Tổng quan về các kỹ thuật phân tích sử dụng trong thiết lập chất chuẩn gốc (primary standard)

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VÕ THỊ TÚ QUYÊN

TỔNG QUAN VỀ CÁC KỸ THUẬT PHÂN
TÍCH SỬ DỤNG TRONG THIẾT LẬP
CHẤT CHUẨN GỐC
(PRIMARY STANDARD)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2018


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VÕ THỊ TÚ QUYÊN
Mã sinh viên: 1301348

TỔNG QUAN VỀ CÁC KỸ THUẬT PHÂN
TÍCH SỬ DỤNG TRONG THIẾT LẬP
CHẤT CHUẨN GỐC
(PRIMARY STANDARD)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
NCS.ThS. Nguyễn Lâm Hồng
Nơi thực hiện:
Bộ môn Hóa phân tích & Độc chất

HÀ NỘI - 2018


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ
thầy cô, gia đình và bạn bè. Đến nay khi khóa luận đã hoàn thành, tôi xin phép được bày
tỏ sự biết ơn sâu sắc và chân thành nhất đến họ.
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và sự kính trọng đến NCS.ThS.
Nguyễn Lâm Hồng - Giảng viên Bộ môn Hóa phân tích & Độc chất, người thầy đã trực
tiếp tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi từ những bước đầu tiên cho đến khi hoàn
thành khóa luận. Tôi cũng xin cảm ơn HVCH. Đào Tú Anh vì đã dành thời gian tra
cứu, hỗ trợ tôi rất nhiều trong quá trình tìm tài liệu.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô trong Bộ môn Hóa phân tích
& Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội đã quan tâm, giúp đỡ tôi trong thời gian vừa
qua.
Nhân đây, tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, toàn thể các thầy cô giáo và
cán bộ nhân viên Trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã luôn tận tình chỉ bảo,
giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại đây.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, bạn bè - những
người đã luôn đồng hành, cổ vũ và động viên tôi trong học tập và trong cuộc sống.

Hà Nội, ngày 18 tháng 05 năm 2018
Sinh viên

Võ Thị Tú Quyên


MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. KHÁI NIỆM VỀ CHẤT CHUẨN GỐC...................................................2
1.1. Khái niệm về chất chuẩn đối chiếu .................................................................... 2
1.2. Phân loại chất chuẩn đối chiếu hóa học:............................................................ 2
1.2.1. Chất chuẩn đối chiếu hóa học gốc (primary chemical reference standards PCRS) ....................................................................................................................2
1.2.2. Chất chuẩn đối chiếu hóa học thứ cấp (secondary chemical reference
standards - SCRS) .................................................................................................3
1.3. Hướng dẫn quy trình thiết lập chất chuẩn gốc ................................................... 4
CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN CÁC KỸ THUẬT XÂY DỰNG BỘ DỮ LIỆU NHẬN
DẠNG CHẤT CHUẨN GỐC .......................................................................................10
2.1. Mô tả vật lý ...................................................................................................... 10
2.1.1. Kiểm tra cảm quan ....................................................................................10
2.1.2. Kính hiển vi quang học .............................................................................10
2.1.3. Xác định điểm chảy ...................................................................................10
2.1.4. Góc quay cực riêng....................................................................................10
2.2. Bộ phổ nhận dạng về cấu trúc.......................................................................... 11
2.2.1. Kỹ thuật quang phổ hồng ngoại (IR) .........................................................11
2.2.2. Kỹ thuật quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) ........................12
2.2.3. Kỹ thuật phổ khối lượng (MS) ..................................................................13
2.2.4. Kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ..........................................15
2.2.5. Phân tích nguyên tố ...................................................................................16
2.2.6. Nhiễu xạ tia X............................................................................................16
CHƯƠNG 3. TỔNG QUAN CÁC KỸ THUẬT XÁC ĐỘ TINH KHIẾT NGUYÊN
LIỆU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN GỐC ....................................................................17
3.1. Nguồn gốc và phân loại tạp chất trong nguyên liệu thiết lập chất chuẩn gốc . 17

3.1.1. Nguồn gốc tạp chất ....................................................................................17
3.1.2. Phân loại tạp chất ......................................................................................17
3.2. Các kỹ thuật xác định tạp chất trong nguyên liệu thiết lập chất chuẩn gốc .... 19
3.2.1. Kỹ thuật xác định gián tiếp: ......................................................................19
3.2.2. Kỹ thuật xác định độ tinh khiết trực tiếp ...................................................37
3.2.3. Kết hợp cả 2 kỹ thuật xác định độ tinh khiết trực tiếp và gián tiếp ..........39
CHƯƠNG 4. TÌNH HÌNH THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN GỐC TRÊN THẾ GIỚI VÀ
Ở VIỆT NAM ................................................................................................................40
4.1. Tình hình thiết lập chất chuẩn gốc trên thế giới .............................................. 40
4.2. Tình hình thiết lập chất chuẩn gốc tại Việt Nam ............................................. 41
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .......................................................................................... 43
1.1. Kết luận ............................................................................................................ 43
1.2. Đề xuất ............................................................................................................. 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Kí hiệu

