NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA THÀNH PHẦN KHOÁNG, CHẤT CẢM ỨNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY TERPINEN4OL CỦA MÔ SẸO CÂY TRÀM TRÀ (Melaleuca alternifolia Cheel)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM


ĐỖ TIẾN VINH

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA THÀNH PHẦN
KHOÁNG, CHẤT CẢM ỨNG ĐẾN KHẢ NĂNG
SINH TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY TERPINEN-4-OL
CỦA MÔ SẸO CÂY TRÀM TRÀ
(Melaleuca alternifolia Cheel)

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh, Tháng 12/2011


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM


ĐỖ TIẾN VINH

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA THÀNH PHẦN
KHOÁNG, CHẤT CẢM ỨNG ĐẾN KHẢ NĂNG
SINH TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY TERPINEN-4-OL
CỦA MÔ SẸO CÂY TRÀM TRÀ
(Melaleuca alternifolia Cheel)

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học
Mã số

: 60.42.80

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hướng dẫn khoa học:
PGS.TS. TRẦN VĂN MINH

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 12/2011


NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA THÀNH PHẦN KHOÁNG, CHẤT
CẢM ỨNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY
TERPINEN-4-OL CỦA MÔ SẸO CÂY TRÀM TRÀ
(Melaleuca alternifolia Cheel)
ĐỖ TIẾN VINH

Hội đồng chấm luận văn:
1. Chủ tịch:

PGS.TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN
Đại học Nông Lâm TP.HCM

2. Thư ký:

TS. PHẠM ĐỨC TOÀN
Đại học Nông Lâm TP.HCM

3. Phản biện 1:

PGS.TS. DƯƠNG TẤN NHỰT
Phân viện Sinh Học Tây Nguyên

4. Phản biện 2:

PGS.TS. BÙI VĂN LỆ
Đại học khoa học tự nhiên TP.HCM

5. Ủy viên:

TS. BÙI MINH TRÍ
Đại học Nông Lâm TP.HCM

i


LÝ LỊCH CÁ NHÂN
Tôi tên Đỗ Tiến Vinh sinh ngày 18 tháng 12 năm 1986 tại xã Phú Cường
huyện Định Quán tỉnh Đồng Nai. Con ông Đỗ Ngọc Diêu và bà Phan Thị Nhiều.
Từ năm 2001 đến năm 2004 theo học và tốt nghiệp trung học phổ thông tại
trường trung học phổ thông Điểu Cải, huyện Định Quán, tỉnh Đồng Nai.
Từ tháng 9 năm 2004 đến tháng 8 năm 2008 theo học và tốt nghiệp đại học
chuyên ngành Công nghệ Sinh học hệ chính quy tại trường đại học Văn Lang,
Thành phố Hồ Chí Minh.
Từ tháng 5 đến tháng 8 năm 2009 ôn tập và thi đầu vào cao học chuyên
ngành Công nghệ Sinh học tại trường đại học Nông Lâm, Thành phố Hồ Chí Minh.
Từ tháng 9 năm 2009 đến hiện tại theo học cao học chuyên ngành Công nghệ
Sinh học tại trường đại học Nông Lâm, Thành phố Hồ Chí Minh.
Tình trạng gia đình: Độc thân.

Địa chỉ liên lạc: 104/A ấp Tam Bung, xã Phú Cường, huyện Định Quán, tỉnh
Đồng Nai.
Điện thoại: 0989.844.778.
Email:

ii


LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu
trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình
nào khác.

Đỗ Tiến Vinh

iii


LỜI CẢM ƠN
Trong hai năm học tập và nghiên cứu đề tài tốt nghiệp cao học đã giúp tôi
thu nhận rất nhiều kiến thức, kinh nghiệm cả trong chuyên môn lẫn cuộc sống và
đến hôm nay khi đã hoàn thành khóa học tôi xin gửi lời tri ân đến:
Ban giám hiệu trường đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, thầy
trưởng bộ môn cùng các thầy cô trong bộ môn Công nghệ Sinh học, đã truyền đạt
cho tôi những kiến thức quý báo trong suốt thời gian học tại trường.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Trần Văn Minh. Thầy đã tận tình hướng
dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện đề tài tốt nghiệp này.
PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng, TS. Vũ Văn Độ, Cô Bùi Thị Tường Thu, cô
Đỗ Thị Tuyến đã hỗ trợ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài.

Viện Sinh học Nhiệt đới Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện thuận
lợi về thiết bị, dụng cụ, địa điểm cho tôi thực hiện đề tài.
Con xin cảm ơn ba mẹ đã nuôi con khôn lớn và cho con được học tới ngày
hôm nay.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới ThS. Nguyễn Trung Hậu, các anh chị
trong phòng Công nghệ Tế bào Thực vật Viện Sinh học Nhiệt đới cùng tất cả các
bạn của tôi. Những người đã luôn quan tâm, ủng hộ và chia sẻ với tôi những khó
khăn trong quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp.

