XÁC ĐỊNH SỰ HIỆN DIỆN VÀ PHÁT HIỆN MỘT SỐ GEN ĐỘC LỰC CỦA VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS, VIBRIO VULNIFICUS TRÊN TÔM, NHUYỄN THỂ BẰNG KỸ THUẬT PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
********************

NGUYỄN THỊ HỒNG KIỂN

XÁC ĐỊNH SỰ HIỆN DIỆN VÀ PHÁT HIỆN MỘT SỐ
GEN ĐỘC LỰC CỦA VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS,
VIBRIO VULNIFICUS TRÊN TÔM, NHUYỄN THỂ

BẰNG KỸ THUẬT PCR

Chuyên ngành: THÚ Y
Mã số ngành: 60 62 50

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Thành phố Hồ Chí Minh - Tháng 12/2011


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN THỊ HỒNG KIỂN

XÁC ĐỊNH SỰ HIỆN DIỆN VÀ PHÁT HIỆN MỘT SỐ
GEN ĐỘC LỰC CỦA VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS,
VIBRIO VULNIFICUS TRÊN TÔM, NHUYỄN THỂ

BẰNG KỸ THUẬT PCR

Chuyên ngành: THÚ Y
Mã số ngành: 60 62 50
LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Hướng dẫn khoa học
PGS.TS.NGUYỄN NGỌC TUÂN

Thành phố Hồ Chí Minh - Tháng 12/2011


XÁC ĐỊNH SỰ HIỆN DIỆN VÀ PHÁT HIỆN MỘT SỐ
GEN ĐỘC LỰC CỦA VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS,
VIBRIO VULNIFICUS TRÊN TÔM, NHUYỄN THỂ
BẰNG KỸ THUẬT PCR

NGUYỄN THỊ HỒNG KIỂN

Hội đồng chấm luận văn:
1. Chủ tịch:

TS. PHẠM HÙNG VÂN
Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh

2. Thư ký:

TS. VÕ THỊ TRÀ AN
Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh

3. Phản biện 1:

TS. HỒ THỊ KIM HOA
Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh

4. Phản biện 2:

TS. TRẦN THỊ BÍCH LIÊN
Hội Thú y

5. Ủy viên:

TS. TRẦN THỊ QUỲNH LAN
Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh

i


LÝ LỊCH CÁ NHÂN

Họ và tên: Nguyễn Thị Hồng Kiển
Ngày sinh: 23/08/1974
Nơi sinh: Tiền Giang
Họ tên Cha: Nguyễn Văn Hai
Họ tên Mẹ: Nguyễn Thị Huỳnh Mai
Quá trình học tập
-Tháng 6/1993: Tốt nghiệp phổ thông trung học tại trường PTTH Đốc Binh Kiều,
Cai Lậy, Tiền Giang.
-Tháng 8/1998: Tốt nghiệp Đại học ngành Chăn nuôi Thú y hệ chính quy tại trường
Đại học Cần Thơ.

-Tháng 10/1998: làm việc tại Chi cục Thú y tỉnh Tiền Giang.
-Tháng 11/1999: đến nay làm việc tại Trạm Thú y thị xã Dĩ An, tỉnh Bình Dương.
-Tháng 10/2009: Học Cao học ngành Thú y tại Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí
Minh
Địa chỉ liên lạc
Số nhà 13/21 Kp Thắng Lợi 2, P. Dĩ An, thị xã Dĩ An, tỉnh Bình Dương
Email:
Điện thoại: 0909.209.903

ii


LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan những công bố trong luận văn này là trung thực và là
một phần trong đề tài cấp bộ mã số B2010 – 12 – 95 do PGS. TS. Nguyễn Ngọc
Tuân làm chủ nhiệm. Những số liệu trong luận văn được phép công bố với sự đồng
ý của chủ nhiệm đề tài.

XÁC NHẬN CỦA CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI

Học viên

Nguyễn Thị Hồng Kiển

iii


LỜI CẢM ƠN
Xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm

Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Khoa Chăn Nuôi Thú Y, cùng tất cả
quý thầy cô đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời
gian được học tại trường.
Con mãi luôn ghi nhớ và biết ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Ngọc Tuân,
người thầy đã tận tình dạy dỗ, động viên, hướng dẫn con thực hiện đề tài và
hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Trân trọng cảm ơn Phòng thực tập Kiểm nghiệm thú sản và Môi trường
sức khỏe vật nuôi, Khoa Chăn nuôi Thú y, Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ
Chí Minh; Công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á, Bình Dương đã tạo mọi điều
kiện tốt nhất để cho tôi thực hiện và hoàn thành đề tài này.
Chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Chi cục Thú y Bình Dương, Chi bộ
Phòng Kinh tế, Trạm Thú y Dĩ An và các anh em đồng nghiệp tạo điều kiện,
thông cảm và chia sẻ công việc để cho tôi được theo học và hoàn thành luận
văn tốt nghiệp.
Chân thành cám ơn các anh chị lớp Cao học Thú y khóa 2009 cùng tất
cả các bạn bè và anh em trong phòng thực hành Kiểm nghiệm thú sản và Môi
trường sức khỏe vật nuôi, Công ty CPCN Việt Á đã nhiệt tình giúp đỡ tôi
hoàn thành tốt đợt thực hiện đề tài.
Và con mãi khắc ghi công ơn trời biển của Cha Mẹ đã sinh thành,
dưỡng dục con nên người và cho con có được ngày hôm nay. Cảm ơn chồng,
các con và Cô Mai đã thông cảm, chia sẻ, động viên để có được niềm tin, nghị
lực vượt qua những khó khăn trong cuộc sống và học tập.
Nguyễn Thị Hồng Kiển