Tên tiếng Anh

Tên tiếng Việt

AAS

Atomic Absorption Spectrometry

Quang phổ hấp thụ nguyên tử

ACN

Acetonitrile

Acetonitril

APCI

Atmospheric Pressure Chemical

Ion hóa hóa học ở áp suất khí

Ionization

quyển

Association of Southeast Asian

Hiệp hội các quốc gia Đông Nam

Nations

Á

ASEAN

CCĐC

Chất chuẩn đối chiếu

CE

Capillary Electropherosis

Điện di mao quản

CEC

Capillary Electrochromatography

Điện sắc ký mao quản

CIEF

Capillary Isoelectric Focusing

Điện di mao quản hội tụ đẳng điện

CITP

Capillary Isotachophoresis

Điện di mao quản đẳng tốc

CZE

Capillary Zone Electrophoresis

Điện di mao quản vùng

DAD

Diode Array Detector

Detector mảng diod

DMF

N,N-dimethylformamide

N,N-dimethylformamid

DMI

1,3-dimethyl- 2-imidazolidinone

1,3-dimethyl- 2-imidazolidinon

DSC

Differential Scanning Calorimetry

Quét nhiệt vi sai

EDQM

European Directorate for the

Hội đồng Châu Âu về chất lượng

Quality of Medicine -HealthCare

thuốc

EI

Electron Impact

Ion hóa bằng dòng electron

EOF

Electroendosmotic Flow

Dòng điện thẩm

EPRS

European Pharmacopeia Reference

Chất chuẩn đối chiếu Dược điển

Substances

Châu Âu

ESI

Electrospray Ionization

Ion hóa bằng tia điện

FAAS

Flame Atomic Absorption

Nguyên tử hóa bằng ngọn lửa

Spectrometry
GC

Gas Chromatography

Sắc ký khí


GMP

Good Manufacturing Practices

Thực hành tốt sản xuất thuốc

HL

Hàm lượng

HĐDĐ

Hội đồng Dược điển

HPLC

High Performance Liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Chromatography
ICH

International Conference on

Hội nghị quốc tế về hài hòa các

Harmonisation of Technical

yêu cầu kỹ thuật để đăng ký dược

Requirements for Registration of

phẩm sử dụng cho con người

Pharmaceuticals of Human Use
ICP-MS

ICRS

Inductively Coupled Plasma- Mass

Quang phổ plasma cảm ứng kết nối

Spectroscopy

phổ khối lượng

International Chemical Reference

Chất chuẩn đối chiếu quốc tế

Substances
IP

International Pharmacopoeia

Dược điển quốc tế

IR

Infrared Radiation

Quang phổ hồng ngoại

ISO

International Organization for

Tổ chức tiêu chuẩn hóa quốc tế

Standardization
LOD

Limit of Detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of Quantitation

Giới hạn định lượng

MEKC

Micellar Electrokinetic

Sắc ký mixen điện động

Chromatography
MS

Mass Spectroscopy

Phổ khối lượng

NMR

Nuclear Magnetic Resonance

Cộng hưởng từ hật nhân

NP-HPLC Normal Phase-High Performance

PCRS

Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha

Liquid Chromatography

thuận

Primary Chemical Reference

Chất chuẩn đối chiếu hóa học gốc

Standards
PDE

Permitted daily exposure

Liều phơi nhiễm cho phép mỗi
ngày

Ph.Eur
PTN

European Pharmacopoeia

Dược điển Châu Âu
Phòng thí nghiệm

qNMR

Quantitative Nuclear Magnetic

Cộng hưởng từ hạt nhân định

Resonance

lượng

RP-HPLC Reversed Phase-High Performance

Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo

Liquid Chromatography
S
SCRS

Diện tích
Secondary Chemical Reference

Chất chuẩn đối chiếu thứ cấp

Standards
Tiêu chuẩn cơ sở

TCCS
TGA

Thermogravimetric Analysis

Phân tích nhiệt trọng lượng

TLC

Thin Layer Chromatography

Sắc ký lớp mỏng

TOF

Time- of- Flight Analyser

Bộ phân tích thời gian bay

USPRS

United States Pharmacopeia

Chất chuẩn đối chiếu Dược điển

Reference Substances

Mỹ

Ultraviolet - Visible Spectroscopy

Quang phổ hấp thụ tử ngoại khả

UV-VIS

kiến
VKNTTƯ

Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung
Ương

WHO

World Health Organization

Tổ chức y tế thế giới


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 4.1 So sánh kết quả độ tinh khiết thu được thông qua DSC với kết quả độ tinh
khiết thu được thông qua sắc ký và các kỹ thuật phân tích khác ..................................11


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 3.1 Hình ảnh phân tích MEKC của một mẫu muối natri amoxicillin .............PL-2
Hình 4.1 Phổ IR của 1,5 mg Indinavir số kiểm soát 105231 ……………………...PL-3
Hình 4.2 Phổ UV của Indinavir số kiểm soát 105231……………………………...PL-4
Hình 4.3 Sắc ký đồ của Indinavir số 105231 được theo dõi ở bước sóng 220 nm....PL-7


ĐẶT VẤN ĐỀ

Chất chuẩn nói chung và chất chuẩn gốc nói riêng có vai trò rất quan trọng trong
lĩnh vực kiểm tra chất lượng, giám sát chất lượng nguyên liệu làm thuốc và chế phẩm
thuốc của ngành Dược. Ngoài ra nó còn được dùng để đánh giá thử nghiệm thành thạo
cho các kiểm nghiệm viên của các PTN muốn đăng kí tham gia làm PTN thành viên
trong các chương trình hợp tác thiết lập chất chuẩn của Trung tâm hợp tác về CCĐC của
WHO hay Hội đồng Dược điển Mỹ, Ủy ban đối chiếu của ASEAN, Hội đồng Dược điển
Châu Âu [41].
Hiện nay, các chất chuẩn sử dụng cho công tác kiểm nghiệm và nghiên cứu ở Việt
Nam thường được mua từ các nguồn chất chuẩn nước ngoài như Hội đồng Dược điển
Mỹ, Anh, Châu Âu,… (USPRS, BPCRS, EPCRS, ICRS), các hãng hóa chất lớn (Merck,
Sigma Aldrich,…); chất chuẩn quốc gia được thiết lập trong nước tại VKNTTƯ và Viện
Kiểm nghiệm thuốc TP.HCM, chất chuẩn làm việc do các phòng thử nghiệm tự thiết
lập. Nhu cầu sử dụng chất chuẩn trong nước ngày càng lớn, tuy nhiên chất chuẩn được
thiết lập trong nước chủ yếu là chuẩn thứ cấp được nối với chuẩn quốc tế và công tác
thiết lập chất chuẩn gốc trong nghiên cứu và phát triển thuốc mới và chất chuẩn có nguồn
gốc từ dược liệu trong trường hợp không có chuẩn gốc để nối đang còn rất hạn chế. Do
vậy, công tác kiểm tra, giám sát chất lượng thuốc đặc biệt thuốc có nguồn gốc từ dược
liệu đang gặp khó khăn do thiếu chất chuẩn.
Để chủ động hơn trong thiết lập chất chuẩn và trong trường hợp nghiên cứu phát
triển thuốc mới, chưa có chất chuẩn nối, khóa luận “Tổng quan về các kỹ thuật phân
tích sử dụng trong thiết lập chất chuẩn gốc (Primary Standard)” được thực hiện với
mong muốn đem đến một cái nhìn tổng quan về thiết lập chất chuẩn gốc cũng như cung
cấp những hiểu biết cơ bản, khả năng phát triển và ứng dụng của nó trong ngành Dược
tại Việt Nam với ba mục tiêu chính sau:
1. Khái niệm về chất chuẩn gốc và các bước trong quy trình thiết lập chất chuẩn
gốc.
2. Tổng quan các kỹ thuật xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng chất chuẩn gốc.
3. Tổng quan các kỹ thuật xác định độ tinh khiết của chất chuẩn gốc.
1

