Nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano dihydroartemisinin bao acid folic

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ THẾ DƯƠNG

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ HỆ TIỂU
PHÂN NANO DIHYDROARTEMISININ
BAO ACID FOLIC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2018


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ THẾ DƯƠNG

Mã sinh viên: 1301067

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ HỆ TIỂU
PHÂN NANO DIHYDROARTEMISININ
BAO ACID FOLIC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. PGS. TS. Nguyễn Ngọc Chiến
2. DS. Phạm Hữu Phong
Nơi thực hiện:
Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia

HÀ NỘI - 2018

LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến
PGS. TS. Nguyễn Ngọc Chiến
DS. Phạm Hữu Phong
Là những người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo em tận tình trong suốt thời gian
thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS. Trần Ngọc Bảo và TS. Nguyễn
Văn Hải mặc dù vô cùng bận rộn nhưng đã giúp đỡ, động viên em rất nhiều.
Em cũng xin cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị nghiên cứu viên, kĩ thuật viên,
các bạn sinh viên đang làm nghiên cứu khoa học và đề tài tại Viện Công nghệ Dược
phẩm Quốc gia, Bộ môn Công Nghiệp Dược, Bộ môn Bào Chế đã giúp đỡ, tạo điều kiện
thuận lợi cho em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Ban giám hiệu Nhà trường cùng
Phòng Đào tạo đã giúp đỡ rất nhiều trong thời gian em học tập, làm việc tại trường.
Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè đã giành cho em sự giúp
đỡ, ủng hộ, động viên trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận.

Hà Nội, tháng 5 năm 2018
Sinh viên

Đỗ Thế Dương


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………………………………………...1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ...........................................................................................2
1.1. Tổng quan về dihydroartemisinin .........................................................................2
1.1.1. Tính chất lý, hóa .............................................................................................2
1.1.2. Tác dụng dược lý ............................................................................................2
1.1.3. Dược động học ................................................................................................3
1.1.4. Định lượng DHA ............................................................................................3
1.2. Vài nét về chất mang PLGA .................................................................................5
1.2.1. Cấu trúc ...........................................................................................................5
1.2.2. Tính chất, ứng dụng ........................................................................................5
1.2.3. Một số hạn chế khi sử dụng PLGA ................................................................6
1.3. Vài nét về FA, thụ thể của FA ..............................................................................6
1.3.1. Acid folic ........................................................................................................6
1.3.2. Thụ thể của FA ...............................................................................................7
1.4. Vài nét về PVA .....................................................................................................7
1.4.1. Cấu tạo ............................................................................................................7
1.4.2. Tính chất .........................................................................................................8
1.5. Vài nét về dicyclohexyl carbodiimid (DCC), 4-dimethylamino pyridin (DMAP)
và phản ứng Steglich.. ..................................................................................................8
1.6. Tổng quan về nano polyme .................................................................................10
1.6.1. Đặc điểm .......................................................................................................10
1.6.2. Một số phương pháp bào chế tiểu phân nano polyme ..................................10
1.7. Một số nghiên cứu bào chế hê ̣tiểu phân nano liên quan. ...................................13


1.7.1. Một số nghiên cứu về nano DHA .................................................................13
1.7.2. Một số nghiên cứu về nano PLGA ...............................................................13
1.7.3. Một số nghiên cứu về nano bao acid folic hướng đích .................................14
CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ..............................................................................................................15
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu ...................................................................15

2.1.1. Nguyên vật liệu .............................................................................................15
2.1.2. Thiết bị nghiên cứu .......................................................................................15
2.2. Nội dung nghiên cứu ...........................................................................................16
2.2.1. Xây dựng công thức bào chế hệ nano DHA-PLGA bao PVA-FA ...............16
2.2.2. Đánh giá đặc tính tiểu phân nano DHA-PLGA bao PVA-FA......................16
2.3. Phương pháp nghiên cứu.....................................................................................16
2.3.1. Phương pháp bào chế tiểu phân nano DHA-PLGA bao PVA-FA ...............16
2.3.2. Phương pháp đánh giá đặc tính tiểu phân nano DHA-PLGA bao PVA-FA 18
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .....................................................................21
3.1. Kết quả khảo sát phương pháp định lượng .........................................................21
3.1.1. Độ tuyến tính ................................................................................................21
3.1.2. Độ ổn định hệ thống .....................................................................................21
3.2. Kết quả xây dựng công thức bào chế hệ tiểu phân nano DHA-PLGA ...............22
3.2.1. Ảnh hưởng của các yếu tố công thức ...........................................................23
3.2.2. Ảnh hưởng của các yếu tố quy trình .............................................................25
3.3. Kết quả xây dựng công thức bào chế hệ tiểu phân nano DHA-PLGA bao PVAFA ...............................................................................................................................28
3.3.1. Kết quả phản ứng tạo dịch bao PVA-FA ......................................................28
3.3.2. Kết quả xây dựng công thức bào chế hệ tiểu phân nano DHA-PLGA bao
PVA ........................................................................................................................28


3.3.3. Kết quả xây dựng công thức bào chế hệ tiểu phân nano DHA-PLGA bao
PVA- FA .................................................................................................................29
3.3.4. Kết quả tính EE và LC của một số công thức lựa chọn ................................31
3.4. Xác định sự có mặt của FA trong hệ tiểu phân nano DHA bao PVA-FA ..........31
3.4.1. Cảm quan ......................................................................................................31
3.4.2. Dùng phổ FT-IR ...........................................................................................32
3.4.3. Dùng quang phổ UV- VIS ............................................................................33
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................................35
TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
ACN:

Acetonitril

DC:

Dược chất

DCC:

Dicyclohexyl carbodiimid

DCM:

Dicloromethan

DHA:

Dihydroartemisinin

DMAP:

4-Dimethylamino pyridin

DMSO:

Dimethyl sulfoxid

EE:

Hiệu suất mang thuốc (Encapsulation efficiency)

FA:

Acid folic

FDA:

Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm (Food and Drug Administration)

FR:

Thụ thể folat (Folat receptor)

FT-IR:

Phổ hồng ngoại biến đổi (Fourier Transform Infraced Spectroscopy)

HPLC:

Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography)

Kl/tt:

Khối lượng/thể tích

KTTP:

Kích thước tiểu phân trung bình

LC:

Tỷ lệ nạp thuốc (Drug loading capacity)

PDI:

Chỉ số đa phân tán (Polydispersity index)

PEG:

Poly ethylen glycol

PLGA:

Poly (Acid lactic-co-glycolic)

PVA:

Polyvinyl alcol

RSD:

Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation)


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Một số các nghiên cứu định lượng DHA ........................................................4
Bảng 1.2: Các loại PVA ..................................................................................................8
Bảng 2.1: Danh mục nguyên liệu, hóa chất sử dụng .....................................................15
Bảng 3.1: Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ DHA ...................................21
Bảng 3.2: Kết quả khảo sát độ ổn định của hệ thống ....................................................22
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của nồng độ chất diện hoạt tới đặc tính của hệ tiểu phân nano
DHA-PLGA ...................................................................................................................23
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của lượng dược chất tới đặc tính của hệ tiểu phân nano DHAPLGA. ............................................................................................................................24
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của năng lượng siêu âm tới đặc tính của hệ tiểu phân nano
DHA-PLGA ...................................................................................................................26
Bảng 3.6: Ảnh hưởng của thời gian siêu âm tới đặc tính của hệ tiểu phân nano DHAPLGA .............................................................................................................................27
Bảng 3.7: Ảnh hưởng của tỷ lệ PVA so với PLGA tới đặc tính của hệ tiểu phân nano
DHA-PLGA bao PVA ...................................................................................................29
Bảng 3.8: Ảnh hưởng của tỷ lệ PVA-FA so với PLGA tới đặc tính của hệ tiểu phân
nano DHA-PLGA bao PVA-FA ....................................................................................30
Bảng 3.9: Khảo sát hiệu suất mang thuốc và khả năng nạp thuốc của một số công thức.
.......................................................................................................................................31


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1: Công thức cấu tạo của dihydroartemisinin ......................................................2
Hình 1.2: Cấu trúc hóa học và sự thủy phân của PLGA .................................................5
Hình 1.3: Công thức cấu tạo của acid folic .....................................................................6
Hình 1.4: (A) PVA thủy phân một phần

(B) PVA thủy phân toàn phần ...................8

Hình 1.5: Phản ứng Steglich ............................................................................................9
Hình 1.6: Sự khác nhau giữa siêu vi cầu và siêu vi nang ..............................................10
Hình 1.7: Kỹ thuật nhũ hóa và bốc hơi dung môi .........................................................11

Hình 1.8: Kỹ thuật nhũ hóa và khuếch tán dung môi ....................................................12
Hình 2.1: Sơ đồ bào chế tiểu phân nano DHA-PLG bao PVA-FA sử dụng phương
pháp bao hệ DHA-PLGA bằng PVA-FA ......................................................................18
Hình 3.1: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ DHA .........21
Hình 3.2: Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ chất diện hoạt tới đặc tính của hệ tiểu phân
nano DHA-PLGA ..........................................................................................................23
Hình 3.3: Đồ thị ảnh hưởng của lượng dược chất tới đặc tính của hệ tiểu phân nano
DHA-PLGA. ..................................................................................................................25
Hình 3.4: Đồ thị ảnh hưởng của năng lượng siêu âm tới đặc tính của hệ tiểu phân nano
DHA-PLGA. ..................................................................................................................26
Hình 3.5: Đồ thị ảnh hưởng của thời gian siêu âm tới đặc tính của hệ tiểu phân nano
DHA-PLGA ...................................................................................................................27
Hình 3.6: Dịch bao PVA-FA sau khi sấy khô ...............................................................28
Hình 3.7: Đồ thị biểu diễn mối liên hệ giữa lượng PVA thêm vào với đặc tính của hệ
tiểu phân nano ................................................................................................................29
Hình 3.8: Ảnh hưởng của tỷ lệ PVA-FA so với PLGA tới đặc tính của hệ tiểu phân
nano DHA-PLGA bao PVA-FA. ...................................................................................30
HÌnh 3.9: Màu sắc của hỗn dịch nano đã bao sau 2 ngày .............................................31
Hình 3.10: Phổ FT-IR của PVA nguyên liệu, dịch bao PVA-FA, FA nguyên liệu. ....32
Hình 3.11: Phổ FT-IR của PVA nguyên liệu, dịch bao PVA-FA, FA nguyên liệu ở
vùng số sóng từ 2000 cm-1 đến 1400 cm-1 .....................................................................33
Hình 3.12: Phổ hấp thụ UV của nano DHA-PLGA bao PVA-FA ................................34
Hình 3.13: Phổ hấp thụ UV của FA nguyên liệu………………………………….......34


ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm gần đây, rất nhiều nghiên cứu chứng minh rằng DHA tiêu diệt
và ức chế hiệu quả sự phát triển của tế bào ung thư. Mặc dù vậy, DHA ít tan trong nước,
có sinh khả dụng thấp khi dùng đường uống, bị phân hủy trong dịch dạ dày - ruột, và có
thời gian bán thải rất ngắn [37]. Do đó cần phát triển một dạng bào chế nhằm làm tăng

