Nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể chó phú quốc dựa trên trình tự HV1 thuộc vùng CR trên hệ gen ty thể (tt)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM


THÁI KẾ QUÂN

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ CHÓ
PHÚ QUỐC DỰA TRÊN TRÌNH TỰ HV1 THUỘC VÙNG
CR TRÊN HỆ GEN TY THỂ
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số: 9420201

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2019


Công trình được hoàn thành tại: Thành phố Hồ Chí Minh
Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. Trần Hoàng Dũng
2. TS. Chung Anh Dũng
Phản biện 1: ..................................................................................
Phản biện 2: .................................................................................
Phản biện 3: ..................................................................................
Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện họp
tại Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam ngày
năm 2018
Có thể tìm hiểu luận án tại:

1. Thư viện Quốc gia
2. Thư viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam
3. Thư viện Viện KHKTNN Miền Nam.

tháng


1
MỞ ĐẦU
1. Giới thiệu
Chó lưng xoáy Phú Quốc là giống chó quý có nguồn gốc từ
đảo Phú Quốc (Kiên Giang, Việt Nam), là một trong ba giống chó có
xoáy lông ở lưng trên thế giới. Hiện nay, chó lưng xoáy Phú Quốc
vẫn chưa xác định được chứng nhận chính thức là một giống chó và
cũng chưa được xác định nguồn gốc. Có ý kiến cho rằng chó lưng
xoáy Phú Quốc có nguồn gốc từ chó lưng xoáy Thái Lan vì có cùng
kiểu hình lưng xoáy, tuy nhiên, những ý kiến chủ quan này được đưa
ra không dựa trên một căn cứ khoa học nào.
DNA ty thể, đặc biệt là vùng kiểm soát (Control Region – CR)
có tốc độ đột biến cao, tạo sự khác biệt về mặt di truyền giữa các cá
thể. Đề tài “Nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể chó Phú Quốc
bằng trình tự vùng CR (control region) trên genome ty thể” đánh giá
sự đa dạng di truyền trong vùng CR của quần thể chó lưng xoáy Phú
Quốc, tìm hiểu mối quan hệ di truyền với các giống chó khác trên thế
giới, từ đó làm cơ sở để suy đoán nguồn gốc của giống chó quý này.
2. Mục tiêu của đề tài
Nhận định nguồn gốc chó lưng xoáy Phú Quốc dựa trên
thông tin về đa dạng di truyền vùng CR trên genome ty thể của chó.
3. Những đóng góp mới của đề tài
- Lần đầu tiên trên thế giới xây dựng được phần mềm định

loại haplotype vùng CR thuộc DNA ty thể của các giống chó trên thế
giới.
- Đánh giá được sự đa dạng di truyền vùng CR thuộc DNA ty
thể của chó lưng xoáy Phú Quốc.


2
- Nhận định được nguồn gốc chó lưng xoáy Phú Quốc dựa
vào các thông tin sinh học phân tử.
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
4.1. Ý nghĩa khoa học
Đề tài đã khảo sát và xác định được sự đa dạng di truyền
vùng 582 cặp base của chó lưng xoáy Phú Quốc, cung cấp các dữ liệu
và căn cứ giúp suy đoán được nguồn gốc hình thành của chó lưng
xoáy Phú Quốc. Đề tài cũng cung cấp được quy trình tách chiết DNA
từ lông chó, có thể được ứng dụng trong các nghiên cứu khác về di
truyền ở loài chó. Phần mềm xác định nhanh haplotype vùng 582 cặp
base vùng CR DNA ty thể chó có thể được sử dụng trong cộng đồng
nghiên cứu về vùng trình tự này từ khắp nơi trên thế giới.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Nghiên cứu này đã cung cấp được những dữ liệu, căn cứ đầu
tiên giúp suy đoán nguồn gốc của chó lưng xoáy Phú Quốc. Đề tài
cung cấp thông tin về đa dạng di truyền và nguồn gốc hình thành chó
lưng xoáy Phú Quốc, làm tiền đề cho công tác bảo tồn gen của giống
chó lưng xoáy Phú Quốc quý của Việt Nam.
5. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
5.1. Đối tượng nghiên cứu
Đề tài thực hiện nghiên cứu trên vùng 582 cặp base thuộc
vùng CR DNA ty thể của chó. Tổng cộng 200 con chó bao gồm 100
con chó lưng xoáy Phú Quốc và 100 con chó nhà (chó cỏ) Việt Nam

được khảo sát trong phạm vi đề tài.
5.2. Phạm vi nghiên cứu
Đề tài tập trung nghiên cứu vùng trình tự 582 cặp base thuộc
vùng CR DNA ty thể trên 100 con chó lưng xoáy Phú Quốc và 100


3
con chó nhà Việt Nam. Các giống chó trên thế giới được sử dụng
trong việc xác định mối quan hệ di truyền với chó lưng xoáy Phú
Quốc được chọn dựa trên thông tin về hành trình di cư của chó đã
được công bố, và dựa trên sự sẵn có của thông tin, không bao gồm tất
cả các giống chó hiện hữu trên toàn thế giới.


