Xây dựng phương pháp định tính, định lượng nguyên liệu tạp chất a của terazosin

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

-----  -----

NGUYỄN THANH XUÂN

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP
ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG NGUYÊN LIỆU
TẠP CHẤT A CỦA TERAZOSIN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2018


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

-----  -----

NGUYỄN THANH XUÂN
Mã sinh viên: 1301484

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP
ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG NGUYÊN LIỆU
TẠP CHẤT A CỦA TERAZOSIN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Người hướng dẫn:
NCS. Th.S Đỗ Thị Thanh Thủy
Nơi thực hiện:
Bộ môn Hóa Dƣợc

Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng

HÀ NỘI - 2018


LỜI CẢM ƠN
Trƣớc khi trình bày nội dung đề tài của mình, tôi xin chân thành gửi lời
cảm ơn đến những ngƣời trong thời gian qua đã luôn bên cạnh hỗ trợ, động viên
để tôi có thể hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này.
Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới NCS.
ThS. Đỗ Thị Thanh Thủy - giảng viên Bộ môn Hóa Dƣợc, trƣờng Đại học
Dƣợc Hà Nội, ngƣời thầy trực tiếp hƣớng dẫn và chỉ bảo tôi từ những ngày đầu
làm nghiên cứu khoa học cho đến khi hoàn thành khóa luận này. Những điều
học đƣợc từ cô là những kinh nghiệm quý báu giúp tôi bƣớc tiếp trên những
chặng đƣờng khó khăn phía trƣớc.
Tôi xin cảm ơn Ban giám hiệu nhà trƣờng, phòng Đào tạo cùng các thầy
cô giảng viên, kỹ thuật viên Bộ môn Hóa Dƣợc và các cán bộ Khoa Thiết lập
chất chuẩn & chất đối chiếu của Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng đã hết
lòng tạo điều kiện cho tôi thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, ngƣời thân, bạn bè
và các anh, chị, em trong nhóm nghiên cứu Kiểm nghiệm tại Bộ môn Hóa Dƣợc
đã luôn giúp đỡ, chia sẻ khó khăn và khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và
nghiên cứu. Tôi sẽ không thể hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này nếu không có
sự giúp đỡ của tất cả mọi ngƣời.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 12 tháng 5 năm 2018
Sinh viên

Nguyễn Thanh Xuân

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................
MỤC LỤC ..........................................................................................................
DANH MỤC CÁC CHỮ, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT .................................
DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................................
DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................... 2
1.1. Terazosin ..................................................................................................... 2
1.1.1. Một số thông tin chung về terazosin ..................................................... 2
1.1.2. Tác dụng và chỉ định của terazosin....................................................... 2
1.1.3. Một số chế phẩm chứa terazosin trên thị trƣờng .................................. 3
1.2. Tạp chất A của terazosin ............................................................................. 4
1.2.1. Một số thông tin chung về tạp A của terazosin .................................... 4
1.2.2. Nguyên nhân gây ra tạp chất A............................................................. 5
1.2.3. Phƣơng pháp xác định IAT bằng TLC ................................................. 5
1.2.4. Phƣơng pháp xác định IAT bằng HPLC ............................................... 6
1.3. Tổng quan về các phƣơng pháp hóa lý sử dụng trong nghiên cứu đề tài ... 9
1.3.1. Phƣơng pháp TLC ................................................................................. 9
1.3.2. Phƣơng pháp HPLC ............................................................................ 10
1.4. Thẩm định phƣơng pháp phân tích nguyên liệu hóa dƣợc ....................... 11
1.4.1. Tính thích hợp của hệ thống sắc ký .................................................... 11
1.4.2. Độ đặc hiệu ......................................................................................... 12
1.4.3. Độ tuyến tính và khoảng xác định ...................................................... 12
1.4.4. Độ chính xác ....................................................................................... 12


1.4.5. Độ đúng ............................................................................................... 13

1.4.6. Độ ổn định của dung dịch phân tích ................................................... 13
1.5. Tình hình thiết lập tạp chuẩn A trong nƣớc và trên thế giới..................... 13
1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ..................................................... 13
1.5.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam .................................................... 14
CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................... 15
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị ............................................................................ 15
2.1.1. Hóa chất, chất chuẩn ........................................................................... 15
2.1.2. Thiết bị ................................................................................................ 16
2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 16
2.2.1. Xây dựng phƣơng pháp định tính IAT bằng TLC .............................. 16
2.2.2. Xây dựng phƣơng pháp định tính, định lƣợng IAT bằng HPLC ........ 17
2.2.3. Ứng dụng hai phƣơng pháp đã xây dựng để định tính, định lƣợng
nguyên liệu IAT ............................................................................................ 17
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu........................................................................... 17
2.3.1. Phƣơng pháp TLC ............................................................................... 17
2.3.2. Phƣơng pháp HPLC ............................................................................ 17
2.3.3. Thẩm định phƣơng pháp phân tích ..................................................... 17
2.3.4. Một số phƣơng pháp thống kê sử dụng trong nghiên cứu đề tài ........ 18
CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .................. 20
3.1. Thực nghiệm và kết quả ............................................................................ 20
3.1.1. Xây dựng phƣơng pháp định tính IAT bằng TLC .............................. 20
3.2.2. Xây dựng phƣơng pháp định tính, định lƣợng IAT bằng HPLC ........ 23
3.2.3. Ứng dụng hai phƣơng pháp đã xây dựng để định tính, định lƣợng
nguyên liệu IAT ............................................................................................ 36


3.2. Bàn luận .................................................................................................... 38
3.2.1. Phƣơng pháp định tính nguyên liệu IAT bằng TLC ........................... 38
3.2.2. Phƣơng pháp định tính, định lƣợng nguyên liệu IAT bằng HPLC..... 39

3.2.3. Bàn luận chung ................................................................................... 41
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................
PHỤ LỤC ...........................................................................................................


