liệu pháp gen và ứng dụng liệu pháp gen trong chữa bệnh

Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TPHCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TIỂU LUẬN SINH HỌC PHÂN TỬ VÀ DI TRUYỀN HỌC
ĐỀ TÀI : LIỆU PHÁP GEN VÀ ỨNG DỤNG LIỆU PHÁP

GEN TRONG CHỮA BỆNH
GVHD : PGS.TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG
Lớp : HC09SH
Nhóm
1. Lê Hoàng Khoa

60901228

2. Cao Thị Mỹ Phương

60902029

3. Lê Kim Tài

60902310

4. Nguyễn Thị Thanh Tân

60902381

5. Nguyễn Đức Trung

60902979

Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

MỤC LỤC
LỜI MỞ ĐẦU
NỘI DUNG
A. LIỆU PHÁP GEN
I. Khái niệm
1. Liệu pháp gen
2. Gen liệu pháp
II. Nguyên tắc cơ bản của điều trị bằng liệu pháp gen
III. Phân loại liệu pháp gen
IV. Kỹ thuật cơ bản
1. Cơ sở của liệu pháp gen
2. Các bước cơ bản trong liệu pháp gen
3. Kỹ thuật chuyển gen liệu pháp
V. Nguyên lý của liệu pháp gen
1. Tách dòng gen liệu pháp
2. Các loại vecto thường được sử dụng trong liệu pháp gen
B. Ứng dụng liệu pháp gen trong chữa bệnh
I. Các lĩnh vực ứng dụng chủ yếu của liệu pháp gen
II. Một số xu hướng chữa bệnh bằng liệu pháp gen
III. Ứng dụng liệu pháp gen trong việc chữa bệnh HIV/AIDS
IV. Vấn đề an toàn và triển vọng của liệu pháp gen
C. Kết luận
Tài liệu tham khảo.


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

LỜI MỞ ĐẦU
Nhiệm vụ hàng đầu của CNSH là giải quyết vấn đề mạng sống mà mỗi con người
đều phải trải qua là sinh, lão, bệnh, tử. CNSH đang tập trung nỗ lực tìm ra các
hướng đi để chữa khỏi các căn bệnh di truyền cũng như các căn bệnh hiểm nghèo.
Trong đó liệu pháp gen là một kĩ thuật cao của CNSH có ý nghĩa quan trọng trong
giải quyết nhiệm vụ này.


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

NỘI DUNG
A. LIỆU PHÁP GEN

I. Khái niệm
1. Liệu pháp gen
Liệu pháp gen (gene therapy) là kỹ thuật đưa gen lành vào cơ thể thay thế cho
gen bệnh hay đưa gen cần thiết nào đó thay vào vị trí gen bị sai hỏng để đạt được
mục tiêu của liệu pháp.
- Biện pháp thứ nhất, đưa gen lành vào thay thế cho gen bệnh là cách giải
quyết triệt để, vì gen lành sẽ được đưa vào đúng vị trí của nó trên bộ gen và
chịu tác động bình thường của các trình tự biểu hiện gen đó.

đưa vào tế bào bản sao của gene khỏe mạnh


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

- Biện pháp thứ hai, đưa gen cần thiết thay vào vị trí gen sai hỏng dễ thực hiện
hơn nhưng khi đưa thêm một gen cần thiết vào bộ gen, người ta không làm

chủ được vị trí gắn xen của đoạn mới đưa vào. Điều này dẫn đến một số kết
quả không lường trước được:
 Gen mới đưa vào không nằm trong phức hợp điều hoà nên có thể
được biểu hịên một cách tuỳ tiện, không đúng nơi (đúng với loại tế
bào, mô đặc hiệu) và không đúng lúc (đúng với chu trình phát triển
cá thể), hoặc thậm chí không được biểu hiện.
 Gen mới đưa vào gây những hiệu quả không mong muốn.
 Gen gắn vào một vị trí có khả năng hoạt hoá một gen tiền ung thư
dẫn dến sự biểu hiện quá độ của gen này gây ra ung thư.
2. Gen liệu pháp
 Gen liệu pháp (Therapeutic gene) là các gen có chức năng sử dụng vào điều
trị bệnh cho con người.
 Mỗi loại gen liệu pháp có những đặc điểm và chức năng khác nhau. Gen liệu
pháp có thể là:
 Gen lành (các gen hoạt động bình thường) được đưa vào tế bào
sống để thay thế các gen hỏng, gen mất chức năng
 Những gen có khả năng mã hóa 1 protein đặc hiệu, khi đưa vào tế
bào sống có thể tạo nên các loại protein đặc hiệu. Các protein đặc
hiệu có thể ức chế hoạt động của 1 gen khác trong tế bào, kìm hãm
khả năng phân chia của tế bào hoặc gây chết các tế bào bị bệnh.
 Gen ức chế các gen gây bệnh, gen kìm hãm hoặc các gen phục hồi
Các đoạn oligonucleotide có tác dụng kiềm hãm sự hoạt động các gen bị đột
biến trong tế bào.