độ hòa tan, bảo vệ dược chất, tăng tác dụng hướng đích của DHA.
Nano polyme là dạng bào chế có nhiều ưu điểm như tăng độ tan của dược chất,
bảo vệ dược chất và tăng thời gian lưu thuốc trong hệ tuần hoàn. Các polyme hay được
sử dụng để bào chế nano như poly (acid lactic-co-glycolic), poly acid lactic, poly acid
glycolic …nhờ tính tương thích sinh học cao, khả năng phân hủy sinh học và tính an
toàn đã được FDA (Mỹ) chấp thuận.
Acid folic (FA) là một trong những phối tử (ligand) được sử dụng phổ biến trong
nghiên cứu các hệ vận chuyển thuốc nhằm hướng đích tới các tế bào ung thư nhờ có ái
lực cao với các thụ thể folat trên các tế bào này [31].
Polyvinyl alcol 205 (PVA 205) là một polyme có khả năng tương tác và tạo lớp
áo bền vững bao ngoài tiểu phân nano PLGA [25], [35].
Do đó, khi tổng hợp được PVA và FA, gắn phức hợp lên tiểu phân nano PLGA
làm tăng tác dụng hướng đích trong điều trị các tế bào ung thư, cải thiện sự hấp thu của
dược chất, ít gây hại cho tế bào lành và tăng khả năng thấm, đồng thời kéo dài thời gian
lưu của thuốc trong tuần hoàn chung.
Từ những đặc điểm trên, đề tài “Nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano
dihydroartemisinin bao acid folic” được thực hiện với các mục tiêu sau:
1. Xây dựng được công thức bào chế hệ tiểu phân nano DHA-PLGA bao phức hợp PVAFA.
2. Đánh giá được một số đặc tính và xác định sự có mặt của FA trên tiểu phân nano đã
bào chế được.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về dihydroartemisinin
1.1.1. Tính chất lý, hóa

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của dihydroartemisinin
Công thức phân tử của DHA: C15H24O5.

Tên khoa học (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-Decahydro-3,6,9-trimetyl3,12-epoxy-12H-pyrano[4,3,-j]-1,2-benzodioxepin-10-ol.
Khối lượng phân tử của DHA: 284,35 g/mol.
DHA là chất chuyển hóa chính có hoạt tính của các dẫn xuất artemisinin, DHA
là những tinh thể hình kim màu trắng, vị đắng, không mùi, rất ít tan trong nước và trong
dầu. DHA tan tốt trong ethanol 96%, tan được trong các dung môi ether, cloroform.
Trong môi trường kiềm mạnh hoặc acid mạnh, DHA bị thủy phân mạnh nhưng
bền vững trong môi trường trung tính ngoài ra DHA cũng không bền với nhiệt.
Năng suất quay cực [α] = 140-146 (C =1,0026 trong cloroform). C12 là một
cacbon bất đối tạo ra 2 đồng phân quang học α và β. Bằng phương pháp nhiễu xạ tia X,
người ta chứng minh được DHA tồn tại chủ yếu dạng α, nhưng trong dạng dung dịch thì
tồn tại cả 2 dạng.
Nhiệt độ nóng chảy : 145 – 150C [3].
1.1.2. Tác dụng dược lý
Trong những năm gần đây, có rất nhiều nghiên cứu chứng minh rằng DHA tiêu
diệt và ức chế hiệu quả sự phát triển của tế bào ung thư [16], [22]. DHA ít tan trong

2


nước và sinh khả dụng thấp khi dùng đường uống vì thuốc tan chậm và có thể bị phân
hủy bởi dịch dạ dày ruột. Thời gian bán thải của DHA rất ngắn (34-90 phút) [35], [36].
DHA là chất bán tổng hợp và chuyển hóa từ artemisinin đã được nghiên cứu với
hai cơ chế tiêu diệt tế bào ung thư. Cơ chế thứ nhất nhờ việc tạo ra các gốc tự do thông
qua sự phân cắt đồng nhất của cầu endoperoxid yếu (R-O-O-R), cơ chế thứ hai thông
qua sự phân chia dị hợp của cầu nối endoperoxid và nước, dẫn đến sự hình thành
hydroperoxid hoặc gốc hydroxyl dựa trên phản ứng Fenton. Hai cơ chế chống ung thư
đều cho thấy tác dụng dược lý của DHA có liên quan và phụ thuộc vào nồng độ sắt trong
cơ thể. Các gốc tự do có thể oxy hóa lipid, gây tổn thương màng tế bào, protein và ADN,
gây ra sự tự chết của tế bào ung thư [31].
1.1.3. Dược động học

Nghiên cứu trên động vật thực nghiệm: DHA hấp thu qua đường uống, tỷ lệ liên
kết với protein huyết tương là 50%. DHA phân bố đến khắp các cơ quan, đặc biệt phân
bố nhanh đến gan và tim. DHA phân bố đến hồng cầu bị nhiễm P. falciparum cao hơn
so với hồng cầu bình thường. DHA thải trừ nguyên dạng qua nước tiểu (82,7%) và một
phần qua phân. Khi dùng DHA đồng thời với các thuốc khác có tỷ lệ liên kết với protein
huyết tương cao nhận thấy độc tính không tăng lên.
Nghiên cứu trên cơ thể người: DHA hấp thu qua đường uống với liều 1,1 mg/kg
và 2,2 mg/kg, nồng độ trong huyết tương cao nhất đạt được sau 1,33 giờ và t1/2 là 1,571,63 giờ [9].
1.1.4. Định lượng DHA
Theo Dược điển Trung Quốc 2010, DHA nguyên liệu được định lượng bằng
phương pháp HPLC, sử dụng cột C18, pha động ACN : nước = 60:40, bước sóng phát
hiện 210 nm. Hòa tan 1 lượng DHA và artemisinin chuẩn vào pha động sao cho thu
được 1 dung dịch có nồng độ 1mg/ml. Tiêm 20 µl vào cột sắc ký C18. DHA thể hiện 2
pic, độ phân giải giữa pic artemisinin và pic DHA không thấp hơn 2,0, số đĩa lý thuyết
không thấp hơn 6000 được tính với pic tham khảo của DHA. Sau đó cân chính xác 25
mg mẫu thử, hòa tan vào pha động trong bình định mức 25 ml và pha loãng tới vạch.
Tiêm 20 µl vào cột sắc ký trong 8 giờ và ghi sắc ký đồ. Lặp lại thao tác với DHA chuẩn.
Tính toán hàm lượng DHA dựa vào diện tích pic trên sắc ký đồ của mẫu thử, mẫu chuẩn.
Với viên nén chứa DHA, Dược điển Trung Quốc 2010 định lượng theo phương
pháp đo UV, đo độ hấp thụ tại bước sóng 238 nm, với mẫu trắng là dung dịch hỗn hợp
3