DANH MỤC CÁC CHỮ, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
ACDQ

: 4-Amino-2-cloro-6,7dimethoxyquinazolin

ACN

: Acetonitril

BP (British Pharmacopoeia)

: Dƣợc điển Anh

DOX

: Doxazosin

EP (European Pharmacopoeia)

: Dƣợc điển Châu Âu

HL

: Hàm lƣợng

HPLC (High performance liquid chromatography) : Sắc ký lỏng hiệu năng cao
IAT (Impurity A of terazosin)

: Tạp chất A của terazosin

IR (Infrared)

: Tia hồng ngoại

KP (Korean Pharmacopoeia)

: Dƣợc điển Hàn Quốc

PA (Pure Analysis)

: Tinh khiết phân tích

MeOH

: Methanol

RSD (Relative standard deviation)

: Độ lệch chuẩn tƣơng đối

SKĐ

: Sắc ký đồ

TB

: Trung bình

TEZ

: Terazosin

TLC (Thin layer chromatography)

: Sắc ký lớp mỏng

TLTK

: Tài liệu tham khảo

USP (United State Pharmacopoeia)

: Dƣợc điển Mỹ

USPRS (United State Pharmacopoeia Reference

: Chất đối chiếu của Hội

Standard)

đồng Dƣợc điển Mỹ

UV (Ultraviolet)

: Tia tử ngoại

VIS (Visible)

: Ánh sáng nhìn thấy

WHO (World Health Organization)

: Tổ chức Y tế Thế giới


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Một số chế phẩm chứa terazosin trên thị trƣờng

3

Bảng 1.2. Phƣơng pháp TLC xác định tạp chất A của terazosin

6

Bảng 2.1. Các hệ dung môi khảo sát phƣơng pháp định tính IAT
bằng TLC

17

Bảng 3.1. Kết quả khảo sát hệ pha động của phƣơng pháp TLC

21

Bảng 3.2. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký

26

Bảng 3.3. Các thông số của dung dịch phân giải

30

Bảng 3.4. Cách pha dung dịch thẩm định độ tuyến tính

31

Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phƣơng pháp HPLC

31

Bảng 3.6. Kết quả thẩm định độ lặp lại của phƣơng pháp HPLC

32

Bảng 3.7. Kết quả thẩm định độ lặp lại của phƣơng pháp HPLC trên
thiết bị khác
Bảng 3.8. Kết quả thẩm định độ chính xác trung gian của phƣơng
pháp HPLC

33

33

Bảng 3.9. Kết quả thẩm định độ đúng của phƣơng pháp HPLC

34

Bảng 3.10. Kết quả khảo sát độ ổn định của dung dịch chuẩn

35

Bảng 3.11. Kết quả khảo sát độ ổn định của dung dịch thử

35

Bảng 3.12. Hàm lƣợng IAT trong nguyên liệu tổng hợp đƣợc

38


DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của terazosin

2

Hình 1.2. Một số chế phẩm của terazosin trên thị trƣờng

4

Hình 1.3. Công thức cấu tạo tạp chất A của terazosin theo USP 38

4

Hình 1.4. Sơ đồ phát sinh tạp chất A của terazosin

5

Hình 2.1. Tạp chuẩn A của terazosin của Hội đồng Dƣợc điển Mỹ

15

Hình 2.2. Chất chuẩn terazosin của Hội đồng Dƣợc điển Mỹ

15

Hình 2.3. Cân phân tích METTLER TOLEDO XPE 26 d = 0,001 mg

16

Hình 3.1. Sắc ký đồ khảo sát pha động của phƣơng pháp TLC

20

Hình 3.2. Sắc ký đồ xác định độ đặc hiệu của phƣơng pháp định tính
bằng TLC

23

Hình 3.3. Phổ UV của dung dịch IAT trong pha động

24

Hình 3.4. Sắc kí đồ thẩm định độ đặc hiệu của phƣơng pháp HPLC

28

Hình 3.5. Kết quả xác định độ tinh khiết pic tạp A thử

29

Hình 3.6. Kết quả xác định độ tinh khiết pic tạp A chuẩn

29

Hình 3.7. Kết quả chồng phổ UV pic tạp A chuẩn và pic tạp A thử

30

Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ và diện tích pic
của IAT
Hình 3.9. Sắc ký đồ định tính nguyên liệu IAT bằng TLC
Hình 3.10. Sắc ký đồ mẫu chuẩn và mẫu thử định tính nguyên liệu IAT
bằng HPLC