4

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về chó lƣng xoáy Phú Quốc
1.1.1. Giới thiệu về chó lƣng xoáy Phú Quốc
Chó lưng xoáy sống tại đảo Phú Quốc thuộc vùng biển tỉnh
Kiên Giang là một giống chó đặc trưng với nhiều đặc tính quý của
Việt Nam. Trên thế giới hiện có ba giống chó có xoáy lưng, trong đó,
chó lưng xoáy Rhodesian ở Nam Phi và chó lưng xoáy Thái Lan đã
được Tổ chức giống chó Thế giới (Federation Cynologique
Internationale – FCI) công nhận trong danh sách các giống chó
giống, riêng chó lưng xoáy Phú Quốc của Việt Nam vẫn chưa được
chấp thuận. Nhiều bằng chứng lịch sử đã được các nhà khoa học
công bố nhằm chứng minh nguồn gốc đặc chủng của chó lưng xoáy
Phú Quốc nhưng tính thuyết phục của các dẫn liệu này chưa cao. Cho
đến nay, nguồn gốc tiến hóa và mối quan hệ di truyền của giống chó

này vẫn chưa được nghiên cứu một cách tường tận.
1.1.2. Phân loại chó lƣng xoáy Phú Quốc
1.1.3. Đặc điểm hình thái và tập tính của chó lƣng xoáy Phú Quốc
1.1.4. Các nghiên cứu về nguồn gốc và di truyền chó lƣng xoáy
Phú Quốc
Đến nay, ngoài Việt Nam, chưa có nghiên cứu về nguồn gốc
và di truyền của chó Phú Quốc. Trần Hoàng Dũng và cộng sự (2017)
bước đầu đã phân tích DNA và chứng minh có mối quan hệ di truyền
giữa chó lưng xoáy Phú Quốc mang haplotype E4 với giống chó
Pungsan ở Triều Tiên.
1.2. Đặc điểm di truyền của tính trạng xoáy lƣng


5
Tính trạng xoáy lưng ở chó lưng xoáy do allele trội R trên
nhiễm sắc thể số 18 quy định. Ngoài ra, chó mang cặp allele RR còn
có nguy cơ bị u nang biểu bì cao, làm ảnh hưởng đến sức sống của
chó (Bảng 1.1).
Bảng 1.1: Tương quan giữa kiểu gen và các kiểu hình xoáy lưng, u
nang biểu bì
Kiểu gen

Xoáy lƣng

Mắc bệnh u nang biểu bì

RR

có

khả năng cao

Rr

có

khả năng rất thấp

rr

không

không

1.3. Bộ gen ty thể của chó
1.3.1. Cấu trúc bộ gen ty thể của chó
1.3.2. Cấu trúc và đặc điểm di truyền vùng CR trên bộ gen ty thể
của chó
Vùng CR ở DNA ty thể chó bao gồm ba vùng nhỏ, trong đó
vùng HV1 và HV2 là hai vùng siêu biến, có tính đa hình cao. Trong
đó vùng HV1 thường được dùng trong nghiên cứu sự đa dạng di
truyền nhằm tìm hiểu nguồn gốc phát sinh loài của các giống chó.

Hình 1.4: Vị trí và thành phần vùng CR trong DNA ty thể chó
1.4. Các nghiên cứu về nguồn gốc tiến hóa, phát sinh chủng loại
và đa dạng di truyền của chó


6
1.4.1. Các nghiên cứu khảo cổ

1.4.2. Các nghiên cứu di truyền hiện đại
1.4.2.1. Các chỉ thị phân tử được dùng trong nghiên cứu
Nhiều trình tự DNA mục tiêu khác nhau đã được sử dụng
trong nghiên cứu di truyền ở chó như các siêu tiểu vệ tinh, nhiễm sắc
thể Y, COI, CytB….Đặc biệt, nhiều nghiên cứu trên thế giới đã tập
trung nghiên cứu sự đa hình của vùng 582 cặp base DNA ty thể để
tìm hiểu về nguồn gốc và sự hình thành của nhiều giống chó khác
nhau.
1.4.2.2. Nghiên cứu về nguồn gốc tiến hóa của chó nhà
Trên cây phát sinh chủng loại dựa trên đoạn trình tự 582 cặp
base vùng HV1 của các giống chó trên toàn thế giới, các haplotype
của chó và chó sói phân bố thành 6 nhóm và được đặt tên lần lượt là
các haplogroup A, B, C, D, E và F. Có 72,34% chó trên thế giới
thuộc haplogroup A; 97,40% chó thuộc haplogroup A, B hoặc C. Chó
mang haplotype thuộc nhóm D, E, F chiếm chưa đến 3%, có vị trí
phân bố hẹp, được cho là kết quả của lần thuần hóa thứ hai giữa chó
và chó sói. Dựa vào sự phân bố của các haplotype, Wang và cs
(2016) đã nhận định về vị trí khởi đầu và con đường di cư của chó
như hình 1.8.