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

II. Nguyên tắc cơ bản của điều trị bằng liệu pháp gen
 Theo dõi và hiểu biết cặn kẽ quá trình, cơ chế phát sinh bệnh, đặc tính di
truyền của bệnh

 Nắm vững cấu trúc và chức năng của gen gây bệnh, gen hỏng, gen đột biến,
… và cấu trúc, chức năng của gen liệu pháp.
 Dự đoán hiệu quả của liệu pháp. Nếu hiệu quả cao mới áp dụng
 Thử nghiệm nhiều lần với động vật, khi đạt hiệu quả cao mới áp dụng cho
con người.

III. Phân loại liệu pháp gen
2 nhóm phương pháp cơ bản:
 Liệu pháp gen soma (Somatic Gen Therapy - SGT): là phương pháp điều
trị, thay thế hay sửa chữa các gen hỏng, gen bệnh của các tế bào soma
trong cơ thể. SGT liên quan đến sự biểu hiện gen bên trong những tế bào
sẽ được uốn nắn ở bệnh nhân nhưng không di truyền cho thế hệ sau. Tế
bào dùng chữa trị có thể là tế bào lympho, tế bào gan, đặc biệt là dùng tế
bào gốc. Đây là loại hình GT đang được nghiên cứu tại "Viện Liệu pháp
Gen người" cũng như tại nhiều phòng thí nghiệm khác trên thế giới.
 Liệu pháp gen tế bào mầm (Germline Gen Therapy - GGT): điều trị, sửa
chữa, thay thế gen hỏng cho các giao tử nhằm tạo ra thế hệ sau bình
thường. GGT liên quan đến cải biến gen của những tế bào mầm mà
những tế bào này truyền đạt những sự thay đổi đó cho thế hệ sau. Hãy
còn ít công trình nghiên cứu về sự can thiệp vào dòng mầm vì lý do kỹ
thuật và đạo đức.


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

IV. Các kỹ thuật cơ bản của liệu pháp gen
1. Cơ sở của liệu pháp gen
- Liệu pháp gen có thể được tiến hành thông qua một số cách sau:
 Chuyển trực tiếp gen vào mô người bệnh.

Strategies for Delivering Therapeutic Transgenes into Patients
 Tạo véctơ virus để chuyển gen một cách hiệu quả tới tế bào (in vivo).

HIV based gene therapy vector


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

Virus xâm nhiễm trực tiếp vào tế bào bằng cách gắn với chúng và “bơm”
thông tin di truyền của chúng vào tế bào. Vì các virus tự nhiên tự sinh
sản bên trong tế bào chủ nên gây hại với vật chủ mang chúng. Tuy nhiên,
có thể xoá hay làm mất các phần có hại của virus, ngăn không cho chúng
tái bản trong tế bào chủ. Ngày nay các virus không có khả năng tái bản
này được sử dụng chung cho các nghiên cứu liệu pháp gen trên người và
động vật.
 Sử dụng các kỹ thuật khác nhau để chuyển gen vào tế bào bên ngoài
người bệnh, sau đó chuyển các tế bào đã được biến đổi này vào người
bệnh (ex vivo). Phương pháp này được sử dụng chung để phân phối các
nhân tố phát triển và các phân tử khác tới các vùng đặc hiệu của cơ thể.
Chúng cũng được sử dụng để tạo ra các dòng tế bào đã bị biến đổi hoàn
toàn cho cấy ghép. Giống như trong liệu pháp gen in vivo, các tế bào
được chuyển có thể gây biểu hiện các protein lạ gây sưng tấy hay đáp
ứng miễn dịch.