31
36
37


ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo “Báo cáo chung tổng quan ngành y tế năm 2016”, gánh nặng bệnh
tật ở ngƣời cao tuổi chủ yếu gây ra bởi các bệnh không lây nhiễm, chiếm đến
86-88% số trƣờng hợp tử vong [1]. Trong các bệnh không lây nhiễm, có hai căn

bệnh rất phổ biến ở nam giới đó là tăng huyết áp và phì đại lành tính tuyến tiền
liệt. Terazosin là một thuốc thuộc nhóm chẹn thụ thể α1-adrenergic đƣợc chỉ
định trong điều trị nội khoa hai căn bệnh này [24], [28], [39].
Khi kiểm tra chất lƣợng nguyên liệu và thành phẩm chứa terazosin, một
số Dƣợc điển yêu cầu thử giới hạn tạp chất, trong đó có tạp chất A (1-(4-amino6,7-dimethoxy-2-quinazolinyl)piperazin, dihydroclorid) [30], [40], [41], [42].
Phƣơng pháp thử giới hạn tạp chất đòi hỏi cần có tạp chuẩn A, tuy nhiên tạp
chuẩn này không có sẵn mà phải mua ở nƣớc ngoài với giá thành cao, gây khó
khăn cho công tác kiểm nghiệm [16]. Từ nhu cầu thực tế, nhóm nghiên cứu đã
tổng hợp và tinh chế thành công nguyên liệu tạp chất A tại bộ môn Hóa Dƣợc trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội [20]. Tuy nhiên, để có thể sử dụng nguyên liệu
này thiết lập tạp chuẩn, cần có phƣơng pháp định tính và định lƣợng chính xác
nguyên liệu IAT. Vì vậy, đề tài “Xây dựng phương pháp định tính, định lượng
nguyên liệu tạp chất A của terazosin” đƣợc thực hiện với ba mục tiêu sau:
1- Xây dựng phƣơng pháp định tính nguyên liệu IAT bằng TLC
2- Xây dựng phƣơng pháp định tính, định lƣợng nguyên liệu IAT bằng
HPLC
3- Áp dụng phƣơng pháp đã xây dựng để định tính, định lƣợng IAT trong
nguyên liệu tổng hợp đƣợc.

1


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Terazosin
1.1.1. Một số thông tin chung về terazosin
- Công thức cấu tạo: hình 1.1

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của terazosin
- Công thức phân tử: C19H25N5O4.HCl
- Phân tử lƣợng: 423,89.
- Tên khoa học: 1-(4-amino-6,7-dimethoxy-2-quinazolinyl)-4-(tetrahydro-2furoyl)piperazin monohydroclorid.

- Ngoài dạng khan, terazosin hydroclorid còn có dạng ngậm hai phân tử nƣớc
với công thức phân tử: C19H25N5O4.HCl.2H2O, phân tử lƣợng: 459,92 [42].
- Tính chất: tinh thể màu trắng hoặc hơi vàng, hơi tan trong nƣớc, khó tan trong
methanol, rất khó tan trong ethanol 96%, thực tế không tan trong aceton và nhexan, có khả năng hấp thụ IR và UV [29], [30], [40].
1.1.2. Tác dụng và chỉ định của terazosin
- Terazosin có tác dụng ức chế chọn lọc thụ thể α1-adrenergic nên dẫn
đến giãn mạch, giảm sức cản ngoại biên, hạ huyết áp, do đó đƣợc chỉ định sử
dụng đƣờng uống trong các trƣờng hợp: điều trị tăng huyết áp vừa và nhẹ ở
ngƣời lớn, phối hợp với thuốc hạ huyết áp khác trong trƣờng hợp tăng huyết áp
kháng trị [3], [26], [28], [39].
- Terazosin có tác dụng giãn cơ trơn, làm tăng lƣu lƣợng nƣớc tiểu và cải
thiện triệu chứng tắc nghẽn, do đó đƣợc chỉ định sử dụng đƣờng uống để giảm
triệu chứng trong phì đại lành tính tiền liệt tuyến [28], [39], [45]. Các nghiên
cứu đã cho thấy không có sự khác biệt về hiệu quả lâm sàng giữa terazosin với
2


các thuốc cùng nhóm nhƣ alfuzosin, doxazosin, tamsulosin. Đây là một trong
các lựa chọn đầu tay khi các triệu chứng tắc nghẽn chiếm ƣu thế [36], [39].
- Terazosin có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thƣ tuyến tiền
liệt bằng cách làm gia tăng sự chết theo chu trình của các tế bào này mà không
ảnh hƣởng tới chu trình tế bào bình thƣờng [35]. Bên cạnh đó, thuốc còn có thể
có tác dụng tích cực đến lƣợng cholesterol trong máu của ngƣời bệnh [32].
1.1.3. Một số chế phẩm chứa terazosin trên thị trường
Ở các nƣớc ASEAN và trên thế giới, terazosin đƣợc biết đến với nhiều
biệt dƣợc khác nhau, phổ biến là viên nén với hàm lƣợng 1, 2, 5 và 10 mg (bảng
3.1 và hình 1.2) [46].
Bảng 1.1. Một số chế phẩm chứa terazosin trên thị trƣờng
STT Tên biệt dược

