NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN SỰ TẠO THÀNH LIGNAN TRONG CÂY DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG ( Phyllanthus amarus Schum. Thonn.) NUÔI CẤY IN VITRO NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

BÁO CÁO LUẬN VĂN THẠC SỸ

Phạm Minh Duy
NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ
ĐẾN SỰ TẠO THÀNH LIGNAN TRONG CÂY
DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG (Phyllanthus amarus
Schum. & Thonn.) NUÔI CẤY IN VITRO
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm – Hướng Hóa sinh

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS.TS. Nguyễn Thị Quỳnh
1


ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây DHCĐ (Phyllanthus amarus (Schum. & Thonn.)) có chứa các lignan với
nhiều dược tính quý giá
Nhu cầu sản xuất tăng cao
Sản xuất trên đồng ruộng gặp nhiều
trở ngại về thời tiết, sâu bệnh, v.v.

Một số dược tính chỉ được khảo
sát ở mức độ cao chiết thô

Sản xuất lignan từ cây DHCĐ bằng
nuôi cấy mô quang tự dưỡng

Khảo sát các dược tính này ở

mức độ từng hợp chất cụ thể

Nghiên cứu các yếu tố vật lý/hóa học
trong in vitro giúp gia tăng lignan

Nâng cao giá trị sử dụng cây DHCĐ trong y học

2


GiỚI THIỆU VỀ CÂY DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG
Phân loại
Bộ

Malpighiales

Họ

Phyllanthaceae

Chi

Phyllanthus

Loài

Phyllanthus amarus
(Schum. & Thonn.)

Hình 1. Cây Diệp hạ châu đắng.

Tên quốc tế: Chance Piedra
Tên Việt Nam: Diệp hạ châu đắng, Chó đẻ thân xanh, v.v.
3


Tình hình nghiên cứu

 Ngoài nước
- Phát hiện và chứng minh nhiều dược tính, đặc biệt là khả
năng ức chế virus HBV.
- Ly trích được nhiều nhóm hợp chất thứ cấp từ cây DHCĐ,
trong đó các lignan có nhiều dược tính quan trọng.

Phyllanthin

Hypophyllanthin

Niranthin

Hình 2. Các hợp chất lignan chính trong cây Diệp hạ châu đắng.

- Nghiên cứu về đột biến và chuyển gene
- Nghiên cứu về vi nhân giống

4


Tình hình nghiên cứu
 Trong nước

-

Chủ yếu là nghiên cứu về dược tính và thành phần
alkaloid.

- Vũ Văn Vụ và cs. (1999) và Nguyễn Thị Quỳnh và cs.
(2010) đã nghiên cứu về nuôi cấy mô cây DHCĐ.

 Chưa có nghiên cứu về ảnh hưởng các yếu tố môi
trường lên sự tích lũy lignan của cây DHCĐ in vitro.

5


Giới thiệu về lignan
• Là các dimer từ 2 đơn vị phenylpropanoid nối với nhau
bằng liên kết của 2 carbon 8-8’.
• Có quan hệ mật thiết với lignin.
• Có nhiều dược tính quan trọng: chống ung thư, kháng
viêm, giảm đau, giảm huyết áp, kháng oxy hóa, v.v.

Hình 4. Khung cấu trúc cơ bản của một lignan

6


Biến dưỡng sơ cấp
Quang hợp

Hình 5. Con

đường
sinh
tổng hợp lignan

Carbohydrate

Tổng hợp
protein

Phenylalanine

Phenylalanine ammonia
lyase

Coniferyl alcohol

Tyrosine

Tyrosine ammonia
lyase
Con đường phenylpropanoid

p-coumaryl alcohol

Sinapyl alcohol

DIR
Lignan
Biến dưỡng thứ cấp

Lignin
7


Biến dưỡng sơ cấp
Quang hợp

Hình 5. Con
đường
sinh
tổng hợp lignan

Carbohydrate

Tổng hợp
protein

Phenylalanine

Phenylalanine ammonia
lyase

Coniferyl alcohol

Tyrosine

Tyrosine ammonia
lyase
Con đường phenylpropanoid

p-coumaryl alcohol

Sinapyl alcohol

DIR
Lignan
Biến dưỡng thứ cấp

Lignin
8


Ánh sáng

Tia UV

Nhiệt độ

Phenylalanine ammonia lyase

Ethylene

Axít abscisic

Lignan

Phenylalanine

9

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Nội dung 1. Nghiên cứu sự tích lũy hợp chất lignan của
cây DHCĐ nuôi cấy in vitro quang tự dưỡng dưới ảnh
hưởng của một số yếu tố vật lý của môi trường
– Nồng độ CO2
– Nhiệt độ
– Cường độ ánh sáng và thời gian chiếu sáng