CHƯƠNG 1. KHÁI NIỆM VỀ CHẤT CHUẨN GỐC
1.1. Khái niệm về chất chuẩn đối chiếu
Nguyên liệu đối chiếu là những nguyên liệu có sự đồng nhất và ổn định về một
hoặc một số tính chất, được thiết lập để phù hợp với một quá trình sử dụng hoặc đo
lường đã định sẵn [12], [43], [45], [59].
Thuật ngữ “chất chuẩn đối chiếu hóa học” hay còn gọi là “chất chuẩn đối chiếu”
hay “chất đối chiếu hóa học” được WHO định nghĩa như sau:
“Chất chuẩn đối chiếu hóa học là nguyên liệu đồng nhất, xác thực, được sử dụng
trong các phép thử vật lí, hóa học mà ở đó các tính chất của nó được so sánh với các tính
chất của chất cần thử, với độ tinh khiết phù hợp với mục đích sử dụng” [5], [83].
Trong lĩnh vực kiểm tra chất lượng của ngành Dược, các phương pháp phân tích
trong các Dược điển hiện hành có thể yêu cầu CCĐC trong các phép thử sau [14], [69],
[73], [80], [85]: Đo phổ IR để định tính, đo phổ UV để định lượng, định lượng bằng các
phương pháp so sánh màu, các phương pháp sắc ký để định tính và định lượng, các kỹ
thuật tách để định lượng, các phương pháp định lượng vi sinh, các thử nghiệm hóa học
- miễn dịch, hiệu chuẩn thiết bị.
1.2. Phân loại chất chuẩn đối chiếu hóa học:
1.2.1. Chất chuẩn đối chiếu hóa học gốc (primary chemical reference standards PCRS)
Khái niệm: “Chất chuẩn đối chiếu hóa học gốc là chất được công nhận rộng rãi,
có các chỉ tiêu chất lượng phù hợp với tài liệu công bố, cụ thể và giá trị ấn định của nó
được sử dụng làm tiêu chuẩn phân tích mà không cần phải so sánh với chất hóa học
khác” [83], [85].
Theo ICH Guideline Q7 định nghĩa: Chất chuẩn gốc là một chất được đưa ra bởi
một loạt các phân tích để trở thành nguyên liệu đáng tin cậy có độ tinh khiết cao. Chất
chuẩn này có thể:
•

Thu được từ nguồn được công nhận chính thức;

•

Được bào chế bằng tổng hợp độc lập (independent synthesis);
2


–

•

Thu được từ nguyên liệu sản xuất có độ tinh khiết cao;

•

Được bào chế bằng cách tinh chế tiếp các nguyên liệu sản xuất có sẵn [37].

Các chuẩn gốc - PCRS chính thức:
Các chất chuẩn gốc chính thức có thể tìm được từ các nguồn sau: Trung tâm hợp

tác về chất chuẩn đối chiếu của WHO, Hội đồng Dược điển Châu Âu, các phòng thí
nghiệm trực thuộc của Hội đồng Dược điển Anh và Mỹ [21], [67], [81].
Chất chuẩn quốc tế (ICRS) là một chất chuẩn gốc được thiết lập tại Trung tâm
hợp tác về các chất chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) về tiêu chuẩn chất lượng
của các chế phẩm dược dụng. Các tổ chức tham gia hợp tác đánh giá ICRS do WHO chỉ
định. ICRS được sử dụng chủ yếu trong các phép thử vật lý, hóa học, định lượng của
các chuyên luận dược phẩm được công bố trong IP [40], [85].
Chuẩn theo Dược điển Châu Âu (EPRS): Được thiết lập và cung cấp bởi Ban thư
ký Kỹ thuật thuộc Hội đồng Dược điển Châu Âu [26].
Chuẩn theo Dược điển Mỹ (USPRS): Được thiết lập và phân phối bởi Hội đồng

chất đối chiếu Dược điển Mỹ [80].
–

Các chuẩn gốc-PCRS tiêu chuẩn nhà sản xuất: Trong trường hợp chưa có chất
chuẩn gốc chính thức, nhà sản xuất có thể được xây dựng chất chuẩn gốc của cơ sở
(in-house primary reference standard) bao gồm số lô và đầy đủ đặc tính của chất
chuẩn gốc.

1.2.2. Chất chuẩn đối chiếu hóa học thứ cấp (secondary chemical reference
standards - SCRS)
Khái niệm: Chất chuẩn thứ cấp là một chất chuẩn đối chiếu hóa học mà các tính
chất hay chỉ tiêu chất lượng của nó được xác định bằng cách so sánh với một chất chuẩn
gốc. Chuẩn thứ cấp được dùng làm chất chuẩn đối chiếu cho các phân tích thường ngày
của phòng thí nghiệm [37], [83], [85].
Phân loại chất chuẩn thứ cấp:
–

Chuẩn thứ cấp - SCRS “chính thức” là một chuẩn thứ cấp khu vực hay quốc gia.
•

Chuẩn thứ cấp - SRCS ASEAN: do các PTN của các HĐDĐ, viện kiểm nghiệm
quốc gia thiết lập, trong quá trình thiết lập chuẩn có sử dụng chuẩn gốc PCRS để
3


so sánh. Quá trình thiết lập, phân phối chất chuẩn Dược điển do các HĐDĐ thực
hiện và tuân theo các hướng dẫn của ISO guide 35 – 2017 [44].
•

Chuẩn quốc gia - VNRS: Được thiết lập tại Viện Kiểm Nghiệm thuốc Trung ương

- Bộ Y tế hoặc Viện Kiểm Nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh - Bộ Y tế;
được đánh giá bởi ít nhất hai khoa thử nghiệm là khoa Thiết lập chất chuẩn &
chất đối chiếu và một khoa thử nghiệm khác trong Viện; được liên kết với chất
chuẩn gốc.