Hàm lượng
(mg)

Hãng sản xuất

1

Apo-terazosin

2, 5

Apotex

2

Heitrin

1, 2, 5, 10

Amdipharm

Nước lưu hành
Canada, New Zealand,
Singapore
Ireland
Mỹ, Australia,

3

Hytrin

1, 2, 5, 10

Abbott

Trung Quốc, Philipin,
Indonesia, Nam Phi…

4

5

6

Terazosin 1A
- Pharma
Terazosin
Accord
Terazosin HCl
dihydrate

2, 5

2, 5

1A - Pharma
Accord
Healthcare

2

Sandoz

3

Đức

Cộng hòa Séc

Mỹ


Hình 1.2. Một số chế phẩm của terazosin trên thị trƣờng
1.2. Tạp chất A của terazosin
1.2.1. Một số thông tin chung về tạp A của terazosin
- Công thức cấu tạo: hình 1.3
- Công thức phân tử: C14H19N5O2.2HCl.
- Phân tử lƣợng: 362,25.

Hình 1.3. Công thức cấu tạo tạp chất A của terazosin theo USP 38
- Tên khoa học:
1-(4-amino-6,7-dimethoxy-2-quinazolinyl)piperazin, dihydroclorid.
- Tính chất: màu trắng hoặc trắng ngà, nhiệt độ nóng chảy > 208oC, khó tan
trong methanol, dimethyl sulfoxid [44].
- Độc tính: kích thích da, mắt và hệ hô hấp mức độ trung bình, có hại nếu nuốt
phải, hít phải hoặc hấp thu qua da [44].
- Tạp chất A của terazosin theo USP tƣơng ứng với tạp chất I của terazosin theo
KP X, tạp chất C của terazosin theo BP 2016 và EP 8.0. Tạp chất A của
4

terazosin cũng đồng thời là tạp chất F của doxazosin theo BP 2016 và EP 8.0
[30], [40], [41], [42].
1.2.2. Nguyên nhân gây ra tạp chất A
Khi dạng base hoặc muối hydroclorid của terazosin tiếp xúc với nƣớc có
tính acid ở nhiệt độ phòng trong thời gian dài, liên kết amid bị phân cắt, tạo ra
tạp chất A (hình 1.4).

Hình 1.4. Sơ đồ phát sinh tạp chất A của terazosin
Nếu muối hydrochlorid đƣợc tổng hợp dựa trên cơ sở phản ứng giữa
terazosin base và acid hydrochloric, sản phẩm cuối cùng có thể chứa một lƣợng
nhỏ acid, gây ra sự thủy phân theo thời gian [27], [29], [34].
1.2.3. Phương pháp xác định IAT bằng TLC
Tạp chất A của terazosin có thể đƣợc xác định bằng phƣơng pháp sắc ký
lớp mỏng với các điều kiện ở bảng 1.2.

5


Bảng 1.2. Phƣơng pháp TLC xác định tạp chất A của terazosin
Đối tượng

Pha động

mẫu
Nguyên

Cloroform - toluen -

liệu TEZ

methanol (9 : 1 : 6)

Pha

Nồng

Phát hiện vết

tĩnh

độ IAT

IAT

Silica
gel 60
F254

Chƣa
rõ

n-butanol - acid

Silica

acetic băng - nƣớc

gel 60

(6 : 3 : 5)

F254

Methanol - ethyl

Silica

Nguyên

acetat - dung dịch

gel 60

2,5

liệu IAT

amoniac 25%

F254

mg/ml

Nguyên
liệu IAT

Nguyên
liệu IAT

Nguyên
liệu IAT

Methanol - aceton :

Silica

dung dịch amoniac

gel 60

25% (7 : 2 : 0,5)

F254

n-propanol - n-hexan

Silica

- dung dịch amoniac

gel 60

25% (24 : 8 : 1)

F254

Ethyl acetat Nguyên

methanol -

liệu DOX

triethylamin
(4 : 0,4 : 0,3)

Silica
gel 60
F254

Soi đèn UV
bƣớc sóng

Phun thuốc

mg/ml

thử Ninhydrin

2,5
mg/ml

2,5
mg/ml

[29]

ngắn

2,5

(8 : 2 : 0,5)

TLTK

[14]

Soi đèn UV
254 nm và

[14]

312 nm
Soi đèn UV
254 nm và

[14]

312 nm
Soi đèn UV
254 nm và

[14]

312 nm

0,05

Soi đèn UV

mg/ml

345 nm

[38]

1.2.4. Phương pháp xác định IAT bằng HPLC
Tạp chất A của terazosin có thể đƣợc xác định bằng phƣơng pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao với các điều kiện nhƣ sau:
1.2.4.1. Đối tượng mẫu là nguyên liệu TEZ
Phƣơng pháp 1
- Điều kiện sắc ký:
6