iv


DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT
ASPW

Alkaline saline peptone water: nước muối peptone kiềm

bp

base pairs

BLAST

Basic Local Aligment Search Tool

CDC

Centers for Disease Control and Prevention: trung tâm kiểm soát
phòng bệnh

CFU

Colony Forming Unit

FDA

Food and Drug Administration

ISO

International Organization for Standardization

ISSC

Interstate Shellfish Sanitation Conference

MPN

Most Probable Number

NCBI

National Center For Biotechnology Information

PCR

Polymerase Chain Reaction

TCBS

Thiosulphate Citrate Bile Salt

TDH

Thermostable direct hemolysin: yếu tố gây dung huyết trực tiếp
chịu nhiệt

TLH

Thermolabile direct hemolysin: yếu tố gây dung huyết kém chịu
nhiệt

TRH

Thermostable - related direct hemolysin

WHO

World Health Organization: tổ chức sức khỏe thế giới

v


TÓM TẮT
Xác định sự hiện diện và phát hiện một số gen độc lực của Vibrio
parahaemolyticus, Vibrio vulnificus trên tôm, nhuyễn thể bằng kỹ thuật PCR
Vibrio parahaemolyticus là một trong những nguyên nhân gây viêm dạ
dày – ruột trên người liên quan đến các vụ ngộ độc thức ăn thủy hải sản. Vibrio
vulnificus gây tổn thương mô mềm và nhiễm trùng máu. Mục tiêu của đề tài là
phát hiện sự hiện diện của V. parahaemolyticus, V. vulnificus trên tôm và nhuyễn
thể hai mảnh vỏ cũng như một số gen độc lực của chúng bằng phương pháp PCR
và nuôi cấy truyền thống, so sánh giữa hai phương pháp phát hiện.
Đề tài đã thu thập và xử lý 240 mẫu tôm, nhuyễn thể ở địa bàn tỉnh Đồng
Nai và TP. Hồ Chí Minh. Mẫu được tăng sinh trong môi trường nước muối
peptone kiềm, bổ sung polymycin B 50UI với hai nồng độ muối khác nhau 3%
(môi trường 1) và 6% (môi trường 2). Các phản ứng PCR được thực hiện trực
tiếp từ dung dịch tăng sinh để phát hiện V. parahaemolyticus, V. vulnificus và
một số gen độc lực của chúng. Ngoài ra các gốc khuẩn lạc thu từ môi trường
tăng sinh được thử sinh hóa và khẳng định lại bằng m-PCR1. Một số gốc của hai
loài vi khuẩn này được thử tính đề kháng với một số kháng sinh.
Phản ứng m-PCR1 trực tiếp từ DNA của mẫu tăng sinh đã phát hiện được
V.

parahaemolyticus ở môi trường 1 là 30,42% (73/240 mẫu) và 27,92%

(67/240 mẫu) ở môi trường 2. Phương pháp sinh hóa phát hiện được V.
parahaemolyticus ở hai môi trường lần lượt là 24,58% (59/240 mẫu) và 8,33%
(20/240 mẫu). Tuy nhiên, đối với những gốc đã thử sinh hóa là V.
parahaemolyticus thì m-PCR1 xác nhận được 58/165 gốc (35,15%) ở môi trường 1.
Tương tự, m-PCR1 phát hiện được V. vulnificus là 26,67% (64/240 mẫu)
ở môi trường 1 và 20,42% (49/240 mẫu) ở môi trường 2. Trong khi đó, phương
pháp sinh hóa phát hiện được 16,25% (39/240 mẫu) và 7,5% (13/240 mẫu) ở môi

vi


trường 1 và 2. Đối với những gốc đã thử sinh hóa là V. vulnificus thì m-PCR1
xác nhận được 19/65 gốc (29,23%) ở môi trường 1.
Phản ứng m-PCR2 trực tiếp từ DNA của dung dịch tăng sinh dương tính
và các gốc đã xác nhận dương tính với m-PCR1 là V. parahaemolyticus thì tất
cả đều mang gen tlh.
Phản ứng PCR3 trực tiếp từ DNA của dung dịch tăng sinh dương tính
hoặc các gốc đã xác nhận dương tính với m-PCR1 thì gen vvp chỉ chiếm khoảng
30-40%.
Như vậy, môi trường tăng sinh có 3% NaCl thích hợp cho việc phát hiện V.
parahaemolyticus và V. vulnificus cũng như một số gen độc lực của chúng.
Phương pháp PCR tầm soát hai loài vi khuẩn này nhanh, nhạy và ít tốn chi phí
hơn phương pháp nuôi cấy truyền thống.
Các gốc V.

parahaemolyticus đề kháng hoàn toàn với amoxicillin,

polymycin B, vancomycin (100%) và nhạy cảm cao với chloramphenicol,
gentamicin, ciprofloxacin (100%) và tetracycline (88,89%). Các gốc V. vulnificus
đề kháng hoàn toàn với amoxicillin, polymycin B, erythromycin (100%) và nhạy

cảm cao với gentamicin, chloramphenicol, ciprofloxacin, tetracycline và
vancomycin (100%).

