nghiên cứu xây dựng và ứng dụng thử nghiệm quy trình tách chiết RNA virút từ các loại nhuyễn thể hai mảnh vỏ
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.64 MB, 89 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
--------------------------------------PHẠM TIẾN DŨNG
Phạm Tiến Dũng
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÀ ỨNG DỤNG THỬ NGHIỆM QUY
TRÌNH TÁCH CHIẾT RNA VI RÚT TỪ CÁC LOẠI NHUYỄN
THỂ HAI MẢNH VỎ.
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
KHOÁ
2015B
Hà Nội– Năm 2017
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
--------------------------------------Phạm Tiến Dũng
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÀ ỨNG DỤNG THỬ NGHIỆM QUY TRÌNH
TÁCH CHIẾT RNA VI RÚT TỪ CÁC LOẠI NHUYỄN THỂ HAI MẢNH
VỎ.
Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :
TS. LÊ QUANG HÒA
Hà Nội – Năm 2017
Luận văn thạc sĩ khoa học
Phạm Tiến Dũng
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. 4
LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................... 5
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................... 6
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................... 11
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN ........................................................................................ 13
1.1. Tình hình tiêu thụ và xuất khẩu nhuyễn thể hai mảnh vỏ ở Việt Nam ..... 13
1.2. Tác nhân gây ngộ độc thực phẩm phổ biến: Norovirus và HAV ............... 15
1.2.1. Norovirus ............................................................................................................. 16
1.2.2. Virút viêm gan A ................................................................................................. 17
1.3. Khó khăn khi phát hiện virút trong thực phẩm .......................................... 18
1.4. Chiến lƣợc phát hiện virút trong thực phẩm ............................................... 19
1.5. Quy trình tách chiết virút từ thực phẩm ...................................................... 19
1.5.1. Quy trình tách chiết virút từ thực phẩm bằng cách rửa giải và cô đặc virút ....... 19
1.5.2. Quy trình tách chiết virút từ thực phẩm bằng cách xử lý proteinase K .............. 23
1.5.3. Quy trình tách chiết trực tiếp virút từ thực phẩm ................................................ 24
1.6. Quy trình tinh sạch dịch rửa giải / cô đặc virút hoặc RNA sau khi tách
chiết .................................................................................................................. 24
1.7. Kiểm soát quá trình tách chiết và tinh sạch RNA virút từ thực phẩm ...... 27
1.8. Các phƣơng pháp phát hiện Norovirus và HAV.......................................... 28
1.8.1. Phương pháp sử dụng kính hiển vi điện tử ......................................................... 28
1.8.2. Kỹ thuật ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) .................................. 28
1.8.3. Kỹ thuật RT-PCR (Reverse transcriptase-polymerase chain reaction) ............... 29
1.8.4. Kỹ thuật RT-LAMP (Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification) .............. 30
1.9. Phƣơng pháp phát hiện và định lƣợng HAV và NoV trong nhuyễn thể hai
mảnh vỏ hiện nay ISO/TS 15216-1:2013 và ISO/TS 15216-2:2013 ............ 30
1
Luận văn thạc sĩ khoa học
Phạm Tiến Dũng
1.9.1. Nguyên tắc của phương pháp ISO ...................................................................... 30
1.9.2. Các nghiên cứu trên thế giới sử dụng phương pháp ISO .................................... 31
CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ...................................................... 34
2.1. Vật liệu nghiên cứu ......................................................................................... 34
2.1.1. Chủng virút và mẫu chuẩn RNA ......................................................................... 34
2.1.2. Mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ .............................................................................. 34
2.1.3. Mồi và mẫu dò..................................................................................................... 34
2.1.4. Hóa chất............................................................................................................... 34
2.1.5. Thiết bị ................................................................................................................ 35
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................... 35
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu ............................................................................................. 35
