (EtOH, kl/tt), 1/35 (EtOH sôi, kl/tt), 1/140
(ether, kl/tt), 1/388 (chloroform, kl/tt), 1/1675 (CS2, kl/tt), tương đối tan trong
aceton. Tan trong acid acetic băng nóng và dung dịch 2% NaOH trong EtOH.
Không tan trong ether dầu hỏa. Độ tan trong nước : 1,02.10-4 mg/L ở 250C (dự
đoán) [26].


7

Hình 1.1 : CTCT của acid ursolic.
1.3.2 Tác dụng dược lý của acid ursolic
1.3.2.1 Tác dụng chống viêm
Acid ursolic từ Pyrola rotundifolia có tác dụng chống viêm trong thử nghiệm
gây phù chân bằng carageenan trên chuột [14].
Trong dịch chiết của Rosmarinus officinalis, acid ursolic là một trong các
thành phần ngăn ngừa phù tai chuột trong thử nghiệm gây phù tai chuột bằng 12-otetradecanoylphorbol-13-acetat [11, 12].
Acid ursolic phân lập từ Plantago major thể hiện tác dụng chống viêm trong
thử nghiệm in vitro sinh tổng hợp prostaglandin (có sự xúc tác của COX-2). Acid
ursolic thể hiện tác dụng chống viêm đáng kể trên COX-2 với tỷ lệ chọn lọc COX2/COX-1 là 0,6 [13]. Trong thử nghiệm in vivo, tác dụng chống viêm của acid
ursolic lớn hơn acid oleanolic và indomethacin, cụ thể là giá trị ID50 của acid
ursolic, acid oleanolic và indomethacin lần lượt là 0,14/0,36/0,26 μmol/cm2, điều
này cho thấy acid ursolic có tác dụng chống viêm mạnh hơn gần 2 lần so với

indomethacin và gần 3 lần so với acid oleanolic [8].

1.3.2.2 Tác dụng bảo vệ gan
Acid ursolic có tác dụng bảo vệ gan trong các tổn thương gan do hóa chất,
cũng như bệnh xơ hóa gan cấp tính, xơ gan, acid ursolic được sử dụng đơn độc hoặc
phối hợp với các tác nhân bảo vệ gan khác. Tác dụng bảo vệ gan của acid ursolic có
thể do tác dụng chống oxy hóa và chống viêm của nó mang lại. Một trong những cơ


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
8

chế bảo vệ gan của acid ursolic là làm tăng lượng metallothionein - một protein giàu
cystein có chức năng giống glutathion trong việc bảo vệ gan khỏi các độc tố, loại bỏ
các kim loại nặng. Tuy nhiên đó không phải là cơ chế bảo vệ gan duy nhất của acid
ursolic [16].
Bên cạnh tác dụng bảo vệ gan trong các thử nghiệm gây tổn thương gan bởi
CCl4 hoặc D-galactosamin, acid ursolic còn có tác dụng ngăn ngừa tắc nghẽn đường
mật trong thử nghiệm gây tắc nghẽn đường mật bởi acetaminophen [18].
1.3.2.3 Tác dụng chống khối u
Acid ursolic từ Eriobotrya japonica thể hiện tác dụng ức chế sự đột biến trong
thử nghiệm sử dụng aflatoxin B1 trên Salmonella typhimurium [25].
Acid ursolic tách từ Rosmarinus officinalis có hiệu quả trong ức chế sự hình
thành liên kết cộng hóa trị của B[a]P với DNA của da và ức chế sự hình thành khối

u do B[a]P và 7,12-dimethyl-benz[a]anthracene [12].