+ Pha tĩnh: Cột C8 (250 x 4,6 mm; 5 µm)
+ Pha động: Đệm citrat pH 3,2 - acetonitril (1685 : 315)
+ Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
+ Detector: UV 254 nm
+ Nhiệt độ cột: 30°C
+ Thể tích tiêm mẫu: 20 µl
- Dung dịch tiêm sắc ký:
Dung dịch thử là dung dịch TEZ với nồng độ 0,5 mg/ml trong pha động.
Dung dịch chuẩn là hỗn hợp gồm chất chuẩn TEZ, tạp chuẩn A, B, C của
terazosin, trong đó nồng độ IAT chuẩn là 2 µg/ml. Dung môi dùng để pha IAT
gồm có:
Bƣớc 1: đệm citrat pH 3,2
Bƣớc 2: hỗn hợp nƣớc, acetonitril và methanol (60 : 30 : 10)
Bƣớc 3: pha động.
- Lƣợng IAT trong nguyên liệu terazosin đƣợc tính dựa trên nồng độ của IAT

chuẩn và diện tích pic của IAT trong sắc ký đồ của dung dịch thử và dung dịch
chuẩn.
- Giới hạn: Tạp chất A không quá 0,3% [41], [42].
Phƣơng pháp 2
- Điều kiện sắc ký:
+ Pha tĩnh: Cột C8 (250 x 4,6 mm; 5 µm)
+ Pha động: Đệm citrat pH 3,2 - acetonitril - triethylamin (1650 : 350 : 2)
+ Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
+ Detector: UV 245 nm
+ Nhiệt độ cột: 30°C
+ Thể tích tiêm mẫu: 20 µl.
- Dung dịch tiêm sắc ký:
Dung dịch thử là dung dịch TEZ với nồng độ 0,5 mg/ml trong pha động.
Dung dịch chuẩn (a) đƣợc chuẩn bị bằng cách pha loãng dung dịch thử 1000 lần
với pha động.
7


Dung dịch chuẩn (b) là dung dịch chứa “TEZ dùng cho phép thử tính thích hợp
hệ thống” (trong đó có chứa IAT và một số tạp chất khác của terazosin). Dung
môi dùng để pha dung dịch chuẩn (b) là pha động.
- Sử dụng sắc ký đồ kèm theo “TEZ dùng cho phép thử tính thích hợp hệ thống”
và sắc ký đồ của dung dịch chuẩn (b) để phát hiện pic tƣơng ứng với IAT. Sau
đó xác định giới hạn IAT bằng cách so sánh diện tích pic IAT trong sắc ký đồ
của dung dịch thử với pic chính trong sắc ký đồ của dung dịch chuẩn (a).
- Giới hạn: Diện tích pic IAT trong sắc ký đồ của dung dịch thử không gấp quá
5 lần diện tích pic chính trong sắc ký đồ của dung dịch chuẩn (a) (0,5%) [30],
[40].
Phƣơng pháp 3
- Điều kiện sắc ký:

+ Pha tĩnh: Cột C18 (50 x 2,1 mm, 1,7 µm)
+ Pha động: Chƣơng trình gradient nồng độ gồm các thành phần nƣớc,
acetonitril, methanol và dung dịch amoniac 0,1% tt/tt
+ Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút
+ Detector: PDA 220 nm và QDa mass
+ Nhiệt độ cột: 20oC và 40oC
+ Thể tích tiêm mẫu: 0,2 µl.
- Dung dịch tiêm sắc ký: là hỗn hợp gồm TEZ và các tạp chất từ A đến O theo
EP. Trong đó nồng độ IAT là 7,5 µg/ml. Dung môi pha mẫu là methanol [37].
1.2.4.2. Đối tượng mẫu là nguyên liệu DOX
- Điều kiện sắc ký
+ Pha tĩnh: C18 (250 x 4 mm, 5 µm).
+ Pha động: Chƣơng trình gradient nồng độ gồm dung dịch acid
phosphoric (5g/100ml), acetonitril và nƣớc
+ Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút
+ Detector: 210 nm
+ Nhiệt độ cột: 35oC
+ Thể tích tiêm mẫu: 10 µl.
8


- Dung dịch tiêm sắc ký:
Dung dịch thử là dung dịch DOX với nồng độ 0,5 mg/ml trong pha động.
Dung dịch chuẩn là hỗn hợp gồm chất chuẩn DOX, tạp chuẩn A, B, C, D, E, F
của doxazosin, tạp chuẩn A, C của terazosin trong đó nồng độ IAT chuẩn là 1,5
µg/ml. Dung môi dùng để pha dung dịch chuẩn là hỗn hợp dung môi C và D tỷ
lệ 9 : 1 trong đó C là nƣớc, D là hỗn hợp gồm 100 ml acetonitril và 2 g acid
phosphoric (84 - 86%).
- Hàm lƣợng (%) IAT trong nguyên liệu DOX đƣợc tính dựa vào nồng độ của
IAT trong dung dịch chuẩn, nồng độ DOX trong dung dịch thử và diện tích pic

của IAT trong sắc ký đồ của dung dịch thử, dung dịch chuẩn.
- Giới hạn: Tạp chất A của terazosin không quá 0,3%.
1.3. Tổng quan về các phƣơng pháp hóa lý sử dụng trong nghiên cứu đề tài
1.3.1. Phương pháp TLC
1.3.1.1. Nguyên tắc
Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất đƣợc tiến hành khi cho pha
động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã chấm hỗn hợp các chất cần tách. Trong
quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử di
chuyển trên lớp mỏng theo hƣớng pha động với những tốc độ khác nhau. Kết
quả là thu đƣợc một sắc ký đồ trên lớp mỏng [2].
1.3.1.2. Đại lượng đặc trưng
Đại lƣợng đặc trƣng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di
chuyển Rf, đƣợc tính theo công thức sau:
a
b