vii


SUMMARY
Identification of the presence and detection of some virulence genes of Vibrio
parahaemolyticus and Vibrio vulnificus in shrimp and shellfish by PCR
V. parahaemolyticus is one of the most common causes of seafood-borne
bacterial gastroenteritis in human. V. vulnificus may cause fatal wound infections
and septicemia. The objectives of this study were to detect the presence of V.
parahaemolyticus and V. vulnificus as well as some their virulence genes in shrimp
and shellfish by using multiplex PCR (m-PCR) and traditional method and the
comparision between two methods was used. Total 240 shrimp and shellfish
samples were collected from Dong Nai Province and HoChiMinh City. Samples
were grown in alkaline peptone water (APW) supplemented with polymycin B
50UI containing either 3% salt (medium No 1) or 6% salt (medium No 2). DNA
extracted from enriched samples to identify V. parahaemolyticus and V.
vulnificus by m-PCR1, virulence genes of V. parahaemolyticus by m-PCR2 and
vvp gene of V. vulnificus by PCR3. Besides, isolates from enriched media were
examined using conventional method and were confirmed by m-PCR1. The
isolates of V. parahaemolyticus and V.

vulnificus were tested for antibiotic

resistances.
By m-PCR1 reaction, V. parahaemolyticus was detected from 30.42% of
the enriched samples in medium No 1 and 27.92% of the enriched samples in
medium No 2. While, the bacteria were isolated from only 24.58% and 8.33% of the

samples, respectively. However, only 35.15% of V. parahaemolyticus isolates
(medium No 1) confirmed by m-PCR1 after biochemical analysis was used.
Similarly, the rates of V. vulnificus of the medium No 1 (26.67%) and the
medium No 2 (20.42%) using m-PCR2 were also higher than those of the medium
No 1 (16.25 %) and the medium No 2 (7.50 %) using biochemical identification. In

viii


the other hand, there was 29.23% of V. vulnificus isolates confirmed by m-PCR1
from medium No 1 after the usage of biochemical analysis.
No pathogenic V. parahaemolyticus tdh or trh strains were found in the
positive samples of V. parahaemolyticus, but the tlh gene was found in the samples
infected with V. parahaemolyticus. In addition, the presence of vvp virulence gene
was ranged from 30% to 40%.
Comparison of the two methods highlighted that PCR techniques is more fast,
sensitive and less expensive than traditional method. In addition, the medium No 1
supplemented 3% salt is more suitable for the growing of these two Vibrio species.
All isolates of V.

parahaemolyticus were resistant to amoxicillin,

polymycin B and vancomycin and sensitive to chloramphenicol, gentamicin,
ciprofloxacin and

tetracycline. V. vulnificus showed 100% resistance to

amoxicillin, polymycin B and erythromycin and 100% sensitivity to gentamicin,
chloramphenicol, ciprofloxacin, tetracycline and vancomycin.

ix


MỤC LỤC
Trang chuẩn y ...………………………………………………………………..

i

Lý lịch cá nhân …………………………………………………………………

ii

Lời cam đoan …………………………………………………………………...

iii

Lời cảm ơn ……………………………………………………………………..

iv

Danh sách các từ viết tắt ……………………………………………………….

v

Tóm tắt …………………………………………………………………………

vi

Summary ……………………………………………………………………….

viii

Mục lục …………………………………………………………………………

x

Danh sách các bảng ……………………………………………………………

xi

Danh sách các hình ……………………………………………………………...

xiii

MỞ ĐẦU ………………………………………………………………………..

1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN …………………………………………………..

3

1.1. Phân loại ……………………………………….…………………………...

3

1.2. Đặc điểm………. ………………………………………..……………….....

3

1.3. Nuôi cấy phân lập………….. ..…………………………...………………...

4

1.4. Khả năng gây bệnh ………………………………….………………..........

4

1.4.1. V. parahaemolyticus ……...………………………….………….……......

4

1.4.2. V. vulnificus ..…………………….……………............………………….

6

1.4.3. Triệu chứng, bệnh tích ……..………………….…………………………

8

1.4.3.1. Đối với động vật thủy sản...……………….…………………….………

8

1.4.3.2. Đối với người……………………………..…………………………….

8

1.4.4. Nguồn nhiễm khuẩn ... ……………………..………………..................

9

1.4.4.1. Trên động vật thủy sản …………………………………………………

9

1.4.4.2. Trên người ………..…………………………………………………….

9

x


1.4.5. Điều trị và phòng ngừa ……………………………………………...........

10

1.4.5.1. Đối với động vật thủy sản ……………………………………………...

10

1.4.5.2. Đối với người ………………………………………………..................

10

1.5. Tình hình ngộ độc thực phẩm do V. parahaemolyticus và V. vulnificus gây
ra............................................................................................................................

11

1.5.1. V. parahaemolyticus …………..........…………………………………….

11

1.5.2. V. vulnificus ..........……………………………………………………......

12

1.6. Những phương pháp phát hiện Vibrio …………...…………………………

13

1.6.1. Phương pháp nuôi cấy truyền thống ……………………………………...

13

1.6.1.1. Định tính ………………………………………………………………..

13

1.6.1.2. Định lượng bằng phương pháp pha loãng tới hạn (MPN - Most
Probable Number)……………………………………………………………….

13

1.6.2. Phương pháp Polymerase Chain Reaction (PCR) ………………………..

14

1.6.3. Phương pháp lai DNA.………..……………………………………….....

15

CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP …………………………….

16

2.1. Thời gian và địa điểm …...………………………………………………….

16

2.1.1. Thời gian …………...……………………………………………………..

16

2.1.2. Địa điểm ……...………...………………………………………………...