Hình 1.8: Vị trí khởi đầu và con đường di cư của chó


7

1.4.2.3. Nghiên cứu về đa dạng di truyền của các giống chó
Độ đa dạng di truyền của giống chó rất khác nhau, phản ảnh
vị trí phân bố và thời điểm hình thành của giống chó. Các giống chó
phân bố ở những vùng bị cách ly thì độ đa dạng haplotype rất thấp,
như giống chó Castro Laboreiro Bồ Đào Nha (0,1). Trong khi đó,

giống chó Shiba của Nhật Bản có nguồn gốc từ 3 dòng chó thuộc 3
vùng địa lý khác nhau thì có độ đa dạng haplotype khá cao (0,8161).
1.5. Cơ sở dữ liệu DNA GenBank và dữ liệu vùng trình tự HV1
DNA ty thể
1.5.1. Cơ sở dữ liệu DNA GenBank
1.5.2. Dữ liệu về trình tự vùng HV1 DNA ty thể trên GenBank
Dữ liệu về trình tự vùng HV1 DNA ty thể được lưu trữ nhiều
trên ngân hàng gen GenBank. Cũng như nhiều trường hợp đã công bố
trước đây, dữ liệu về trình tự DNA này có nhiều thông tin không
chính xác hoặc không nhất quán, cần phải được sửa sai và thống
nhất.
1.6. Nhận định chung về vấn đề nghiên cứu sự đa dạng di truyền
của quần thể chó lƣng xoáy Phú Quốc
- Đoạn trình tự 582 cặp base vùng HV1 DNA ty thể sẽ giúp chúng ta
hiểu rõ hơn về sự đa dạng di truyền của chó lưng xoáy Phú Quốc
- Cần tạo được bộ dữ liệu chính xác, đáng tin cậy về các haplotype ở
chó trên toàn thế giới để so sánh, nghiên cứu về sự đa dạng di truyền
của chó lưng xoáy Phú Quốc.
- Sự đa dạng di truyền của chó lưng xoáy Phú Quốc cùng với mối
quan hệ di truyền của giống chó này với các giống chó khác trên thế
giới sẽ là cơ sở nhận định về nguồn gốc của giống chó này.


8

CHƢƠNG 2. NỘI DUNG VÀ
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nội dung nghiên cứu
- Nội dung 1: Xây dựng cơ sở dữ liệu và phần mềm định loại
haplotype đoạn 582 cặp base vùng HV1 DNA ty thể chó

- Nội dung 2: Xác định trình tự nucleotide đoạn 582 cặp base vùng
HV1 DNA ty thể của chó nhà Việt Nam và chó lưng xoáy Phú Quốc
- Nội dung 3: Đánh giá sự đa dạng di truyền của chó lưng xoáy Phú
Quốc dựa trên đoạn 582 cặp base vùng HV1 DNA ty thể
- Nội dung 4: Nhận định nguồn gốc của chó lưng xoáy Phú Quốc
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Xây dựng cơ sở dữ liệu và phần mềm định loại haplotype
đoạn 582 cặp base vùng HV1 DNA ty thể
2.2.1.1. Xây dựng cơ sở dữ liệu các trình tự đoạn 582 cặp base
vùng HV1 DNA ty thể
Cơ sở dữ liệu được thiết kế theo mô hình quan hệ bao gồm 6
bảng có mối quan hệ ràng buộc với nhau. Mỗi bảng chứa thông tin
riêng biệt về trình tự: haplotype, trình tự nucleotide, tên loài. Các
trình tự nucleotide được thu thập từ GenBank bởi phần mềm tự xây
dựng. Thông tin của các trình tự được tách từ bảng ghi của GenBank
và được lưu trữ vào cơ sở dữ liệu.
2.2.1.2. Đánh số nucleotide và trình bày các đột biến
2.2.1.3. Xác định haplotype và hiệu chỉnh dữ liệu
Những thông tin về haplotype của các trình tự DNA bị sai
lệch hoặc không rõ ràng sẽ được phát hiện và điều chỉnh. Quá trình
này sẽ được tiến hành với các luật sau:


9
1. Trình tự đầu tiên được dùng để công bố một haplotype sẽ
được ghi nhận là trình tự chuẩn của haplotype đó.
2. Trình tự giống trình tự chuẩn của một haplotype đã công
bố nhưng được dùng để công bố haplotype khác thì haplotype sau sẽ
bị loại ra khỏi danh sách haplotype đã được công bố.
3. Trình tự khác với trình tự chuẩn của một haplotype đã

công bố nhưng công bố tên giống với haplotype đó thì được xem là
công bố sai, thông tin cần phải được hiệu chỉnh.
2.2.1.4. Phần mềm xác định haplotype vùng HV1 của DNA ty thể
Phần mềm được viết bằng ngôn ngữ lập trình Perl và HTML,
hoạt động ở dạng trang web. Phần mềm sẽ phân tích trình tự truy vấn,
nhận diện các vị trí đa hình để xác định haplotype hoặc haplogroup.
2.2.1.5. Xây dựng cây phát sinh chủng loại
Các cây phát sinh chủng loại được thiết lập bằng chương
trình Paup*, sử dụng phương pháp Neighbor-Joining với 2000 lần lặp
lại để xác định độ tin cậy.
2.2.2. Xác định trình tự nucleotide đoạn 582 cặp base vùng HV1
DNA ty thể của chó nhà Việt Nam và chó lƣng xoáy Phú Quốc
2.2.2.1. Dụng cụ và thiết bị sử dụng
2.2.2.2. Thu thập và xử lý mẫu
Mẫu vật thu thập là lông của 100 con chó lưng xoáy Phú
Quốc và 100 con chó nhà Việt Nam sống tại đảo Phú Quốc, thành
phố Rạch Giá (Kiên Giang), Thành phố Hồ Chí Mình và các vùng
phụ cận.
2.2.2.3. Tách chiết DNA tổng số từ lông chó
DNA từ lông chó được tách chiết theo quy trình được xây
dựng trong đề tài, sử dụng Proteinase K để phân hủy protein,


10
phenol:chloroform để phân tách DNA và các thành phần khác. Sau
khi được tủa bằng ethanol lạnh với sự có mặt của NaCl, DNA được
hòa tan trong nước và trữ ở -30oC.
2.2.2.4. Kiểm tra độ tinh sạch DNA bằng quang phổ kế
2.2.2.5. Khuếch đại trình tự vùng HV1 bằng phản ứng PCR
Vùng HV1 DNA ty thể được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR

với cặp mồi 15412F và 16625R theo quy trình của Gundry và cộng
sự (2007).
2.2.2.6. Giải trình tự và hiệu chỉnh trình tự
Các trình tự nucleotide được xác định bằng phương pháp
Sanger. Mỗi trình tự được giải theo cả hai chiều xuôi và ngược để có
độ tin cậy cao.
2.2.3. Đánh giá sự đa dạng di truyền của chó lƣng xoáy Phú Quốc
dựa trên đoạn 582 cặp base vùng HV1 DNA ty thể
Các số liệu trong đề tài được xử lý thống kê bằng phần mềm
thống kê R. Các biểu đồ thể hiện, minh họa số liệu tính toán được
cũng như các chỉ số về đa dạng di truyền quần thể được tính toán
bằng phần mềm chuyên dụng Arlequin 3.5.
2.2.3.1. Xác định độ đa dạng haplotype
Độ đa dạng haplotype là xác suất bắt được ngẫu nhiên hai
haplotype khác nhau trong quần thể.
2.2.3.2. Xác định độ đa dạng nucleotide
Độ đa dạng nucleotide thể hiện xác suất bắt được ngẫu nhiên
hai nucleotide khác nhau tại một vị trí bất kỳ trên hai trình tự DNA
bất kỳ trong quần thể.


11

2.2.3.3. Xây dựng mạng lưới quan hệ của các haplotype
Mạng lưới ban đầu thể hiện mối quan hệ giữa các haplotype
trong quần thể và số nucleotide sai khác của các haplotype kế cận
được tính bởi phần mềm Arlequin. Trong trường hợp những
haplotype sai khác nhiều hơn 1 nucleotide so với haplotype gần nhất,
các haplotype trung gian sẽ được tìm kiếm thủ công trong danh sách
các haplotype đã được công bố, và sẽ được chèn vào mạng lưới ở vị

trí tương ứng.
2.2.3.4. Xác định khoảng cách di truyền giữa hai quần thể
Khoảng cách di truyền (DA) giữa hai quần thể là số
nucleotide khác biệt trung bình giữa hai quần thể.
2.2.3.5. Phân tích phương sai phân tử (AMOVA)
Độ đa dạng di truyền của quần thể được phân tích ở các mức
độ khác nhau: độ khác biệt giữa các nhóm quần thể nhỏ hơn, giữa các
quần thể nhỏ và trong nội bộ các quần thể nhỏ. Mức chính xác của
các khác biệt được đánh giá thông qua chỉ số F của kiểm định Fisher.
2.2.4. Nhận định nguồn gốc của chó lƣng xoáy Phú Quốc
Nguồn gốc chó lưng xoáy Phú Quốc được nhận định dựa trên
sự tổng hợp các thông tin liên quan thu thập được từ các kết quả của
đề tài cũng như của các nghiên cứu trước đây về loài chó nói chung.