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

- Các nhóm chuyên gia đã chia liệu pháp gen thành các mức khác nhau:
 Chuyển gen với sự hoà nhập (gen được kết hợp chặt chẽ với DNA của
vật chủ)

 Chuyển gen không hoà nhập (gen không kết hợp chặt chẽ với DNA của
vật chủ)
 Sử dụng các oligonucleotide tổng hợp nhân tạo gọi là các phân tử
ribozyme/antisense không có các thành phần điều hoà (sự biểu hiện gen
đã bị biến đổi).
- Để chuyển gen, cần hội đủ một số điều kiện sau đây:
 Đầu tiên, phải có bản sao đầy đủ của gen thích hợp với những trình tự
điều hoà thích hợp (trình tự khởi động), trình tự khởi động có thể là duy
nhất đối với gen đặc hiệu, bằng cách này cho phép gen chỉ biều hiện
trong các mô mà thông thường chúng được biểu hiện.
 Lần lượt, các gen có thể được kết nối với các trình tự khởi động, hoạt
hoá trong tất cả các mô (phương pháp chung nhất được sử dụng ngày
nay) hoặc có thể kết nối với các trình tự có thể hoạt hoá hay bất hoạt như
một công tắc. Những thao tác như vậy có thể đạt được bằng công nghệ
DNA tái tổ hợp.
 Thứ hai, phải lựa chọn kỹ thuật đích. DNA cần kỹ thuật này để có thể
tiếp cận với tế bào. Ba kỹ thuật cơ bản được sử dụng để làm điều này:
 DNA có thể được gắn trực tiếp với các tế bào hoặc cấy vào mô.
Gọi là chuyển DNA trần (nacked DNA transfer)
 DNA có thể được sử dụng dể tạo nên con thoi dịch chuyển virus
(viral transfer shuttle). Đây là phương pháp chuyển DNA hầu như
chắc chắn nhất. DNA xâm nhập không hiệu quả vào tế bào vì nó
khó có thể xuyên qua lớp màng lipit kép, nhưng vector virus dễ
dàng làm việc này.


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

 DNA cũng có thể phối hợp với các phức hệ hoá học khác nhau để
khuếch đại khả năng chuyển dịch qua màng tế bào của nó.

 Thứ ba, có hai phương pháp ứng dụng liệu pháp gen: liệu pháp gen có
thể ứng dụng trực tiếp với bệnh nhân hoặc trên các tế bào đã tách ra khỏi
người bệnh (như tế bào tuỷ xương) sau đó cấy trở lại người bệnh. Trong
tương lai, các thao tác liệu pháp gen của tế bào gốc phát triển trên môi
trường mô tế bào và sau đó cấy lên người bệnh sẽ là tiến triển tột cùng.
- Mỗi kỹ thuật trên đều có những thuận lợi và khó khăn riêng. Khi chọn
phương pháp phân phối gen, một số nhân tố cần được cân nhắc:
 Hiệu quả của liệu pháp phải được đặt lên hàng đầu.
 Sau đó, gen chuyển đổi phải được điều hoà đúng đắn. Nó phải được hoạt
hoá đúng lúc, với độ dài thời gian chính xác và đúng số lượng.
2. Các bước cơ bản trong liệu pháp gen
Trong thực nghiệm, người ta dùng các vector virus để chuyển các gen vào
tế bào động vật theo 2 bước:
 Bước 1: Tạo vector tái tổ hợp mang gen cần chuyển. Trước đó, các virus đã
được biến đổi để không còn khả năng sao chép, đồng thời lại có khả năng
biểu hiện mạnh gen cần đưa vào cơ thể. Các biến đổi này bao gồm việc loại
bỏ các trình tự cần cho sự sao chép của virus và gắn vào trước gen các trình
tự promotor mạnh. Sau đó, vector tái tổ hợp được đưa vào tế bào nuôi cấy.
Loại tế bào được sử dụng nhiều nhất là tế bào tuỷ xương vì dễ nuôi cấy lại
bao gồm nhiều tế bào nguồn đa thế (pluri potential).


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

Creating Recombinant Viral Vectors for Gene Therapy
 Bước 2: Vector virus mang gen lành được đưa vào cơ thể mà từ đó người ta
đã tách các tế bào tuỷ xương. Như vậy, có thể xem đây là kỹ thuật ghép tự
thân dù gen ghép vào là gen lạ đối với cơ thể. Trở ngại lớn là protein do gen
lạ tạo ra có thể kích thích sản sinh kháng thể chống lại chính nó, hơn nữa,
nếu việc chuyển gen vào tế bào nuôi cấy thường thành công thì việc đưa tế

bào chuyển gen trở lại cơ thể lại ít khi có hiệu quả do nhiều nguyên nhân.
Gần đây nhất, một quy trình liệu pháp gen vừa được thông qua nhằm làm chậm
sự phát triển của bệnh AIDS. Người ta chuyển các oligonucleotit đối (antisens)
bổ sung cho một số trình tự của virus HIV (trình tự TAR, REV) vào các tế bào
của một người lành là anh em sinh đôi của người bệnh. Sau đó các tế bào này
được tiêm vào bệnh nhân. Các Oligonicliotit đối TAR sẽ ức chế sự sao chép của
virus khi bắt cặp và vô hiệu hóa trình tự TAR đóng vai trò trong sự sao chép.
Còn các Oligonucleotit đối REV, khi bắt cặp với trình tự REV sẽ ngăn sự vận
chuyển mRNA từ nhân ra tế bào chất.