1.3.2.4 Tác dụng hạ lipid máu
Acid ursolic giúp ngăn ngừa xơ vữa động mạch, giảm cholesterol máu (44%)
và mức β-lipoprotein (50%) ở thỏ và chuột [21].
Acid ursolic ức chế hoạt động của enzym FAS (fatty acid synthase) với IC50 =
6,0 μg/mL. Tác dụng ức chế là do sự đối kháng của acid ursolic với acetyl-CoA và
malonyl-CoA, nhưng không đối kháng với NaDPH [17].
1.3.3 Acid ursolic là nguyên liệu ban đầu để bán tổng hợp một số hợp chất có
tác dụng sinh học quan trọng
Từ acid ursolic có thể bán tổng hợp nên các hợp chất có tiềm năng ức chế
enzym glycogen phosphorylase để điều trị đái tháo đường type 2 [23], đặc biệt là
acid corosolic (chỉ khác acid ursolic là có thêm 1 nhóm OH ở vị trí số 2-alpha).


9

Hình 1.2 : CTCT của acid corosolic.
X.Wen et al (2007) đã tổng hợp acid corosolic từ acid ursolic theo sơ đồ [24]

Hình 1.3 : Sơ đồ bán tổng hợp acid corosolic từ acid ursolic.
1.3.4 Một số phương pháp phân lập acid ursolic
1.3.4.1 Phân lập acid ursolic từ lá Hồng (Diospyros kaki L.f.)
Nguyễn Thị Ngọc Lan (2012) đã chiết tách acid ursolic từ lá Hồng (Diospyros
kaki L.f.) làm chất đối chiếu phục vụ Công tác tiêu chuẩn hóa và kiểm tra chất
lượng dược liệu. Từ 2 kg dược liệu, tác giả đã chiết tách được 125 mg acid ursolic.
Phương pháp chiết tách được trình bày ở hình 1.4 [6].


Ket-noi.com

Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
10

Lá Hồng (2kg)
MeOH (7L x 3 lần)
Dịch chiết MeOH
- MeOH
Cao MeOH (170g)
+ 1,5L nước
Dịch nước
+ DCM (2L x 3 lần)

Dịch chiết nước

Cắn DCM (80g)
SK cột pha đảo
MeOH-H2O
20/1, 10/1

Phân đoạn I-II

1/1

5/1

Phân đoạn III
8,5g

Phân đoạn IV

SK cột pha đảo
MeOH-H2O
9/1

Phân đoạn III-1

1/1

5/1

Phân đoạn III-2

Phân đoạn III-3

SK cột pha đảo
MeOH-H2O (4:1)

Acid ursolic (125 mg)

Hình 1.4 : Sơ đồ chiết xuất và tinh chế acid ursolic từ lá Hồng (Diospyros kaki).


11

1.3.4.2 Phân lập acid ursolic từ vỏ táo (Malus domestica)

Rosa T.S. Frighetto (2007) đã chiết tách và tinh chế acid ursolic từ vỏ táo
(Malus domestica) bằng phương pháp sắc ký phân bố ngược dòng tốc độ cao
(HSCCC - high speed counter-current chromatography) [9].
Vỏ táo
+ n-hexan loại bỏ nhớt
Vỏ táo đã loại
bỏ nhớt
+ EtOH 96% trong 15h
Cất thu hồi dung môi
Cắn EtOH toàn
phần

Sắc ký cột silicagel
pha thuận
Rửa giải bằng CHCl3
Gom các phân đoạn
có acid ursolic
Tinh chế bằng phương
pháp HSCCC
Acid ursolic

Hình 1.5 : Sơ đồ chiết xuất và tinh chế acid ursolic từ vỏ táo (Malus domestica).


