Khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng lên khả năng tạo enzym của vi khuẩn

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN NGỌC ÁNH

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI
TRƯỜNG DINH DƯỠNG LÊN KHẢ
NĂNG TẠO ENZYM CỦA VI KHUẨN
Bacillus subtilis natto
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2013


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN NGỌC ÁNH

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI
TRƯỜNG DINH DƯỠNG LÊN KHẢ
NĂNG TẠO ENZYM CỦA VI KHUẨN
Bacillus subtilis natto

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
TS. Đàm Thanh Xuân
Nơi thực hiện:
Bộ môn Công nghiệp dược

HÀ NỘI - 2013


LỜI CẢM ƠN

Với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn đến cô
giáo, TS. Đàm Thanh Xuân và DS. Lê Ngọc Khánh, những người thầy đã
tận tình hướng dẫn và chỉ bảo cho tôi trong thời gian làm khóa luận.
Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo, các anh chị kỹ
thuật viên trong bộ môn Công Nghiệp Dược đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi
trong suốt thời gian nghiên cứu để hoàn thành khóa luận.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy
cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi
cho tôi trong thời gian tôi học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân,
bạn bè đã luôn giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian học tập vừa qua.

Hà Nội, ngày 21 tháng 5 năm 2013.
Sinh viên
Nguyễn Ngọc Ánh


Ket-noi.com

Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ.........................................................................................................1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN ....................................................................................2
1.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis natto ........................................................................2
1.1.1. Phân loại khoa học.................................................................................2
1.1.2. Nguồn gốc .............................................................................................2
1.1.3. Đặc điểm hình thái .................................................................................2
1.1.4. Đặc điểm sinh dưỡng.............................................................................3
1.1.5. Đặc điểm sinh lý ....................................................................................3
1.1.6. Sản phẩm trao đổi chất của B. subtilis natto ..........................................3
1.2. Natto và Nattokinase.........................................................................................4
1.2.1. Natto.......................................................................................................4
1.2.2. Các enzym có khả năng tiêu huyết khối trước Nattokinase......................5
1.2.3. Nattokinase.............................................................................................6
1.3. Quá trình lên men sản xuất enzym ..................................................................10
1.3.1. Các phương pháp lên men sản xuất enzym từ vi sinh vật......................10
1.3.2. Thu nhận chế phẩm enzym....................................................................11
1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới sự tổng hợp enzym........................................11
1.4. Các nghiên cứu về ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng sinh
enzym Nattokinase của vi khuẩn ...........................................................................12
1.4.1. Ngoài nước...........................................................................................13
1.4.2. Trong nước...........................................................................................13

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................14
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị sử dụng.................................................................14
2.1.1. Vi sinh vật sử dụng ...............................................................................14


2.1.2. Nguyên liệu, hóa chất sử dụng:............................................................. 14
2.1.3. Các môi trường sử dụng: ......................................................................14
2.1.4. Thiết bị .................................................................................................15
2.1.5. Dụng cụ ................................................................................................ 16
2.2. Nội dung nghiên cứu ......................................................................................16
2.2.1. Phân lập vi khuẩn B. subtilis natto từ sản phẩm Natto và xác định enzym
do Bacillus subtilis natto tạo ra. .....................................................................16
2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện dinh dưỡng lên khả năng tạo enzym
của B. subtilis natto. .......................................................................................16
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:..................................................................16
2.3.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn từ sản phẩm Natto.............................. 16
2.3.2. Phương pháp nhuộm Ogiestka.............................................................. 17
2.3.3. Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng ..........................................17
2.3.4. Phương pháp nhân giống trong môi trường lỏng ..................................17
2.3.5. Phương pháp lên men chìm vi khuẩn ....................................................18
2.3.6. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng lên khả
năng sinh enzym ............................................................................................. 18
2.3.7. Phương pháp xác định sự có mặt của enzym trong sản phẩm Natto......19
2.3.8. Phương pháp xác định enzym trong dịch trong và trong sinh khối của
dịch lên men vi khuẩn Bacillus subtilis natto ..................................................19
2.3.9. Phương pháp thử hoạt tính protease:....................................................19
2.3.10. Phương pháp thử hoạt tính amylase....................................................20
2.3.11. Phương pháp thử hoạt tính cellulase: .................................................20
2.3.12. Phương pháp thử hoạt tính fibrinolytic (tiêu fibrin) ............................ 21
CHƯƠNG BA: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ...........................22

3.1. Phân lập vi khuẩn B. subtilis natto từ chế phẩm Natto và xác định enzym do vi
khuẩn sinh ra .........................................................................................................22
3.1.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis natto từ chế phẩm Natto.................22
3.1.2. Xác định một số enzym do vi khuẩn sinh ra...........................................23


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

3.1.3. Xác định enzym trong sản phẩm Natto.................................................25
3.2. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng sinh enzym của
vi khuẩn B. subtilis natto .......................................................................................26
3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn hydratcarbon ......................................26
3.2.2. Lựa chọn nồng độ maltose thích hợp nhất ............................................30
3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của đậu tương và chất cảm ứng............................ 32
3.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của một số muối vô cơ..........................................34
3.2.5. Xây dựng môi trường tổng hợp cho vi khuẩn Bacillus subtilis natto sinh
protease .........................................................................................................35
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ............................................................................................ 39