natri hydroxid 2%: ethanol = 4:1. Tính toán hàm lượng DHA bằng cách so sánh với
dung dịch chuẩn cùng nồng độ.
Ngoài Dược điển Trung Quốc 2010 hướng dẫn định lượng DHA còn rất nhiều
các nghiên cứu của các tác giả định lượng DHA, có thể kể ra một số nghiên cứu sau.
Bảng 1.1: Một số các nghiên cứu định lượng DHA
Tên các
nghiên cứu

Nghiên

Phương
pháp định
lượng
DHA HPLC

Đối tượng
định lượng

cứu Nano

Điều kiện định lượng
- Sử dụng hệ thống sắc ký lỏng hiệu

của Zhang và sử dụng chất

năng cao LC-20A của Shimadzu

cộng sự [35].

- Detector SPD-20MA

mang

thân

lipid

Thiết bị loại khí DGU-20A3

- Sử dụng cột C18 (4,6mm x 150mm
x 5µm)
- Pha động bao gồm ACN: 0,02 mol/l
amoni sulfat:12% triethylamin
= 100:100:0,15(v/v/v).
- Tốc độ dòng 1ml/phút
- Bước sóng phát hiện 213 nm
- Nhiệt độ chạy sắc ký 30C
- Thể tích tiêm mẫu là 50µl.

Nghiên

cứu DHA

trong Chuẩn

của Attih EE viên
và cộng sự [6]. hoặc

độ - Dựa trên phản ứng của DHA với
kali iod (1:1), iod giải phóng được

nén iod

chuẩn độ bằng dung dịch natri

trong

thuốc bột

thiosulfat với chỉ thị hồ tinh bột
- Phạm vi định lượng 5-70 mg DHA

cứu Viên

nén Quang phổ - Tạo phản ứng giữa dung dịch

của Babalola DHA

UV sử dụng methanol của DHA và p-nitroanilin

và cộng sự [8].

p-nitroanilin trong môi trường acid HCl 1M ở

Nghiên

làm tác nhân nhiệt độ cao và thời gian phản ứng
tạo dẫn xuất

ngắn, tỷ lệ giữa DHA: p-nitroanilin là
2:1.

4


- Đo độ hấp thụ của sản phẩm tại
bước sóng 290 nm.

Zhu Kai và DHA

cộng sự [37].

và HPLC

- Cột C18 (250 mm x 4,6mm x 5µm)

piperaquin

- Pha động gồm: ACN:methanol:

phosphat

0,02 mol/lít amoni sulfat = 50:10:40

trong

viên

(v/v/v)
- Tốc độ dòng 1 ml/phút

nén

- Bước sóng phát hiện 210nm
- Nhiệt độ chạy sắc ký 30C.

1.2. Vài nét về chất mang PLGA
1.2.1. Cấu trúc
Poly (acid lactic-co-glycolic) (PLGA) là một copolyme được tổng hợp bằng
phương pháp đồng polyme hóa mở vòng ngẫu nhiên của 2 monome khác nhau, dime

vòng (1,4-dioxan-2,5-dion) của acid glycolic và acid lactic. Các PLGA khác nhau bởi
tỷ lệ các monome sử dụng và khối lượng phân tử (KLPT), ví dụ PLGA 75:25 chứa 75%
acid lactic và 25% acid glycolic [32].

Hình 1.2: Cấu trúc hóa học và sự thủy phân của PLGA
1.2.2. Tính chất, ứng dụng
PLGA là một trong những polyme phân hủy sinh học hiệu quả nhất do có khả
năng kiểm soát và duy trì giải phóng dược chất, độc tính thấp, tương thích sinh học với
nhiều mô và tế bào, ngoài ra nano PLGA đang được nghiên cứu ứng dụng trong liệu
5