–

Chuẩn làm việc (Working standard): Là một chuẩn thứ cấp do một nhà sản xuất hoặc
một PTN tự thiết lập [66].

1.3. Hướng dẫn quy trình thiết lập chất chuẩn gốc
Chất chuẩn gốc được công nhận rộng rãi do đó quy trình thiết lập chất chuẩn gốc
phải được ban hành bởi các tổ chức có thẩm quyền và tuân thủ nghiêm ngặt.
Quy trình thiết lập chất chuẩn gốc gồm 6 bước như sau [20], [83]:
 Bước 1: Đánh giá nhu cầu thiết lập chất chuẩn gốc
Sản xuất, xác nhận, duy trì và phân phối các chất chuẩn gốc là việc tốn nhiều chi
phí và thời gian, do đó vấn đề đầu tiên cần được đánh giá là liệu có một quy trình nào
đó có thể thay thế bởi một quy trình khác thỏa mãn yêu cầu tương đương mà không cần
phải dùng đến chất chuẩn gốc hay không.
 Bước 2: Thu thập nguyên liệu nguồn
Nguyên liệu nguồn có chất lượng đạt yêu cầu có thể được lựa chọn từ lô nguyên
liệu sản xuất có chất lượng tốt nhất và được cung cấp bởi các nhà sản xuất dược phẩm.
Các kỹ thuật tinh chế là cần thiết để nguyên liệu được chấp nhận sử dụng như một chất
chuẩn gốc.
Các yêu cầu về độ tinh khiết cho một chất chuẩn gốc phụ thuộc vào mục đích sử
dụng:
•

Một chất chuẩn gốc đề xuất cho một phép thử định tính không đòi hỏi sự tinh
khiết quá cao, bởi sự hiện diện của một tỷ lệ nhỏ tạp chất thường không ảnh

hưởng đáng chý ý đến phép thử.

•

Các chất chuẩn gốc được sử dụng trong các phép định lượng nên có độ tinh khiết
cao. Theo nguyên tắc cơ bản hướng dẫn, độ tinh khiết 99,5% trở lên là cần thiết,
4


tính trên nguyên liệu dạng khan hoặc không chứa các chất dễ bay hơi.
Khi nguyên liệu nguồn sử dụng làm chất chuẩn gốc được lấy từ nhà cung cấp, cần
cung cấp các tài liệu sau:
•

Chứng chỉ phân tích với đầy đủ thông tin về các phương pháp thử, giá trị được
tìm thấy và số lượng bản sao được sử dụng (nếu có), và quang phổ và/hoặc sắc
ký đồ thích hợp;

•

Kết quả của bất kỳ nghiên cứu độ ổn định nào;

•

Thông tin về điều kiện bảo quản tối ưu cần thiết để đảm bảo độ ổn định (cân nhắc
về nhiệt độ và độ ẩm);

•

Kết quả của bất kỳ nghiên cứu về tính hút ẩm và/hoặc công bố về tính hút ẩm của

nguyên liệu nguồn;

•

Sự xác định của các tạp chất được phát hiện và/hoặc thông tin cụ thể về hệ số đáp
ứng liên quan được xác định bằng những phương pháp rút gọn liên quan đến
thành phần chính, và/hoặc phần trăm khối lượng tạp chất;

•

Bảng dữ liệu an toàn nguyên liệu cập nhật.

 Bước 3: Đánh giá nguyên liệu thiết lập chất chuẩn gốc
Cơ quan ban hành cần phải xem xét tất cả các dữ liệu thu được từ những kiểm tra
nguyên liệu thiết lập chuẩn bằng nhiều phương pháp phân tích khác nhau. Mức độ và
phạm vi phân tích được yêu cầu phụ thuộc vào mục đích sử dụng chất chuẩn gốc.
i.

Sử dụng trong phép thử định tính
Để sử dụng cho phép thử định tính, một lô nguyên liệu có chất lượng tốt (đạt yêu

cầu về độ tinh khiết) được lựa chọn từ một quy trình sản xuất. Điều quan trọng nhất là
kiểm tra được năng lực của nguyên liệu thông qua việc thử nghiệm trên các phép thử dự
định. Thông thường chỉ cần kết quả đánh giá từ một phòng thí nghiệm đủ tiêu chuẩn
[83].
ii.

Sử dụng trong các phép thử tinh khiết
Yêu cầu về độ tinh khiết của chất chuẩn gốc sử dụng với mục đích thử độ tinh

khiết sẽ cao hơn so với mục đích định tính. Nếu sử dụng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng
(TLC), độ tinh khiết tối thiểu có thể là 90%, tuy nhiên đối với kỹ thuật sắc ký lỏng (LC)
hoặc sắc ký khí (GC) thì ít nhất là 95%. Thông thường chỉ cần một phòng thí nghiệm
5


tham gia đánh giá chất chuẩn gốc dùng cho phép thử tinh khiết. Nếu chất chuẩn gốc
được phân lập lần đầu tiên, phải áp dụng các phép thử hóa học và vật lý thích hợp như
cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), phổ khối lượng (MS) và phân tích nguyên tố để mô tả
đặc tính cấu trúc [85].
iii.