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

3. Kỹ thuật chuyển gen liệu pháp
- Hình thức chuyển gen có thể được thao tác thông qua một số cách sau:
 Chuyển trực tiếp gen vào mô người bệnh (liệu pháp in vivo). Gồm:
 Lựa chọn vector liệu pháp thích hợp
 Tách và tạo vector tái tổ hợp mang gen liệu pháp
 Đưa vector tái tổ hợp mang gen liệu pháp vào bằng các kỹ thuật
chuyển gen như vi tiêm, súng bắn gen,…
 Kiểm tra biểu hiện của gen liệu pháp
 Chuyển gen vào tế bào bên ngoài người bệnh (liệu pháp ex vivo):
 Lấy tế bào có gen hỏng ra ngoài cơ thể
 Chuyển gen lành vào thay thế gen hỏng để tạo tế bào lành
 Nhân tế bào lành thành số lượng lớn rồi đưa vào cơ thể


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

- Kỹ thuật chuyển gen liệu pháp:

 Kỹ thuật vi tiêm (Microinjection) : dùng cho cả 2 hình thức in vivo và
ex vivo


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

 Kỹ thuật xung điện (Electroporation) : thường dùng cho ex vivo

 Kỹ thuật dùng súng bắn gen (gene gun) : kỹ thuật này dùng để chuyển
gen liệu pháp vào tế bào đích và thường đạt kết quả cao. Thực hiện
theo hình thức ex vivo

 Kỹ thuật liposome (liposome technique) : thực hiện theo hình thức in
vivo. Cần chú ý chọn tế bào đích để nâng cao hiệu quả


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

V. Nguyên lý của liệu pháp gen :
1. Tách dòng gen liệu pháp :
Tách dòng gen liệu pháp được thực hiện bằng các phương pháp tách dòng thực
nghiệm thông thường, trong các phòng thí nghiệm sinh học phân tử và kỹ thuật
gen. Gen liệu pháp có thể tách dòng từ các nguồn tế bào cho khác nhau như tế
bào vi khuẩn, tế bào thực vật, động vật, tế bào người và một số loại virus. Tách
dòng gen liệu pháp có hiệu quả cao đối với các gen đã biết rõ kích thước, vị trí
của gen trong bộ gen. Hiệu quả tách dòng gen liệu pháp còn phụ thuộc vào cấu
trúc, chức năng gen, sản phẩm của hoạt động gen cũng như mức độ hiện đại
của các thiết bị thí nghiệm.
Tùy theo đặc tính của gen liệu pháp và mục đích của liệu pháp gen, có thể tách
dòng gen liệu pháp từ bộ gen (genome) hoặc từ mRNA. Trường hợp cần các

gen nguyên vẹn (kể cả các vùng không mang mã di truyền) phải tách dòng từ
bộ gen, thường chỉ thực hiện với các gen có kích thước nhỏ. Nếu các gen cần
thiết có kích thước lớn, hoặc chỉ cần các phần DNA mang mã di truyền, phải
thực hiện cách tách dòng từ mRNA. Trường hợp này cần tách chiết mRNA và
thực hiện kỹ thuật phiên mã ngược để tạo các cDNA tương ứng.
Trường hợp gen liệu pháp là các đoạn oligo nucleotide đã biết trình tự (mạch
kép hoặc mạch đơn), có thể tạo các đoạn oligo nucleotide bằng phương pháp
tổng hợp nhân tạo.

2. Các loại vectơ thường sử dụng trong liệu pháp gen
Để có thể nâng cao hiệu quả của liệu pháp gen trong chữa bệnh, một vấn đề
quan trọng là chọn vectơ chuyển gen phù hợp với gen cần chuyển, phù hợp
với loại tế bào đích và loại bệnh cần trị.
Vectơ chuyển các gen liệu pháp trong liệu pháp gen gọi là các vectơ liệu pháp.
Vectơ liệu pháp có một số đặc điểm riêng:
- Phải đảm bảo đưa các gen liệu pháp vào tế bào (cơ thể) dễ dàng, không gây
tổn thương hoạt động của các gen khác trong bộ gen (không hoặc rất ít gây