Học viên thực hiện

Đỗ Tiến Vinh

iv


TÓM TẮT
Đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng, chất cảm ứng đến
khả năng sinh trưởng và tích lũy terpinen-4-ol của mô sẹo cây Tràm Trà (Melaleuca
alternifolia Cheel)” được thực hiện tại Phòng Thí Nghiệm Trọng Điểm Phía Nam
Về Công nghệ Tế bào Thực vật Viện Sinh học Nhiệt đới Thành phố Hồ Chí Minh,
từ tháng 9 năm 2010 đến tháng 9 năm 2011. Mục tiêu của đề tài là xác định các yếu
tố ảnh hưởng tới quá trình nuôi cấy và khả năng tích tũy terpinen-4-ol trong mô sẹo
Tràm Trà. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên. Kết quả quá
trình nghiên cứu cho thấy:
Khảo sát nuôi cấy mô sẹo trên bốn loại môi trường MS - LV - WPM - B5 có
bổ sung đường sucrose (10 - 20 - 30 g/l); BA, NAA, 2,4-D (0,5 - 1,0 - 2,0 - 4,0
mg/l); B1, glycine (5 - 10 - 15 mg/l); nước dừa (5 - 10 - 15%); peptone (0,5 - 1,0 2,0 g/l). Đã xác định được lá Tràm Trà là bộ phận tạo mô sẹo tốt nhất trên môi
trường MS có bổ sung 2,4-D (4 mg/l), BA (0,5 mg/l), glycine (10 mg/l), B1 (5
mg/l), đường sucrose (20 g/l) (tỷ lệ tạo mô sẹo là 97,22%). Khi giảm nồng độ 2,4-D

xuống (1 mg/l), không có BA và bổ sung thêm nước dừa (15%) vào môi trường sẽ
giúp dạng mô sẹo có màu trắng sữa, mềm phát triển tốt nhất (hệ số tăng sinh 19,34
lần). Thời điểm cấy chuyền tốt nhất là 25 ngày sau khi cấy.
Số lần cấy chuyền (từ F1 - F5); cường độ chiếu sáng (0 - 500 - 1000 - 2000 3000 lux); yeast extract, chitosan, casein hydrolysate (50 - 100 - 150 - 200 mg/l) có
ảnh hưởng tới khả năng tăng sinh và tích lũy hoạt chất của mô sẹo. Kết quả cho thấy
khả năng tổng hợp terpinen-4-ol của mô sẹo được duy trì khá tốt trong ba lần cấy
chuyền đầu tiên, từ lần cấy chuyền thứ tư khả năng tổng hợp hoạt chất sẽ giảm.
Nhân sinh khối mô sẹo diễn ra trong điều kiện tối là tốt nhất, mô sẹo khi được chiếu
sáng với cường độ 2000 lux, 12 giờ/ngày sẽ tổng hợp terpinen-4-ol tốt nhất
(0,0218%). Việc bổ sung yeast extract, chitosan, casein hydrolysate có tác dụng làm
tăng hàm lượng terpinen-4-ol. Trong đó, nồng độ yeast extract 150 mg/l cho kết quả

v


tốt nhất (0,0256%). Mô sẹo Tràm Trà khi nuôi cấy trong môi trường lỏng và được
lắc với tốc độ 100 vòng/phút sẽ tạo dịch huyền phù tốt nhất với lượng mẫu ban đầu
là 1,5 g trên 50 ml môi trường và có khả năng tổng hợp terpinen-4-ol cao hơn 1,3
lần so với mô sẹo nuôi cấy trên môi trường thạch.

vi


ABSTRACT
The thesis “Studying the influences of the minerals, elicitors on cell growth
and terpinen-4-ol accumulation of Melaleuca alternifolia Cheel callus” was carried
out at Southern Key Laboratory for Plant Cell Technology, Institute for Tropical
Biology from 9/2010 to 9/2011. The aim of thesis is determination of factors
influencing on growth of callus and terpinen-4-ol accumulation in Melaleuca
alternifolia Cheel callus. The experiment was designed in completely randomized

design. The results of study showed that:
In examination of callus cultures on four media (MS, LV, WPM, B5)
supplemented with sucrose (10 - 20 - 30 g/l); phytohormones (BA, NAA, 2,4-D)
with different levels (0,5 - 1,0 - 2,0 - 4,0 mg/l); B1, glycine (5 - 10 - 15 mg/l);
coconut water (5 - 10 - 15%); peptone (0,5 - 1,0 - 2,0 g/l). Melaleuca alternifolia
Cheel leaves was a best explant for callus induction on MS medium supplemented
with 2,4-D (4 mg/l), BA (0,5 mg/l), glycine (10 mg/l), B1 (5 mg/l), sucrose (20 g/l)
(rate of callus induction is 97,22%). White fragile callus grew best on medium
supplemented with decreased 2,4-D concentration (1 mg/l), coconut water (15%)
without BA (growth rate: 19,34 times). The best subculture time is day 25 for
optimal growth of callus.
Cell generation (F1 - F5); light intensity (0 - 500 - 1000 - 2000 - 3000 lux);
yeast extract, chitosan, casein hydrolysate (50 - 100 - 150 - 200 mg/l) also
influenced on growth and terpinen-4-ol accumulation of callus. The results
indicated that terpinen-4-ol biosynthesis of callus was stably maintained in thrice of
first subcultures and decreased in 4th subculture. Proliferation of callus biomass in
dark condition was best, callus was lighted with intensity of 2000 lux in 12 h/day
enhancing highest terpinen-4-ol content in callus (0,0218%) . The supplement of
yeast extract, chitosan, casein hydrolysate promoted terpinen-4-ol content in callus
and the content of yeast extract (150 mg/l) showed the best result (0,0256%). The

vii


suitable weight of callus for establishment of suspension cultures was 1,5 g per 50
ml liquid medium and shaked with speed 100 round/min for finest suspension. The
biosynthesis of terpinen-4-ol of cell suspension in liquid medium was 1,3 times
higher than that of callus in solid medium.