pháp chẩn đoán hình ảnh và trong điều trị ung thư. PLGA phân hủy sinh học bằng thủy
phân liên kết ester tạo thành acid lactic và acid glycolic. Cả hai được chuyển hóa qua
chu trình Krebs thành CO2 và nước rồi đào thải ra ngoài nên độc tính thấp.
Trong PLGA thì phần PLA (poly acid lactic) có cấu trúc kỵ nước hơn PGA (poly
acid glycolic). Do đó, nếu PLGA có tỷ lệ PLA cao hơn thì ít thân nước hơn và thủy phân
chậm hơn. Điều này ảnh hưởng đến sự giải phóng dược chất. Ngoài ra, sự phân hủy sinh
học của PLGA còn chịu ảnh hưởng của các yếu tố như trạng thái kết tinh, hình dạng bề
mặt và kích thước, pH, khối lượng phân tử trung bình, hàm lượng dược chất, loại dược
chất [32].
1.2.3. Một số hạn chế khi sử dụng PLGA
Khi sử dụng PLGA làm chất mang sự giải phóng dược chất trải qua hai giai đoạn,
trong đó giai đoạn đầu có sự giải phóng “bùng nổ, ồ ạt” do xảy ra quá trình hòa tan và
ăn mòn ở bề mặt. Mặt khác các tiểu phân nano PLGA dễ bị bắt giữ bởi hệ thống thực
bào và tương tác không đặc hiệu với protein và tế bào làm giảm hiệu quả điều trị và tăng
tác dụng phụ. Do đó, nhiều nghiên cứu nhằm thay đổi các đặc tính lý hóa bề mặt của
tiểu phân nano PLGA đã được thực hiện như bao tiểu phân với polyme thân nước (PEG,
chitosan) để kéo dài thời gian tuần hoàn do tiểu phân thân nước có khả năng tuần hoàn
trong máu lâu hơn và bị tích lũy ở gan ở mức độ tối thiểu [32].

1.3. Vài nét về FA, thụ thể của FA
1.3.1. Acid folic

Hình 1.3: Công thức cấu tạo của acid folic
Tính chất: Bột kết tinh màu hơi vàng, không mùi, không tan trong nước lạnh, tan
tốt trong kiềm, acid, nhiệt độ nóng chảy 250C. Acid folic dễ bị phân hủy mất hoạt tính
dưới tác dụng của ánh sáng, chất oxy hóa, chất khử, acid, kiềm hoặc khi đun nóng.

6


Acid folic (FA) là một trong những phối tử (ligand) được sử dụng phổ biến với
mục đích hướng đích nhờ gắn với các thụ thể folat trên tế bào ung thư [11], [29], [30].
1.3.2. Thụ thể của FA
Các thụ thể folat (FR) thuộc về một họ protein liên kết acid folic có ái lực cao,
được mã hóa bởi ba gen khác nhau , ,  và nằm trên nhiễm sắc thể 11. Các thụ thể
folat hoàn chỉnh tương tự những protein mà chứa 229-236 amino acid với trọng lượng
phân tử 38-40 kDa [13]. FR và FR được gắn trên màng tế bào bằng glycosyl
phosphatidyl inositol (GPI). Trong khi đó FR là một protein liên kết gắn với folat hòa
tan được tiết ra khi glycosylphosphatidylinositol có sự biến đổi [18].
Thông thường thụ thể folat ở người xuất hiện ở một số mô bình thường trong
ngưỡng cho phép. Trong đó thụ thể folat FR xuất hiện nhiều nhất ở tế bào biểu mô
thận, phổi, ruột, tuyến giáp. Trong tất cả các mô này các thụ thể được biểu hiện trên bề
mặt màng đỉnh. Ngoài ra cũng còn thấy sự hiện diện cao của FR ở phần ống lượn gần
của thận có khả năng gắn kết acid folic trước khi được bài tiết qua nước tiểu và đưa trở
lại lưu thông thông qua quá trình tái hấp thu [13], [14], [15].
Thụ thể folat FR phần lớn được biểu hiện qua các khối u không có biểu mô như
bệnh bạch cầu tủy cấp tính.
Sự hiện diện quá mức của các thụ thể folat FR thường xuất hiện ở những vị trí
có khối u ác tính, có nguồn gốc biểu mô như u buồng trứng, nội mạc tử cung, đại trực

tràng, vú, phổi, thận, di căn não, ung thư biểu mô thần kinh [27]. Dựa vào đây chúng ta
có thể chẩn đoán chính xác bệnh ung thư thông qua xét nghiệm tìm FR.
Bình thường các thụ thể folat không thể tiếp cận được với dòng máu nên không
có khả năng gắn acid folic tuy nhiên khi tế bào chuyển thành ác tính thụ thể folat có thể
tiếp cận được với dòng máu đây là điều kiện lý tưởng để đưa thuốc hướng đích thụ thể
folat qua trung gian acid folic [13].
1.4. Vài nét về PVA
1.4.1. Cấu tạo
PVA được tổng hợp từ quá trình thủy phân polyvinyl acetat. Phụ thuộc vào mức
độ thủy phân và khối lượng phân tử (độ trùng hợp) mà có thể tổng hợp được hàng loạt
các PVA khác nhau [4], [19], [20].

7


Hình 1.4: (A) PVA thủy phân một phần

%

Số

OH

monome

105

98,5

500

110

98,5

117
120

Tên

(B) PVA thủy phân toàn phần

%

Số

OH

monome

205

88

500

1000

210

88

98,5

1700

215

98,5

2000

217

Tên

%

Số

OH

monome

403

80

300

1000

405

80

500

88

1500

417

80

1700

88

1700

420

80

2000

Tên

Bảng 1.2: Các loại PVA
1.4.2. Tính chất
- Khả năng tan trong nước và là chất diện hoạt yếu có nhiều ứng dụng dùng phổ
biến trong bào chế nano [20].
- PVA là một polyme chứa nhiều nhóm OH, do đó nó có tính chất của một rượu
đa chức, PVA có thể tham gia các phản ứng ether hóa, este hóa… [4], [19].
- PVA có ái lực với PLGA khả năng tương tác và tạo lớp áo bền vững bao ngoài
tiểu phân nano PLGA [23], [7], [33].
1.5. Vài nét về dicyclohexyl carbodiimid, 4-dimethylamino pyridin và phản ứng
Steglich.
Phản ứng este hóa Steglich là một biến thể của phản ứng este sử dụng DCC như
một tác nhân loại nước hình thành liên kết este và DMAP như là một chất xúc tác. Phản
ứng lần đầu tiên được mô tả bởi Wolfgang Steglich vào năm 1978 [25]. Nó là một sự
phát triển của một phương pháp cũ hơn cho sự hình thành các amid sử dụng DCC và 1hydroxy benzotriazol (HOBT) [28]. Phản ứng này thường được tiến hành ở nhiệt độ
8


phòng với dung môi thích hợp là dicloromethan. Một đặc tính là DCC hấp thụ nước sinh
ra trong phản ứng tạo thành hợp chất urê dicyclohexyl urea (DCU).

