Nghiên cứu áp dụng phương pháp giải trình tự toàn bộ exome (WES) trong xác định đột biến gen gây bệnh động kinh nghiêm trọng ở trẻ nhỏ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA Y
−−

Nghiên cứu áp dụng phương pháp giải trình tự toàn
bộ exome (WES) trong xác định đột biến gen gây
bệnh động kinh nghiêm trọng ở trẻ nhỏ
Thành viên: LÊ PHAN HOÀNG TRÚC,
BÙI CHÍ BẢO, ĐỖ THỊ THU HẰNG


1. Mở đầu

2. Đối tượng – Phương pháp
3. Kết quả

4. Kết luận


1. MỞ ĐẦU


1.1. Động kinh và nguyên nhân
Rối loạn thần kinh
mãn tính

Động kinh
50 triệu
0.4% - 1%
dân số
1.6 % trẻ

em

Đặt trưng bởi sự tái
phát các cơn co giật
vô căn

Gây ra các hậu quả
về tâm lý, nhận thức
và xã hội

Cơn phóng
điện cực phát
ở vỏ não

Nhân tố
kích thích

Nhân tố
ức chế


1.1. Động kinh và nguyên nhân

40%
60%
Động kinh vô căn
Động kinh triệu chứng

3 loại di
truyền

Rối loạn
đơn gen
Yếu tố
đa gen

Gen mẫn
cảm

1 gen – 1
kiểu hình
Các kênh ion
hay các thụ thể


1.1. Động kinh và nguyên nhân
Đặc điểm
lâm sàng
Kỹ thuật
MRI, CT

Sinh hóa,
xét
nghiệm
máu

Chẩn
đoán

Xét

nghiệm
gen

Điện
não đồ


1.2. Hội chứng động kinh nghiêm trọng ở trẻ em

Giai đoạn sơ
sinh
• Hội chứng Ohtahara
(OS)
• Bệnh não giật cơ
sớm (EME)

Giai đoạn nhũ
nhi
• Hội chứng West
(infantile spasms_IS)
• Động kinh với cơn co
giật cục bộ dịch
chuyển
• Hội chứng Dravet
(DS)

Giai đoạn thơ
ấu
• Hội chứng LennoxGastaut (LGS)
• Hội chứng Doose

• Phổ các hội chứng
mất ngôn ngữ mắc
phái dạng động kinh
• Hội chứng LandauKleffner (LKS)

Nhóm động
kinh nghiêm
trọng không
phân loại
được.


1.3. Công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) và WES

Công nghệ giải
trình tự gen thế
hệ mới
Giải trình tự
nhanh

Chi phí thấp


1.3. Công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) và WES
Giải trình
tự toàn bộ
hệ gen

Giải trình
tự

microRNA

Giải trình
tự đích

NGS
o
o
o
Mô tả biểu
hiện gen

Giải trình
tự toàn bộ
vùng mã
hóa

Illumina (HiSeq, MiSeq…)
LifeTechnologies (PGM, Proton)
Roche (454)


1.3. Công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) và WES

Giải trình tự toàn bộ
vùng mã hóa (WES)

Hơn 95% thông tin
vùng mã hóa

2% bộ
gen người

85% đột
biến gây
bệnh đơn
gen

Các phần mềm
phân tích (BWA,
Platypus…) và
phần mềm
thương mại.

Bệnh do
đa yếu tố
gen

Đối chiếu
lên trình
tự chuẩn.

Xuất
variant

Chú giải
variant


1.3. Công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) và WES

Tỷ lệ chẩn đoán 30%
32.5% động kinh
nghiêm trọng
38% động kinh

Thành tựu của WES


2. ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP


2.1. Đối
tượng
nghiên
cứu

Nhóm

Ca bệnh

Giới tính/tuổi

Ký hiệu mẫu

Quan hệ với bệnh nhân

1: Control

WES 7

Nam/5 tuổi

7C

Bệnh nhi

2: Hội chứng
Dravet

3: ĐKNT
không phân
loại được

WES 8

Nam/8 tuổi

WES 1

Nam/7 tuổi

WES 2

Nam/7 tuổi

WES 3

Nam/4 tuổi

WES 5

Nữ/ 8 tuổi

WES 4

WES 6

Nam/5 tuổi

Nam/8 tuổi

8C

Bệnh nhi

1C

Bệnh nhi

2C

Bệnh nhi

3C

Bệnh nhi

5C

Bệnh nhi

4C

Bệnh nhi

1B

1M
2B

2M
3B

3M
5B

5M
6C

Bố

Mẹ
Bố

Mẹ
Bố

Mẹ
Bố

Mẹ

Bệnh nhi


2.2. Phương
pháp
Quy
trình
tổng
quát
của
nghiên
cứu

Thu mẫu máu bệnh nhân
Tách chiết DNA và thu nhận DNA tổng số
Gửi giải trình tự thế hệ mới toàn bộ vùng mã hóa
(WES)
Phân tích kết quả WES
Kiểm tra kết quả bằng Sanger
Phân loại đột biến theo tiêu chuẩn ACMG