Sử dụng trong các phép định lượng
Nếu chất chuẩn gốc được sử dụng trong một phép định lượng, mức độ và phạm

vi kiểm tra sẽ rộng và nghiêm ngặt hơn. Tối thiểu ba phòng thí nghiệm cần hợp tác để
đánh giá chất đề xuất, sử dụng nhiều kỹ thuật được thiết lập và thẩm định bao gồm cả
phương pháp được quy định trong Dược điển. Khi áp dụng phương pháp không đặc hiệu
như đo quang phổ UV hay so màu, cần phải kiểm tra đáp ứng tương đối giữa hoạt chất
và tạp chất có mặt. Khi sử dụng một phương pháp chọn lọc điều quan trọng là xác định
chính xác số lượng tạp chất. Trong trường hợp này, tốt nhất nên kiểm tra chất chuẩn đề
xuất bằng nhiều phương pháp nhất có thể, bao gồm phương pháp tuyệt đối [83], [85].
iv.

Sử dụng trong hiệu chuẩn dụng cụ, thiết bị
Mức độ kiểm tra tương tự như đối với chất chuẩn sử dụng trong các phép định

lượng. Một số phòng thí nghiệm cần hợp tác để đánh giá chất chuẩn được đề xuất bằng
cách sử dụng nhiều kỹ thuật phân tích để xác nhận độ tinh khiết của chất chuẩn đề xuất
là phù hợp.

 Bước 4: Các phương pháp hóa học và vật lý được sử dụng để đánh giá chất chuẩn
gốc
Các phương pháp lựa chọn được chia thành hai nhóm lớn:
 Nhóm các phương pháp nhận dạng:
•

Các mô tả vật lý: Cảm quan, kính hiển vi quang học, nhiệt độ nóng chảy, góc
quay cực riêng.

•

Bộ phổ: Nếu chất chuẩn gốc được đề xuất có cấu trúc đã được xác định rõ ràng
thì có thể nhận dạng thông qua bộ dữ liệu phổ IR, NMR, MS, UV bằng cách so
sánh. Nếu chất chuẩn được đề xuất là chất có cấu trúc mới hoặc thiếu dữ kiện mô
tả về tính chất thì ngoài việc sử dụng bộ phổ (IR, NMR, MS, UV) thì cần phải sử
dụng thêm các kỹ thuật phân tích hiện đại dùng để mô tả các hợp chất mới như
phân tích nguyên tố, nghiên cứu tinh thể học, phân tích nhóm chức,… để mô tả
6


đầy đủ đặc tính của chất chuẩn được đề xuất [85].
 Nhóm các kỹ thuật xác định độ tinh khiết:
•

Xác định tạp chất liên quan bằng các kỹ thuật: HPLC/DAD, LC/MS, CE.

•

Xác định tạp chất vô cơ bằng phương pháp: tro toàn phần, tro sulfat, AAS, ICPMS.
Xác định lượng nước và các chất dễ bay hơi bằng mất khối lượng do làm khô,

•

phân tích nhiệt trọng lượng TGA; ngoài ra lượng nước có thể được xác định bằng
kỹ thuật chuẩn độ Karl Fischer, lượng dung môi dễ bay hơi xác định bằng GC
[80].
Xác định độ tinh khiết trực tiếp bằng các kỹ thuật: qNMR, DSC.

•

Theo hướng dẫn của USP một số phương pháp phân tích thường được sử dụng [79]:
-

Cảm quan;

-

Kiểm tra nhận dạng (NMR, IR, UV,…);

-

Kiểm tra độ tinh khiết gián tiếp (khoảng nóng chảy, góc quay cực riêng,…);

-

Kiểm tra độ tinh khiết trực tiếp (Độ tinh khiết sắc ký, xác định tạp chất vô cơ,
xác định tạp chất bay hơi gồm nước và dung môi bay hơi);

-

Phân tích nhóm chức (chuẩn độ, UV/VIS, phân tích nguyên tố,…);

-

Định lượng dựa vào lô chất chuẩn đặc tính tốt khác trước đó.

 Bước 5: Xác định giá trị ấn định
Giá trị ấn định được xác định dựa trên kết quả đánh giá liên phòng trong đó các
PTN sử dụng phương pháp phân tích khác nhau. Thông thường các giá trị này được tập
hợp từ ít nhất 3 PTN độc lập tham gia thiết lập chuẩn gốc. Giá trị thực nghiệm thu được
này đại diện tốt nhất cho ước tính giá trị thực [83].
Khi tất cả các phép thử độ tinh khiết đã được hoàn thành và các phương pháp đã
được thẩm định đầy đủ, độ tinh khiết của chất chuẩn gốc được tính theo công thức sau:
Độ tinh khiết = 100% – % tạp chất hữu cơ - % tạp chất vô cơ - %
nước - % dung môi tồn dư [79], [85].
Hay:

Độ tinh khiết = [100% - (nước + dung môi tồn dư + tạp chất vô cơ)
× độ tinh khiết sắc ký/điện di] (%) [75].

Giá trị ấn định được xác lập bằng cách so sánh kết quả phân tích giữa các PTN
thông qua việc sử dụng phương pháp kiểm định thống kê ANOVA [7], [42].
7


 Bước 6: Xử lý và phân phối các CCĐC
Sự nguyên vẹn (về mặt đặc tính) phải được đảm bảo và duy trì trong suốt thời
gian sử dụng.
Hoạt động đóng gói: Phải tuân thủ các yêu cầu GMP. Lọ chứa chất chuẩn gốc
phải tránh độ ẩm, ánh sáng, oxy và phải được kiểm tra tính thấm ẩm. Các chất đắt tiền

hoặc chỉ có sẵn với lượng rất nhỏ có thể được pha thành dung dịch sau đó đông khô
hoặc bay hơi. Một số chất chuẩn gốc phải được đóng gói trong khí trơ hoặc trong điều
kiện độ ẩm được kiểm soát.
Bảo quản: Thông tin về các điều kiện bảo quản thường có thể lấy từ nhà sản xuất
nguyên liệu thiết lập chất chuẩn gốc và nên được yêu cầu thường xuyên khi một chất
chuẩn mới được thiết lập. Lưu trữ ở nhiệt độ khoảng 2℃ - 8℃ với các biện pháp chống
hấp thụ độ ẩm thích hợp đã được chứng minh phù hợp cho hầu hết các chất chuẩn [83].
Độ ổn định: Độ ổn định của các chất chuẩn gốc nên được theo dõi bằng cách kiểm
tra lại thường xuyên và nên được thay thế ngay khi xuất hiện một sự thay đổi đáng kể
một đặc tính. Việc lựa chọn phương pháp phân tích thích hợp để theo dõi sự ổn định phụ
thuộc vào tính chất và mục đích sử dụng của chất chuẩn.
Thông tin được cung cấp với các chất chuẩn gốc: Trên nhãn của chất chuẩn gốc
cần cung cấp các thông tin sau [41], [83]:
•