DANH MỤC CÁC BẢNG

Tên bảng

Trang

Bảng 1.1: Thành phần chính trong 100g Natto

4

Bảng 2.2: Thực phẩm chức năng chứa Nattokinase

9

Bảng 2.1 . Các nguyên liệu, hóa chất sử dụng

14

Bảng 2.2. Các thiết bị sử dụng

15

Bảng 3.1. Kết quả định tính enzym trong dịch ly tâm và trong sinh

24

khối
Bảng 3.2. Hoạt tính enzym thể hiện bằng đường kính vòng phân

25

giải cơ chất của dịch enzym chiết từ phần hạt đậu và phần dịch
nhớt của Natto
Bảng 3.3. Hoạt tính protease của dịch lên men khi nuôi cấy trong

27

môi trường MT2 và môi trường MT2 có bổ sung các nguồn
hydratcarbon khác nhau thể hiện bằng đường kính vòng phân giải
casein
Bảng 3.4. Hoạt tính amylase và cellulase của dịch lên men khi

27

nuôi cấy trong môi trường MT2 và môi trường MT2 có bổ sung
các nguồn hydratcarbon khác nhau thể hiện bằng đường kính
vòng phân giải cơ chất
Bảng 3.5. Thời gian tiêu fibrin của dịch lên men thu được khi nuôi

29

cấy trong môi trường có bổ sung các nguồn hydratcarbon khác
nhau
Bảng 3.6. Hoạt tính protease của dịch lên men khi nuôi cấy trong

30


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi

phi

môi trường MT2 và môi trường MT2 có bổ sung maltose ở các
nồng độ khác nhau thể hiện bằng đường kính vòng phân giải
casein
Bảng 3.7. Hoạt tính amylase và cellulase của dịch lên men khi

31

nuôi cấy trong môi trường MT2 có bổ sung maltose ở các nồng độ
khác nhau thể hiện bằng đường kính vòng phân giải cơ chất
Bảng 3.8. Hoạt tính protease của dịch lên men khi nuôi cấy trong

32

môi trường MT2 và môi trường MT2 có bổ sung đậu tương và
casein thể hiện bằng đường kính vòng phân giải cơ chất
Bảng 3.9. Hoạt tính enzyme của dịch lên men khi nuôi cấy trong

34

môi trường MT2 và MT2 có bổ sung một số muối vô cơ, thể hiện
bằng đường kính vòng phân giải cơ chất
Bảng 3.10. Hoạt tính enzyme của dịch lên men khi nuôi cấy trong

36

môi trường MT2 và môi trường tổng hợp, thể hiện bằng đường
kính vòng phân giải cơ chất
Bảng 3.11. Thời gian tiêu fibrin của dịch lên men thu được khi

nuôi cấy trong môi trường canh thang và môi trường tổng hợp

37


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ

Tên hình

Trang

Hình 1.1: Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis natto

2

Hình 1.2. Cấu trúc bậc 3 của Nattokinase

7

Hình 1.3. Cơ chế tiêu fibrin của Nattokinase

8

Hình 3.1. Ảnh khuẩn lạc phân lập được và hình ảnh tế bào vi

22

khuẩn khi soi trên kính hiển vi độ phóng đại 1.000 lần
Hình 3.2. Kết quả thử hoạt tính protease, amylase, cellulase

24

trong dịch ly tâm và dịch chiết từ sinh khối
Hình 3.3. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nguồn hydratcarbon

28

đến hoạt tính enzym của vi khuẩn
Hình 3.4. Biểu đồ so sánh khả năng sinh enzym của Bacillus
subtilis natto khi nuôi cấy trong môi trường MT2 và môi trường
tổng hợp

37


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

STT

Chữ viết tắt

Tên đầy đủ

1

B. subtilis natto

Bacillus subtilis natto

2

E. coli

Escherichia coli

3

CU

Caseinolytic units

4

FU

Fibrinolytic units

5

U

Unit

6

t- PA

Tissue plasminogen activator

7

γ – PGA

γ - polyglutamat

8

Na CMC

Natri carboxymethylcellulose


1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, tỷ lệ mắc bệnh nghẽn động mạch do các cục máu đông như chứng
nhồi máu cơ tim hay nhồi máu não đang tăng cao ở Việt Nam cũng như trên thế
giới. Các loại thuốc đang dùng hiện nay như urokinase, streptokinase,... được sử
dụng chủ yếu trong cấp cứu tai biến và có nhiều tác dụng phụ. Nattokinase là enzym
có nguồn gốc từ Natto, một món ăn truyền thống của Nhật Bản.
Nattokinase là một enzym protease do vi khuẩn Bacillus subtilis natto sinh ra,