viii

MỤC LỤC
TRANG
Trang tựa
Trang chuẩn y ............................................................................................................ i
Lý lịch cá nhân ......................................................................................................... ii
Lời cam đoan ........................................................................................................... iii
Lời cảm ơn .............................................................................................................. iv
Tóm tắt ................................................................................................................... v
Mục lục .................................................................................................................. ix
Danh sách các chữ viết tắt ..................................................................................... xiii
Danh sách các hình................................................................................................ xiv
Danh sách các bảng ................................................................................................ xv
ĐẶT VẤN ĐỀ

................................................................................................... 01

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Cây Tràm Trà .................................................................................................. 04
1.1.1. Phân bố sinh thái .......................................................................................... 05
1.1.2. Đặc điểm thực vật học.................................................................................. 05
1.1.3. Thành phần hóa học ..................................................................................... 06
1.1.4. Công dụng .................................................................................................... 08
1.1.5. Một số công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về cây Tràm Trà ......... 09
1.1.5.1. Công trình nghiên cứu trong nước ............................................................ 09
1.1.5.2. Công trình nghiên cứu nước ngoài ............................................................ 11
1.2. Terpinen-4-ol................................................................................................... 12
1.3. Nuôi cấy mô sẹo .............................................................................................. 15
1.3.1. Các giai đoạn trong quá trình hình thành mô sẹo .............................. 16

1.3.2. Những nhân tố ảnh hưởng tới quá trình phát sinh mô sẹo ........................... 17
1.3.3. Các giai đoạn phát triển của mô sẹo ............................................................ 18
1.3.4. Hình thái mô sẹo .......................................................................................... 18

ix


1.3.5. Màu sắc của mô sẹo ..................................................................................... 19
1.3.6. Phát sinh cơ quan trong nuôi cấy mô sẹo ..................................................... 20
1.3.7. Ứng dụng của nuôi cấy mô sẹo ................................................................... 21
1.3.8. Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất các hợp chất thứ cấp trong
nuôi cấy tế bào ............................................................................................ 22
1.3.9. Các phương pháp nâng cao tổng hợp hoạt chât trong nuôi cấy tế bào ........ 22
1.3.9.1. Tối ưu hoá điều kiện nuôi cấy ................................................................... 23
1.3.9.2. Chọn lọc dòng tế bào có khả năng sản xuất cao ....................................... 23
1.3.9.3. Bổ sung tiền chất ....................................................................................... 23
1.3.9.4. Cố định tế bào ........................................................................................... 23
1.3.9.5. Nhân tố cảm ứng (elicitor) ........................................................................ 24
1.4. Phương pháp sắc ký khí .................................................................................. 24
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu ......................................................................................... 26
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu................................................................... 26
2.3. Nội dung và phương pháp thực hiện ............................................................... 27
2.3.1. Tạo cây Tràm Trà in vitro ............................................................................ 28
Thí nghiệm 1: Vô mẫu in vitro............................................................................... 28
Thí nghiệm 2: Khảo sát môi trường khoáng cơ bản nuôi cấy cây Tràm Trà ......... 28
Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của BA lên khả năng nhân chồi Tràm Trà. ... 29
Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của IBA, NAA lên khả năng tạo rễ của chồi
Tràm Trà...................................................................................................... 29
2.3.2. Nuôi cấy tạo mô sẹo cây Tràm Trà .............................................................. 30

Thí nghiệm 5: Khảo sát môi trường khoáng cơ bản nuôi cấy tạo mô sẹo cây Tràm
Trà .................................................................................................................... 30
Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng đến
quá trình tạo mô sẹo cây Tràm Trà ............................................................. 30
Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của B1 và glycine đến quá trình tạo mô sẹo
cây Tràm Trà ............................................................................................... 31

x


2.3.3. Nhân sinh khối mô sẹo Tràm Trà................................................................. 31
Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA; NAA; 2,4-D đến quá trình
nhân sinh khối mô sẹo Tràm Trà ................................................................ 31
Thí nghiệm 9: Nghiên cứu ảnh hưởng của các thành phần hữu cơ đến quá trình
nhân sinh khối mô sẹo cây Tràm Trà .......................................................... 32
2.3.4. Xác định đường cong sinh trưởng mô sẹo Tràm Trà ................................... 32
Thí nghiệm 10: Khảo sát đường cong sinh trưởng mô sẹo Tràm Trà .................... 32
2.3.5. Nghiên cứu các yếu tố tác động đến khả năng tổng hợp terpinen-4-ol trong
mô sẹo Tràm Trà. ........................................................................................ 33
Thí nghiệm 11: Nghiên cứu ảnh hưởng của số lần cấy chuyền đến hàm lượng
terpinen-4-ol trong mô sẹo Tràm Trà.......................................................... 33
Thí nghiệm 12: Nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng đến quá trình nhân sinh khối
và hàm lượng terpinen-4-ol trong mô sẹo Tràm Trà. ................................. 33
Thí nghiệm 13: Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất bổ trợ đến quá trình nhân sinh
khối và hàm lượng terpinen-4-ol trong mô sẹo Tràm Trà .......................... 34
Thí nghiệm 14: Nghiên cứu ảnh hưởng của trạng thái môi trường đến khả năng
tích lũy hoạt chất trong mô sẹo ................................................................... 34
2.4. Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu và xử lí kết quả ..................... 35
2.4.1. Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu ............................................ 35
2.4.2. Phương pháp xác định hàm lượng terpinen-4-ol.......................................... 35