Tên thích hợp: tên quốc tế (International Nonproprietary Name – INN);

•

Tên của cơ quan ban hành;

•

Số lượng của nguyên liệu trong bao bì;

•

Số lô hoặc số đăng ký.
Phân phối và cung cấp: việc phân phối trong cùng một quốc gia thường không

gây ra vấn đề tuy nhiên khi các mẫu được gửi đi các nước khác, cả bên gửi và bên nhận
đều có thể gặp khó khăn do sự khác nhau về quy định bưu chính, hải quan. Vì vậy cần
phải tìm cách giải quyết các rào cản đối với phân phối chất chuẩn gốc.
Thời hạn sử dụng: Các chất chuẩn gốc không có “hạn sử dụng” theo nghĩa thông
thường. Để tránh việc loại bỏ lãng phí các chất đạt yêu cầu, cơ quan ban hành có thể sử
dụng cơ chế kiểm soát chung của mẻ chất chuẩn gốc. Nếu đặc biệt cần thiết phải xác
8


định ngày hết hạn hoặc ngày kiểm tra lại, cần ghi lại trên nhãn và/hoặc trong một số tài
liệu kèm theo chất chuẩn gốc và phải lưu lại hồ sơ [83].

9


CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN CÁC KỸ THUẬT XÂY DỰNG BỘ DỮ LIỆU
NHẬN DẠNG CHẤT CHUẨN GỐC
2.1. Mô tả vật lý
2.1.1. Kiểm tra cảm quan
Các đặc điểm nhìn thấy được như màu sắc, kết cấu (texture), hình thái học
(morphology) cũng như sự nhiễm bẩn nhìn thấy được. Các chất hầu như sẽ thay đổi màu
sắc hoặc kết cấu khi tiếp xúc với các tác nhân như ánh sáng hoặc độ ẩm. Do đó, kiểm
tra cảm quan là một biện pháp quan trọng để kiểm tra các chất chuẩn [66].
2.1.2. Kính hiển vi quang học
Kính hiển vi quang học liên quan đến việc kiểm tra nguyên liệu thiết lập chuẩn
và xác định sự kết tinh dưới kính hiển vi. Một đánh giá ban đầu về hình thái chất chuẩn,
tính đồng nhất, một khía cạnh định tính của khúc xạ ánh sáng bằng tinh thể có thể dễ
dàng quan sát bằng kỹ thuật này. Các hạt tinh thể sẽ xuất hiện sự thay đổi từ sáng đến
tối (hoặc thay đổi màu sắc), dạng vô định hình sẽ không thay đổi khi xoay bàn soi của
kính hiển vi phân cực [71].

2.1.3. Xác định điểm chảy
Điểm chảy của một chất là nhiệt độ đã hiệu chỉnh, tại đó hạt chất rắn cuối cùng
của chất thử nghiệm chuyển thành trạng thái lỏng, bắt đầu biến màu, hóa than hoặc sủi
bọt. Để xác định điểm chảy, tùy theo tính chất lý học của từng chất mà áp dụng phương
pháp xác định điểm chảy phù hợp [5]. Điểm chảy là một hằng số vật lý biểu thị sự nhận
dạng và độ tinh khiết của nguyên liệu [14], [85].
2.1.4. Góc quay cực riêng
Theo Dược điển Việt Nam V- PL 6.4: Góc quay cực là góc của mặt phẳng phân
cực khi bị quay đi khi ánh sáng phân cực đi qua chất đó nếu là chất lỏng hoặc qua dung
dịch chất đó nếu là chất rắn. Nếu không có hướng dẫn riêng, góc quay cực α được xác
định ở nhiệt độ 20℃ và với chùm tia đơn sắc có bước sóng ứng với vạch D (589,3 nm)
của đèn natri qua lớp chất lỏng hay dung dịch có bề dày 1 dm. Góc quay cực riêng [α]20
𝐷
của một chất lỏng là góc quay cực đo được khi chùm ánh sáng D truyền qua lớp chất
lỏng ddó có bề dày là 1 dm ở 20℃ chia cho tỷ trọng tương đối của chất ở cùng nhiệt độ.
10


Góc quay cực riêng [α]20
của một chất rắn là góc quay cực đo được khi chùm ánh sáng
𝐷
D truyền qua lớp dung dịch có bề dày 1 dm và có nồng độ là 1 g/ml, ở 20℃ (góc quay
cực riêng của chất rắn luôn được biểu thị cùng với dung môi và nồng độ dung dịch đo)
[5], [14]. Góc quay cực riêng được sử dụng để xác nhận chất chuẩn [14], [66].
2.2. Bộ phổ nhận dạng về cấu trúc
2.2.1. Kỹ thuật quang phổ hồng ngoại (IR)
2.2.1.1. Nguyên tắc
Phổ hồng ngoại là một kỹ thuật dựa vào sự dao động và quay của các nguyên tử
trong phân tử khi cho tia bức xạ IR đi qua mẫu phân tích và xác định phần tia tới bị hấp
thụ với những năng lượng nhất định trong vùng bức xạ có số sóng 4000 - 670 cm-1.