được sử dụng để phòng và phá các cục máu đông do có tác dụng tiêu fibrin mạnh,
an toàn khi sử dụng.
Trong điều kiện lên men chìm, vi khuẩn Bacillus subtilis natto còn có khả
năng sinh nhiều enzym ngoại bào như protease, amylase, cellulase... Việc thay đổi
môi trường dinh dưỡng có thể ảnh hưởng đến sự sinh enzym của vi khuẩn. Vì thế,
lựa chọn một môi trường tốt nhất cho enzym sinh lượng lớn protease và giảm bớt
các enzym khác đóng vai trò quan trọng trong việc tách chiết protease, sau đó là
Nattokinase.
Do đó, khóa luận “Khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả
năng sinh enzym của vi khuẩn Bacillus subtilis natto” được thực hiện với hai mục
tiêu:
1. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis natto từ sản phẩm Natto trên thị trường và
xác định một số enzym do vi khuẩn sinh ra.
2. Bước đầu lựa chọn môi trường nuôi cấy cho Bacillus subtilis natto sản xuất
protease tiêu fibrin.


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
2

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis natto
B. subtilis natto (còn được gọi là Bacillus subtilis var. natto) là một chủng thuộc
loài Bacillus subtilis, được giáo sư Sawamura phân lập và định danh lần đầu tiên

vào năm 1905 [ 21].
1.1.1. Phân loại khoa học
B. subtilis natto là một vi khuẩn thật (Eurobacteria) thuộc:
Họ (Family): Bacillaceae
Chi (Genus): Bacillus
Loài (Species): Bacillus subtilis
Phân loài (Subspecies): Bacillus subtilis natto [32].
1.1.2. Nguồn gốc
B. subtilis natto được giáo sư Sawamura tìm thấy trong Natto, một món ăn truyền
thống có từ hàng ngàn năm trước của người Nhật. B. subtilis natto có nhiều trong
rơm rạ, cỏ khô... và phát triển tốt trong các loại đậu, đặc biệt là đậu tương; vi khuẩn
này cũng phát triển trên thực phẩm có nguồn gốc động vật và thực vật khác như: tảo
biển, cá, thịt, tôm, cua...[13], [22].
1.1.3. Đặc điểm hình thái

Hình 1.1: Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis natto [27], [30]

B. subtilis natto là trực khuẩn hiếu khí, bắt màu Gram dương, nội bào tử hình que
có kích thước dưới 1μm. Các tế bào vi khuẩn đứng riêng rẽ hay nối với nhau thành


3

chuỗi. Khuẩn lạc khô, không màu hoặc màu xám nhạt, có kích thước lớn và hình
dạng bất định. Bề mặt hơi nhăn hoặc tạo ra lớp màng mịn lan rộng trên bề mặt
thạch, có mép nhăn bám chặt vào môi trường thạch [20],[ 22].
1.1.4. Đặc điểm sinh dưỡng
B. subtilis natto là sinh vật dị dưỡng, có khả năng sử dụng nhiều nguồn
hydratcarbon: đường đơn như glucose, fructose..., đường đôi như maltose, lactose,
saccharose..., polysaccharid như tinh bột... Nguồn nitơ cần thiết cho sự phát triển

của vi khuẩn là protein và aminoacid. B. subtilis natto có thể sử dụng dễ dàng acid
glutamic, arginine, acid aspartic... nhưng không sử dụng được threonine, trypophan,
phenylalanine và methionine [13],[22].
B. subtilis natto cần biotin cho sự phát triển, trong môi trường không có biotin
các tế bào sinh dưỡng không thể phát triển và bào tử của chúng không nảy mầm
được. Nồng độ biotin tối thiểu cần thiết cho sự nảy mầm của bào tử là 0,1% [13],
[22].
1.1.5. Đặc điểm sinh lý
B. subtilis natto là sinh vật hiếu khí bắt buộc, cần oxy để sinh trưởng và có thể
phát triển ở nồng độ oxy lớn hơn 3%. B. subtilis natto phát triển trong khoảng nhiệt
độ rộng. Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn phát triển là từ 30- 50ºC, nhiệt độ tối ưu là
37°C. Nhiệt độ tối ưu cho sự nảy mầm của bào tử là 40°C. Bào tử B. subtilis natto
vẫn có thể nảy mầm sau khi bảo quản ở 0°C. Ở 55°C, vi khuẩn ngừng phát triển và
sự ly giải tế bào sinh dưỡng diễn ra. B. subtilis natto phát triển ở pH trung tính hoặc
hơi kiềm, khoảng pH tối ưu cho sự sinh trưởng là 7,2- 7,6. Sự nảy chồi và phát triển
bị ức chế ở pH ≤ 4,5 [ 13], [22].
1.1.6. Sản phẩm trao đổi chất của B. subtilis natto
Các sản phẩm trao đổi chất của B. subtilis natto rất đa dạng, nhưng quan trọng
nhất là hệ enzym. Vi khuẩn này sản xuất một lượng lớn các enzym được ứng dụng
nhiều trong công nghiệp như: protease, amylase, phytase...[22], trong đó có
Nattokinase, một protease ngoại bào là có ý nghĩa nhất và đang được nghiên cứu,
ứng dụng rộng rãi.