12

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Xây dựng cơ sở dữ liệu đoạn 582 cặp base vùng HV1 DNA ty
thể chó
Bằng công cụ BLAST tìm trong cơ sở dữ liệu về DNA của
GenBank, 5567 trình tự nucleotide có nguồn gốc từ các cá thể thuộc
loài Canis lupus có độ tương đồng cao với vùng trình tự HV1 của
trình tự chuẩn (mã số truy cập GenBank U96639.2) được xác định và
lưu trữ vào cơ sở dữ liệu. Trong số này, 1921 trình tự chỉ chứa một
phần của vùng trình tự 582 cặp base nên không đủ cơ sở để xác định
haplotype; 414 trình tự được xác định đúng haplotype theo hệ thống
chia thành 6 haplogroup từ A đến F thông dụng hiện nay, 3232 trình
tự có thông tin về haplotype không chính xác hoặc không theo hệ
thống thông dụng này hoặc không có thông tin về haplotype đều đã

được định loại haplotype và lưu trữ trong cơ sở dữ liệu.
Phần mềm xác định nhanh haplotype vùng HV1 của DNA ty
thể cũng được xây dựng bằng ngôn ngữ lập trình Perl, chạy trên nền
Web và có thể được truy cập miễn phí qua Internet ở địa chỉ
. Thử nghiệm trên 50 trình tự ngẫu nhiên
trong cơ sở dữ liệu cho thấy phần mềm đã hoạt động chính xác, cho
kết quả định loại haplotype thích hợp và nhanh hơn kỹ thuật định loại
haplotype bằng cây phát sinh chủng loại. Các ưu điểm của việc định
loại haplotype bằng phần mềm Haplotype identifier so với phương
pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại có thể được tóm tắt trong
bảng sau (Bảng 3.5).


13

Bảng 3.5: So sánh việc định loại haplotype bằng Haplotype identifier
và bằng xây dựng cây phát sinh chủng loại

Trình

Haplotype

Xây dựng cây phát

identifier

sinh chủng loại

có Xác định được Không xác định được

tự

haplotype trùng chính
với

xác

haplotype haplotype

đã công bố
Trình

có Xác định được Xác

tự

haplotype

haplogroup

định

được

haplogroup

không trùng với
haplotype

đã

công bố
Thời gian xác Nhanh
định haplotype

1 Thời gian xác định lâu,

(~

giây/trình tự)

tùy vào phương pháp
sử dụng (10 phút đến 8
giờ)

Phần

mềm Không cần

Cần

chuyên dụng
Yêu cầu kinh Người
nghiệm

dùng Người dùng phải nắm

không cần biết được kỹ thuật xây
kỹ

thuật

định dựng cây phát sinh

loại haplotype

chủng loại


14

3.2. Xác định trình tự đoạn 582 cặp base vùng HV1 DNA ty thể
chó nhà Việt Nam và chó lƣng xoáy Phú Quốc
3.2.1. Xác định quy trình tách chiết DNA từ lông chó
Bằng cách sử dụng các hóa chất thông dụng trong phòng thí
nghiệm sinh học phân tử, và khảo sát các điều kiện ủ mẫu (nhiệt độ,
thời gian), một quy trình tách chiết DNA từ lông chó đã được xây
dựng như sau (Hình 3.5).

Hình 3.5: Quy trình tách chiết DNA từ lông chó
Quy trình tách chiết cho phép thu được DNA toàn phần (gồm
DNA trong nhân và DNA ty thể) từ nguồn nguyên liệu là khoảng 40
sợi lông chó. DNA thu được có thể được sử dụng trong các nghiên
cứu tiếp theo.
3.2.2. Tách chiết DNA từ lông chó
Hai trăm mẫu lông chó (gồm 100 chó lưng xoáy Phú Quốc
và 100 chó nhà Việt Nam) được đã được sử dụng để tách chiết DNA
theo quy trình đã xây dựng. Các mẫu DNA thu được có chất lượng
tốt, được sử dụng trong các phản ứng PCR khuếch đại vùng trình tự
HV1

15

3.2.3. Khuếch đại vùng HV1
DNA sau khi được tách chiết sẽ được sử dụng làm nguyên
liệu cho phản ứng khuếch đại vùng trình tự HV1 DNA ty thể, để tiếp
đó, nguồn nguyên liệu – sản phẩm PCR – này sẽ được sử dụng trong
việc giải trình tự nucleotide. Sản phẩm của các phản ứng khuếch đại
DNA được kiểm tra thông qua điện di trên gel agarose 1%. Tín hiệu
của các băng DNA đều sáng đậm, rõ nét, tập trung ở vị trí ở giữa
băng 1000 cặp base và 1500 cặp base của thang DNA 1Kb, phù hợp
với kích thước mong đợi theo lý thuyết vào khoảng 1200 cặp base.
3.2.4. Đọc và hiệu chỉnh trình tự nucleotide
Sản phẩm khuếch đại vùng HV1 sẽ được giải trình tự với cặp
mồi 15412F và 16114R. Kết quả giải trình tự được đọc bằng phần
mềm FinchTV. Ở mỗi mẫu, hai trình tự nucleotide được đọc bằng
mồi 15412F và 16114R sẽ được so sánh với nhau để kiểm chứng.
Trình tự cuối cùng được khẳng định bởi cả hai mồi sẽ là trình tự
nucleotide của mẫu tương ứng. Hai trăm mẫu DNA khảo sát trong đề
tài là những mẫu có kết quả giải trình tự rõ ràng, đặc biệt là ở vùng
trình tự 582 cặp base cần phân tích.
3.2.5. Xác định haplotype của các mẫu chó lƣng xoáy Phú Quốc
và chó nhà Việt Nam
Toàn bộ 200 trình tự khảo sát được đưa vào phần mềm định
loại haplotype để xác định nhanh haplotype. Đa số các mẫu có
haplotype thuộc 3 haplogroup thường gặp là A, B, C. Hầu hết các
mẫu (197/200) có haplotype đã được công bố trên thế giới. Ngoài ra,
3 mẫu có haplotype mới chưa từng được công bố trên thế giới, được
đặt tên lần lượt là An1 (thuộc haplogroup A), Cn1, Cn2 (thuộc