2.2. Phương pháp

DNA bộ gen

Quy trình giải trình tự NGS tại Macrogen theo

công nghệ Illumina trên hệ thống Hiseq 4000
Phân
mảnh
DNA
Flow Cell

Adapters
Gắn

Các chu kỳ
khuếch đại

Tạo
cụm

Thư viện

A: Chuẩn bị thư viện

Các chu kỳ
giải trình tự

B: Tạo cụm

Dữ liệu xuất ra
file output

Hình kỹ
thuật số
File Text

C: Giải trình tự


2.2. Phương pháp
Quy trình phân tích kết quả giải trình tự toàn bộ exon - WES
NextGENe

Chuyển định
dạng file

Geneticist Assitant
Lọc và chú
giải variant

Đối chiếu lên
trình tự chuẩn
Phân tích Trio
Xuất variant

Ngoại kiểm kết
quả phân tích
WES


2.2. Phương pháp
Ký hiệu
Gen
Chr:ChrPos
Ref

Alt
Type
Coverage
Var.Fre
Zygosity
Exon.Nu
Codon.Pos
HGVS.c
HGVS.p
CLNDBN
CLNDSDB
CLNDSDBID

Các thông tin chú giải variant thể hiện trong các
bảng kết quả nghiên cứu
Ý nghĩa

Tên gen xảy ra biến thể
Nhiễm sắc thể vào vị trí trên nhiễm sắc thể
Nucleotide tham khảo tại vị trí xảy ra biến thể
Nucleotide thay thế tại vị trí xảy ra biến thể
Loại đột biến

Số lần đọc được tại vị trí xảy ra biến thể trong quá trình giải trình tự
Tần số biến thể
Tình trạng kết hợp giao tử
Exon xảy ra biến thể
Vị trí codon trong exon xảy ra biến thể
Sự thay đổi nucleotide
Sự thay đổi acid amin

Tên bệnh của biến thể
Cơ sở dữ liệu bệnh của biến thể
ID trong cơ sở dữ liệu bệnh của biến thể


2.2.
Phương
pháp

Ký hiệu
CLNSIG
MAF
DBSNP
COMMON
PROVEAN:
pred_score
SIFT: pred_score
Polyphen2_HDIV:
pred_score
Polyphen2_HVAR:
pred_score
MutationTaster:
pred_score
ESP-AF-GLOBAL
ESP-AF-POPMAX
ESP-AC

Ý nghĩa
Ý nghĩa lâm sàng của biến thể: 0- ý nghĩa không chắc chắn; 1- không
được cung cấp; 2- lành tính; 3- có khả năng lành tính; 4- có khả năng gây

bệnh; 5- gây bệnh; 6- phản ứng với thuốc; 7-tương thích mô; 255- khác.
Tỷ lệ của tần số Allele nhỏ ở người Mỹ gốc Âu (EA), người Mỹ gốc Phi
(AA) và toàn bộ (All)
Bản dbSNP thành lập rs_id
SNP phổ biến có ít nhất 1 quần thể có kết quả nghiên cứu trên ngân hàng
dữ liệu 1000Genomes với tần số Allele nhỏ >= 1%
Công cụ dự đoán chức năng PROVEAN: dự đoán_điểm tương ứng
Công cụ dự đoán chức năng SIFT: dự đoán_điểm tương ứng

Công cụ dự đoán chức năng Polyphen2_HDIV: dự đoán_điểm

Công cụ dự đoán chức năng Polyphen2_HVAR: dự đoán_điểm

Công cụ dự đoán chức năng MutationTaster: dự đoán_điểm tương ứng

Tần số allele chung theo ESP
Tần số allele cao nhấn trong cộng đồng theo ESP
Tổng số allele đếm được theo ESP


2.2. Phương pháp
Điều kiện lọc biến thể khi đối
chiếu lên trình tự chuẩn
Thông tin dùng
để lọc
Tần số của biến thể
Số lượt đọc

Điều kiện lọc

Điều kiện lọc tìm biến thể nghi ngờ
Thông tin dùng
để lọc
Type
MAF

≥

≥

20%
10

PROVEAN_score
SIFT _score
Polyphen2_HDIV
_score
Polyphen2_HVAR
_score

Điều kiện lọc
#

Synonymous

<=

-2.5

<=

0.005

<

0.05

>=

0.5

>=

0.5


3. KẾT QUẢ


3. Kết quả
Số lượng biến
thể thu được
qua từng bước
phân tích

Ca bệnh

WES 1

WES 2

WES 3
WES 4
WES 5
WES 6
WES 7
WES 8

Cá thể

1C
1B
1M
2C
2B
2M
3C
3B
3M
4C
5C
5B
5M
6C
7C
8C

NextGENe
111.539
100.874

113.085
132.802
105.345
102.526
131.314
108.442
101.470
98.755
101.144
98.380
94.667
101.080
109.459
108.355