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi

phi
4

1.2. Natto và Nattokinase
1.2.1. Natto
Natto là một món ăn truyền thống của Nhật Bản, là những hạt đậu nành đã luộc
chín và lên men với vi khuẩn B. subtilis natto ở nhiệt độ khoảng 40oC trong vòng
14-18 giờ [13],[19]. Natto chứa nhiều chất bổ dưỡng cho sức khỏe trong đó enzym
Nattokinase là một hoạt chất sản sinh trong quá trình lên men Natto được xem là
hoạt chất có hiệu quả trong việc ngăn ngừa các chứng bệnh tim mạch [19].

Bảng 1.1: Thành phần chính trong 100g natto: [15], [24]
Thành phần

Hàm lượng

Calorie

200 Kcal

Protein

16,5 g

Lipid

10,0 g

Đường

9,8 g

Nattokinase

7100 CU

Vitamin B1

0,07 mg

Vitamin B2

0,56 mg

Vitamin B3

1,1 mg

Vitamin K2

870 μg

Calci

90 mg

Từ hàng ngàn năm trước, Natto đã trở thành món ăn không thể thiếu của người
Nhật do nó chứa nhiều chất bổ dưỡng cho sức khỏe, có lợi cho tiêu hóa, tim mạch
và là một trong những món ăn làm tăng tuổi thọ của người Nhật. Vì thế, nhiều
nghiên cứu về Natto đã được tiến hành.

Năm 1905, tiến sĩ Shin Sawamura (đại học Tokyo) đã tách được hai loại vi khuẩn
từ Natto gồm vi khuẩn B. subtilis natto có vai trò lên men hạt đậu, gây ra mùi
hương đặc biệt và vi khuẩn Bacillus mesentericus vulgaris tạo chất chất nhớt đặc
trưng và vị ngọt [21]. Năm 1913, Sawamura công bố kết quả nghiên cứu của mình


5

qua nhiều mẫu Natto và kết luận vi khuẩn chủ yếu trong các mẫu chính là B. subtilis
natto. Ông đã đưa ra mô tả chi tiết về đặc điểm vi khuẩn, enzyme và nhu cầu dinh
dưỡng của nó. Ngày nay, các sản phẩm Natto trên thị trường được lên men với vi
khuẩn B. subtilis natto [21].
Năm 1986, tiến sĩ Sumi Hiroyuki công bố toàn bộ kết quả nghiên cứu về tác
dụng của Natto sau khi thử nghiệm gần 200 loại thực phẩm khác nhau để so sánh,
xác định Natto có khả năng phân hủy huyết khối một cách hữu hiệu và mạnh nhất
trong các loại thực phẩm. Ông đã xác định enzym Nattokinase, một hoạt chất sản
sinh trong quá trình lên men Natto có vai trò phân hủy huyết khối một cách hữu
hiệu, mạnh gấp 4 lần enzym nội sinh làm tan máu đông là plasmin [21, [23].
Tại hội nghị quốc tế về dinh dưỡng tổ chức tại New Zealand (30/4-3/5/2006)
giáo sư Masafumi Kitakaze đã khẳng định Natto có tác dụng làm giảm rõ rệt các
chứng mỡ máu cao (triglyceride và cholesterol). Ông kêu gọi cộng đồng thế giới
cải thiện nếp sống sinh hoạt và tiêu thụ Natto trước nguy cơ béo phì do “thừa” dinh
dưỡng và các chứng bệnh hiểm nghèo, nan y (tiểu đường, ung thư) ngày càng tăng
khắp nơi trên thế giới [31].
1.2.2. Các enzym có khả năng tiêu huyết khối trước Nattokinase
Trước khi Nattokinase được nghiên cứu rộng rãi, có nhiều enzym đã được ứng
dụng trong trị liệu về huyết khối như Streptokinase, Urokinase, Alteplase... Cơ chế
chung của các enzym này là: hoạt hóa plasminogen thành plasmin có tác dụng phân
giải fibrin, fibrinogen cùng các yếu tố của quá trình đông máu (yếu tố V, VIII,
XIIIa), đồng thời các sản phẩm giáng hóa của fibrin và fibrinogen cũng có tác dụng

kháng thrombin, ức chế kết tập tiểu cầu để ngăn quá trình đông máu. Vì thế plasmin
có tác dụng làm tan huyết khối, giúp tái lập lại sự tưới máu cho các mô [1], [2]. Căn
cứ vào tính chọn lọc trên fibrin mà người ta chia các enzyme tiêu huyết khối thành
hai nhóm:
a. Enzym tiêu huyết khối không tác dụng chọn lọc trên fibrin: là những thuốc tác
động đến cả plasminogen gắn hoặc không gắn với fibrin vì thế gây tác dụng không
mong muốn là chảy máu toàn thân. Một số enzym điển hình của nhóm này như:


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
6

- Streptokinase (SK): chiết xuất từ môi trường nuôi cấy các chủng Streptococcus
haemolyticus tan huyết β nhóm C. Streptokinase là protein lạ nên khi vào cơ thể sẽ
kích thích cơ thể sinh kháng thể làm mất hoạt tính và gây dị ứng.
-Urokinase (UK): chiết xuất từ nước tiểu người, từ môi trường nuôi cấy tế bào
thận bào thai, hoặc có thể sản xuất bằng công nghệ gen.
-Anistreplase (APSAC): là streptokinase thay đổi cấu trúc phân tử bằng công
nghệ sinh học [1], [2].
b. Enzym tiêu huyết khối tác dụng chọn lọc trên fibrin: là những enzym hoạt hóa

plasminogen gắn trên fibrin nên có ưu điểm là ít gây chảy máu toàn thân, hiệu lực
tiêu fibrin mạnh hơn và không gây dị ứng khi sử dụng. Tuy nhiên, do sản xuất bằng
công nghệ cao nên giá thành của chúng khá đắt. Một số enzym điển hình của nhóm

này như:
- Alteplase (t-PA): có nguồn gốc từ các tế bào nội mạc của thành mạch, được tiết
ra trong hầu hết dịch ngoại bào của cơ thể như huyết tương, nước tiểu, nước bọt,
nước mắt... Alteplase trong lâm sàng được sản xuất bằng công nghệ tái tổ hợp ADN
từ tế bào buồng trứng chuột đồng Trung Quốc và gọi là rt- PA.
- Pro-urokinase: là tiền chất của Urokinase, có trong nước tiểu. Pro-urokinase
được sản xuất bằng công nghệ tái tổ hợp từ vi khuẩn E. Coli.
Mặc dù một số enzym đề cập ở trên được sử dụng rộng rãi trong điều trị huyết
khối hiện nay, chúng vẫn có nhược điểm, chẳng hạn như chi phí cao, thời gian bán
thải ngắn, nguy cơ chảy máu toàn thân, riêng Streptokinase còn gây phản ứng dị
ứng [9]. Hiện nay, các tác nhân làm tan huyết khối có trong tảo, nấm và thực phẩm
lên men đang được nghiên cứu để cung cấp nguồn thuốc trị huyết khối an toàn và
giá rẻ [9].
1.2.3. Nattokinase
a. Nguồn gốc
Nattokinase (ký hiệu EC 3.4.21.62) là một enzym có hoạt tính tiêu fibrin rất
mạnh có nguồn gốc từ món ăn truyền thống của Nhật Bản có tên là Natto [23].


7

Nattokinase còn được gọi là: Subtilisin NAT, Subtilisin BSP, enzyme trong Natto
[32].
b. Đặc điểm cấu tạo
Nattokinase có cấu trúc là một chuỗi polypeptid đơn gồm 275 gốc acid amin và
không có cầu nối disulfid trong phân tử. Trọng lượng phân tử là 27,728 Da và pI=
8,6 ± 0,3 [12]. Là enzym thuộc họ subtilisin của protease serin, Nattokinase cũng có
trung tâm hoạt động bao gồm nhóm hydroxyl của Ser-221, imidazol của His-64 và
nhóm carboxyl của Asp-32. Cơ chất đặc hiệu của Nattokinase là: Suc-Ala-Ala- ProPhe-pNA [12].

Hình 1.2 . Cấu trúc bậc 3 của Nattokinase [32]
c. Tính chất
Nattokinase bền vững ở pH từ 6,0 – 10,0, bất hoạt ở pH nhỏ hơn 5 và pH lớn hơn
11, hoạt tính tối ưu ở pH =8- 9. Nattokinase bền vững ở nhiệt độ dưới 40°C, bị giảm
hoạt tính khi nhiệt độ tăng lên 50°C và bị phân hủy ở 70°C [12], [13]. Hoạt tính của
Nattokinase bị ức chế 1 phần bởi HgCl2, H2O2 và bị ức chế hoàn toàn bởi
phenylmethylsulfonyl fluorides (PMSF), ethylendiamin tetraacetic acid (EDTA),
các ion Fe3+ và Al3+ cũng ức chế enzym này [9], [13], [25]. Hoạt tính của
Nattokinase tăng lên khi có mặt MgSO4, CaCl2, MnCl2 [ 9].
d. Cơ chế tiêu fibrin
Nattokinase phân huỷ fibrin trực tiếp hay gián tiếp thông qua ba con đường khác
nhau:


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
8

Hình 1.3 . Cơ chế tiêu fibrin của Nattokinase [19]