16

2.2. Nội dung thực hiện …...…………………………………………………….

16

2.3. Các chỉ tiêu theo dõi …...…………………………………………………...

16

2.4. Vật liệu …...………………………………………………………………...

17

2.4.1. Dụng cụ …………...……...………………………………………………

17

2.4.2. Môi trường và hóa chất sử dụng …..…….………………………………..

17

2.4.2.1. Môi trường nuôi cấy ………………....…………………………………

17

2.4.2.2. Hóa chất sử dụng …….…………...…………………………………….

17

2.5. Phương pháp tiến hành …...………………………………………………...

17

2.5.1. Thu thập và bảo quản mẫu ……………………………..…………………

17

2.5.2. Xử lý mẫu ……………………………..………………………………….

17

xi

2.5.3. Nuôi cấy và phân lập ……………………………………………………..

18

2.5.4. Phương pháp ly trích DNA ……………………………...……………......

21

2.5.5. Phương pháp PCR……...……..………………….……………………….

21

2.5.6. Thử nghiệm kháng sinh đồ…………………………………......................

25

2.5.7. Xử lý số liệu ……………………...…………… ………………………...

25

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ……….…………………………

26

3.1. Kết quả về tỷ lệ nhiễm ……………………………………………………...

26

3.1.1. So sánh tỷ lệ phát hiện V. parahaemolyticus hoặc V. vulnificus giữa
phương pháp sinh hoá và m-PCR ……………………………………………….

26

3.1.1.1. V. parahaemolyticus ……………….……………………...……………

26

3.1.1.2. V. vulnificus …………………………….……………………...……….

27

3.1.2. Kết quả phát hiện gen độc lực tlh, tdh, trh của V. parahaemolyticus và
vvp của V. vulnificus ………….………………………………………………...

30

3.1.2.1. Gen độc lực của V. parahaemolyticus……………………………….….

30

3.1.2.2. Gen độc lực của V. vulnificus …………….…………………..………..

31

3.1.3. Kết quả thử kháng sinh đồ ………………………………………………..

32

3.2. Thảo luận …………………………………………………………………...

33

3.2.1. Thảo luận kết quả phát hiện V. parahaemolyticus và V. vulnificus ………

33

3.2.2. Thảo luận kết quả phát hiện gen độc lực tlh, tdh, trh và vvp ………..……

38

3.2.2.1. V. parahaemolyticus ……………….………….………………………..

38

3.2.2.2. V. vulnificus ………………….…………………………………………

40

3.2.3. Thảo luận kết quả thử kháng sinh đồ ………..…………………..………..

41

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ……………………………………………………

43

Kết luận …………………………………………………...…………………….

43

Đề nghị ………………………………………………………...………………..

43

TÀI LIỆU THAM KHẢO ……………………………………………………..

44

PHỤ LỤC ………………………………………………………………………

55

xii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hóa của các loài Vibrio spp. …………...……………...

05

Bảng 1.2. Một số biện pháp phòng và trị bệnh cho tôm……..………………….. 10
Bảng 2.1. Phân bố mẫu khảo sát ………… …………...………………………… 18
Bảng 2.2. Các phản ứng sinh hóa dùng để định danh V. parahaemolyticus và V.
vulnificus …............................................................................................ 19
Bảng 2.3. Các primer trong phản ứng PCR ………………….… ………….......

22

Bảng 3.1. So sánh tỷ lệ phát hiện V. parahaemolyticus giữa phương pháp sinh
hóa và phương pháp m-PCR ………………………………………….

28

Bảng 3.2. So sánh tỷ lệ phát hiện V. vulnificus giữa phương pháp sinh hóa và
phương pháp m-PCR ……………………...…..………………………

29

Bảng 3.3. Tỷ lệ phát hiện gen độc lực của V. parahaemolyticus từ dung dịch
tăng sinh dương tính với m-PCR1………………………………..…… 30
Bảng 3.4. Kết quả phát hiện V. parahaemolyticus và gen độc lực của V.
parahaemolyticus từ các gốc đã thử sinh hóa ……………………….

31

Bảng 3.5. Tỷ lệ phát hiện gen độc lực vvp của V. vulnificus từ dung dịch tăng
sinh dương tính với m-PCR1……………………………………..…… 31
Bảng 3.6. Kết quả phát hiện V. vulnificus và gen vvp của V. vulnificus từ các
gốc đã thử sinh hóa ……………...………………...………………..... 32
Bảng 3.7. Kết quả thử kháng sinh đồ ……………………………………………. 33

xiii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1. Sơ đồ phân lập Vibrio từ mẫu hải sản và phát hiện gen độc lực của V.
parahaemolyticus và V. vulnificus ………………………...........................

20

Hình 2.2. Sản phẩm m-PCR1………………………………………………..…...

23

Hình 2.3. Sản phẩm m-PCR1 với chứng âm………....…………………………..

23

Hình 2.4. Sản phẩm m-PCR2 với chứng dương ……..….…………..………….. 24
Hình 2.5. Sản phẩm PCR3 ………………………………...…………………….. 24
Hình 2.6. Sản phẩm PCR3 với chứng âm………………………………………... 24

xiv


MỞ ĐẦU
Đặt vấn đề
Vibrio là vi khuẩn Gram âm, có 72 loài, sống ở những vùng cửa sông và
nước biển ấm. Ở các nước nhiệt đới, Vibrio cholerae là nguyên nhân chủ yếu trong
các vụ ngộ độc do Vibrio. Tuy nhiên từ đầu năm 1950 V. parahaemolyticus cũng
liên quan đến các vụ ngộ độc thức ăn thủy hải sản ở Mỹ (Mead và cs, 1999; Daniels
và cs, 2000), châu Âu, châu Á (Feldhusen, 2000), và chiếm ít nhất 25% trong những
vụ ngộ độc thức ăn ở Đài Loan, Nhật Bản, Việt Nam (Chowdhury và cs, 2004) và
các nước Đông Nam Á (Bhuiyan và cs, 2002). Người tiêu dùng ăn hải sản chưa nấu
chín nhiễm V. parahaemolyticus thường có biểu hiện viêm dạ dày ruột. Trong khi
đó, một loài khác của Vibrio là V. vulnificus được phát hiện năm 1970, thường
không gây ra các đợt dịch tiêu chảy. Trên những người có tiền sử bệnh gan hoặc
bệnh suy giảm miễn dịch, khi bị nhiễm V. vulnificus đã có tỷ lệ chết cao với triệu