16
haplogroup C). Đặc biệt, ở các mẫu chó lưng xoáy Phú Quốc còn
xuất hiện với tỷ lệ lớn các haplotype thuộc haplogroup E là nhóm các
haplotype hiếm, vốn có tỷ lệ thấp trên thế giới.
3.3. Đa dạng di truyền vùng HV1 DNA ty thể chó lƣng xoáy Phú
Quốc
3.3.1. Sự đa dạng ở cấp độ nucleotide
Ở chó lưng xoáy Phú Quốc, 100 trình tự khảo sát được nhóm
lại thành 19 nhóm dựa sự giống nhau của trình tự nucleotide, tương
ứng với 19 haplotype được ghi nhận. Trên toàn bộ chiều dài 582 cặp
base vùng HV1 DNA ty thể của chó lưng xoáy Phú Quốc có tổng
cộng 33 vị trí đa hình, gồm 31 vị trí có các đột biến thay thế
nucleotide và 2 vị trí có đột biến mất hay thêm nucleotide (indel).
Hầu hết các đột biến thay thế là đồng hoán (30/31 vị trí), chỉ có 2 vị
trí (nucleotide thứ 15479 và 15639) là có dị hoán (biến đổi giữa G và
C; biến đổi giữa T và A,G), tại vị trí 15639, vừa xảy ra đồng hoán và
dị hoán. Ở chó nhà Việt Nam, tổng cộng có 34 vị trí đa hình được ghi
nhận, trong đó có 32 vị trí vị trí các đột biến thay thế nucleotide và 2
vị trí có đột biến mất hay thêm nucleotide. Tất cả các vị trí đột biến
thay thế nucleotide đều xuất hiện đồng hoán, chỉ có 1 vị trí 15639 thì
tương tự như đã thấy ở nhóm chó lưng xoáy Phú Quốc, vừa xảy ra
đồng hoán, vừa xảy ra dị hoán. Mức độ đa dạng nucleotide ở chó
lưng xoáy Phú Quốc và chó nhà Việt Nam (tương ứng là 0,014588 ±
0,007534 và 0,014035 ± 0,007270) ở mức cao so với nhiều giống chó
khác trên thế giới.
3.3.2. Sự đa dạng ở cấp độ haplotype
Một trăm trình tự 582 cặp base của chó lưng xoáy Phú Quốc
được giải trình tự và được xác định bao gồm 19 haplotype khác nhau,

17
trong đó có 1 haplotype mới chưa được công bố, còn 18 haplotype
còn lại đã được ghi nhận trước đây ở các giống chó trên thế giới. Các
trình tự mang haplotype thuộc các haplogroup thường gặp là A, B, C
chiếm đến 77%, không có trường hợp nào mang haplotype thuộc
haplogroup D và F. Đáng chú ý, 23% các trình tự mang haplotype
thuộc haplogroup E là nhóm hiếm trên thế giới, vốn chỉ chiếm tỷ lệ
rất thấp trên thế giới (cùng với các haplotype thuộc haplogroup D, F
chỉ chiếm chưa đến 3%). Với 19 haplotype được phát hiện trong số
100 mẫu khảo sát, chỉ số đa dạng haplotype của giống chó lưng xoáy
Phú Quốc lên đến 0,9042 ± 0,0127, nghĩa là xác suất để bắt gặp hai
mẫu có haplotype khác nhau là khoảng 90%. So với một số giống
chó khác trên thế giới, mức độ đa dạng haplotype ở chó lưng xoáy
Phú Quốc thấp hơn nhóm chó Thái Lan nhưng vẫn thuộc nhóm cao,
tương tự như ở chó Pungsang (Triều Tiên), chó nhà Việt Nam và cao
hơn nhiều so với các giống chó chăn cừu Bồ Đào Nha, chó Shepherd
Đức, chó Ngao Tây Tạng, chó Kangal (Thổ Nhĩ Kỳ) , hay chó Shiba
(Nhật Bản) và chó Jindo (Hàn Quốc).
3.3.3. Quan hệ di truyền của chó lƣng xoáy Phú Quốc với các
giống chó khác
3.3.3.1. Quan hệ di truyền của chó lưng xoáy Phú Quốc với các
giống chó khác trên thế giới
Phân tích phương sai phân tử (AMOVA) cho thấy các khác
biệt di truyền giữa các giống chó trên thế giới tuy nhỏ, nhưng có ý
nghĩa thống kê (Bảng 3.11).