2.4.2.1. Ly trích terpinen-4-ol trong mô sẹo Tràm Trà bằng phương pháp chưng
cất lôi cuốn hơi nước ................................................................................... 35
2.4.2.2. Xác định terpinen-4-ol bằng phương pháp sắc ký khí .............................. 36
2.4.3. Xử lý số liệu ................................................................................................. 36
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tạo cây Tràm Trà in vitro ............................................................................... 37
Thí nghiệm 1: Vô mẫu in vitro............................................................................... 37
Thí nghiệm 2: Khảo sát môi trường khoáng cơ bản nuôi cấy cây Tràm Trà ......... 38
Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của BA lên khả năng nhân chồi Tràm Trà. ... 40

xi


Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của IBA, NAA lên khả năng tạo rễ của cây
Tràm Trà in vitro ......................................................................................... 43
3.2. Nuôi cấy tạo mô sẹo cây Tràm Trà ................................................................. 45
Thí nghiệm 5: Khảo sát môi trường khoáng cơ bản nuôi cấy tạo mô sẹo cây Tràm
Trà .................................................................................................................... 45
Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến quá trình
tạo mô sẹo cây Tràm Trà............................................................................. 50
Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của B1 và glycine đến quá trình tạo mô sẹo
cây Tràm Trà ............................................................................................... 53
3.3. Nhân sinh khối mô sẹo Tràm Trà.................................................................... 56
Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA; NAA; 2,4-D đến quá trình
nhân sinh khối mô sẹo Tràm Trà ................................................................ 56
Thí nghiệm 9: Nghiên cứu ảnh hưởng của các thành phần hữu cơ đến quá trình
nhân sinh khối mô sẹo cây Tràm Trà .......................................................... 59
3.4. Xác định đường cong sinh trưởng mô sẹo Tràm Trà ...................................... 62
Thí nghiệm 10: Khảo sát đường cong sinh trưởng mô sẹo Tràm Trà .................... 62
3.5. Nghiên cứu các yếu tố tác động đến khả năng tổng hợp terpinen-4-ol trong mô

sẹo Tràm Trà. .............................................................................................. 64
Thí nghiệm 11: Nghiên cứu ảnh hưởng của số lần cấy chuyền đến hàm lượng
terpinen-4-ol trong mô sẹo Tràm Trà.......................................................... 64
Thí nghiệm 12: Nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng đến nhân sinh khối và hàm
lượng terpinen-4-ol của mô sẹo Tràm Trà .................................................. 67
Thí nghiệm 13: Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất bổ trợ đến quá trình nhân sinh
khối và hàm lượng terpinen-4-ol của mô sẹo Tràm Trà ............................. 69
Thí nghiệm 14: Nghiên cứu ảnh hưởng của trạng thái môi trường đến khả năng
tích lũy hoạt chất trong mô sẹo ................................................................... 73
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................. 76
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 78
PHỤ LỤC .............................................................................................................. 85

xii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ACIAR:

australian centre for international agricultural research.

BA:

benzyladenine

B1:

vitamin B1 (Thiamin)

B5:

môi trường Gamborg 1968

CA:

casein hydrolysate

CHI:

chitosan

CTV:

cộng tác viên

CW:

coconut water (nước dừa)

DNA:

deoxyribonucleic acic

GA3:

gibberellic acid

IBA:

indolebutyric acid

ISO:

international organization for standardization

LV:

môi trường Litvay 1985

MS:

môi trường Murashige-Skoog 1962

Môi trường thạch: môi trường có bổ sung agar 8 g/l
NAA:

α-Naphthalene acetic acid

NT:

nghiệm thức

TN:

thí nghiệm

TTO:

tea tree oil

WPM:

môi trường Loyd & McCown 1980

YE:

yeast extract

2,4-D:

2,4-dichlorophenoxy acetic acid

xiii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
HÌNH

TRANG

Hình 1.1. Cây Tràm Trà ........................................................................................ 04
Hình 1.2. Hoa Tràm Trà ........................................................................................ 06
Hình 1.3. Con đường tổng hợp terpenoid trong thực vật ...................................... 12
Hình 1.4. Con đường sinh tổng hợp monoterpenes trong tinh dầu Tràm Trà ....... 13
Hình 1.5. Mối liên hệ sinh hóa giữa các monoterpenes trong tinh dầu Tràm Trà 14
Hình 1.6. Sơ đồ khối máy sắc ký khí khối phổ ..................................................... 25
Hình 2.1. Sơ đồ tổng quan nội dung thực hiện ..................................................... 27
Hình 3.1. Chồi phát sinh sau khi vô trùng mẫu 25 ngày ....................................... 38
Hình 3.2. Chồi Tràm Trà sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường MS, LV, WPM,
B5 ................................................................................................................ 40