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

đáp ứng miễn dịch, không gây phá hủy chức năng các mô, không có tác
động kích hoạt gen tiền ung thư…).
- Phải có khả năng mang một gen liệu pháp có kích thước càng lớn càng tốt.
- Có sự linh hoạt với các tế bào đích, mô đích để có thể gắn gen liệu pháp vào
đúng những vị trí định trước
Hiện nay, dựa vào nguồn gốc của vectơ liệu pháp gen, người ta chia các vectơ liệu
pháp làm 2 nhóm: vectơ có bản chất virus (viral vector) và vectơ không có bản
chất virus (nonviral vector).
2.1 Các vectơ liệu pháp gen có bản chất virus (viral vector)

Cơ chế xâm nhiễm và gây bệnh của virus
Virus chứa vật chất di truyền được bao quanh bởi lớp màng protein. Đầu tiên, virus
gắn với các tế bào chuyên biệt bằng sự tương tác với thụ thể (hay một chuỗi các
điểm thụ thể) trên bề mặt tế bào. Tiếp đó, virus vào tế bào bởi sự tương tác với các
phân tử bề mặt đặc hiệu trên tế bào, bằng cách này nó dễ dàng đi xuyên qua lớp rào
chắn màng tế bào.
Khi xâm nhiễm tế bào, virus có khả năng chuyển bộ gen của virus vào trong các tế
bào chủ. Một số nhóm virus có thể gắn được bộ gen virus hoặc một số gen của
chúng vào bộ gen của tế bào chủ, tạo thành một thể thống nhất. Các gen virus gắn
với tế bào chủ, có thể tồn tại lâu dài cùng với quá trình phân chia tế bào chủ, tạo
nên các provirus. Hiện tượng tạo provirus được gọi là trạng thái tiềm sinh của
virus. Đối với các virus gây bệnh, đó là thời gian ủ bệnh.
Trong quá trình tồn tại và phân chia của tế bào chủ, bộ gen virus cũng được nhân
lên tạo vô số tế bào mang gen virus, vẫn hoạt động bình thường. Khi có một tác
nhân nào đó (thường là tia tử ngoại, các chất độc, tia phóng xạ hoặc nhiệt độ
cao…) tác động vào provirus, làm cho bộ gen virus tách khỏi tế bào, thực hiện quá
trình tái bản gen virus và tổng hợp các thành phần của virus trong tế bào chủ. Sự
lắp ghép các thành phần của virus tạo nên các virion, các virion hoạt động tạo nên
vô số virus mới phá vỡ tế bào chủ và tiếp tục xâm nhiễm tế bào khác. Đây là giai
đoạn biểu hiện bệnh rõ nhất.


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

Trên cơ sở hiểu biết về bộ gen virus, cơ chế xâm nhiễm tế bào, cơ chế gắn gen của
virus vào bộ gen tế bào, con người đã tìm ra các biện pháp loại bỏ hoặc gây bất
hoạt các gen có hại của virus, nhưng vẫn giữ lại các gen giúp cho sự xâm nhiễm và
gắn gen virus vào bộ gen tế bào, tạo nên các vectơ liệu pháp gen.
Các viral vector được chia thành nhiều nhóm tùy theo đặc điểm cấu trúc bộ gen,
đặc điểm xâm nhiễm, đặc điểm gây bệnh của virus… . Viral vector gồm một số

loại chủ yếu: vectơ adenovirus, vectơ retrovirus, vectơ adeno-associated virus
(AAV), vectơ herpes simplex virus (HSV)… .

2.1.1 Vectơ adenovirus
Đặc điểm và cấu tạo di truyền
Adenovirus là một loại virus có caspid đa diện 20 mặt, phần lõi chứa DNA mạch
kép. Vỏ caspid của virus chứa 3 protein: hexon, fiber và base penton. Hexon là
thành phần cấu trúc quan trọng, tạo thành bề mặt 20 mặt, trong khi các penton tạo


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

thành phức hệ với fiber cho kết quả là 12 chóp ngoài vỏ virus đóng vai trò quan
trọng trong việc gắn với các phối tử. Adenovirus được phân lập đầu tiên từ amidan
vòm họng của người, gây các bệnh về đường hô hấp. Bộ gen của adenovirus là một
chuỗi DNA xoắn kép dài 36 kb, gồm hơn 50 gen.