18

Bảng 3.11: Phân tích AMOVA giữa một số quần thể chó trên
thế giới
Nguồn biến
thiên
Giữa

các

nhóm chó
Giữa

các

quần

thể

Tổng bình
phƣơng
sai khác

Độ biến
thiên

Tỷ lệ phần
trăm biến
thiên

512,086

0,55663

13

111,69

0,348993

8,15

2538,619

3,37582

78,85

3162,395

4,28145

100

trong nhóm
Trong

nội

bộ quần thể
Tổng cộng

Chỉ
số F

Giá
trị P

0,130

0,013

01

69

0,093
69
0,211
52

0

0

Một điểm đáng chú ý là chó Thái Lan không quá gần gũi về
mặt di truyền với chó nhà Việt Nam (Hình 3.13). Khoảng cách di
truyền giữa chó lưng xoáy Phú Quốc và chó Thái Lan lên đến
2,27668, gần gấp 7 lần so với khoảng cách di truyền giữa chó lưng
xoáy Phú Quốc và chó nhà Việt Nam (0,33899). Đây là cơ sở cho
phép khẳng định chó lưng xoáy Phú Quốc có nguồn gốc từ chó nhà

Việt Nam, không phải từ chó Thái Lan như những phỏng đoán trước
đây.


19

Hình 3.13: Khoảng cách di truyền giữa một số giống chó trên thế giới
3.3.3.2. Quan hệ di truyền của chó lưng xoáy Phú Quốc và chó nhà
Việt Nam
Kết quả phân tích AMOVA cho thấy chó lưng xoáy Phú
Quốc và chó nhà Việt Nam không có sự sai khác di truyền đáng kể
(Bảng 3.12).
Bảng 3.12: Phân tích AMOVA giữa các quần thể chó sống
tại Việt Nam
Nguồn biến
thiên
Giữa
hai
nhóm chó
Giữa
các
quần
thể
trong nhóm
Trong nội
bộ quần thể
Tổng cộng

Tổng bình
phƣơng sai

khác

Độ biến
thiên

Tỷ lệ
phần
trăm biến
thiên

Chỉ số
F

Giá trị
P

21,120

0,19002

4,38

0,04378

0,10655

6,923

-0,04919

-1,13

0,01185

0,84360

818,857

4,19927

96,76

0,03245

0,06647

451,278

4,31726

100%


20
Theo tính toán của Savolainen trước đây, khác biệt 1
nucleotide trong vùng 582 cặp base ở DNA ty thể (hay 1 đơn vị
khoảng cách di truyền giữa hai quần thể) tương ứng với khoảng
40000 năm. Như vậy, xét trên toàn bộ quần thể chó khảo sát trong đề
tài, với khoảng cách di truyền là 0,33899 thì tiền thân của chó lưng
xoáy Phú Quốc và chó nhà Việt Nam ngày nay đã phân hóa từ tổ tiên

chung vào khoảng 6780 năm trước.
3.3.3.3. Quan hệ di truyền của chó lưng xoáy Phú Quốc và chó nhà
Việt Nam tại Kiên Giang
Sự tương đồng về thành phần haplotype của hai nhóm chó
lưng xoáy Phú Quốc và chó nhà Việt Nam tại Kiên Giang, đặc biệt là
các haplotype chung đều chiếm tỷ lệ cao trong quần thể cho thấy có
hiện tượng chuyển dịch di truyền (gene flow) từ đất liển ra đảo (Hình
3.14).

Hình 3.14: Sự tương đồng haplotype giữa nhóm chó đất liền Kiên
Giang và nhóm chó trên đảo Phú Quốc
Phân tích phương sai phân tử giữa hai nhóm chó hiện đang
sinh sống tại khu vực Kiên Giang cũng cho thấy không có sự khác
biệt di truyền giữa các nhóm chó này (Bảng 3.13).