chứng tổn thương mô mềm và nhiễm trùng máu (Daniels và Shafaie, 2000; Oliver
và Kaper, 2001).
Hiện nay, ở Việt Nam đã có những ghi nhận về tình trạng ngộ độc thực phẩm
từ những người ăn thủy hải sản bị nhiễm V. parahaemolyticus (Tuyet và cs, 2002).
Tuy nhiên, chưa ghi nhận tình trạng nhiễm trùng do V. vulnificus nhưng đây cũng là
một trong những loài Vibrio gây bệnh cho người. Nguồn lây nhiễm chính cho người
được xác định là do ăn phải thực phẩm mang trùng như tôm cua, hàu, sò, ốc... còn
sống hoặc trong quá trình chế biến, nấu chưa chín, đông lạnh thực phẩm không
đúng, nhiễm chéo giữa các loại thực phẩm với nhau (Nolan và cs, 1984; Rippey,
1994; Kaysner, 2000). Mặt khác, vi khuẩn sống trong môi trường nước ô nhiễm có
thể xuyên qua da khi bị trầy sướt và gây bệnh (Rippey, 1994).
Vì thế, phát hiện các Vibrio này đòi hỏi phải nhanh và chính xác, nên việc
ứng dụng các kỹ thuật công nghệ sinh học phân tử được sử dụng ngày càng rộng rãi.

15


Để góp phần vào việc tầm soát V. parahaemolyticus và V. vulnificus trên tôm và
nhuyễn thể, được sự đồng ý của Khoa Chăn nuôi – Thú y, Phòng đào tạo sau đại
học và dưới sự hướng dẫn của PGS. TS. Nguyễn Ngọc Tuân, chúng tôi tiến hành
thực hiện đề tài: “Xác định sự hiện diện và phát hiện một số gen độc lực của
Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus trên tôm, nhuyễn thể bằng kỹ thuật
PCR ”
Mục đích
Góp phần nâng cao hiệu quả phát hiện nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm
do Vibrio trên người tại Việt Nam.
Mục tiêu cụ thể
(1) Xác định sự hiện diện Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus trên
tôm và nhuyễn thể bằng phương pháp nuôi cấy và PCR, so sánh hai phương pháp
phát hiện này.

(2) Phát hiện các gen độc lực tlh, tdh, trh của V. parahaemolyticus và gen
vvp của V. vulnificus trên tôm và nhuyễn thể bằng phương pháp PCR.
(3) Xác định tính nhạy cảm của một số gốc V. parahaemolyticus, V.
vulnificus định danh được đối với một số loại kháng sinh.
Giới hạn của đề tài
Đề tài chỉ thu thập mẫu tại điểm thu mua và các chợ ở tỉnh Đồng Nai và TP.
Hồ Chí Minh.

16


Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. Phân loại
Vibrio parahaemolyticus và Vibrio vulnificus thuộc ngành Proteobacteria,
lớp Gamma Proteobacteria, bộ Vibrionales, họ Vibrionaceae, giống Vibrio. Đến
nay đã có 72 loài được phát hiện, trong đó 12 loài được ghi nhận là có khả năng gây
bệnh cho người, đáng lưu ý là V. alginolyticus, V. cholerae, V. parahaemolyticus và
V. vulnificus (FAO, 2002). Những loài gây bệnh cho động vật thủy sản thường gặp
là: V. alginolyticus, V. anguillarum, V. ordalii, V. salmonicida, V. parahaemolyticus,
V. harvey, V. vulnificus.... (Buller, 2004).
1.2. Đặc điểm
Vibrio là vi khuẩn Gram âm, hình que thẳng hoặc hơi uốn cong, di động nhờ
một hoặc nhiều tiêm mao mảnh và không hình thành bào tử. Chúng có kích thước
0,3 - 0,5 x 1,4 - 2,6 m, phần lớn các loài sống kỵ khí tùy nghi ở những vùng nước
biển ấm hoặc cửa sông (Bùi Quang Tề, 2006). Vi khuẩn có khả năng sống ở 5 430C, nhưng tốt nhất là 370C. Chúng thường chết khi nhiệt độ dưới 50C, bị bất hoạt
trên 650C/ 1 phút; 550C/ 5 phút hay 500C/ 10 phút (Andrews và cs, 2000). Trong
điều kiện tối ưu, số lượng vi khuẩn có thể phát triển trong 9 - 10 phút, và tăng
nhanh gấp 13 - 26 lần so với ban đầu sau 24 giờ ở nhiệt độ 260C (Kaufman và cs,
2003). pH tối ưu là 7,8 - 8,6, chúng có thể tồn tại trong khoảng pH 4,8 - 11. Tuy

nhiên, sự phát triển của vi khuẩn sẽ bị dừng lại nếu có sự hiện diện của 0,1% acetic
acid (pH = 5,1). Chúng có thể phát triển trong môi trường có muối 0,5 - 10%,
nhưng nồng độ muối tối ưu là 3% (FDA, 2004).
Giống như những vi khuẩn Gram âm khác, Vibrio có thể phát triển trong môi
trường có muối mật tương đối cao. Chúng là những vi khuẩn yếm khí tùy nghi và
phát triển rất tốt trong môi trường kiềm. Hầu hết các loài của Vibrio đều phát triển