A. Nattokinase trực tiếp giáng hoá fibrin trong cục máu đông, làm biến đổi fibrin từ
dạng polymer không tan thành các sản phẩm giáng hoá có trọng lượng phân tử thấp,
hoà tan. Như vậy, Nattokinase có cơ chế tiêu fibrin giống với plasmin.
B. Nattokinase giáng hoá fibrin gián tiếp bằng cách hoạt hoá Pro-urokinase thành
Urokinase, dẫn đến thúc đẩy quá trình biến đổi plasminogen thành plasmin, làm

tăng plasmin nội sinh là enzyme phân giải fibrin tự nhiên trong cơ thể.
C. Nattokinase giáng hoá fibrin gián tiếp bằng cách hoạt hoá quá trình tổng hợp tPA (Alteplase) trong huyết tương. Kết quả là tăng cường tạo thành plasmin.
Đặc biệt, Nattokinase không ảnh hưởng đến quá trình hình thành fibrin từ
fibrinogen, do đó không làm suy giảm cơ chế đông máu bình thường của cơ thể. Vì
vậy, Nattokinase không gây ra biến chứng chảy máu như các thuốc chống đông máu
bình thường [19].
e. Công dụng
Nattokinase có tác dụng phòng và phá các cục máu đông do có khả năng tiêu
fibrin một cách hữu hiệu (cao gấp 4 lần plasmin), đồng thời rất an toàn cho cơ thể
khi hấp thụ qua đường uống [23]. Nattokinase có thể hòa tan cục máu đông khi
uống 100mg/ ngày và tác dụng của nó kéo dài 8- 12 giờ. Do ưu điểm an toàn, hiệu
lực cao, giá rẻ hơn rất nhiều so với các thuốc tan huyết khối thông thường,


9

Nattokinase có tiềm năng lớn trong trị liệu huyết khối [21],[28]. Ngoài ra,
Nattokinase còn có tác dụng tốt trong các bệnh tim mạch như làm giảm huyết áp,
giảm lipid máu, ngăn xơ vữa động mạch...[ 28]
f. Nattokinase dùng trong thực phẩm chức năng và thuốc
Nattokinase lần đầu tiên được phân lập và bán trên thị trường dưới tên NSK-SD
vào năm 1998 bởi Phòng thí nghiệm sinh học Nhật Bản, đã loại bỏ vitamin K2.
Nattokinase đôi khi được sử dụng trong y học như là một tác nhân làm giảm cục
máu đông, thay thế cho điều trị bằng aspirin hàng ngày. Tuy nhiên, sự thay thế này
không được khuyến cáo [28].
Hiện nay, có rất nhiều các sản phẩm chứa Nattokinase được sản xuất dưới dạng
thực phẩm chức năng với mục đích hỗ trợ phòng ngừa và điều trị các bệnh lý về tim
mạch [28].

Bảng 2.2: Thực phẩm chức năng chứa Nattokinase [28], [29]

Sản phẩm

Hàm lượng
Nattokinase

Dạng

bào Nhà sản xuất

(FU)

chế

Nattopes

300

Viên nang

Công ty IMC, Việt Nam

S- Nattokinase

5.000

Viên nang

United Biomedical, Mỹ

Nattokinase

1.000

Viên nang

CNS PHARM KOREA Co., Ltd,
Hàn Quốc

Nattokinase

3.000

Viên nang

plus
Nattokinase
plus Fucoidan

Food Science of Vermont dba Da
Vinci Laboratories, Mỹ

2.000

Viên nang

Umeken, Nhật Bản


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho

kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
10

1.3. Quá trình lên men sản xuất enzym
1.3.1. Các phương pháp lên men sản xuất enzym từ vi sinh vật
a. Phương pháp lên men bề mặt
Đây là phương pháp chủ yếu sử dụng cơ chất là các loại cám và bột: cám mì,
cám gạo, bột đậu, bột ngô...được hấp chín và làm ẩm sau đó trộn thêm trấu và mùn
cưa để tăng độ xốp. Vi sinh vật được nuôi ở nhiệt độ khoảng 28- 30°C, độ ẩm 5565%, trong thời gian nuôi từ 36- 48 giờ.
Ưu điểm của phương pháp lên men bề mặt là :
-

Nồng độ enzym cao hơn lên men chìm.

-

Dễ sấy khô và ít hao tổn hoạt tính enzym.

-

Chế phẩm thô dễ vận chuyển.

-

Thiết bị đơn giản, tốn ít năng lượng.

-

Có thể xử lý cục bộ khi bị nhiễm.
Tuy nhiên, phương pháp này cũng có nhược điểm đó là khó kiểm soát chính xác

độ ẩm, sinh khối, lượng O2, CO2 nên chất lượng chế phẩm ở các mẻ không đồng
đều, tốc độ sản xuất sản phẩm thấp hơn lên men chìm, khó cơ giới hóa, tự động
hóa, cần diện tích nuôi lớn...[4], [5]. Hiện nay, phương pháp lên men bề mặt ít
được sử dụng trong sản xuất kháng sinh và các chế phẩm sinh học nhưng vẫn được
sử dụng trong lên men sản xuất enzym [4].
b. Phương pháp lên men chìm
Vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường lỏng với cơ chất là tinh bột, nitơ, chất
khoáng... Phương pháp nuôi cấy chìm đòi hỏi phải được vô trùng tuyệt đối ở các
khâu vệ sinh tổng hợp, thanh trùng môi trường dinh dưỡng, thao tác nuôi cấy,
không khí cung cấp cho quá trình nuôi cấy.
Ưu điểm của phương pháp lên men chìm là:
-

Dễ kiểm soát quá trình do đó có thể sản xuất công nghiệp, cơ giới hóa, tự động
hóa.