Số biến thể
Geneticist Assistant
Lọc qua panel gen
Lọc
liên quan đến
bằng
động kinh nghiêm điều
trọng ở trẻ em
kiện
71
1
72
1
70
1

69
1
63
0
76
0
69
0
67
1
76
0
67
0
69
0
69
0
68
0
75
0
74
2
76
1


3. Kết quả
Gen

Chr:ChrPos
Ref
Alt
Type
Coverage
Var.Fre
Zygosity
Exon.Nu
Codon.Pos

SCN1A
2:166852601
T
frame-shift
11
0.556
heterozygous
24
3

Thông tin biến thế nghi ngờ ở bệnh nhi 7C

CACNA1A
19:13318673
CAGCAG
in-frame
10
0.444
heterozygous
48

3
c.6988_6993delC
HGVS.c
c.4503delA
AGCAG
p.Glu1502LysfsT p.Gln2330_Gln23
HGVS.p
er10
31del
CLNDBN
N/A
N/A
CLNDSDB
N/A
N/A
N/A
N/A
CLNDSDBID
CLNSIG
N/A
N/A

MAF
DBSNP
COMMON
ESP-AF-GLOBAL
ESP-AFPOPMAX
ESP-AC
PROVEAN:
pred_score

SIFT:
pred_score
Polyphen2_HDI
V: pred_score
Polyphen2_HVA
R: pred_score
MutationTaster
: pred_score

N/A
N/A
N/A
N/A

N/A
N/A
N/A
N/A

N/A

N/A

N/A

N/A

N/A

N/A

N/A

N/A

N/A

N/A

N/A

N/A

N/A

N/A


3. Kết quả
Thông
tin biến
thế nghi
ngờ ở
bệnh nhi
8C

Gen
Chr:ChrPos
Ref
Alt

Type
Coverage
Var.Fre
Zygosity
Exon.Nu
Codon.Pos
HGVS.c
HGVS.p
CLNDBN
CLNDSDB
CLNDSDBID
CLNSIG

SCN1A
2:166852531
C
T
nonsense
56
0.518
heterozygous
24
1
c.4573C>T
p.Arg1525Ter
Severe_myoclonic_

epilepsy_in_infancy

|not_provided

MedGen:OMIM:SNOMED_C
T|MedGen
C0751122:607208:230437
002|CN221809
5|5

MAF
DBSNP
COMMON
ESP-AF-GLOBAL
ESP-AF-POPMAX
ESP-AC
PROVEAN:
pred_score
SIFT: pred_score
Polyphen2_HDIV:
pred_score
Polyphen2_HVAR:
pred_score
MutationTaster:
pred_score

N/A
N/A
N/A
N/A
N/A
N/A

N/A

N/A

N/A

N/A
A_1


3. Kết quả
Thông tin
biến thế
nghi ngờ
ở bệnh
nhi 1C

Gen
1C: AF/Cor
1B: AF/Cor
1M: AF/Cor
Chr:ChrPos
Ref
Alt
Type
Coverage
Var.Fre
Zygosity
Exon.Nu
Codon.Pos
HGVS.c

HGVS.p
CLNDBN
CLNDSDB

SCN1A
0.505/111
0.267/60
0/0
2:166903479
G
A
missense
111
0.505
heterozygous
9
2
c.1178G>A
p.Arg393His
Severe_myoclonic_

epilepsy_in_infancy

|not_provided
MedGen:OMIM:SNOMED_CT
|MedGen

C0751122:607208:23043
7002|CN221809
CLNSIG

5|5
MAF
N/A
DBSNP
N/A
COMMON
N/A
ESP-AF-GLOBAL
N/A
ESP-AF-POPMAX
N/A
ESP-AC
N/A
PROVEAN:
D_-4.91
pred_score
SIFT: pred_score
D_0
Polyphen2_HDIV
D_1
: pred_score
Polyphen2_HVAR
D_0.998
: pred_score
MutationTaster:
D_1
pred_score
CLNDSDBID

3. Kết quả
Thông
tin biến
thế nghi
ngờ ở
bệnh
nhi 2C

Gen
2C: AF/Cor
2B: AF/Cor
2M: AF/Cor
Chr:ChrPos
Ref
Alt
Type
Coverage
Var.Fre
Zygosity
Exon.Nu
Codon.Pos
HGVS.c
HGVS.p
CLNDBN
CLNDSDB
CLNDSDBID
CLNSIG

GABRB3
0.504/127

0/0
0/0
15:26812868
C
T
missense
127
0.504
heterozygous
7
2
c.695G>A
p.Arg232Gln
N/A
N/A
N/A
N/A

MAF
DBSNP
COMMON
ESP-AF-GLOBAL
ESP-AF-POPMAX
ESP-AC
PROVEAN:
pred_score
SIFT: pred_score
Polyphen2_HDIV:
pred_score
Polyphen2_HVAR:

pred_score
MutationTaster:
pred_score

N/A
N/A
N/A
N/A
N/A
N/A

D_-3.54

D_0.033
D_0.999
D_0.95
D_1