17


trong môi trường nước biển. Na+ rất cần thiết cho việc kích thích sự phát triển của
tất cả các loài Vibrio. Chúng không có khả năng sinh H2S, có khả năng lên men
đường. Việc phân lập vi khuẩn từ thực phẩm thường được thực hiện nhờ vào môi
trường tăng sinh nước peptone kiềm (APW-Alkaline peptone water). Môi trường sử
dụng để kiểm tra phản ứng sinh hóa của V. parahaemolyticus được thêm 2% hoặc
3% NaCl. Dựa vào một số phản ứng sinh hóa khác nhau bao gồm cả hoạt động của
β-galactosidase (ONPG) mà người ta có thể chẩn đoán phân biệt V.
parahaemolyticus, V. vulnificus (Elliot và cs, 1995) (Hình 1.1.)
1.3. Nuôi cấy phân lập
Môi trường chọn lọc thiosulphate citrate bile salt agar (TCBS) thích hợp cho
sự phát triển những loài Vibrio và đồng thời ức chế các loài vi khuẩn không thuộc
Vibrio. Môi trường nuôi cấy tối ưu cho V. parahaemolyticus và V. vulnificus ở 3%
NaCl và mức nồng độ muối tối thiểu là 0,5% (Elliot và cs, 1995).
1.4. Khả năng gây bệnh
V. parahaemolyticus và V. vulnificus là một trong những loài Vibrio có khả
năng gây bệnh cho người và động vật thủy hải sản (Buller, 2004). V.
parahaemolyticus gây viêm dạ dày ruột ở người ăn hải sản bị nhiễm vi khuẩn này.
Chúng thường xuất hiện lúc thời tiết ấm trong môi trường nuôi thủy hải sản như cá,
tôm, cua, sò, hàu… (Liston, 1990).
1.4.1. V. parahaemolyticus

Tất cả các chủng V. parahaemolyticus đều có chung một kháng nguyên lông
H, 12 kiểu kháng nguyên thân O và trên 70 kiểu kháng nguyên vỏ K đã được mô tả
(Sakazaki và cs, 1963; Miwatani và cs, 1976). Hầu hết những chủng gây bệnh của V.
parahaemolyticus đều có khả năng gây dung huyết do gen tdh (thermostable direct
hemolysin) đảm nhiệm (Yeung và Boor, 2004). Độc lực chủ yếu của V.
parahaemolyticus là độc tố hemolysin gây dung huyết beta trên môi trường
Wagatsuma với vòng halo sáng rõ xung quanh khuẩn lạc sau 18-24 giờ nuôi cấy ở
370C. Phản ứng này được đặt tên là phản ứng Kanagawa (Takeda, 1983). Ngoài ra,
Taniguchi và cs (1986) đã chứng minh rằng sự hiện diện của gen gây dung huyết

18


Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hóa của các loài Vibrio spp.
V. algi-

V.

V.

nolyticus

cholerae

TCBS agar

Vàng

mCPC agar
CC agar

AGS

fluvialis

V.
furnissii

V.
hollisae

V.
metschnikovii

V.
mimicus

V.
parahaemolyticus

V.
vulnificus

P.
shigelloides**

Vàng

Vàng

Vàng

Không

Vàng

Xanh

Xanh

Xanh

Xanh

Không

Tím

Không

Không

Không

Không

Không

Không

Vàng

Không

Không

Tím

Không

Không

Không

Không

Không

Không

Vàng

Không

KA

Ka

KK

KK

Ka

KK

KA

KA

KA

nd

Oxidase

+

+

+

+

+

−

+

+

+

+

Arginine dihydrolase

−

−

+

+

−

+

−

−

−

+

Ornithine decarboxylase

+

+
−

+
+
+

−
−
−

−
−
−

−
−
−

−
+
−

+
+
+

+
+
−

+
+
−

+
+
+

3% NaCl
6% NaCl
8% NaCl
10% NaCl
Tăng trưởng ở 42°C

+
+
+
+

+
−
−
−

+
+
V
−

+
+
+
−

+
+
−
−

+
+
V
−

+
−
−

+
+
+
−

+
+
−

+
−

−

+

+

V

−

nd

V

+

+

+

+

Sucrose
DCellobiose
Lactose
Arabinose
DMannose
DMannitol
ONPG
VogesProskauer

Gelatinase
Urease

+

+

+

+

−

+

−

−

−

−

−

−

+

−

−

−

−

V

+

−

−
−

−
−

−
+

−
+

−
+

−
−

−
−

−
+

+
−

−
−

+

+

+

+

+

+

+

+

+

−

+

+

+

+

−

+

+

+

V

−

−

+

+

+

−

+

+

−

+

−

+

V

−

−

−

+

−

−

−

−

+
−

+
−

+
−

+
−

−
−

+
−

+
−

+
V

+
−

−
−

Lysine decarboxylase

0% NaCl
Tăng
trưởng
(w/v):

Sinh
acid từ

** Plesiomonas shigelloides
(FDA, 2004)
Chữ viết tắt: TCBS: thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose; mCPC: modified cellobiose-polymyxin B-colistin; AGS:
arginine-glucose slant; nd: không làm; V: có thể thay đổi; R: đề kháng; KK: kiềm / kiềm; KA: kiềm/acid; Ka:
kiềm/acid(ít)

kém chịu nhiệt (thermolabile hemolysin, tlh) được tìm thấy trong chủng này. Do đó,
gen độc lực tdh được xem là gen quan trọng và nó đã được dùng để phát hiện vi