-

Năng suất cao và chất lượng đồng đều.


11

-

Có thể nuôi cấy dễ dàng các chủng vi sinh vật đột biến có khả năng sinh enzym
cao và lựa chọn tối ưu thành phần môi trường, các điều kiện nuôi cấy.

-

Enzym thu được tinh khiết hơn lên men bề mặt, đảm báo vệ sinh, vô trùng.
Tuy nhiên do nồng độ enzym thu được thấp nên enzym thu được sau khi tách và

thu hồi sẽ có giá thành cao, nếu không đảm bảo vô trùng ở tất cả các bước thì sẽ bị
nhiễm hàng loạt, gây hao phí lớn [4], [5].
1.3.2. Thu nhận chế phẩm enzym
Enzym thương phẩm được sản xuất dưới hai dạng: dạng bột khô và dạng lỏng, có
thể là dạng thô hoặc dạng tinh khiết. Đối với lên men bề mặt có thể đồng hóa nếu
cần, sau đó dùng dung dịch đệm hay nước cất để chiết rút enzym ta có dịch chiết
enzym. Đối với lên men chìm chỉ cần lọc bỏ sinh khối là có dịch chiết như trên sau
đó có thể dùng tác nhân kết tủa thuận nghịch như aceton, ethanol, muối trung tính
để có chế phẩm enzym ở dạng sạch hơn. Từ chế phẩm sạch này, bằng kỹ thuật điện
di, lọc gel... ta có thể tách từng phần để có enzym tinh khiết hơn [4], [5].
1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới sự tổng hợp enzym
a. Ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng
Dinh dưỡng là yếu tố quan trọng có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển và tổng hợp
enzym của vi sinh vật. Cùng một loại vi sinh vật nhưng nếu nuôi cấy trên các môi
trường có thành phần dinh dưỡng khác nhau thì mức độ tạo thành enzym và thành
phần enzym được tạo thành cũng khác nhau.
Ví dụ: nuôi cấy Aspergillus oryzae trên môi trường cám đại mạch thì thì có thể
tạo được nhiều enzym, trong đó có các loại enzym hoạt tính cao như amylase,
protease, maltase, pectinase... nhưng nếu nuôi cấy trên môi trường Czapek cải tiến
với nitrat và tinh bột thì chỉ tạo thành chủ yếu là α – amylase, còn các enzym khác
tạo thành với lượng không đáng kể.
Hiện tượng này chỉ thấy ở vi sinh vật chứ không thấy ở động và thực vật. Khi

trong môi trường có những chất khó đồng hóa, vi sinh vật phải tiết vào môi trường
những enzym tương ứng để phân hủy chúng thành những chất đồng hóa được. Vì


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
12

vậy khi cho chất cảm ứng vào môi trường dinh dưỡng thì khả năng sinh tổng hợp
enzym của vi sinh vật có thể tăng lên gấp nhiều lần so với trường hợp bình thường.
Trong công nghệ sản xuất enzym cần phải lựa chọn chất cảm ứng thích hợp và
xác định nồng độ tối ưu của nó trong môi trường để có hiệu suất sinh tổng hợp cao
nhất [4], [5].
b. Ảnh hưởng của pH của môi trường
pH môi trường biến đổi khá rõ rệt trong quá trình nuôi cấy và gây ảnh hưởng lớn
đến sự tổng hợp enzym. Do đó người ta thường điều chỉnh pH để thu được enzym
với hiệu suất cao nhất. Mỗi loại enzym thường được tổng hợp mạnh trong một vùng
pH xác định đối với từng loại vi sinh vật. Ví dụ: amylase và pectinase của nấm mốc
được tổng hợp mạnh trong môi trường có pH= 4,5 - 5,0 còn protease thì pH=6 - 6,5
[4], [6].
c. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Phần lớn các vi sinh vật có khả năng tổng hợp các enzym đều thuộc loại ưa nhiệt
trung bình, có nhiệt độ tối thích 22- 32oC, một số vi khuẩn thích hợp ở nhiệt độ cao
hơn (35-55 oC) và chúng có khả năng tổng hợp các enzym có độ bền nhiệt cao. Khi
nâng nhiệt độ môi trường tới quá mức thích hợp thì khả năng sinh tổng hợp enzym

bị giảm rõ rệt [4], [6].
d. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Thời gian nuôi cấy thích hợp của mỗi loại vi sinh vật được xác định bằng thời
gian cho phép tích tụ enzym tối đa. Thời gian đó phụ thuộc vào từng chủng vi sinh
vật và ít phụ thuộc vào enzym chúng tổng hợp.
Ngoài ra, tùy từng loại vi khuẩn mà ta lựa chọn điều kiện cấp khí và độ ẩm cho
ph ù hợp [4], [5].
1.4. Các nghiên cứu về ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng
sinh enzym Nattokinase của vi khuẩn
Cùng với sự quan tâm ngày càng nhiều đối với Nattokinase, những năm gần đây
có nhiều nghiên cứu tối ưu hóa môi trường nuôi cấy cho vi khuẩn sản xuất lượng
Nattokinase lớn nhất.