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi

phi
12

CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu
2.1.1 Nguyên liệu và hóa chất
Nguyên liệu : cành, lá Hương nhu tía được thu hái tại huyện Ba Vì, Hà Nội.
Mẫu tươi được giám định tên khoa học ở bộ môn Thực vật trường Đại học Dược Hà
Nội với mã số tiêu bản là HNIP/18039/13, tiêu bản được lưu tại Phòng tiêu bản cây
thuốc (HNIP) - trường Đại học Dược Hà Nội (phụ lục 1).
Hóa chất : Dung môi dùng trong chiết xuất là dung môi công nghiệp đã cất lại.
Các hóa chất, dung môi dùng cho kết tinh, tinh chế là dung môi tinh khiết của Trung
Quốc. Acid ursolic đối chứng được cung cấp bởi Khoa Hóa thực vật - Viện Dược
liệu, được sử dụng làm chất đối chứng cho các thí nghiệm sau này.
2.1.2 Trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu
- Các dụng cụ cần thiết trong quá trình thực nghiệm như bình nón, cốc có mỏ, ống
nghiệm, pipet, ...
- Thu hồi dung môi bằng máy cất quay Rotavapor R-200 của hãng BUCHI - Viện
Dược liệu.
- Xác định độ ẩm trên máy PRECISA HA60 - Viện Dược liệu.
- Cân phân tích PRECISA - Viện Dược liệu.
- Bản mỏng silicagel GF254 (Merck) tráng sẵn pha thuận - Viện Dược liệu.
- Phổ hồng ngoại đo trên máy quang phổ hồng ngoại IMPACT 410 NICOLET Viện Hóa học.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H, 13C đo trên máy BRUKER AVANCE AM500 FTNMR - Viện Hóa học.


13

- Phổ khối đo trên máy sắc kí lỏng- khối phổ SHIMADZU LC-MS 2010EV - Viện

Hóa học.

2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Định tính các nhóm chất hữu cơ có trong cây Hương nhu tía (Ocimum
sanctum L.)
Định tính các nhóm chất chính trong dược liệu theo phương pháp hóa học ghi
trong sách Thực tập Dược liệu và Bài giảng Dược liệu tập 1 của trường Đại học
Dược Hà Nội [1, 2].
2.2.2 Định tính acid ursolic trong cành lá Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.)
bằng SKLM
- Bản mỏng Silicagel GF254 pha thuận (Merck) được hoạt hóa trong vòng 1 giờ ở
nhiệt độ 1100C.
- Chuẩn bị dịch chấm sắc ký của mẫu thử và mẫu đối chứng :
+ Mẫu đối chứng : lấy khoảng 1 mg acid ursolic đối chứng hòa tan vào 1 mL
MeOH.
+ Mẫu thử : lấy khoảng 5 mg cắn MeOH hòa tan vào 1 mL MeOH (cắn được
chuẩn bị như mục 2.2.3).
- Các hệ dung môi khai triển :
Hệ 1 : CHCl3 : MeOH = 9 : 1 (tt/tt).
Hệ 2 : ether dầu hỏa : EtOAc = 4 : 6 (tt/tt).
Dung môi khai triển được bão hòa trong cốc sắc ký, đặt bản mỏng đã chấm
dịch chiết vào cốc, chạy theo chiều từ dưới lên trên. Sau khi khai triển xong, lấy bản
mỏng ra, để khô tự nhiên.
- Phương pháp phát hiện : Quan sát các vết dưới ánh sáng tử ngoại (UV) ở 2 bước sóng
254 nm và 365 nm, phun dung dịch H2SO4 10% trong EtOH, hơ nóng trên bếp điện.