Vùng này cung cấp những thông tin quan trọng về các dao động của các liên kết trong
các loại nhóm chức do đó là các thông tin về cấu trúc của các phân tử [85]. Vì mỗi mức
năng lượng tại đỉnh bất kỳ trong phổ hấp thụ IR xuất hiện tương ứng tần số dao động
của một phần trong phân tử chất phân tích. Vì mỗi dạng liên kết có tần số dao động khác
nhau và hai dạng liên kết như nhau trong hai hợp chất khác nhau ở trong môi trường
khác nhau, nên hai phân tử có cấu trúc khác nhau sẽ không thể có phổ IR giống nhau
[6].
Để có thông tin cấu trúc chính xác từ phổ IR, cần tìm hiểu các tần số mà tại đó
các nhóm chức khác nhau hấp thụ. Có thể sử dụng bảng tương quan IR (cung cấp các
thông tin về hấp thụ của các nhóm chức khác nhau) [6].
2.2.1.2. Ưu nhược điểm
Ưu điểm: Phổ IR là đặc trưng cho các nhóm chức có trong hợp chất hữu cơ (trừ
trường hợp đồng phân quang học) [6], [85] và phổ IR thường không bị ảnh hưởng nhiều
bởi sự có mặt của một lượng nhỏ tạp chất (lên đến vài phần trăm) trong chất thử [85].
Nhược điểm: Ứng dụng về định tính của phổ IR trong trường hợp đồng phân
quang học bị hạn chế [6], [85].
2.2.1.3. Ứng dụng
Phổ IR được sử dụng chủ yếu như một phép xác định cấu trúc và nhận dạng chất
phân tích thông qua các đỉnh đặc trưng cho các nhóm chức đặc biệt trong phân tử hợp
11


chất [3], [85]. Bằng cách so sánh phổ IR của hai hợp chất ta có thể xác định chúng có
giống nhau hay không [6]. Phổ IR là kỹ thuật nhận dạng được sử dụng phổ biến nhất
cho các chất chuẩn gốc [66], [85]. Có thể nhận dạng chất chuẩn gốc bằng cách so sánh
với dữ liệu phổ đã công bố trong nghiên cứu trước đây [14], [26].
Trong các Dược điển, phổ IR thường được sử dụng để xác định cấu trúc các
nguyên liệu thuốc như: Trong IP (Allopurinol, Artemisinin, Atenolol, Atropin sulfat,
Betamethason, Caffein, Cloramphenicol,… yêu cầu phổ phải phù hợp với phổ chuẩn)
[85], trong USP (Abacavir, Acetaminophen, Amikacin, Amitriptylin hydrochlorid,

Benzocain,… yêu cầu phải phù hợp với phổ chuẩn) [80], trong Dược điển Việt Nam V
(Albendazol, Allopurinol, Ampicilin, Haloperidol,… yêu cầu phải phù hợp với phổ IR
chuẩn đối chiếu) [5].
2.2.2. Kỹ thuật quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến (UV-VIS)
2.2.2.1. Nguyên tắc:
Phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) là một trong các
phương pháp phân tích dựa trên sự hấp thụ bức xạ điện từ từ 200 - 800 nm [5]. Thông
thường phổ tử ngoại được đo trong dung môi, với nồng độ xấp xỉ 10-4 mol/l [8]. Có thể
định tính một số chất bằng cách so sánh vị trí các cực đại và cực tiểu hấp thụ và tỷ lệ
mật độ quang giữa các bước sóng đó phải nằm trong một giới hạn cho phép; quang phổ
đạo hàm; chồng phổ [3], [66], [85].
2.2.2.2. Ưu nhược điểm
Nhược điểm: Chỉ một số dạng cấu trúc trong các hợp chất hữu cơ mới có sự hấp
thụ như vậy nên trên thực tế việc ứng dụng phổ UV bị giới hạn trong một số hợp chất
nhất định, chủ yếu là các hợp chất có cấu trúc nối đôi liên hợp [4]; không áp dụng được
khi hợp chất chưa biết rõ cấu trúc, khi hợp chất hấp thụ kém/không hấp thụ UV. Tại
vùng bước sóng dưới 200 nm xảy ra sự hấp thụ UV không chọn lọc [65].
2.2.2.3. Ứng dụng
Phổ UV-VIS là một kỹ thuật cung cấp thêm thông tin để nhận dạng chất phân tích
[80]. Bên cạnh đó phổ UV-VIS có thể định tính một số chất bằng cách so sánh vị trí các

12


cực đại và cực tiểu hấp thụ và tỷ lệ mật độ quang giữa các bước sóng đó phải nằm trong
một giới hạn cho phép [3], [66], [85].
Trong các Dược điển đã áp dung quang phổ UV-VIS để định tính được các hợp
chất: USP (Albuterol, Atenolol, Budesonid, …) [80], IP (Aciclovir, Stavudin,
Zidovudin,…) [85].
2.2.3. Kỹ thuật phổ khối lượng (MS)

2.2.3.1. Nguyên tắc
Chất phân tích được chuyển sang thể khí và ion hóa, tạo thành các ion dương hoặc
âm. Phương pháp phổ khối dựa trên việc đo trực tiếp tỷ số m/z, là tỷ số giữa khối lượng
m và điện tích z của ion chất phân tích. Tỷ số này được trình bày dưới dạng đơn vị khối
lượng nguyên tử (1 a.m.u = 1/12 khối lượng của

12

C) hay Dalton (1Da = khối lượng

nguyên tử hydro) [3], [5], [14], [26].
Trong máy phổ khối, các ion được tạo thành trong nguồn ion, được gia tốc rồi
được tách trong bộ phận phân tích trước khi đến detector. Tất cả các quá trình trên được
thực hiện trong một buồng hút chân không đến khoảng 10-3 đến 10-6 Pa. Phổ thu được
biểu diễn cường độ tương đối của các ion khác nhau phụ thuộc vào tỷ số m/z của các
ion đó [3]. Tín hiệu tương ứng với một ion là một nhóm các pic tương ứng với phân bố
thống kê của các đồng vị khác nhau của ion đó. Đó là hình ảnh đồng vị ion và trong đó
pic của đồng vị có cường độ lớn nhất của một nguyên tử được gọi là pic đơn đồng vị.
Trong phổ MS của các hợp chất hữu cơ, không thể phân loại các phân tử hữu cơ
khác nhau như hydrocarbon, alcohol, ester,… nhưng cần phải chú ý đến phân tử nguyên
vẹn được ion hóa trước khi phân mảnh mà không phải là nhóm chức đặc trưng bị tách
ra khỏi phần còn lại của phân tử [6].
2.2.3.2. Ưu điểm của kỹ thuật MS
Ưu điểm:
•

Với lượng mẫu nhỏ nhất có thể xác định được khối lượng tương đối của phân tử
và thậm chí thành phần các nguyên tố của một hợp chất.