13

1.4.1. Ngoài nước: Junguo Liu và cộng sự (2006) nghiên cứu tối ưu hóa các điều
kiện dinh dưỡng cho sinh tổng hợp Nattokinase sử dụng chủng Bacillus subtilis
natto NLSSE. Khảo sát các nguồn nitrogen: (NH4)2SO4, NaNO3, natri glutamat,
casein, pepton từ đậu nành và khảo sát các nguồn carbon: glucose, sucrose, maltose,
xylose và glycerol. Kết quả nguồn carbon tốt nhất là maltose 2%, nguồn nitơ tốt
nhất là pepton đậu nành, hoạt tính Nattokinase đạt 1.300 U/ml với thành phần môi
trường tối ưu (g/l): pepton đậu nành: 8,28, CaCl2: 0,64 và cao nấm men: 0,74 [18].
Deepak và cộng sự (2008) nghiên cứu tối ưu hóa môi trường cho sinh tổng hợp
Nattokinase từ chủng Bacillus subtilis. Các nhân tố được chọn để khảo sát: glucose,
pepton, MgSO4, và CaCl2 ở 5 mức độ. Hoạt tính đạt 3.194 U/ml với thành phần môi
trường (%): glucose 1%, pepton 5,5%, MgSO4 0,2% và CaCl2 0,5% [10]. Li Hui
Rong (2011) xác định môi trường tối ưu cho sản xuất Nattokinase từ vi khuẩn
Bacillus subtilis natto gồm: MgSO4 0,02%, K2HPO4 0,02%, KH2PO4 0,01%, CaCl2
0,05%, maltose 3%, peptone từ đậu nành: 3% [16].

1.4.2. Trong nước
Lê Thị Bích Phượng và cộng sự (2012) đã phân lập được hai chủng Bacillus
sp.7.2 và Bacillus sp.NP3 có khả năng sinh tổng hợp mạnh enzyme làm tan huyết
khối (Nattokinase) từ một số chủng Bacillus spp lấy từ bộ sưu tập giống của Viện
Sinh học nhiệt đới và phân lập từ thực phẩm Natto; hoạt tính Nattokinase và
protease của mẫu NP3 và 7.2 tương đương với một số thực phẩm chức năng hiện
đang bán trên thị trường [7]. Hoàng Thị Khánh Hồng (2012) đã nghiên cứu khả
năng biểu hiện và tiết Nattokinase nhờ ADN bộ gen Bacillus spp phân lập từ sản
phẩm Natto [3]. Hin Vireak (2012) xác định môi trường nuôi cấy Bacillus subtilis
natto cho hoạt tính protease tốt nhất là canh thang bổ sung casein 0,5 % [8].


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
14

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị sử dụng
2.1.1. Vi sinh vật sử dụng: Vi khuẩn B. subtilis natto được phân lập từ sản phẩm
Natto của Nhật Bản.
2.1.2. Nguyên liệu, hóa chất sử dụng:
Bảng 2.1 . Các nguyên liệu, hóa chất sử dụng
TT

Nguyên liệu

Nguồn gốc

1

Cao thịt

Đức

2

Pepton

Đức

3

Casein

Đức

4

Thạch bột

Việt Nam

5

Glucose

Trung Quốc

6

Lactose

Trung Quốc

7

Saccharose

Trung Quốc

8

Maltose

Trung Quốc

9

Tinh bột

Trung Quốc

10

NaCl

Trung Quốc

11

Na CMC

Trung Quốc

12

Dung dịch lysozym 1mg/ml

Viện kiểm nghiệm

13

Dung dịch xanh methylen

Trung Quốc

14

MgSO4

Trung Quốc

15

CaCl2

Trung Quốc

16

MnCl2

Trung Quốc

17

Dung dịch Lugol

Trung Quốc

2.1.3. Các môi trường sử dụng:
 Môi trường thạch thường (MT1):


15

Pepton

1,0 g

Cao thịt

0,5 g

NaCl

0,5 g

Thạch bột

2 g

Nước máy vđ

100ml

 Môi trường canh thang (MT2):
Pepton

1,0 g

Cao thịt

0,5 g

NaCl

0,5 g

Nước máy vđ

100ml

2.1.4. Thiết bị
Bảng 2.2. Các thiết bị sử dụng

Thiết bị

Nguồn gốc

Tủ cấy UV Bioair

Italy

Tủ ấm Memmert

Đức

Tủ sấy Memmert

Đức

Máy ly tâm Universal

Đức

Máy lắc Bioshaker

Đức

Cân kỹ thuật Sartorius

Đức

Kính hiển vi Labomed

Mỹ

Tủ lạnh Toshiba

Nhật Bản

Lò vi sóng Daewoo

Hàn Quốc

Nồi hấp ALP

Nhật Bản

Máy khuấy từ Heidolph

Đức

Thước đo đường kính vòng phân giải

Trung Quốc