21
Bảng 3.13: Phân tích AMOVA giữa các quần thể chó ở Kiên Giang

Nguồn
biến thiên
Giữa hai
nhóm chó
Giữa các
quần thể
trong
nhóm
Trong nội
bộ quần
thể

Tổng cộng

Độ biến
thiên

Tỷ lệ
phần
trăm
biến
thiên

Chỉ số F

Giá trị P

10,204

0,14484

3,38

0,03383

0,34018

2,970

-0,03645

-0,85

-0,00881

0,52590

438,104

4,17242

97,47

0,02532

0,13392

451,278

4,31726

100%

Tổng
bình
phƣơng
sai khác

Đáng chú ý, khoảng cách di truyền giữa chó nhà Việt Nam ở
đất liền Kiên Giang và chó lưng xoáy Phú Quốc trên đảo (0,36176)
tương tự như khoảng cách di truyền giữa chó nhà Việt Nam và chó
lưng xoáy Phú Quốc nói chung (0,33899). Trong khi đó, khoảng cách

di truyền giữa chó nhà Việt Nam và chó lưng xoáy Phú Quốc trên
đảo nhỏ hơn rất nhiều (0,07154). Tính theo thời gian hình thành sai
khác trong vùng trình tự 582 cặp base này, thời điểm phân hóa giữa
hai giống chó trên đảo Phú Quốc vào khoảng 1430 năm trước
(0,07154 x 40000/2).
3.4. Nhận định về nguồn gốc của chó lƣng xoáy Phú Quốc
Dựa trên những kết quả thu được của đề tài, cùng với những
nghiên cứu trước đây về con đường di cư của chó trên thế giới, và
nguồn gốc hình thành giống chó dingo châu Úc, cũng như đặc điểm
di truyền của tính trạng có xoáy lưng, có thể đưa ra giả thuyết về
nguồn gốc chó lưng xoáy Phú Quốc như sau:


22
Chó nhà được thuần hóa đầu tiên ở vùng ranh giới Việt Nam – Trung
Quốc và di cư về các vùng đất khác nhau hình thành nên sự đa dạng
và phân bố rộng của các giống chó ngày nay. Ngoài nhóm chó di
chuyển về phía Tây đến châu Âu, nhóm chó di chuyển lên phía Bắc,
thì tại địa điểm thuần hóa này, một nhóm chó đã di cư về phía Nam,
là tổ tiên của chó nhà Việt Nam ngày nay. Trong quá trình di cư về
phía Nam, sự giao phối giữa chó đực và chó sói cái mang haplotype
E đã bổ sung nguồn gen này vào vốn gen của loài chó. Khoảng 6780
năm trước, một nhóm chó nhà Việt Nam đã tách ra khỏi quần đàn,
hình thành một quần thể mới và di cư về phía Kiên Giang ngày nay.
Đến khoảng 1430 năm trước, quá trình di cư của con người từ đất
liền (tỉnh Kiên Giang ngày nay) đã mang đồng thời một nhóm các cá
thể chó nhà Việt Nam mang haplotype dòng A, B, C và E lên đảo
Phú Quốc. Những con chó này không có xoáy lưng, mang hai allele r
trên nhiễm sắc thể số 18. Tại đây, trong điều kiện cách ly địa lý,
nguồn dinh dưỡng bị hạn chế, allele r bị đột biến thành allele R ở

những con chó mang haplotype thuộc các haplogroup khác nhau. Sự
phát triển ưu thế của các cá thể mang haplotype E, cùng với sự lai
giống cận huyết do bị cách ly địa lý, đã góp phần nâng cao tần suất
haplotype E và allele R trong quần thể chó lưng xoáy Phú Quốc.


23

KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ
I. Kết luận
1. Từ 5567 trình tự được lưu trữ trên ngân hàng gen
GenBank, đã xây dựng được bộ cơ sở dữ liệu và công cụ định loại
nhanh haplotype HV1 DNA ty thể chó.
2. Đã xây dựng thành công quy trình tách chiết DNA từ lông
chó. Đã giải trình tự, phân tích và biên tập đoạn 582 cặp base vùng
HV1 DNA ty thể của 100 con chó lưng xoáy Phú Quốc và 100 con
chó nhà Việt Nam. Ở chó lưng xoáy Phú Quốc, 19 haplotype thuộc 4
haplogroup khác nhau được phát hiện, trong đó có đến 23 mẫu thuộc
haplogroup E hiếm. Trong khi đó, ở chó nhà Việt Nam có 24
haplotype thuộc 4 haplogroup khác nhau được phát hiện, trong đó có
4 mẫu thuộc haplogroup E hiếm.
3. Chó lưng xoáy Phú Quốc có sự đa đang di truyền vùng
HV1 DNA ty thể ở mức cao hơn nhiều so với các giống chó khác
trên thế giới, với độ đa dạng haplotype 0,9042 ± 0,0127 và độ đa
dạng nucleotide 0,014588 ± 0,007534.
Chó lưng xoáy Phú Quốc có mối quan hệ di truyền rất gần
gũi với chó nhà Việt Nam, với khoảng cách di truyền là 0,33899 và
quan hệ di truyền xa với chó Thái Lan, với khoảng cách di truyền lên
đến 2,27668.
4. Những dữ liệu khoa học nêu trên bước đầu đã khẳng định

chó lưng xoáy Phú Quốc bắt nguồn từ chó nhà Việt Nam và không
bắt nguồn từ chó Thái Lan như các nhận định trước đây. Các điều