Rf
Trong đó:

a: khoảng cách từ điểm chấm mẫu đến tâm của vết sắc ký (cm)
b: khoảng cách từ điểm chấm mẫu đến tuyến dung môi, đo trên

cùng đƣờng đi của vết (cm)
Rf chỉ có giá trị từ 0 đến 1 [2], [4], [23].
1.4.1.3. Ứng dụng trong kiểm nghiệm

9


Trong kiểm nghiệm, TLC chủ yếu đƣợc dùng để định tính bằng cách so

sánh giá trị Rf (vị trí) và màu sắc của vết chất thử với Rf và màu sắc của vết chất
chuẩn đƣợc triển khai trên cùng một bản mỏng trong cùng một điều kiện. Ngoài
ra TLC còn dùng để thử tinh khiết, bán định lƣợng và định lƣợng [4], [23].
1.3.2. Phương pháp HPLC
1.3.2.1. Nguyên tắc
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là phƣơng pháp phân tách các chất trên một
pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dƣới áp suất cao
[5]. Phần lớn sự chia tách dựa trên cơ chế phân bố, sử dụng silica biến đổi hóa
học làm pha tĩnh và các dung môi phân cực làm pha động [2], [23].
1.3.2.2. Các đại lượng đặc trưng
- Thời gian lƣu tR: là khoảng cách trên đƣờng nền từ điểm tiêm mẫu đến đƣờng
thẳng đứng kẻ từ đỉnh pic của chất [2]. Thời gian lƣu là đại lƣợng dùng để định
tính các chất [23].
- Diện tích pic S: là đại lƣợng dùng để định lƣợng các chất, có độ chính xác cao
hơn so với chiều cao pic [31].
- Số đĩa lý thuyết N: là đại lƣợng dùng để biểu thị khả năng tách của cột trong
một điều kiện sắc ký nhất định.
N = 5,54 (
Trong đó:

tR
W1/2

2

) hoặc N = 16 (

tR 2
W

)

W: Chiều rộng đo ở đáy pic
W1/2: Chiều rộng đo ở nửa chiều cao pic [2], [5], [23].

- Độ phân giải Rs: là đại lƣợng đặc trƣng cho sự tách nhau của 2 pic liền kề.
Rs =
Trong đó:

2
WA WB

hoặc

1,18(

-

)

W1/2A W1/2B

tRA, tRB: Thời gian lƣu của 2 pic liền kề nhau (A và B).
WA, WB: Độ rộng đo ở đáy các pic
W1/2A, W1/2B: Độ rộng đo ở nửa chiều cao pic [2], [23].

Độ phân giải lớn hơn 1,5 thì hai pic tách khỏi nhau rõ ràng. Phần lớn các
phép phân tích HPLC mong muốn đạt đƣợc giá trị Rs > 2,0 [2], [31].
10

- Hệ số đối xứng As (hay hệ số kéo đuôi T): là thông số thể hiện sự đối xứng
của pic
Trong đó:

As =

W0,05
2d

W0,05: Chiều rộng pic ở 1/20 chiều cao pic
d: Khoảng cách từ đƣờng thẳng đứng đi qua đỉnh pic đến cạnh phía

trƣớc của pic ở 1/20 chiều cao pic.
Khi As = 1 thì pic hoàn toàn đối xứng (lý tƣởng). Giá trị As càng tăng thì
sự kéo đuôi của pic càng rõ [2], [23].
1.3.2.3. Ứng dụng trong kiểm nghiệm
- Định tính: Dựa trên sự giống nhau về thời gian lƣu trên sắc ký đồ của mẫu
chuẩn và mẫu thử.
- Định lƣợng: Nguyên tắc của tất cả các phép định lƣợng bằng HPLC là nồng độ
của chất phân tích tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó [5]. Một số
phƣơng pháp thƣờng dùng trong định lƣợng nhƣ phƣơng pháp chuẩn nội,
phƣơng pháp chuẩn ngoại, phƣơng pháp thêm chuẩn, phƣơng pháp chuẩn hóa
diện tích…
- Thử tạp chất [4], [23].
1.4. Thẩm định phƣơng pháp phân tích nguyên liệu hóa dƣợc
Thẩm định phƣơng pháp phân tích là quá trình để đảm bảo phƣơng pháp
phân tích đạt các yêu cầu cho mục đích đề ra. Khi xây dựng phƣơng pháp phân
tích mới, với phƣơng pháp định tính, cần thẩm định tiêu chí độ đặc hiệu. Với
phƣơng pháp định lƣợng, các tiêu chí cần thẩm định bao gồm: tính thích hợp của

hệ thống sắc ký, độ đặc hiệu, độ tuyến tính và khoảng xác định, độ lặp lại, độ
chính xác trung gian, độ đúng và độ ổn định [25], [33], [43].
1.4.1. Tính thích hợp của hệ thống sắc ký
Đánh giá tính thích hợp hệ thống sắc ký nhằm để đảm bảo hệ thống sắc ký
có hiệu năng phù hợp [2].
Cách xác định: Tiêm lặp lại nhiều lần một dung dịch chuẩn dùng trong
định lƣợng hoặc dung dịch chuẩn khác. Sau đó đánh giá trên các đại lƣợng đặc