Hình 1.5: Phản ứng Steglich

* Cơ chế phản ứng:
DMAP

DCC

Với amin, phản ứng xảy ra dễ dàng hơn so với các amid tương ứng do amin có
tính ái nhân cao hơn. Nếu quá trình este hóa chậm, phản ứng phụ sẽ xảy ra làm giảm
hiệu suất phản ứng hoặc quá trình tinh chế sản phẩm phức tạp hơn. Phản ứng phụ này

là sự tái sắp xếp 1,3 của chất trung gian O-acyl thành N-acylure và không thể tiếp tục
phản ứng với alcol. DMAP ngăn chặn phản ứng phụ này, hoạt động như chất chuyển
acyl theo cách sau:

Sản phẩm cuối cùng tạo ra là este [25].
* Phản ứng giữa acid folic và PVA 205

9


Aicd folic là acid hữu cơ có 2 nhóm –COOH, PVA 205 là polyme alcol với rất
nhiều nhóm –OH, cơ chế phản ứng tạo thành este giữa 2 chất diễn ra giống như cơ chế
nêu trên, sản phẩm chính tạo thành là nhiều ester khác nhau.
FA-COOH + PVA-OH

FA-COO-PVA

1.6. Tổng quan về nano polyme
1.6.1. Đặc điểm
Các tiểu phân nano polyme (PNPs) được bào chế từ các polyme tương thích hoặc
phân hủy sinh học có kích thước từ 1-1000 nm tại đó thuốc được hòa tan, bẫy, bao gói
hoặc phân tán trong cốt của chất mang. Tùy theo phương pháp bào chế mà thu được siêu
vi cầu (nanospheres) hoặc siêu vi nang (nanocapsules). Siêu vi nang có cấu trúc nhân vỏ
như vi nang, còn siêu vi cầu có cấu trúc cốt (matrix) đồng nhất như vi cầu [2].

Hình 1.6: Sự khác nhau giữa siêu vi cầu và siêu vi nang
Tiểu phân polyme mang thuốc có đặc điểm chung là dùng polyme làm giá mang
dược chất với mục đích che chở, bảo vệ dược chất, kéo dài tác dụng của dược chất và
hướng dược chất tới đích tác dụng.
Theo cơ chế mang dược chất có thể chia làm 3 nhóm [2]:

-

Hệ cốt: Tiểu phân nano được phân tán trong giá mang polyme: Siêu vi cầu, tiểu

phân lipid rắn.
-

Hệ màng bao: Polyme bao ngoài tiểu phân nano dược chất: Siêu vi nang,

liposome, micell, dendrime, ống carbon…
-

Hệ liên kết: Polyme gắn trực tiếp với phân tử dược chất qua các cầu liên kết hóa

học.
1.6.2. Một số phương pháp bào chế tiểu phân nano polyme
Các phương pháp bào chế PNPs hay được sử dụng có thể chia ra 3 nhóm [2]:
10


-

Phương pháp phân tán trong polyme được hình thành từ trước: Là một kỹ thuật

phổ biến được sử dụng để bào chế các hệ nano sử dụng polyme phân hủy sinh học như
poly (acid lactic) (PLA), poly (D, L-acid glycolic) (PLG), poly (D, L-acid lactic-coglycolic) (PLGA) và poly (cyanoacrylat) (PCA). Nhóm này bao gồm các phương pháp
nhũ hóa và bốc hơi dung môi, nhũ hóa và khuếch tán dung môi, hóa muối, thẩm tách,
sử dụng dung môi siêu tới hạn.
-

Phương pháp polyme hóa từ monome: Nhũ tương, vi nhũ tương, polyme hóa bề

mặt.
-

Phương pháp gel ion hóa hay keo tụ.

-

Sau đây là một số phương pháp thường được sử dụng.

1.6.2.1. Nhũ hóa và bốc hơi dung môi
Nguyên tắc: Tạo ra vi nhũ tương (thường là dầu/nước), sau đó bốc hơi dung môi
hữu cơ tạo vi tiểu phân. Polyme hay dùng loại tan trong dung môi hữu cơ như PLA,
PLGA, Eudragit,…Hòa tan chất mang và dược chất vào dung môi hữu cơ (hay dùng
methylen clorid, cyclohexan…) rồi nhũ hóa vào pha nước đã có chất nhũ hóa (PVA
(polyvinyl alcol), Tween, Poloxamer…). Tiến hành đồng nhất hóa rồi bốc hơi dung môi
hữu cơ, lọc và rửa vi tiểu phân. Một số yếu tố ảnh hưởng tới đặc tính tiểu phân nano tạo
thành là cường độ và thời gian đồng nhất hóa, loại và lượng chất nhũ hóa, tỷ lệ polyme,
dược chất và cách bốc hơi dung môi [2].