2.2.2. Phương pháp Trizol ............................................................................................. 37
2.2.3. Phương pháp tinh sạch bằng cột silica Purelink RNA mini Kit ......................... 38
2.2.4. Phương pháp xử lý mẫu bằng CTAB .................................................................. 39
2.2.5. Phương pháp kết tủa RNA bằng LiCl ................................................................. 40
2.2.6. Phương pháp tinh sạch bằng bi từ silica.............................................................. 41
2.2.7. Phương pháp Real-time RT-PCR ........................................................................ 41
2.2.8. Phương pháp tách chiết RNA virút theo ISO/TS 15216-2:2013 ........................ 43
2.2.9. Phương pháp nhiễm chủ động Mengovirus, Norovirus và HAV theo ISO ..... 44
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................... 45
3.1. Hiệu quả tách chiết và tinh sạch RNA Mengovirus của các phƣơng pháp
dựa trên Trizol và màng silica. ...................................................................... 45
3.1.1. Hiệu quả tách chiết và tinh sạch RNA Mengovirus của phương pháp A (Trizol)
46
3.1.2. Hiệu quả tách chiết và tinh sạch RNA Mengovirus của phương pháp B (Trizol và
tinh sạch bằng Purelink RNA mini Kit) .............................................................. 48
3.1.2. Hiệu quả tách chiết và tinh sạch RNA Mengovirus của phương pháp C (Trizol,
tinh sạch bằng Purelink RNA mini Kit và kết tủa với LiCl). .............................. 49
2
Luận văn thạc sĩ khoa học
Phạm Tiến Dũng
3.1.3. Hiệu quả tách chiết và tinh sạch RNA Mengovirus của phương pháp D (Trizol
kết hợp với Purelink RNA mini Kit và xử lý với CTAB) ................................... 50
3.1.3. Hiệu quả tách chiết và tinh sạch RNA Mengovirus của phương pháp E (Trizol,
tinh sạch bằng Purelink RNA mini Kit, xử lý bằng CTAB và kết tủa với LiCl) 51
3.1.6. Tổng hợp kết quả tách chiết và tinh sách RNA Mengovirus của các phương pháp
dựa trên Trizol và màng silica ............................................................................. 53
3.2. Hiệu quả tinh sạch RNA Mengovirus bằng bi từ silica ............................... 57
3.2.1. Tối ưu lượng bi từ silica sử dụng để tinh sạch RNA Mengovirus đạt hiệu quả
cao 57
3.2.2. Tối ưu nồng độ cồn trong dịch nổi khi ủ với bi từ silica để tinh sạch RNA
Mengovirus đạt hiệu quả cao .............................................................................. 58
3.2.3. Tối ưu nhiệt độ rửa giải RNA Mengovirus khi tinh sạch bằng bi từ silica ......... 59
3.3. So sánh hiệu quả tách chiết RNA virút giữa phƣơng pháp E và phƣơng
pháp ISO trên các mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ đƣợc nhiễm chủ động... 61
3.3.1. So sánh hiệu suất thu hồi RNA Mengovirus của các mẫu hàu, ngao và vẹm
được nhiễm chủ động 4 ngưỡng virút. .............................................................. 63
3.3.2. So sánh hiệu quả tách chiết RNA virút giữa phương pháp E và phương pháp
ISO trên mẫu hàu được nhiễm chủ động............................................................. 64
3.3.3. So sánh hiệu quả tách chiết RNA virút giữa phương pháp E và phương pháp
ISO trên mẫu ngao được nhiễm chủ động........................................................... 65
3.3.4. So sánh hiệu quả tách chiết RNA virút giữa phương pháp E và phương pháp
ISO trên mẫu vẹm được nhiễm chủ động ........................................................... 67
3.3.5. Tổng hợp kết quả so sánh phương pháp E và phương pháp ISO khi tách chiết
RNA từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ được nhiễm chủ động virút ............................ 69
3.4. So sánh hiệu quả tách chiết của phƣơng pháp ISO và phƣơng pháp E khi
tách chiết NoV từ mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ tự nhiên .......................... 71
3.5. Ứng dụng thử nghiệm phƣơng pháp E để tách chiết RNA virút từ nhuyễn
thể 2 mảnh vỏ................................................................................................... 75
CHƢƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................... 78
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 81
3
Luận văn thạc sĩ khoa học
Phạm Tiến Dũng
LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Quang Hòa, trưởng
phòng thí nghiệm Kỹ thuật gen, Trung tâm nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh
học, viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách khoa
Hà Nội đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn
thành luận văn.
Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn các thầy, cô trong Viện đã nhiệt tình giảng dạy và
giúp đỡ trong quá trình học tập và nghiên cứu. Qua đây, tôi cũng xin chân thành cảm
ơn các cán bộ phòng thí nghiệm viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm,
các bạn sinh viên, học viên trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong quá
trình thí nghiệm.
Bên cạnh đó, tôi cũng xin chân thành cảm ơn TS. Elisabetta Suffredini (Istituto
Superiore di Sanità) đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn.
Đặc biệt là tôi xin chân thành cảm ơn Bộ Khoa Học Công Nghệ đã cấp kinh phí
cho nhiệm vụ Nghị Định Thư giữa Việt Nam và Cộng hòa Ý với tiêu đề “Nghiên cứu
phát triển phương pháp, công cụ phân tích nhanh vi sinh vật gây bệnh và độc tố
trong các sản phẩm thủy sản”, mã số : 06/2014/HĐ-NĐT để tôi có thể hoàn thành
được nghiên cứu này.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè đã động viên
giúp đỡ, tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận văn.
Tôi xin trân trọng cảm ơn !
Học viên
Phạm Tiến Dũng
4
Luận văn thạc sĩ khoa học
Phạm Tiến Dũng
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan những số liệu được công bố trong đề tài : “Nghiên cứu xây
dựng và ứng dụng thử nghiệm quy trình tách chiết RNA virút từ các loại nhuyễn
thể hai mảnh vỏ” là trung thực, do tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS. Lê Quang
Hòa và chưa từng được công bố trong công trình khoa học khác.
Học viên
Phạm Tiến Dũng
5
Luận văn thạc sĩ khoa học
Phạm Tiến Dũng
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Tên đầy đủ/ thuật ngữ
Từ viết tắt
AdV
Adenovirus
BSA
bovine serum albumin
CIAA
Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1)
CTAB
Cetyl trimethylammonium bromide
DNA
Deoxyribonucleic acid
ELISA
Enzyme-linked immunosorbent assay
EtOH
Ethanol
G
Genogroup
HAV
Hepatitis A virus
ISO
International Organization for Standardization
LBM
Live bivalve molluscs
LiCl
Lithium chloride
NoV
Norovirus
ORF
Open reading frame
RNA
Ribonucleic acid
RoV
Rotavirus
RT-LAMP
Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification
RT-PCR
Reverse transcriptase polymerase chain reaction
RT-qPCR
Real time Reverse transcriptase polymerase chain reaction
6
Luận văn thạc sĩ khoa học
Phạm Tiến Dũng
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Một số lô hàng nhuyễn thể Việt Nam xuất khẩu sang châu Âu bị phát hiện
nhiễm Norovirus………………………………………………………………………...14
Bảng 1.2. Đệm rửa giải và các chất thêm vào để tách chiết virus từ mẫu thực phẩm..21
Bảng 1.3. Thuận lợi và khó khăn của các phương pháp được sử dụng để cô đặc hạt
virút……………………………………………………………………………………...23
Bảng 1.4. Tổng kết các phương pháp ly giải virus, cô đặc và tách chiết axit nucleic từ
nhuyễn thể hai mảnh vỏ dựa trên kỹ thuật RT-PCR…………………………………..26
Bảng 2.1. Trình tự mồi và mẫu dò định lượng Mengovirus, NoV và HAV sử dụng
trong phản ứng RT-qPCR………………………………………………………………42
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng Real-time RT-PCR định lượng Mengovirus, NoV và
HAV..................................................................................................................................42
Bảng 2.3. Chu trình nhiệt phản ứng Real-time RT-PCR định lượng Mengovirus, NoV
và HAV.............................................................................................................................43