Hình 3.3. Chồi Tràm Trà nuôi cấy trên môi trường LV + sucrose 30 (g/l) + BA
(0,1 - 0,5 - 1,0 - 2,0 mg/l) ............................................................................ 42
Hình 3.4. Chồi Tràm Trà nuôi cấy trên môi trường LV + sucrose 30 (g/l) + NAA
(0,1 - 0,5 - 1,0 - 2,0 mg/l); IBA 2,0 mg/l .................................................... 44
Hình 3.5. Mô sẹo tạo từ lá và thân trên môi trường MS, LV, WPM, B5 .............. 48
Hình 3.6. Mô sẹo tạo từ lá khi nuôi cấy trên môi trường MS + BA; MS + BA 0,5 mg/l
+ 2,4-D 4,0 mg/l .......................................................................................... 53
Hình 3.7. Mô sẹo tạo từ lá trên môi trường MS + BA 0,5 mg/l + 2,4-D 4,0 mg/l +
B1 5 mg/l + glycine 10 mg/l ....................................................................... 56
Hình 3.8. Mô sẹo nuôi cấy trên môi trường MS + 2,4-D (1 mg/l) + sucrose (20 g/l)
+ B1 (5 mg/l) + glycine (10 mg/l)............................................................... 59
Hình 3.9. Mô sẹo Tràm Trà nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D
(1mg/l), glycine (5 mg/l), B1 (10 mg/l), cw (15%), sucrose (20 g/l) ......... 62
Hình 3.10. Đường cong sinh trưởng của mô sẹo cây Tràm Trà ............................ 63
Hình 3.11. Sắc ký đồ sắc ký khí khối phổ xác định hàm lượng terpinen-4-ol ...... 66
Hình 3.12. Mô sẹo Tràm Trà khi nuôi cấy ngoài sáng .......................................... 69
Hình 3.13. Dịch huyền phù tế bào Tràm Trà......................................................... 75

xiv


DANH SÁCH CÁC BẢNG
BẢNG

TRANG

Bảng 1.1. Thành phần hóa học của dầu Tràm Trà ................................................. 07
Bảng 3.1. Khảo sát vô trùng mẫu cây Tràm Trà.................................................... 37
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của thành phần khoáng cơ bản nuôi cấy cây Tràm Trà ..... 39
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của BA lên khả năng nhân cụm chồi Tràm Trà. ................ 41

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của IBA và NAA lên khả năng tạo rễ ............................... 43
Bảng 3.5a. Khảo sát môi trường khoáng thích hợp tạo mô sẹo cây Tràm Trà...... 45
Bảng 3.5b. Thời gian tạo mô sẹo cây Tràm Trà trên bốn loại môi trường khoáng
MS, LV, WPM, B5 ................................................................................................ 47
Bảng 3.6a. Ảnh hưởng của BA và 2,4-D trong quá trình tạo mô sẹo .................. 50
Bảng 3.6b. Ảnh hưởng của BA và 2,4-D đến thời gian tạo mô sẹo ...................... 52
Bảng 3.7a. Ảnh hưởng của B1 và glycine đến quá trình tạo mô sẹo ............................ 54
Bảng 3.7b. Ảnh hưởng của B1 và glycine đến thời gian tạo mô sẹo. ................... 55
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của BA; NAA và 2,4-D đến nhân sinh khối mô sẹo .......... 58
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của các thành phần hữu cơ đến nhân sinh khối mô sẹo.............. 60
Bảng 3.10. Khảo sát ảnh hưởng của số lần cấy chuyền đến hàm lượng terpinen-4-ol
trong mô sẹo. ............................................................................................... 64
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng đến quá trình nhân sinh khối mô
sẹo và hàm lượng terpinen-4-ol trong mô sẹo. ........................................... 67
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ yeast extract, chitosan, casein hydrolysate đến
quá trình nhân sinh khối và hàm lượng terpinen-4-ol của mô sẹo. ............. 72
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của trọng lượng mẫu ban đầu đến khả năng tạo dịch huyền
phù. .............................................................................................................. 73

xv


MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Tràm Trà (Melaleuca alternifolia Cheel) còn được gọi là Tràm Lá Hẹp là
loại cây chứa tinh dầu có xuất xứ từ nước Úc. Trước đây, Tràm Trà được sử dụng
để cải tạo môi trường ở những vùng khí hậu khắc nghiệt, đất gò đồi nghèo dinh
dưỡng nhờ khả năng sinh trưởng và phát triển mạnh. Đến năm 1923, cùng với việc
các nhà khoa học phát hiện khả năng kháng khuẩn của tinh dầu Tràm Trà và một số
tác dụng dược lý khác (trị viêm họng, viêm da chữa các vết thương bỏng, rắn cắn,

cầm máu, trị các chứng bệnh ngoài da như ngứa ngáy, mề đay, gàu, lở loét, mụn
trứng cá, rận rệp, đau nhức…) đã giúp cây Tràm Trà trở nên phổ biến với khả năng
sản xuất tinh dầu quý. Tinh dầu Tràm Trà được sử dụng rộng rãi như một nguồn
kháng sinh tự nhiên với nhu cầu ngày càng tăng dẫn đến việc cây Tràm Trà đã được
trồng tập trung ở nhiều nơi trên thế giới với mục tiêu sản xuất tinh dầu.
Ở Việt Nam, cây Tràm Trà được viện dược liệu di thực về trồng và nhân
giống ở các tỉnh phía Bắc vào năm 1986, sau đó được đưa vào trồng ở các tỉnh phía
Nam (năm 1995). Từ khi đưa vào trồng ở nước ta cây Tràm Trà cho thấy khả năng
thích nghi tốt, không chỉ tham gia phủ xanh đất trống đồi trọc lá Tràm Trà còn tạo
ra các sản phẩm tinh dầu có thể xuất khẩu được. Chất lượng tinh dầu Tràm Trà
trồng tại Việt Nam phù hợp với tinh dầu Tràm Trà trồng tại Úc với hàm lượng
terpinen-4-ol trên 30% (Nguyễn Văn Nghi và ctv, 1997). Giá trị thương phẩm của
dầu Tràm Trà phụ thuộc chủ yếu vào hàm lượng terpinen-4-ol, tinh dầu có hàm
lượng hoạt chất này cao rất được ưa chuộng và có giá thành cao trên thị trường. Tuy
nhiên, hàm lượng terpinen-4-ol tích lũy trong cây ngoài tự nhiên phụ thuộc vào
nhiều yếu tố như: mùa, cá thể, các yếu tố ngoại cảnh, thời điểm thu hoạch...Vì vậy,
để thu được tinh dầu Tràm Trà với chất lượng tốt gặp rất nhiều khó khăn. Bên cạnh