Hình 1.7: Kỹ thuật nhũ hóa và bốc hơi dung môi
1.6.2.2. Nhũ hóa và khuếch tán dung môi
Nguyên tắc: Nhũ hóa pha hữu cơ (gồm polyme, dược chất, dung môi hữu cơ) vào
một dung dịch chất ổn định (pha nước). Dung môi sẽ khuếch tán từ pha dầu vào pha
nước hình thành các tiểu phân nano polyme. Để kết tụ polyme và tạo thành các tiểu phân
11


nano cần thiết phải sử dụng pha pha loãng để thúc đẩy sự khuyếch tán của dung môi pha

phân tán. Các dung môi được bốc hơi hoặc lọc.
Kỹ thuật này có ưu điểm như hiệu suất bao gói cao (thường lớn hơn 70%), không
cần phải đồng nhất, độ tái lặp giữa các lô cao, dễ mở rộng quy mô, đơn giản, phân bố
kích thước tiểu phân hẹp. Nhược điểm là thể tích lớn nước được loại bỏ khỏi hỗn dịch
và sự thẩm thấu nước hòa tan dược chất vào pha ngoại bão hòa nước trong suốt quá trình
nhũ tương hóa làm giảm hiệu suất bao gói dược chất [21].

Hình 1.8: Kỹ thuật nhũ hóa và khuếch tán dung môi
1.6.2.3. Sử dụng dung môi siêu tới hạn
Nguyên tắc: Hòa tan dược chất trong dung môi siêu tới hạn (hay dùng CO2) ở
điều kiện tới hạn, sau đó xả CO2 để giảm áp suất đột ngột, dược chất sẽ bị kết tủa lại
dưới dạng siêu mịn hoặc hòa tan dược chất vào dung môi rồi bơm vào thùng chứa cùng
với CO2 siêu tới hạn, dung môi chuyển sang CO2 làm kết tủa dược chất, sau đó giảm áp
suất để thu sản phẩm.
Phương pháp này có nhiều ưu điểm như không độc, giá thành rẻ, các thông số tới
hạn của CO2 không quá cao (nhiệt độ tới hạn là 31,3°C, áp suất tới hạn là 73,7 bar) [3].
1.6.2.4. Phương pháp gel ion hóa hay keo tụ
Các tiểu phân nano polyme được bào chế bằng cách sử dụng các polyme phân
hủy sinh học ưa nước như là chitosan, gelatin, natri alginat. Phương pháp này liên quan
đến một hỗn hợp của hai pha nước, trong đó có một pha là polyme chitosan, một đồng
polyme di-block của polyethylen oxid hoặc polypropylen oxid (PEO-PPO). Pha còn lại
là một poly anion natri tripolyphosphat. Nhóm amin của chitosan tích điện dương tương
tác với tripolyphosphat tích điện âm để tạo thành keo tụ với kích thước nano. Keo tụ
12


được hình thành do kết quả tương tác tĩnh điện giữa 2 pha nước, ở đó nguyên liệu chuyển
từ trạng thái lỏng sang trạng thái gel [21].
1.7. Một số nghiên cứu bào chế hê ̣tiểu phân nano liên quan.
1.7.1. Một số nghiên cứu về nano DHA

Năm 2014, Dai và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu bào chế phức hệ DHA và
polyme PEG (PEG-DHA) sau đó đánh giá hiệu quả điều trị ung thư trên dòng tế bào
ung thư phổi của phức hệ. Nhóm tác giả đã tạo ra phức hệ PEG-DHA có tỷ lệ nạp thuốc
trong khoảng 2,82 - 8,14%, độ tan trong nước của phức hệ tăng đáng kể (82 - 163 lần so
với DHA nguyên liệu), hoạt tính chống ung thư in vitro tại nồng độ ≥ 8 mg/ml cho thấy
khả năng sống sót của tế bào chỉ từ 15-20%, thời gian bán thải dài, gấp 5,75-16,7 lần so
với hỗn dịch DHA. Xét nghiệm xenograft sau đó chứng minh khả năng ức chế sự phát
triển của khối u của phức hệ cao hơn DHA nguyên liệu. Phức hệ PEG-DHA bào chế
được không chỉ cải thiện độ tan và hiệu quả điều trị của DHA mà còn cho thấy tiềm
năng sản xuất quy mô lớn và khả năng ứng dụng lâm sàng [10].
Liu và cộng sự (năm 2016) đã phát triển hệ đưa thuốc nano hướng đích khối u
bằng cách tổng hợp hệ transferrin-8arm-PEG-DHA và tạo tiểu phân bằng phương pháp
kết tủa. Công thức nano vừa tổng hợp đã làm tăng đáng kể độ tan của DHA (khoảng 102
lần so với DHA nguyên liệu ), khả năng nạp thuốc cao (10% DHA), thời gian tuần hoàn
dài, KTTP khoảng 147 nm. Độc tính tế bào in vitro và nghiên cứu ức chế sự phát triển
của khối u in vivo trên chuột gây u phổi của tế bào ung thư phổi (LLC- Lewis lung
carcinoma) đã khẳng định hiệu quả của công thức nano có sử dụng transferrin so với
DHA nguyên liệu và công thức nano không kết hợp transferrin. Do vậy công thức được
phát triển này hứa hẹn là một hệ mang thuốc hướng đích khối u hiệu quả đối với các
thuốc chống ung thư không tan trong nước [17].
1.7.2. Một số nghiên cứu về nano PLGA
Năm 2014, nhóm nghiên cứu của Hanh Thuy Nguyen đã tiến hành bào chế và
đánh giá tiểu phân nanopolyme chứa ART với chất mang là polyme PLGA, ART được
hòa tan trong dung môi hữu cơ trước khi được phân tán vào pha nước là dung dịch chất
diện hoạt. Hỗn hợp được khuấy trong vòng 3 giờ để quá trình bốc hơi dung môi hữu cơ
được diễn ra. Tiểu phân thu được được đánh giá các tiêu chí về kích thước, điện thế bề
mặt và các thí nghiện in vitro như khả năng giải phóng, độc tính tế bào. Kết quả thu
được khá khả quan khi kích thước tiểu phân trung bình vào khoảng 166 đến 305 nm tùy
13