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai

tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
14

2.2.3 Phân lập bằng sắc ký cột
- Chiết xuất : Chiết hồi lưu cành lá Hương nhu tía (phơi sấy khô, xay nhỏ) với
MeOH. Sau đó, gộp dịch chiết, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm tới cắn.
- Chiết các phân đoạn : Phân tán đều cắn MeOH toàn phần vào một lượng tối thiểu
nước nóng, sau đó chiết lần lượt với các dung môi theo thứ tự tăng dần độ phân cực
là n-hexan, DCM, EtOAc. Thu các phần dịch chiết, rồi đem cất thu hồi dung môi
dưới áp suất giảm tới cắn.
- Phân lập bằng sắc ký cột :
+ Lựa chọn phân đoạn DCM để tiến hành sắc ký.
+ Chất hấp phụ : Silicagel 60 (cỡ hạt 0,04 - 0,063 mm) được hoạt hóa ở 110 0C
trong 1 giờ. Để nguội ở bình hút ẩm.
+ Cột sắc ký : kích thước 5x25 cm.
+ Hệ dung môi rửa giải : Sử dụng hệ dung môi DCM và MeOH tăng dần độ phân
cực (gradient lượng MeOH từ 0% đến 10%).
- Độ tinh khiết của chất phân lập được kiểm tra sơ bộ bằng SKLM, đo điểm chảy.
Sau đó sử dụng các phương pháp phân tích phổ (phổ hồng ngoại IR, khối phổ ESIMS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H/13C-NMR), tham khảo cơ sở dữ liệu phổ của
các tài liệu đã công bố để biện giải cấu trúc chất phân lập được.
2.2.4 Phương pháp chiết xuất acid ursolic từ Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.)
Chiết cành, lá Hương nhu tía bằng phương pháp hồi lưu với hệ dung môi
EtOH và EtOAc, dịch chiết được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm tới cắn.
Phân tán cắn vào một lượng tối thiểu nước nóng, chiết nhiều lần với DCM, gộp các
phần dịch chiết DCM. Cất thu hồi bớt dung môi, sau đó đun hồi lưu lớp DCM với
than hoạt để than hoạt hấp phụ acid ursolic, rửa giải acid ursolic ra khỏi than hoạt
bằng dung môi aceton, cất thu hồi dung môi thu được acid ursolic thô.

15

Kết tinh acid ursolic : sử dụng phương pháp kết tinh bằng nhiệt độ, dựa trên sự
chênh lệch độ tan của acid ursolic trong EtOH ở nhiệt độ sôi (1/35, kl/tt) và trong
EtOH ở nhiệt độ thường (1/178, kl/tt) [26].
2.2.5 Khảo sát một số thông số của quá trình chiết xuất
Tiến hành khảo sát một số thông số ảnh hưởng đến hiệu suất chiết xuất :
• Dung môi.
• Nhiệt độ.
• Tỷ lệ dung môi/dược liệu.
• Số lần chiết xuất.
Hàm lượng acid ursolic thô chiết được so với khối lượng dược liệu khô được tính
theo công thức :

m
A(%) =

x 100

M (1-b)
Trong đó :
A : hàm lượng phần trăm (%) của acid ursolic thô.
m : khối lượng acid ursolic thô thu được.
b : hàm ẩm dược liệu.
M : khối lượng dược liệu.

CHƯƠNG 3 : THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ
BÀN LUẬN

3.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học
Định tính các nhóm chất trong cành, lá Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.)
bằng phản ứng hóa học.


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
16

- Chuẩn bị dịch chiết cồn : Cho 5 g dược liệu vào bình nón dung tích 100 mL, thêm
50 mL EtOH 900, đun cách thủy 10 phút, lọc nóng. Dùng dịch lọc làm các phản ứng.
- Chuẩn bị dịch chiết ether dầu hỏa : Cho 5 g dược liệu vào bình nón dung tích 50
mL, đổ ngập ether dầu hỏa, ngâm qua đêm, lọc. Dịch lọc dùng để làm các phản ứng.
3.1.1 Định tính alcaloid
Lấy 5 g dược liệu cho vào bình nón dung tích 50 mL, thêm dung dịch H2SO4
2% cho ngập dược liệu, đun sôi vài phút. Để nguội, lọc dịch chiết vào bình gạn,
kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac 6N đến pH kiềm. Chiết alcaloid bằng
cloroform (CHCl3) 3 lần, mỗi lần 5 mL. Dịch chiết cloroform được gộp lại và lắc
với H2SO4 2%. Gạn lấy lớp nước acid, cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống khoảng 1
mL rồi thêm vào :
- Ống 1 : 2-3 giọt TT Dragendorff, dung dịch trong suốt, không có tủa vàng cam.
- Ống 2 : 2-3 giọt TT Mayer, dung dịch trong suốt, không có tủa vàng nhạt.
- Ống 3 : 2-3 giọt TT Bouchardat, dung dịch trong suốt, không có tủa nâu.
Kết luận : dược liệu không có alcaloid.
3.1.2 Định tính anthranoid