1


đó, để sản xuất tinh dầu thu hoạt chất terpinen-4-ol đòi hỏi rất nhiều diện tích, thời
gian dài, chi phí cao. Tổng hợp terpinen-4-ol nhân tạo lại là một quá trình phức tạp.
Ngày nay, với sự phát triển của công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật đã mở ra
một hướng mới để giải quyết các vấn đề nêu trên. Trong đó, nuôi cấy mô sẹo được
xem là kỹ thuật mang lại nhiều hiệu quả, là tiền đề cho các nghiên cứu khác như: tái
sinh chồi từ mô sẹo (trong sản xuất giống), nuôi cấy tạo dịch huyền phù tế bào thu
nhận các hợp chất thứ cấp... Bên cạnh đó, nuôi cấy mô sẹo còn khắc phục được
những hạn chế của phương pháp sản xuất truyền thống thu nhận hoạt chất từ nguồn
tự nhiên. Với ưu điểm chỉ cần một diện tích nhỏ, chi phí nhân công thấp, có thể tự

động hóa ở qui mô công nghiệp và chọn lọc được những dòng tế bào có khả năng
sản xuất hoạt chất cao, nuôi cấy mô sẹo cho thấy là một phương pháp hiệu quả để
sản xuất terpinen-4-ol trên quy mô công nghiệp. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng, chất cảm ứng đến khả năng sinh
trưởng và tích lũy terpinen-4-ol của mô sẹo cây Tràm Trà (Melaleuca alternifolia
Cheel)”.
2. Mục tiêu đề tài
Xác định các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình nuôi cấy mô sẹo và khả năng
tích lũy terpinen-4-ol trong mô sẹo Tràm Trà.
3. Nội dung
- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường khoáng, chất điều hòa sinh trưởng
đến quá trình nhân chồi và ra rễ của cây Tràm Trà.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường khoáng, chất điều hòa sinh trưởng
và các chất hữu cơ đến quá trình tạo mô sẹo cây Tràm Trà.
- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân sinh khối mô sẹo cây
Tràm Trà.
- Nghiên cứu sự tác động của điều kiện nuôi cấy và các chất bổ trợ sinh
trưởng đến khả năng tích lũy terpinen-4-ol trong mô sẹo cây Tràm Trà.

2


4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
- Đề xuất hướng sản xuất terpinen-4-ol trên quy mô công nghiệp thông qua
nuôi cấy mô sẹo Tràm Trà.
- Kết quả nghiên cứu của đề tài làm tiền đề cho một số nghiên cứu khác như
tái sinh chồi từ mô sẹo tạo nguồn cây giống sạch bệnh với số lượng lớn hay nuôi
cấy dịch huyền phù tế bào Tràm Trà thu nhận các chất có hoạt tính sinh học và
hướng tới sản xuất trên quy mô công nghiệp.

3


Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. Cây Tràm Trà
- Tên khoa học:

Melaleuca alternifolia Cheel

- Chi:

Melaleuca

- Họ:

Myrtaceae

- Bộ:

Myrtales

- Giới:

Plantae

Cây Tràm Trà còn được gọi là Tràm
Lá Hẹp, Tràm Úc là một chi lớn của họ
Myrtaceae bao gồm hơn 230 loài với
khoảng 219 loài đặc hữu của nước Úc.

Trong số đó, một số loài có giá trị sản xuất
tinh dầu thương mại như Melaleuca
alternifolia Cheel, Melaleuca cajuputi,
Melaleuca quinquenervia Blake. Tuy nhiên,
Melaleuca alternifolia Cheel hiện là loài
được sử dụng để sản xuất tinh dầu chủ yếu
tại Úc (Baskorowati, 2006).
Tràm Trà là loại cây có tinh dầu
được dùng làm dược liệu, được thuyền
trưởng James Cook (người Anh) phát hiện ở

Hình 1.1. Cây Tràm Trà
(Baskorowati, 2006)

bờ biển New South Wales của nước Úc vào năm 1770. Cây Tràm Trà mọc trong các
đầm lầy, vùng đất thấp trên bờ biển ở phía bắc New South Wales, nơi mà các bộ tộc
bản địa sử dụng lá tràm như là một chất khử trùng trong nhiều thế kỷ. Sau đó,
những người tới định cư bắt đầu sử dụng lá để điều trị một loạt các bệnh về da như