Trong bộ gen của adenovirus có 4 vùng gen quan trọng, ký hiệu là E 1, E2, E3 và E4.
Gen E1 có chức năng mã hóa cho các protein enzyme giúp cho quá trình phiên mã
tổng hợp các protein sớm (protein enzyme của virus). Gen E 2 và E4 điều hòa quá
trình tái bản DNA virus, dịch mã tổng hợp protein muộn đồng thời có liên quan
đến sự đáp ứng miễn dich của vật chủ trong quá trình tấn công của adenovirus.
Nguyên lý thiết kế vectơ adenovirus
Vectơ adenovirus được tạo nên từ các adenovirus tái tổ hợp. Đầu tiên cần tạo các
adenovirus tái tổ hợp có khả năng xâm nhiễm tế bào chủ nhưng mất khả năng tái
bản trong tế bào chủ. Để thiết kế vectơ adenovirus phải loại bỏ gen E 1 của
adenovirus, thay thế bằng phức hợp promoter-gen liệu pháp và các gen cần thiết
điều khiển quá trình biểu hiện của gen liệu pháp trong tế bào chủ. Gen E 3 cũng
được gây bất hoạt hoặc loại bỏ. Bộ gen virus sau khi loại bỏ gen E 1 và E3 được đưa
vào tế bào đóng gói (packaging cell) cùng với gen liệu pháp. Tại đây, quá trình tái

tổ hợp ở những điểm tương đồng tạo nên bộ gen adenovirus tái tổ hợp chứa gen
liệu pháp.


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

Cơ chế hoạt động
Adenovirus có thể xâm nhiễm cả tế bào không phân chia và các tế bào đang phân
chia.
Vectơ adenovirus có thể mang các gen liệu pháp kích thước lớn từ 8 kb đến 30 kb,
không gây đột biến gen của tế bào đích. Điểm bất lợi nhất khi sử dụng vectơ
adenovirus là gây hiệu ứng giảm mạnh đáp ứng miễn dịch của tế bào.
Vectơ adenovirus có khả năng xâm nhiễm nhiều loại tế bào do nhiều loại tế bào
đích có các cơ quan thụ cảm phù hợp với adenovirus. Khi xâm nhiễm vào trong tế
bào chủ, phần lõi mang bộ gen virus và gen liệu pháp chui qua lỗ màng nhân. Bộ
gen của adenovirus không có khả năng gắn với bộ gen của tế bào chủ. Trong nhân
của tế bào chủ, các gen của adenovirus thực hiện quá trình phiên mã, quá trình dịch
mã trong tế bào chất của tế bào tạo các protein liệu pháp và các protein cần thiết
cho virus.

2.1.2 Vectơ retrovirus ( retroviral vector)
Đặc điểm cấu tạo và di truyền
Retrovirus là loại virus RNA, có khả năng xâm nhiễm tế bào chủ cao, có khả năng
gắn bộ gen virus với bộ gen tế bào chủ.
Cấu trúc retrovirus gồm phần vỏ có ba lớp. Lớp vỏ ngoài cùng là glycoprotein, tiếp
đến lớp vỏ kép lipid, trong cùng là vỏ caspid. Bên trong lớp vỏ caspid là RNA và
các loại enzyme của virus. Enzyme phiên mã ngược giúp virus chuyển bộ gen
RNA sang dạng cDNA mạch kép. Enzyme cài xen giúp cho quá trình cài xen bộ
gen virus với bộ gen tế bào chủ ở những điểm tương đồng.

Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

Cấu tạo retrovirus
Bộ gen retrovirus gồm 2 sợi đơn RNA đồng dạng, kích thước khoảng 7-11 kb. Mỗi
sợi RNA chứa ba nhóm gen chủ yếu: gag, pol, env. Một số virus gây ung thư có
thêm nhóm gen gây ung thư oncogen.
Gen gag mã hóa các protein lõi trong thành phần cấu trúc hạt virion, gen pol mã
hóa các enzyme phiên mã ngược và các enzyme cần thiết cho hoạt động của virus,
gen env mã hóa protein trong cấu trúc các lớp vỏ của virus. Hai đầu mỗi sợi RNA
có một trình tự lặp dài tận cùng – LTR (long terminal repeats). Đoạn lặp LTR mang
một số trình tự cần thiết cho quá trình biểu hiện gen của virus và một trình tự đặc
hiệu giúp gắn bộ gen virus với bộ gen tế bào chủ, gọi là trình tự gắn xen – att
(attachment site). Trong bộ gen virus còn có một trình tự giúp quá trình đóng gói
bộ gen của virus gọi là trình tự ᴪ.