theo đặc tính của chất diện hoạt. Chất diện hoạt tốt nhất cho mô hình thí nghiệm được
đánh giá là Tween 80 với khoảng kích thước 166 - 177 nm với hiệu suất nạp dược chất
đạt 77,5 - 83,4% với các nồng độ thay đổi. Các kết quả đánh giá in vitro về khả năng
chống tăng trưởng tế bào trên các dòng tế bào ung thư SCC7 (ung thư biểu mô), A549
(ung thư phổi trên người), MCF-7 (ung thư vú) cho thấy hiệu quả vượt trội so với ART
tự do ở nồng độ 50-100 µg/m [26].
1.7.3. Một số nghiên cứu về nano bao acid folic hướng đích
Zhang và cộng sự năm 2016 tại Đại học Đông Hoa, Trung Quốc đã nghiên cứu
tạo ra các hạt nano oxid sắt (Fe3O4) bao acid folic hướng đích như chất cản quang dùng
trong chẩn đoán ung thư buồng trứng sớm và đặc hiệu. Kết quả nghiên cứu cho thấy với
kích thước hạt trung bình là 9,2 ± 1,7 nm, không thể hiện độc tính trên tế bào buồng
trứng người (Skov-3), hệ tiểu phân nano oxid sắt bao FA có thể gắn đặc hiệu với các thụ
thể folat trên bề mặt tế bào ung thư, qua đó cho phép xác định chính xác vị trí của khối
u nhờ sử dụng máy cộng hưởng từ. Nghiên cứu còn cho thấy sự khác nhau có ý nghĩa
thống kê (p = 0,002, n = 3) về khả năng phát hiện chính xác vị trí khối u khi so sánh
giữa các hạt nano oxid sắt bao và không bao FA sau 4 giờ tiêm. Qua đó cho thấy, các
hạt nano oxid sắt chứa FA hướng đích là hệ nano tiềm năng để phát triển dùng trong
những chẩn đoán phát hiện ung thư buồng trứng ở người [34].

14


CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu
2.1.1. Nguyên vật liệu
Bảng 2.1: Danh mục nguyên liệu, hóa chất sử dụng
STT
1

2

3

4
5
6

Tên nguyên liệu
Dihydroartemisinin

Nguồn gốc

Tiêu chuẩn

Dược phẩm Tuấn Tú

CP2010

(Việt Nam)
DHA chuẩn

Viện kiểm nghiệm
thuốc trung ương

PLGA 50:50, KLPT
7000-17000 Dalton
Polyvinyl alcol 205
(PVA 205)

Acid folic

Evonik (Đức)

Nhà sản xuất

Singapore

Nhà sản xuất

Sigma Aldrich (Mỹ)

Dicloromethan
(DCM)

DĐVN IV

Nhà sản xuất

Trung Quốc

USP38-NF33

7

Acetonitril (ACN)

Merck (Đức)

Tinh khiết HPLC

8

Tween 80

Trung Quốc

USP38-NF33

9

Acid phosphoric

Trung Quốc

USP38-NF33

10

Kalidihydro phosphat

Merck (Đức)

Tinh khiết HPLC

11

DMSO

Trung Quốc

Nhà sản xuất

12

DCC

Merck

Nhà sản xuất

13

DMAP

Merck

Nhà sản xuất

14

Nước tinh khiết

Việt Nam

DĐVN IV

15

Một số nguyên vật liệu

khác

2.1.2. Thiết bị nghiên cứu
- Máy đo thế Zeta và xác định phân bố kích thước tiểu phân Zetasizer NanoZS90
Malvern (Anh).
- Máy khuấy từ WiseStir (Hàn Quốc).
15


- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu (Nhật Bản).
- Máy siêu âm đầu dò Vibra Cell, Sonics & Materials, INC (Mỹ), công suất tối đa 130
W, tần số 20 kHz.
- Máy lọc nước PURELAB classic UV, ELGA (Anh).
- Máy li tâm lạnh Hemrle Labortechnik GmbH (Đức).
- Máy đo pH Eutech instrument pH501.
- Màng thẩm tích 10000 Dalton (chỉ cho các phân tử có khối lượng phân tử nhỏ hơn
10000 Dalton đi qua).
- Ống li tâm chứa màng siêu lọc (MWCO 10000 Dalton, Millipore, Mỹ) chỉ cho các
phân tử có khối lượng phân tử nhỏ hơn 10000 Dalton đi qua).
- Tủ sấy chân không.
- Máy lắc điều nhiệt Shakeer Incubator, LSI-100B (Nhật Bản).
- Máy lắc Vortex mixte (Đức).
- Máy quang phổ IR FT/IR-6000, JASCO (Mỹ).
- Máy quang phổ UV-VIS U-1900, HITACHI (Nhật Bản).
- Cân kĩ thuật, cân phân tích, các dụng cụ thủy tinh khác.
- Một số thiết bị dụng cụ khác.
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Xây dựng công thức bào chế hệ nano DHA-PLGA bao PVA-FA
- Khảo sát phương pháp bào chế.
- Khảo sát ảnh hưởng của các thành phần trong công thức.

2.2.2. Đánh giá đặc tính tiểu phân nano DHA-PLGA bao PVA-FA
- Kích thước tiểu phân.
- Chỉ số PDI, thế Zeta.
- Định lượng dược chất.
- Hiệu suất mang thuốc.
- Khả năng nạp thuốc.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp bào chế tiểu phân nano DHA-PLGA bao PVA-FA
Nguyên tắc: Bào chế hệ tiểu phân nano DHA-PLGA theo phương pháp nhũ hóa
bốc hơi dung môi, sau đó phối hợp phức hợp hóa học của PVA-FA vào hệ tiểu phân

16