11


trƣng nhƣ: thời gian lƣu, diện tích pic, số đĩa lý thuyết, hệ số đối xứng của pic,
độ phân giải.
1.4.2. Độ đặc hiệu
Độ đặc hiệu là khả năng xác định đƣợc chất phân tích khi có mặt các
thành phần khác trong mẫu [25], [33].
Cách xác định:
- Với phép thử định tính: Cần chứng minh phép thử dƣơng tính khi có mặt
chất phân tích và âm tính khi không có mặt nó. Kết quả cũng phải âm tính khi có
mặt các chất liên quan có cấu trúc gần giống chất phân tích.
- Với phép định lƣợng: Cần chứng minh kết quả không bị ảnh hƣởng bởi
các yếu tố trong quá trình phân tích.
1.4.3. Độ tuyến tính và khoảng xác định
Độ tuyến tính là sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lƣợng đo đƣợc (y) và
nồng độ chất cần phân tích (x) trong khoảng xác định, biểu thị bằng phƣơng
trình hồi quy y = ax + b và hệ số tƣơng quan tuyến tính R.
Khoảng xác định là khoảng nồng độ đã đƣợc khảo sát đảm bảo độ tuyến
tính, độ chính xác và độ đúng. Với phép định lƣợng, khoảng xác định tối thiểu là
từ 80% đến 120% nồng độ thử [31], [33].
Cách xác định: Chuẩn bị một dãy các mẫu có nồng độ tăng dần từ X1 đến

Xn. Tiến hành phân tích các mẫu này bằng phƣơng pháp cần thẩm định, thu
đƣợc các đáp ứng từ Y1 đến Yn. Xác định phƣơng trình hồi quy và hệ số tƣơng
quan tuyến tính. Phải tiến hành tối thiểu ở 5 mức nồng độ khác nhau.
1.4.4. Độ chính xác
Độ chính xác là mức độ thống nhất của các kết quả thử lặp lại trên cùng
một mẫu theo quy trình phân tích, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD).
Độ chính xác đƣợc thẩm định dựa trên hai tiêu chí: độ lặp lại và độ chính xác
trung gian. Độ lặp lại biểu thị độ chính xác của các kết quả phân tích trong cùng
một điều kiện, thực hiện trong một khoảng thời gian ngắn. Độ chính xác trung
gian biểu thị độ chính xác của các kết quả phân tích đƣợc thực hiện tại cùng một
12


phòng thí nghiệm nhƣng trong các ngày khác nhau, những ngƣời phân tích,
dụng cụ phân tích khác nhau.
Cách xác định: Lặp lại toàn bộ quá trình phân tích trên cùng một mẫu thử
đồng nhất từ công đoạn đầu tiên đến công đoạn cuối cùng của quy trình phân
tích. Tối thiểu phải thực hiện 9 lần trong phạm vi định lƣợng ở 3 nồng độ, mỗi
nồng độ 3 lần hoặc tối thiểu 6 lần ở 100% nồng độ thử [25], [33], [43].
1.4.5. Độ đúng
Độ đúng là mức độ gần sát của các giá trị đo đƣợc so với giá trị đƣợc
chấp nhận. Đối với mẫu là nguyên liệu, có thể xác định độ đúng bằng một trong
ba phƣơng pháp sau:
Cách 1: Sử dụng phƣơng pháp thêm chuẩn, tính % tìm lại của chuẩn.
Cách 2: Dùng phƣơng pháp phân tích để xác định lại hàm lƣợng của một
chất chuẩn. Phải thực hiện ít nhất ở 3 nồng độ (trong phạm vi định lƣợng), mỗi
nồng độ ít nhất 3 lần lặp lại.
Cách 3: So sánh các kết quả của phƣơng pháp phân tích đƣợc đề xuất với
kết quả của phƣơng pháp phân tích trong Dƣợc điển hoặc phƣơng pháp đã đƣợc
thẩm định.

1.4.6. Độ ổn định của dung dịch phân tích
Độ ổn định của dung dịch phân tích là một yếu tố quan trọng để xem xét
trong quá trình thẩm định phƣơng pháp phân tích. Bất cứ dung dịch nào sử dụng
để định lƣợng nên nên đƣợc đánh giá độ ổn định [31].
1.5. Tình hình thiết lập tạp chuẩn A trong nƣớc và trên thế giới
1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Tạp chuẩn A của terazosin đã đƣợc USP và một số công ty nhƣ Shanghai
Kewel Chemical (Trung Quốc), Sincopharmachem (Mỹ), Toronto Research
Chemicals (Canada), Whyte Chemicals (Anh) tiến hành thiết lập. Mặc dù vậy,
chỉ có công ty Shanghai Kewel Chemical công bố hàm lƣợng tạp chuẩn là 95 98%, các công ty còn lại không công bố hàm lƣợng cũng nhƣ quy trình tổng
hợp, tinh chế và thiết lập chuẩn. Việc đặt mua tạp chuẩn này gặp nhiều khó
13