4


vết cắt, vết bỏng, vết côn trùng cắn... Từ đó, việc sử dụng dầu cây Tràm Trà lan
rộng và bây giờ phổ biến trên toàn thế giới như một chất kháng sinh tự nhiên. Các
sản phẩm tinh chế từ tinh dầu Tràm Trà chứa hàm lượng terpinene-4-ol cao và hàm
lượng 1,8-cineole thấp (dưới 5%) đã phát triển mạnh trên quy mô thương mại.
Trong giai đoạn những năm 1926, dầu Tràm Trà Úc sản xuất chủ yếu từ nguồn tự
nhiên thu trên bờ biển phía bắc của New South Wales với sản lượng 2 - 20 tấn/năm
(Baskorowati, 2006). Do nhu cầu dầu Tràm Trà gia tăng từ cuối những năm 1980
Tràm Trà đã được trồng tập chung trên quy mô công nghiệp (chủ yếu ở phía bắc

New South Wales và Bắc Queensland) với tổng diện tích 4.000 ha có thể đáp ứng
nhu cầu dầu Tràm Trà gần 500 tấn/năm.
1.1.1. Phân bố sinh thái
Trong tự nhiên, các loài Melaleuca nói chung được tìm thấy trong các rừng
thưa, rừng gỗ hay vùng đất có cây bụi, cụ thể là dọc theo các dòng suối và rìa các
đầm lầy (Riedl, 1997). Ở nước Úc cây Tràm Trà mọc chủ yếu trong các đầm lầy,
vùng đất thấp trên bờ biển ở phía bắc New South Wales.
Sau khi di thực vào nước ta (tháng 6/1986), cây Tràm Trà được trồng tại các
địa phương như: Hà Nội, Hà Tây, Quảng Bình, Phú Yên… Với số lượng cây rất ít.
Năm 1995, chương trình hợp tác với Úc bác sĩ Nguyễn Hoàng Tâm trồng trên quy
mô 25 ha tại xã Lộc Thành - Lộc Ninh - Bình Phước đã khai thác được tinh dầu cho
xuất khẩu với số lượng lớn. Việc đánh giá khả năng sinh trưởng, tính thích nghi của
cây Tràm Trà trên các vùng sinh thái cùng với các phương pháp nhân giống bằng
hạt hay bằng giâm cành có hiệu quả kinh tế, nhằm từng bước phát triển cây tinh dầu
mới này trên cả nước đã được thực hiện.
1.1.2. Đặc điểm thực vật học
Tràm Trà thuộc loại cây thân gỗ cao từ 2 - 30 m, có lớp vỏ dễ tróc. Lá màu
xanh, mọc so le, hình trứng hay mũi mác, dài 1 - 25 cm và rộng 0,5 - 7 cm, mép lá
nhẵn, màu xanh lục sẫm hay xanh xám. Hoa mọc thành cụm dày đặc dọc theo thân.
Cụm hoa có gai bao gồm 08 - 24 hoa đơn (chiều dài 5 mm, chiều rộng 2 mm). Mỗi
bông hoa là một thể hoàn chỉnh với cơ quan sinh sản đực và cái, gồm 4 lá đài, 4

5


cánh hoa, 5 nhị chứa nhiều bao phấn
được gắn bởi chỉ nhị ngắn và một đầu
nhụy nhỏ ở phần cuối của mỗi nhị.
Tất cả các bộ phận của hoa
trước khi nở được bao bọc bởi những

cánh hoa trắng. Khi các cánh hoa mở,
các nhị bung ra, phô ra các nhị hoa với
các sợi mịn như lông tơ màu trắng.
Phấn hoa của các hoa đơn được tung
ra trước đầu nhụy và được nhụy thu
Hình 1.2. Hoa Tràm Trà
(Baskorowati, 2006)

lấy.
Một số lượng lớn hoa được sinh

ra trên một cây trong một khoảng thời gian 2 - 3 tuần thường là từ giữa tháng mười
đến cuối tháng mười một. Do đó, có rất nhiều cơ hội cho nhụy hoa nhận phấn từ
hoa gần đó của cùng một cây làm tăng khả năng tự thụ phấn (Baskorowati, 2006).
1.1.3. Thành phần hóa học
Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thới Nhâm và ctv (2002), thành phần
hóa học của tinh dầu Tràm Trà trồng tại Việt Nam có chứa hàm lượng terpinen-4-ol cao
(46,6%) và chứa ít cineol (5,05%). Thành phần chủ yếu của tinh dầu Tràm Trà Úc
ngược lại với tinh dầu Tràm (Melaleuca cajuputi) chứa khoảng 45 - 60% cinoel,
nhưng chỉ chứa rất ít terpinen-4-ol (1 - 1,5%).
Dầu Tràm Trà được chưng cất bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước chủ yếu
từ lá của Melaleuca alternifolia. Lá Tràm Trà chứa 2% dầu dễ bay hơi màu vàng
nhạt. Khoảng một phần ba phần tinh dầu này bao gồm các hydrocarbon terpene như
beta-pinen, limonene, aromadendrene, 1-8 cineole và nhiều hợp chất khác. Phần còn
lại bao gồm các terpen oxy hóa, với 30% terpinen-4-ol (Tyler, 1994). Brophy và ctv
(1989) đã thử nghiệm trên 800 mẫu dầu Tràm Trà và xác định được khoảng 100
thành phần có trong dầu Tràm Trà. Trong đó, terpinen-4-ol là nhiều nhất cùng với
các thành phần khác như terpinolene và 1,8-cineole… (Bảng 1.1). Các thành phần