19


khuẩn V. parahaemolyticus bằng kỹ thuật PCR hoặc những kỹ thuật khác (Okuda
và cs, 1997; Bej và cs, 1999; Cook và cs, 2002). Protein TDH do gen tdh sản sinh
có 165 axit amin, khối lượng phân tử là 44.000 Dalton (Miyamoto và cs, 1980).
Đoạn gen tdh được nhân dòng lần đầu bởi Kaper và cs, (1984) và xác định trình tự
vào năm 1985 (Nishibuchi và Kaper, 1995). Ngoài gen tdh, vi khuẩn này còn mang

gen tdh-related hemolysin (trh) được phát hiện từ bệnh nhân ngộ độc thực phẩm
với triệu chứng viêm dạ dày ruột tại Cộng hòa Maldives năm 1985. Gen trh tương
đồng 60% với gen tdh, có vai trò gây viêm dạ dày ruột ở người nhiễm V.
parahaemolyticus (Honda và cs, 1988). Tuy nhiên, những chủng vi khuẩn V.
parahaemolyticus gây bệnh lâm sàng cho người đã được chứng minh sự hiện diện
của cả hai gen tdh và trh nhưng khi nuôi cấy vi khuẩn này lại không biểu hiện gen
trh (Bej và cs, 1999). Đến nay, cả hai gen tdh và trh được xem là những gen độc lực
của V. parahaemolyticus gây bệnh cho người.
Một yếu tố độc lực quan trọng khác của vi khuẩn Gram âm là yếu tố kết dính
tế bào biểu mô vật chủ. Yamamoto và Yokota (1989) cho rằng V. parahaemolyticus
có khả năng sản sinh yếu tố gây ngưng kết hồng cầu. Thêm vào đó, tiêm mao vi
khuẩn cũng đóng vai trò kết dính với thụ thể tế bào biểu mô ruột. Có ý kiến cho
rằng quá trình kết dính liên quan đến tình trạng bệnh do V. parahaemolyticus
(Nakasone và Iwanaga, 1990).
1.4.2. V. vulnificus
Cho đến ngày nay, những dấu hiệu đặc biệt liên quan đến đặc tính về di
truyền và hình thái của vi khuẩn V. vulnificus vẫn chưa được hiểu rõ trong cơ chế
gây bệnh cho người. Tuy nhiên, dựa vào đặc tính kiểu hình, phản ứng huyết thanh,
phản ứng sinh hóa và khả năng gây bệnh trên các loài vật chủ khác nhau mà người
ta chia chúng ra thành ba biotype (Tison và cs, 1982): biotype 1 có thể gây bệnh cho
người, biotype 2 thường gây bệnh cho lươn châu Á và châu Âu (và cũng là tác nhân
gây bệnh cơ hội cho người); gần đây một biotype thứ 3 (hay còn gọi là type Israeli)
được phát hiện ở Isarel, đã gây ra các vụ ngộ độc ở Isarel vào năm 1996-1997
(Bisharat và cs, 1996;1999). Đây là kiểu gen trung gian của biotype 1 và 2. Phân

20


tích gen, người ta thấy rằng gen có độ dài 33kb chỉ hiện diện ở biotype 1. Một số
gen định vị trong quần thể gen này liên quan đến cơ chế gây bệnh cho người. Bất kỳ

chủng V.vulnificus nào mang quần thể gen này đều có khả năng tăng tính độc lực
của chúng (Cohen và cs, 2007). Độc lực của biotype 2 này thường liên quan đến
LPS và cho phản ứng âm tính với indol.
Trong đó, capsular polysaccharide (CPS) là độc lực quan trọng nhất của V.
vulnificus vì nhờ vào lớp này mà vi khuẩn có khả năng tránh được sự thực bào
(Strom và Paranjpye, 2000). Những vi khuẩn bị đột biến vỏ, thường không có khả
năng gây bệnh trên chuột và người (Wright và cs, 1990). Sự hiện diện của vỏ liên
quan đến hình thái của khuẩn lạc, những khuẩn lạc có vỏ thường mờ đục, trong khi
những vi khuẩn không có vỏ thường trong suốt (Wright và cs, 1999). Zuppardo và
Siebeling (1998) lần đầu tiên xác định gen mã hóa enzyme epimerase là thành phần
chủ yếu hình thành vỏ và yếu tố độc lực. Wright và cs (2001) sau đó đã xác định hệ
thống tổng hợp vỏ tương tự như biotype 1 và đã đề xuất cơ chế di truyền của việc
biến đổi vi khuẩn không có vỏ và có vỏ. Việc xác định những gen khác liên quan
đến quá trình biến dưỡng đường đã cho thấy việc sinh tổng hợp LPS.
V. vulnificus có khả năng sản sinh một loại enzym ngoại bào, thermolysinlike metalloperoxidase, khối lượng phân tử 45 KDa, đây là một enzyme có khả
năng thủy phân reticulin và collagen (Miyoshi và cs, 1987). Những enzyme này
cần kẽm cho quá trình hoạt động và được gọi là metalloprotease (vvp) (Miyoshi và
cs, 1987). Metalloprotease được cho là yếu tố độc lực, đặc biệt là gây xuất huyết
làm tổn thương da thông qua việc phân giải màng đáy của mạch máu, tăng cường
tính thấm thành mạch và phù thủng. Chuột thực nghiệm sẽ chết với những biểu hiện
hoại tử da khi được tiêm yếu tố độc lực này vào tĩnh mạch, trong xoang bụng hay
dưới da (Kothary và Kreger, 1987; Miyoshi và cs, 1998). Metalloprotease của V.
vulnificus do gen empV và vvp thì tương đồng cao với những protease của các loài
khác chẳng hạn như V. anguillarium, V. cholerae, V. proteolyticus (Chang và cs,
1996; 1997; Miyoshi, 1997). Watanabe và cộng sự (2004) cũng cho rằng