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

Bộ gen của virus gây bệnh ung thư MLV và DNA của virus (hình thái của bộ
gen virus trong các tế bào bị nhiễm)
Nguyên lý thiết kế vectơ
Nguyên lý chung của quá trình thiết kế vectơ retrovirus là phải loại bỏ các gen độc
của virus, chỉ giữ lại một số gen cần thiết cho quá trình xâm nhiễm, tái bản, gắn
gen, đồng thời cài thêm các gen liệu pháp.
Các giai đoạn thiết kế vectơ retrovirus:
1. Loại bỏ các gen chủ yếu của virus gag, pol, env và oncogen, thay thế bằng
gen liệu pháp tạo thành vectơ bộ gen
2. Xử lý cắt riêng các gen gag, pol, env của retrovirus nhưng vẫn đảm bảo chức
năng của các gen

3. Đưa vectơ bộ gen cùng với các gen gag, pol,env đã xử lý của virus vào một
tế bào đóng gói
4. Trong tế bào đóng gói, các gen virus hoạt động tổng hợp các thành phần của
vỏ virus, các thành phần của vỏ virus kết hợp với vectơ mang gen liệu pháp
hình thành nên vectơ retrovirus
Cơ chế hoạt động
Mỗi loại retrovirus có đặc điểm cấu trúc gen, khả năng xâm nhiễm và tái bản riêng,
do đó từ các loại retrovirus khác nhau ta có các loại vectơ retrovirus khác nhau.
Hai nhóm vectơ retrovirus được sử dụng nhiều nhất trong liệu pháp gen là MoMuLV (Moloney murine luekemina) và Lentivirus ( HIV – human immune
deficiency virus, SIV – Simian immune deficiency virus). Vectơ Mo-MuLV sử
dụng cho những tế bào đang phân chia, vectơ HIV và SIV sử dụng cho những tế
bào ở trạng thái không phân chia.
Vectơ retrovirus được đưa đến tế bào đích bằng nhiều kỹ thuật khác nhau. Sau khi
vào trong tế bào, các thành phần vỏ của virus bị phân hủy trong tế bào chất của tế
bào đích, RNA được giải phóng. Enzyme phiên mã ngược của virus xúc tác quá
trình chuyển RNA sợi đơn thành cDNA sợi kép. cDNA qua lỗ màng nhân vào
trong nhân tế bào đích, nhờ enzyme intergase của virus làm cho cDNA mạch kép


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

được gắn xen vào bộ gen ở những điểm tương đồng. Gen liệu pháp cũng đồng thời
được gắn xen vào bộ gen của tế bào đích phiên mã và dịch mã tạo nên các protein
liệu pháp trong tế bào đích.
2.1.3 Vectơ Adeno-Associated virus
Đặc điểm cấu tạo và di truyền
Adeno-Asociated Virus (AAV) là loại virus kích thước nhỏ thuộc nhóm parvovirus
không gây bệnh cho người. khi không có mặt của một loại virus trợ giúp khác như
adenovirus, virus helper…, AAV có thể xâm nhiễm các tế bào không phân chia,
gắn bộ gen virus vào bộ gen người ở vị trí đặc hiệu trên nhiễm sắc thể số 19 tạo

nên tiền virus (provirus).
Bộ gen của AAV là DNA sợi đơn, được bao bọc trong lớp vỏ caspid. Kích thước bộ
gen khoảng 4,5 – 4,7 kb, hai đầu là các trình tự lặp tận cùng đảo ngược ITR
(Inverted Terminal Repeats) gồm 145 bp. Bộ gen AAV gồm 2 nhóm gen chính là
gen rep và gen cap, các promoter p5, p19 và p40, phần cuối bộ gen là trình tự gắn
đuôi poly Adenin – poly A (polyadeninlation). Gen cap mã hóa protein trong cấu
trúc vỏ caspid của AAV. Gen rep mã hóa các enzyme giúp cho quá trình tái bản,
phiên mã và quá trình gắn bộ gen AAV vào bộ gen tế bào chủ.


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

Nguyên lý thiết kế
Khi thiết kế các vectơ AAV phải loại bỏ các gen rep, cap của AAV đồng thời thay
thế vào vị trí đó là gen liệu pháp cùng promoter thích hợp. Bộ gen của AAV chỉ
thích hợp với các gen liệu pháp có kích thước dưới 4kb, khi kích thước gen liệu
pháp lớn hơn 5kb, vectơ sẽ mất tác dụng.
Quá trình thiết kế vectơ AAV cần sự có mặt của virus trợ giúp, thường sử dụng là
các adenoviral helpers giúp quá trình tái tổ hợp đồng thời với gen liệu pháp, gọi là
sự đồng chuyển nhiễm. Hiện nay, thiết kế vectơ AAV người ta sử dụng đồng thời
vectơ plasmid mang gen liệu pháp và các đoạn ITR, virus AAV và virus trợ giúp là
adenoviral helper. Quá trình chuyển nhiễm đồng thời tạo nên vectơ AAV mang gen
liệu pháp và các dạng adenovirus lai. Các adenovirus lai bị gây bất hoạt bằng kỹ
thuật xử lý nhiệt, sau đó dùng kỹ thuật siêu ly tâm phân đoạn để tách các vectơ
AAV mang gen liệu pháp.
Cơ chế hoạt động
Khi vectơ AAV tiếp cận tế bào ở các thụ thể đặc trưng, toàn bộ các gen qua lỗ
màng nhân vào trong nhân tế bào. Trong nhân tế bào chủ, một số gen mã hóa các
protein enzyme được phiên mã và dịch mã, giúp cho quá trình tái bản DNA và gắn
DNA vào vị trí đặc hiệu trên bộ gen tế bào chủ. Gen liệu pháp cũng được nhân lên,