- Phản ứng Borntraeger: cho 5 g dược liệu vào bình nón dung tích 100 mL, thêm 10
mL dung dịch H2SO4 25% cho ngập dược liệu rồi đun sôi trong vài phút. Lọc dịch
chiết vào bình gạn, để nguội rồi lắc với 5 mL ether. Lấy 1 mL dịch ether cho vào
ống nghiệm, thêm 1mL KOH 10%, lắc kỹ, quan sát thấy lớp KOH không có màu.
Kết luận : dược liệu không có anthranoid.
3.1.3 Định tính flavonoid
- Phản ứng Cyanidin : cho 2 mL dịch chiết cồn vào một ống nghiệm, thêm một ít
bột Mg kim loại, rồi thêm vài giọt HCl đặc. Đun nóng trên bếp cách thủy sau vài
phút thấy xuất hiện màu tím đỏ.


17

- Phản ứng với dung dịch FeCl3 5% : cho 2 mL dịch chiết cồn vào một ống nghiệm,
thêm 2-3 giọt dung dịch FeCl3 5%, thấy dung dịch chuyển màu xanh sẫm.
- Phản ứng với kiềm : Nhỏ vài giọt dịch chiết cồn lên một mảnh giấy lọc, hơ khô rồi
đặt mảnh giấy lên miệng lọ amoniac đặc thấy màu vàng hiện rõ, khi soi dưới đèn tử
ngoại thấy có màu vàng sáng.
Kết luận : dược liệu có chứa flavonoid.
3.1.4 Định tính saponin
- Hiện tượng tạo bọt : Lấy 2 ống nghiệm cỡ bằng nhau, cho vào ống thứ nhất 5 mL
HCl 0,1 N và ống thứ 2 là 5 mL NaOH 0,1 N. Cho thêm vào mỗi ống 2-3 giọt dịch
chiết cồn rồi bịt ống nghiệm, lắc mạnh cả 2 ống trong 15 giây. Để yên, thấy cột bọt
ở 2 ống bền vững và bằng nhau.
- Phản ứng Salkowski : Lấy 10 mL dịch chiết cồn cho vào bình nón và thêm 10 mL
H2SO4 loãng. Đun sôi cách thủy vài phút. Để nguội, chiết với cloroform. Lấy
khoảng 2 mL dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm. Thêm từ từ 1 mL H2SO4
đặc theo thành ống nghiệm, quan sát thấy giữa hai lớp xuất hiện vòng màu xanh lá.
- Phản ứng Liebermann - Burchardt : Lấy 1 mL dịch chiết cloroform ở trên cho vào
1 ống nghiệm rồi cô tới cắn. Cho vào cắn 0,5 mL anhydrid acetic, lắc đều, đặt

nghiêng ống 450 rồi thêm 0,5 mL acid sulfuric đặc theo thành ống nghiệm để dịch
lỏng trong ống chia thành 2 lớp, quan sát thấy mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng
trong ống nghiệm có màu đỏ.
Kết luận : dược liệu có chứa saponin, sơ bộ là nhóm triterpenoid.
3.1.5 Định tính tanin
- Phản ứng với dung dịch gelatin 1% : lấy 1g dược liệu cho vào bình nón dung tích
50 mL. Thêm nước ngập dược liệu rồi đun sôi vài phút. Lọc nóng, lấy 1 mL dịch
lọc cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch gelatin 1%, không quan sát thấy
tủa bông.
Kết luận : dược liệu không có tanin.