khăn, do thời gian đặt hàng lâu với giá rất cao (Khoảng hơn 20 triệu cho lọ 50
mg tạp chuẩn do USP thiết lập).
1.5.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam
Tại Việt Nam, chất chuẩn, tạp chuẩn hiện đang là một trong những mối
quan tâm của công tác kiểm tra chất lƣợng thuốc. Mặc dù có khoảng vài trăm
chất chuẩn đã đƣợc thiết lập, nhƣng trong đó chủ yếu là chuẩn hoạt chất, số
lƣợng tạp chuẩn chiếm số lƣợng nhỏ [47], [48].
Một số đề tài đã nghiên cứu tổng hợp ra nguyên liệu để tiến tới thiết lập
tạp chuẩn nhƣ:
- Tổng hợp tạp chuẩn A của terazosin [14], [20].
- Tổng hợp tạp chuẩn B của terazosin [17].
- Bƣớc đầu tổng hợp tạp chuẩn C của terazosin [11].
- Tổng hợp tạp chuẩn A của clopidogrel [6], [21].
- Tổng hợp tạp chuẩn 4-aminophenol của paracetamol [10].
Bên cạnh đó, đã có một số đề tài nghiên cứu thiết lập tạp chuẩn đƣợc thực
hiện. Các tạp chuẩn đã đƣợc thiết lập nhƣ sau:

- Tạp E của dimenhydrinat [7]
- Tạp A và B của gliclazid [8]
- Tạp (2-clorophenyl)diphenylmethanol của clotrimazol [9]
- Tạp A của gabapentin [12]
- Tạp A của metronidazol [13]
- Tạp A và B của nifedipin [15]
- Tạp captopril disulfit của captopril [18]
- Tạp 2-amino-1-(4-nitrophenyl)propan-1,3-diol của chloramphenicol [19]
- Tạp B của valsartan [22].
Tuy nhiên, chƣa có nghiên cứu nào công bố quy trình thiết lập tạp chuẩn
A của terazosin, cũng nhƣ các phƣơng pháp đƣợc sử dụng để định tính, định
lƣợng nguyên liệu IAT trong quá trình thiết lập tạp chuẩn.

14


CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Hóa chất, chất chuẩn
- Tạp chuẩn A của Hội đồng Dƣợc điển Mỹ (USPRS): lô F0C245, hàm
lƣợng 90,0% (hình 2.1).
- Chất chuẩn terazosin của Hội đồng Dƣợc điển Mỹ (USPRS): lô G0F290,
hàm lƣợng 91,9% (hình 2.2).

Hình 2.1. Tạp chuẩn A của terazosin

Hình 2.2. Chất chuẩn terazosin của

của Hội đồng Dƣợc điển Mỹ

Hội đồng Dƣợc điển Mỹ

- 2-cloro-6,7-dimethoxyquinazolin-4-amino (ACDQ) PA: Sigma Aldrich,
lô STBC3541V, hàm lƣợng 99,7%.
- Nguyên liệu tạp chất A của terazosin (IAT) đƣợc tổng hợp tại phòng thí
nghiệm bộ môn Hóa Dƣợc - trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội.
- Các hóa chất, dung môi tinh khiết phân tích và loại dùng cho HPLC của
hãng Sigma Aldrich, Merck (Đức)
Acid acetic băng PA

+ Ethyl acetat PA

+ Acid citric khan PA

+ Methanol PA & HPLC

+ Aceton PA

+ Natri citrat PA

+ Acetonitril PA & HPLC

+ n-propanol PA

+ n-butanol PA

+ n-hexan PA

+ Cloroform PA

+ Toluen PA
15


+ Dicloromethan PA

+ Triethylamin PA

+ Dung dịch amoniac 25% PA
- Nƣớc cất.
2.1.2. Thiết bị
- Bản mỏng silica gel 60 F254 Merck (Đức)
- Cân phân tích METTLER TOLEDO XPE26 có độ chính xác 0,001 mg
(Thụy Sĩ) (hình 2.3)
- Cột sắc ký Supelco C8 (250 x 4,6 mm, 5 µm)
- Đèn soi tử ngoại UV-VIS Vilber Lourmart (Pháp)
- Máy đo pH Metrohm 780 (Thụy Sĩ)
- Máy lắc siêu âm ELMASONIC S180 H (Đức)
- Máy quang phổ UV-VIS Hitachi U-3900H (Nhật)
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao SHIMADZU diode array UV-VIS SPDM20A đƣợc trang bị phần mềm Lab-solution, bơm gradient LC-20AD 4 kênh
dung môi, hệ thống đuổi khí DGU-2A5, lò cột CTO-10AS VP, detector DAD
SPD-M20A và bộ phận tiêm mẫu tự động SIL-20ACHT (Nhật Bản).
- Bình triển khai sắc ký lớp mỏng và các dụng cụ thủy tinh cần thiết.

Hình 2.3. Cân phân tích METTLER TOLEDO XPE26 d = 0,001 mg
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Xây dựng phương pháp định tính IAT bằng TLC
- Khảo sát điều kiện sắc ký
16