phiên mã và dich mã tạo nên các protein liệu pháp.
2.1.4 Vectơ liệu pháp từ Herpes Simplex Virus (HSV)
Đặc điểm cấu tạo và di truyền của herpes virus
Herpes virus là một nhóm virus lớn, gây bệnh ở người và động vật. Herpes virus có
kích thước khoảng 150nm, cấu tạo gồm vỏ ngoài, vỏ trong, màng lipid, vỏ caspid
và phần lõi chứa DNA. Vỏ caspid cấu tạo từ 162 đơn phân, tạo hình đa diện 20
mặt. Bộ gen là phân tử DNA mạch kép, kích thước 152 260 bp.
Herpea virus tương đối đa dạng, gồm nhiều nhóm có sự phân biệt gọi là herpes typ
1, herpes typ 2.., do đó được gọi là virus đơn hình ( herpes simplex) ký hiệu là
HSV-1, HSV-2.
Bộ gen herpes virus gồm ba nhóm gen chủ yếu là: nhóm gen α hay gen rất sớm –
IE (immediate early), nhóm gen β hay gen sớm – E (early) và nhóm gen γ hay gen


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

muộn – L (late), hai đầu là các trình tự TR (terminal repeat)… . Trong bộ gen có
khoảng một phần hai các gen không cần thiết cho sự tái bản của herpes virus trong
tế bào chủ.

Cấu tạo của herpes virus
Nguyên lý thiết kế vectơ HSV-1
Thiết kế vectơ HSV-1 dựa trên cơ sở tái tổ hợp của virus HSV-1 với Amplicon
plasmid. Amplicon plasmid là một plasmid tái tổ hợp mang gen Ori, gen kháng
Ampicilin trong plasmid của E.coli đồng thời mang gen Ori và gen mã hóa khả
năng đóng gói của HSV và gen liệu pháp có gắn đoạn promoter kiểm soát nhóm
gen rất sớm.
Amplicon plasmid và virus trợ giúp cùng được gây nhiễm vào tế bào khả biến. Quá
trình tái tổ hợp trong nhân tế bào khả biến tạo nên các vectơ HSV mang gen liệu
pháp có thể sư dụng trong liệu pháp gen.

Cơ chế hoạt động của vectơ HSV-1
Vectơ HSV-1 có khả năng cho gắn và chuyển những gen liệu pháp kích thước từ 30
đến 50 kb. Vectơ HSV-1 xâm nhiễm tế bào chủ nhanh, thời gian tiềm ẩn dài, không
hoặc ít gây đáp ứng miễn dịch không mong muốn ở tế bào chủ.
Hiện nay, vectơ HSV-1 sử dụng trong liệu pháp gen còn hạn chế do vectơ HSV-1
có thể tạo một số hợp chất độc trong tế bào một cách gián tiếp. Mặt khác, vectơ


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

HSV-1 chỉ biểu hiện đặc hiệu ở các tế bào thần kinh, do đó phạm vi ứng dụng của
vectơ HSV-1 trong chữa bệnh rất hẹp, chủ yếu điều trị các bệnh lien quan đến hệ
thần kinh.
2.2 Các vector không có bản chất virus
2.2.1 Liposomes
- Liposome là vector không có bản chất virus, lợi dụng các tính chất tự nhiên của
màng tế bào để xâm nhập vào tế bào. Tất cả các vật chất sinh học có cực và thành
phần lipid cũng như tính hòa tan nước khác nhau. Thành phần và cấu trúc của nó
xác định các tính chất này.
- DNA tích điện âm. Tính “béo” cao và tích điện âm của màng tế bào người và
màng nhân ngăn cản sự di chuyển tự do ra vào tế bào của DNA. Liposome mang
điện tích dương, lớp vỏ ưa lipid. Do tích điện đối dấu, DNA và liposome dễ dàng
gắn chặt với nhau, tạo nên phức hợp ưa lipid liposome-DNA. Tính hoà tan chất
lipid này cho phép vận chuyển nó qua màng tế bào và màng nhân, dễ dàng đưa
DNA vào nhân của tế bào.

Hình 15. Sơ đồ quá trình sử dụng liposomes làm vector chuyển gen.