10


• Vật liệu

– Đốt thân cây DHCĐ in vitro mang 1 lá mở
• Phương pháp

– Nuôi cấy đốt thân trong hộp Magenta (4
đốt/hộp), nắp có 2 lỗ trao đổi khí (Φ = 1 cm)
dán màng millipore.
– Môi trường MS với khoáng đa lượng 1/2,
không đường và vitamin, bổ sung KH2PO4
200 mg/l và KNO3 200 mg/l.
– Giá thể: perlite
11


Thí nghiệm 1. Đánh giá mối tương quan giữa hàm
lượng hợp chất lignan tích lũy trong cây DHCĐ in vitro
với nồng độ CO2 của môi trường nuôi cấy

Bảng 1. Bố trí thí nghiệm 1

Tên nghiệm thức

Nồng độ CO2
(µmol mol-1)

400

400

1200

1200

12


Điều kiện thí nghiệm
• Thời gian nuôi cấy: 45 ngày
• Môi trường: 65 ml/hộp + 15 ml/hộp (ngày thứ 30)
• Giá thể: 110 ml/hộp
• Cường độ ánh sáng: 160 µmol m-2 s-1
• Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày
• Nhiệt độ giai đoạn sáng/tối: 27/22 oC
• Độ ẩm tương đối: 50%
Chỉ tiêu theo dõi ngày thứ 45
• Các chỉ tiêu tăng trưởng
• Hàm lượng phyllanthin, hypophyllanthin và niranthin
(mg/g thân lá khô), so sánh với cây ngoài đồng 45

13
ngày (Phú Yên)


Thí nghiệm 2. Vai trò của stress nhiệt độ trong sự tích lũy
một số hợp chất lignan của cây Diệp hạ châu đắng in vitro
Bảng 2. Bố trí thí nghiệm 2

Tên nghiệm thức Nhiệt độ sáng/tối (oC)
23
33

23/23
33/23

23-33

23/23 trong 30 ngày đầu
33/23 trong 15 ngày cuối

14


Điều kiện thí nghiệm
• Thời gian nuôi cấy: 45 ngày
• Môi trường: 55 ml/hộp + 15 ml/hộp (ngày thứ 25)
• Giá thể: 90 ml/hộp
• Cường độ ánh sáng: 160 µmol m-2 s-1
• Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày
• Độ ẩm tương đối: 50%

Chỉ tiêu theo dõi ngày thứ 45
• Các chỉ tiêu tăng trưởng
• Hàm lượng phyllanthin, hypophyllanthin và niranthin
(mg/g thân lá khô), so sánh với cây ngoài đồng 45
ngày (Phú Yên)

15


Thí nghiệm 3. Khảo sát sự tích lũy hợp chất lignan của
cây Diệp hạ châu đắng in vitro dưới các cường độ ánh
sáng và thời gian chiếu sáng khác nhau
Bảng 3. Bố trí thí nghiệm 3

Tên nghiệm
thức

Cường độ ánh sáng Thời gian chiếu sáng
(µmol m-2 s-1)
(giờ/ngày)

80-8

80

8

160-8

160

8

80-16

80

16

160-16

160

16

16


Điều kiện thí nghiệm
• Thời gian nuôi cấy: 40 ngày
• Môi trường: 55 ml/hộp + 15 ml/hộp (ngày thứ 25)
• Giá thể: 90 ml/hộp
• Nhiệt độ giai đoạn sáng/tối: 27/22 oC
• Độ ẩm tương đối: 50%
Chỉ tiêu theo dõi ngày thứ 40
• Các chỉ tiêu tăng trưởng
• Hàm lượng phyllanthin, hypophyllanthin và niranthin
(mg/g thân lá khô), so sánh với cây ngoài đồng 45
ngày (Phú Yên)
17

Nội dung 2. Tìm hiểu tác động của tiền chất lên sự tích lũy
các hợp chất lignan ở cây Diệp hạ châu đắng in vitro
Thí nghiệm 4. Vai trò của tiền chất phenylalanine trong sự tích
lũy một số hợp chất lignan của cây Diệp hạ châu đắng khi được
bổ sung vào môi trường nuôi cấy ở các giai đoạn khác nhau
Bảng 4. Bố trí thí nghiệm 4
Nghiệm thức