•

Qua việc phân mảnh trong khối phổ có thể suy ra thông tin về cấu trúc hoặc thông
tin về xác định khối lượng phân tử [3], [5], [6], [8].
13


•

Có thể dùng MS để xác định thành phần đồng vị của các nguyển tố trong mẫu [3]

•

Kỹ thuật bắn phá nhanh bằng nguyên tử (FAB) rất đơn giản, đặc hiệu và độ nhạy
cho phép phân tích trong khoảng picogram, thích hợp để ion hóa các chất phân
cực và dễ phân hủy nhiệt [3], [65].

•

Kỹ thuật ion hóa bằng tia điện (ESI) thích hợp để ion hóa các chất phân cực (khác
với kỹ thuật EI). Kỹ thuật ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI) thích hợp
để kết nối HPLC/MS [22]. Hai kỹ thuật này cho phép phát hiện các hợp chất hữu
cơ ở mức pictogram [2], [65].

•

Chế độ SIM (Single-ion monitoring, chọn tín hiệu của một ion) hoặc chế độ MIM
(multiple-ion monitoring, chọn tín hiệu của một số ion đặc trưng của chất phân
tích) cho độ nhạy cao hơn, phát hiện hợp chất khi nồng độ dưới ngưỡng pictogram
[3], [65].

•

Để phân tích trực tiếp các hỗn hợp sinh học phức tạp, kết hợp 2 kỹ thuật sắc ký
lỏng và phổ khối lượng cho thấy hiệu quả. Ion hóa bằng giải hấp lazer (MALDI)
kết hợp với bộ phân tích thời gian bay (TOF) đã chứng tỏ là một công cụ mạnh
và nhạy. Kỹ thuật này có khả năng phân tích hỗn hợp của peptid và protein trong
một khoảng nồng độ rộng từ picomol (10-12 mol) đến attomol (10-18 mol), đây là
một lợi thế của kỹ thuật này với ứng dụng rộng trong hóa hữu cơ, nghiên cứu dược
phẩm và công nghệ sinh học.

Nhược điểm: Phổ MS không phân biệt được các đồng phân. Trong ion hóa bằng
dòng electron (EI), độ nhạy cỡ nanogram [65]; kỹ thuật EI thường tạo ra nhiều mảnh
nhỏ, ít hoặc thậm chí không có ion phân tử cho nên đôi khi khó biện giải phổ. Trong
trường hợp đó người ta dùng kĩ thuật ion hóa “mềm” hơn. Mặt khác, kỹ thuật này
đòi hỏi phải hóa hơi mẫu nên ít thích hợp với các chất phân cực hoặc dễ bị nhiệt phân
hủy [3].
2.2.3.3. Ứng dụng
Phổ khối lượng là công cụ hiệu quả để định tính và định lượng các hợp chất hữu
cơ như protein, peptid, các hoạt chất, các sản phẩm chuyển hóa, tạp chất hay các sản
phẩm phân hủy khác [80].

14


2.2.4. Kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
2.2.4.1. Nguyên tắc
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) là một kỹ thuật nghiên cứu cấu trúc phân tử
bằng sự tương tác của bức xạ điện từ tần số radio với tập hợp hạt nhân được đặt trong
từ trường mạnh. Các hạt nhân này là một phần của nguyên tử và các nguyên tử lại được
tập hợp lại thành phân tử và do đó phổ có thể cung cấp thông tin chi tiết về cấu trúc phân

tử. Có nhiều hạt nhân có thể dùng để nghiên cứu bằng kỹ thuật NMR nhưng hydro và
carbon là chung nhất. Phổ NMR cung cấp thông tin về số lượng nguyên tử khác biệt về
mặt từ tính có mặt trong phân tử nghiên cứu [6].
2.2.4.2. Ưu nhược điểm
Ưu điểm: Phổ NMR cung cấp thông tin về cấu trúc phân tử rất chi tiết do đó nó
có tính đặc hiệu cao [6], [27]. Tính hữu ích của phân tích NMR phát sinh từ quan sát
thấy rằng cùng một loại hạt nhân, khi nằm trong các môi trường phân tử khác nhau thì
có tần suất cộng hưởng khác nhau. Phổ NMR là một kỹ thuật mạnh để xác định cấu trúc
vì tính đặc hiệu của nó trong việc phát hiện một số hạt nhân nhất định như 1H, 13C, 31P
và 19F. Cơ sở xác định là so sánh các tín hiệu từ mẫu thử với các tín hiệu dự kiến từ một
tiêu chuẩn tham chiếu đủ tiêu chuẩn. Các cấu trúc tương đối đơn giản có thể được xác
định bằng cách sử dụng các thay đổi hóa học, mô hình ghép nối và cường độ thu được
từ Phổ 1H và 13C một chiều. Đối với các cấu trúc phức tạp hơn, các nhà phổ học có thể
phải có được phổ hai chiều từ các thí nghiệm đã được phát triển để xác định kết nối đồng
nhất hoặc kết nối hạch nhân [80].
Nhược điểm: Kỹ thuật NMR có độ nhạy tương đối thấp do sự khác biệt nhỏ về
năng lượng giữa các trạng thái liên kết dẫn đến kết quả là sự khác biệt số lượng hạt nhân
giữa 2 mức của chỉ có một phần triệu. Ngoài ra, tuổi thọ dài của hầu hết các hạt nhân
trong trạng thái kích thích ảnh hưởng đến thiết kế của kiểm tra phân tích NMR đặc biệt
trong các thí nghiệm xung có tính lặp lại.
2.2.4.3. Ứng dụng
Phổ NMR là một kỹ thuật hiệu quả trong xác định cấu trúc hóa học của các phân
tử hữu cơ bằng cách giải phổ. Để xác định cấu trúc thường đo phổ 1D NMR là đủ còn
trong các trường hợp phức tạp cần sử dụng thêm phổ 2D. Phổ NMR có thể được sử dụng
15