6

này có tác dụng tương tự trên các bệnh do vi sinh vật gây ra (Homer và ctv, 2000).
Ngày nay, trong sản xuất thương mại dầu Tràm Trà được gọi là TTO và tổ chức tiêu
chuẩn quốc tế (ISO) đã quy định về tỷ lệ tối thiểu và tối đa cho 14 thành phần trong
dầu, đặc biệt là terpinen-4-ol (trên 30%) và 1,8-cineole (dưới 15%) (ISO 2004)
(Bảng 1.1). Những quy định này được ban hành vì terpinen-4-ol được cho là thành
phần hoạt động và 1,8 cineole đã được báo cáo là một chất kích thích da (Carson và
ctv, 2006). Hiện nay, tiêu chuẩn này vẫn tồn tại vì 1,8-cineole và terpinen-4-ol
thường có tỷ lệ nghịch đảo trong dầu, dầu với nồng độ terpinen-4-ol cao hơn được
xác định là có hoạt tính kháng khuẩn tốt hơn (Brophy và ctv, 1989).
Bảng 1.1. Thành phần hóa học của dầu Tràm Trà (Carson và ctv, 2006)
Thành phần
Terpinen-4-ol
γ-terpinene
α-terpinene
1, 8-cineole
Terpinolene
α-terpineol
p-cymene
α-pinene
Aromadendrene
Virdiflorene
δ-cadinene
Limonene
β-phellandrene
Globulol
Myrcene
α -thujene
β-pinene

Sabinene
α -phellandrene
Viridiflorol

Tỷ lệ trung
bình (%)

Tỷ lệ tối
thiểu (%)

Tỷ lệ tối
đa (%)

Tiêu chuẩn
ISO 4730 (%)

37,93
20,20
9,56
3,87
3,45
3,01
2,80
2,46
1,68
1,68
1,49
1,01
0,94
0,86

0,86
0,83
0,66
0,45
0,44
0,33

28,6
9,5
4,6
0,5
1,6
1,5
0,4
0,8
0,1
0,3
0,1
0,4
0,4
0,1
0,1
0,1
0,1
0,0
0,1
0,1

57,9
28,3

12,8
17,7
5,4
7,6
12,4
3,6
6,6
6,1
7,5
2,7
1,9
3,0
1,8
2,1
1,6
3,2
1,9
1,4

≥30
10-28
5-13
≤15
1,5-5
1,5-8
0,5-12
1-6

7

0,5-4


1.1.4. Công dụng
Tinh dầu Tràm Trà có màu vàng chanh nhẹ với mùi thơm dễ chịu, là chất
khử trùng không gây hại sức khỏe. Tinh dầu Tràm Trà Úc có tác động kháng khuẩn
trên cả vi khuẩn gram (-) và gram (+) thử nghiệm và hoạt lực kháng khuẩn tương
đương với nhóm kháng sinh cephalosporin thế hệ 2. Tính chất kháng khuẩn này có
thể ứng dụng trong các chế phẩm xoa bóp, trị viêm họng, viêm da, trong mỹ phẩm...
Ngoài ra, các kết quả nghiên cứu về các chỉ số vật lý, các chỉ số đặc trưng và thành
phần hóa học của tinh dầu giúp góp phần tiêu chuẩn hóa và kiểm nghiệm phân biệt
tinh dầu Melaleuca alternifolia với các tinh dầu khác (Nguyễn Thới Nhâm và ctv,
2002).
Tinh dầu Tràm Trà được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất kem đánh răng,
nước súc miệng, dùng để chữa các vết thương bỏng, rắn cắn, để cầm máu, trị các
chứng ngoài da như ngứa ngáy, mề đay, gàu, lở loét, mụn trứng cá, rận rệp, đau
nhức, nức nẻ, viêm lợi… Hiện nay, nhu cầu tinh dầu Tràm Trà trên thế giới rất lớn,
các nước như Mỹ, Nga, Châu Âu… Hàng năm phải nhập với số lượng rất lớn, giá từ
25 - 42 USD/kg tinh dầu (Nguyễn Văn Minh, 2010).
Từ năm 1992, một số thử nghiệm lâm sàng cho thấy khả năng điều trị tốt của
dầu Tràm Trà so với một số phương pháp điều trị thông thường như trong thử
nghiệm điều trị bệnh nấm móng tay trên 117 bệnh nhân, các nhiễm trùng được điều
trị trong sáu tháng với hai lần trong một ngày, các bệnh nhân trong hai nhóm thử
nghiệm được điều trị bằng clotrimazole 1% hoặc 100% dầu Tràm Trà. Cuối quá
trình điều trị, cả hai nhóm đều cho thấy kết quả tích cực như nhau (Buck và ctv,
1994). Dầu Tràm Trà cũng có hiệu quả loại bỏ chí, các vi sinh vật gây bệnh viêm da
tiết bã và gàu (Veal, 1996). Ngoài ra, dầu Tràm Trà còn ức chế sự phát triển của
nhiều loài và chủng nấm khác như thử nghiệm đối với 26 chủng Dermatophytes và
54 chủng nấm men (bao gồm 32 chủng Candida albicans và 22 chủng Malassezia
furfur) đã cho kết quả ức chế sự phát triển của tất cả các chủng nấm này (Nenoff và

ctv, 1996). Trong một nghiên cứu khác, dầu Tràm Trà cho thấy khả năng ức chế đến
90% trên 64 chủng Malassezia furfur, nồng độ ức chế tối thiểu của dầu Tràm Trà là

8