21


metalloprotease được ly trích từ chủng V.vulnificus gây bệnh cho người thì tương

đồng với chủng V.vulnificus gây bệnh cho lươn.
1.4.3. Triệu chứng, bệnh tích
1.4.3.1. Đối với động vật thủy sản
V.vulnificus gây bệnh nhiễm trùng máu ở cá chình, V. parahaemolyticus gây
bệnh phát sáng ở ấu trùng tôm sú. Ngoài ra, V. parahaemolyticus, V. vulnificus còn
gây bệnh đỏ thân ở tôm sú thịt, ăn mòn vỏ giáp xác, gây vón cục máu ở cua, bệnh
ấu trùng trên nhuyễn thể. Tôm bị nhiễm bệnh thường ở trạng thái không bình
thường như nổi lên mặt ao, dạt bờ, kéo đàn bơi lòng vòng, hôn mê, lờ đờ, kém ăn
hoặc bỏ ăn.
Tôm biến đổi thành màu đỏ hay xanh. Vỏ tôm cua bị mềm và xuất hiện các
vết hoại tử, ăn mòn vỏ và các phần phụ. Ấu trùng tôm và tôm giống có hiện tượng
phát sáng khi nhiễm V. parahaemolyticus (Bùi Quang Tề, 2006).
1.4.3.2. Đối với người
Người bị nhiễm V. parahaemolyticus, thời gian ủ bệnh từ 4-74 giờ, trung
bình là 12-46 giờ với các triệu chứng tiêu chảy nước và vọp bẻ bất thường. Đôi khi
có triệu chứng buồn nôn, ói mửa và sốt. Triệu chứng thường kéo dài từ 1-7 ngày,
trung bình 2,5 ngày, thỉnh thoảng có khi lâu hơn. Thông thường, người mắc bệnh sẽ
tự khỏi và không có những tổn thương nghiêm trọng, chỉ khoảng 7% người mắc
bệnh nhập viện (Lake và cs, 2003). Ngược lại, V. vulnificus thường gây triệu chứng
bệnh trầm trọng nhất và tỷ lệ chết lên đến 50% trong tổng số ca bệnh. V. vulnificus
là loại vi khuẩn chuyên gây hoại tử màng cân, được gọi là khuẩn ăn thịt người (flesh
- eating) do vi khuẩn này nhanh chóng phá hủy mô mềm. Theo Hongkong News,
Baltimore Sun, Science Daily (8/2005), mỗi năm, toàn khu vực Maryland (Mỹ) có
hơn 100 trường hợp nhiễm khuẩn do ăn hải sản tươi sống và 38% trường hợp bị
nhiễm V. vulnificus. Tỷ lệ nhiễm bệnh tăng lên khi thời tiết ấm hơn. Các nhà khoa
học cho rằng V. vulnificus không phải là hậu quả của sự ô nhiễm môi trường. Thời
gian từ tháng 6 đến tháng 10 là thời gian thích hợp nhất cho V. vulnificus phát triển
vì thời tiết lúc này ấm áp. V. vulnificus có thể gây nhiễm trùng máu và tử vong chỉ

22

trong một ngày, đặc biệt là những người có bệnh lý về gan và suy giảm miễn dịch.
Những người khỏe mạnh cũng có nguy cơ lây nhiễm V. vulnificus qua vết thương
hở. Sau khi bị nhiễm khuẩn, người bệnh sẽ có triệu chứng nôn mửa, tiêu chảy, đau
bụng... Ở người có bệnh lý về gan và hệ miễn dịch, V. vulnificus gây nhiễm trùng
máu và đe dọa đến tính mạng với các triệu chứng như sốt cao, ớn lạnh rùng mình,
vết thương ở da thêm nghiêm trọng, sốc nhiễm trùng. Nhóm người này có nguy cơ
nhiễm khuẩn cao gấp 80 lần người bình thường và nguy cơ tử vong cao gấp 200 lần.
1.4.4. Nguồn nhiễm khuẩn
1.4.4.1. Trên động vật thủy sản
Vibrio spp. thường gây bệnh ở động vật thủy sản nước mặn và nước ngọt
như cá, giáp xác, nhuyễn thể…. Khi có những yếu tố bất lợi gây stress như thay đổi
nhiệt độ môi trường hoặc bị nhiễm những tác nhân khác như virus, nấm và ký sinh
trùng. Động vật thủy sản bị giảm sức đề kháng, nên khi nhiễm các loài vi khuẩn
Vibrio spp. cơ hội sẽ bị bệnh nặng hơn dẫn đến động vật thủy sản chết rải rác hoặc
hàng loạt. Mùa xuất hiện bệnh tùy theo loài và địa điểm nuôi. V. parahaemolyticus
và V. vulnificus là loại vi khuẩn sống tự do trong môi trường nước biển và cửa sông,
phổ biến vào mùa xuân và mùa hè. Chúng hiện diện khắp nơi trên thế giới hay trong
nước bể ươn tảo, bể ươn ấu trùng, bể ươn Artemia. Trong bể ươn, mật độ Vibrio
thường tăng theo thời gian nuôi. Chúng tụ nhiều trong thức ăn của các loài hải sản
vỏ cứng như tôm cua, nghêu sò, hàu và ốc (Bùi Quang Tề, 2006).
1.4.4.2. Trên người
Vi khuẩn sống trong môi trường nước ô nhiễm có thể xuyên qua da khi da
người bị trầy sướt (Rippey, 1994).
Người bị nhiễm vi khuẩn khi ăn phải các thực phẩm mang trùng như tôm cua,
hàu, ốc... còn sống hoặc trong quá trình chế biến, nấu chưa chín, đông lạnh thực
phẩm không đúng, nhiễm chéo giữa các loại thực phẩm với nhau (Nolan và cs,
1984; Rippey, 1994; Kaysner, 2000).

23