Nồng độ phenylalanine
(µmol/l)

Thời điểm bổ sung
(ngày)

ĐC

0

-

13-0

13

0

26-0

26

0

39-0

39

0

13-25

13

25

26-25

26

25

39-25

39

25

18

Vật liệu (tương tự nội dung 1)
Phương pháp (tương tự nội dung 1)
Điều kiện thí nghiệm
• Thời gian nuôi cấy: 45 ngày
• Môi trường: 55 ml/hộp + 15 ml/hộp (ngày thứ 25)
• Giá thể: 90 ml/hộp
• Cường độ ánh sáng: 160 µmol m-2 s-1
• Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày
• Nhiệt độ giai đoạn sáng/tối: 27/22 oC
• Độ ẩm tương đối: 50%
Chỉ tiêu theo dõi ngày thứ 45
• Các chỉ tiêu tăng trưởng
• Hàm lượng phyllanthin, hypophyllanthin và niranthin (mg/g
19
thân lá khô), so sánh cây ngoài đồng 45 ngày (Phú Yên)


Nội dung 3. Khảo sát đặc tính kháng khuẩn và kháng oxy hóa của
các hợp chất lignan trong cây Diệp hạ châu đắng in vitro

• Vật liệu
– Cao chiết thô methanol cây DHCĐ
– Phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin phân tách bằng sắc
ký cột từ cao trên
• Phương pháp
– Kháng khuẩn: phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch
(Kirby-Bauer Agar Disk Diffusion)
– Kháng oxy hóa:
• Phương pháp lực khử sắt (FRAP)

• Phương pháp loại điện tử DPPH

20


Thí nghiệm 5. Khảo sát khả năng kháng khuẩn của các hợp chất
lignan trong cây Diệp hạ châu đắng in vitro trên một số loại vi khuẩn

Bảng 5. Bố trí thí nghiệm 5
Chủng vi khuẩn khảo sát
Hợp chất khảo sát

E. Coli
EPEC

Salmonella
S. aureus
spp.

DMSO (-)

EĐc

SĐc

SaĐc

Cao chiết thô

EC

SC

SaC

Phyllanthin

EP

SP

SaP

Hypophyllanthin

EH

SH

SaH

Niranthin
Penicillin (+)

EN
EPe

SN
SPe

SaN
SaPe

Ceftriaxone (+)

ECe

SCe

21
SaCe


Điều kiện thí nghiệm
• Đĩa nuôi cấy: đĩa Petri (Φ = 80 mm)
• Môi trường: Mϋller Hinton Agar (20 ml/đĩa)
• Nồng độ vi sinh vật: 1,5 x 107 cfu/đĩa Petri
• Lượng chất thử: 10 mg/ml, 5 µl/đĩa giấy (Φ = 6 mm)
• Nhiệt độ ủ: 37 oC
• Thời gian ủ: 24 giờ
Chỉ tiêu theo dõi sau 24 giờ
• Đường kính vòng kháng khuẩn (mm)

22


Thí nghiệm 6. Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của các hợp
chất lignan trong cây Diệp hạ châu đắng in vitro
Phương pháp lực khử sắt
• Tỷ lệ chất thử : thuốc thử FRAP = 20 : 180 (µl)

• Thời gian ủ: 15 phút
• Nhiệt độ ủ: nhiệt độ phòng
• Bước sóng đo: 630 nm
• Chất đối chứng: Trolox
Phương pháp loại điện tử DPPH
• Nồng độ thuốc thử DPPH: 100 µM.
• Tỷ lệ chất thử : thuốc thử DPPH = 100 : 100 (µl)
• Thời gian ủ: 30 phút
• Nhiệt độ ủ: nhiệt độ phòng
• Bước sóng đo: 490 nm
• Chất đối chứng: Trolox

23


KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

24


Thí nghiệm 1. Đánh giá mối tương quan giữa hàm lượng
hợp chất lignan tích lũy trong cây Diệp hạ châu đắng in
vitro với nồng độ CO2 của môi trường nuôi cấy
Hình 6. Cây Diệp hạ châu
đắng nuôi cấy in vitro
quang tự dưỡng ở các
nồng độ CO2 khác nhau
vào
ngày
thứ

45.

25