Bảng 3.1. Kết quả đánh giá hiệu quả tách chiết và tinh sạch của phương pháp A
(Trizol) bằng kỹ thuật RT-qPCR……………………………………………………….47
Bảng 3.2. Kết quả đánh giá hiệu quả tách chiết và tinh sạch của phương pháp B
(Trizol kết hợp với Purelink RNA mini Kit) bằng kỹ thuật RT-qPCR………………...49
Bảng 3.3. Kết quả đánh giá hiệu quả tách chiết và tinh sạch của phương pháp C
(Trizol kết hợp với Purelink RNA mini Kit và kết tủa RNA bằng LiCl) bằng kỹ thuật
RT-qPCR………………………………………………………………………………..50
Bảng 3.4. Kết quả đánh giá hiệu quả tách chiết và tinh sạch RNA Mengovirus của
phương pháp D (Trizol kết hợp với Purelink RNA mini Kit và xử lý CTAB) bằng kỹ
thuật RT-qPCR…………………………………………………………………………51
Bảng 3.5. Kết quả đánh giá hiệu quả tách chiết và tinh sạch RNA Mengovirus của
phương pháp E (Trizol kết hợp với Purelink RNA mini Kit, xử lý với CTAB rồi kết tủa
RNA bằng LiCl) bằng kỹ thuật RT-qPCR……………………………………………..52
Bảng 3.6. Hiệu quả tách chiết và tinh sạch RNA Mengovirus của các phương pháp
dựa trên Trizol và màng silica…………………………………………………………53
7
Luận văn thạc sĩ khoa học
Phạm Tiến Dũng
Bảng 3.7. Kết quả tối ưu lượng bi từ silica sử dụng để tinh sạch RNA Mengovirus đạt
hiệu quả cao……………………………………………………………………………..58
Bảng 3.8. Kết quả tối ưu nồng độ cồn trong dịch nổi khi ủ với bi từ silica để tinh sạch
RNA Mengovirus đạt hiệu quả cao……………………………………………………..59
Bảng 3.9. Kết quả tối ưu nhiệt độ rửa giải RNA Mengovirus khi tinh sạch bằng bi từ
silica……………………………………………………………………………………..60
Bảng 3.10. nồng độ HAV và NoV trong các ngưỡng được nhiễm chủ động vào mẫu
nhuyễn thể hai mảnh vỏ………………………………………………………………..61
Bảng 3.11. nồng độ phiên bản thể gen của HAV và NoV trong các plasmid dựng
đường chuẩn định lượng RT-qPCR…………………………………………………...61
Bảng 3.12. So sánh hiệu suất thu hồi RNA Mengovirus của các mẫu hàu, ngao và vẹm
được nhiễm chủ động 4 ngưỡng virút………………………………………………....63
Bảng 3.13. So sánh hiệu quả tách chiết RNA virút giữa phương pháp E và phương
pháp ISO trên mẫu hàu được nhiễm chủ động……………………………………….64
Bảng 3.14. So sánh hiệu suất thu hồi RNA của Norovirus GI trong mẫu hàu được
nhiễm chủ động giữa phương pháp E và phương pháp ISO………………………....64
Bảng 3.15. So sánh hiệu suất thu hồi RNA của Norovirus GII trong mẫu hàu được
nhiễm chủ động giữa phương pháp E và phương pháp ISO…………………………65
Bảng 3.16. So sánh hiệu suất thu hồi RNA của HAV trong mẫu ngao được nhiễm chủ
động giữa phương pháp E và phương pháp ISO……………………………………..65
Bảng 3.17. So sánh hiệu suất thu hồi RNA của Norovirus GI trong mẫu ngao được
nhiễm chủ động giữa phương pháp E và phương pháp ISO………………………...66
Bảng 3.18. So sánh hiệu suất thu hồi RNA của Norovirus GII trong mẫu ngao được
nhiễm chủ động giữa phương pháp E và phương pháp ISO………………………...66
Bảng 3.19. So sánh hiệu suất thu hồi RNA của HAV trong mẫu vẹm được nhiễm chủ
động giữa phương pháp E và phương pháp ISO…………………………………….67
Bảng 3.20. So sánh hiệu suất thu hồi RNA của Norovirus GI trong mẫu vẹm được
nhiễm chủ động giữa phương pháp E và phương pháp ISO………………………..68
8
Luận văn thạc sĩ khoa học
Phạm Tiến Dũng
Bảng 3.21. So sánh hiệu suất thu hồi RNA của Norovirus GII trong mẫu vẹm được
nhiễm chủ động giữa phương pháp E và phương pháp ISO………………………….68
Bảng 3.22. So sánh phương pháp E và phương pháp ISO khi tách chiết RNA của HAV
từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ được nhiễm chủ động virút………………………………69
Bảng 3.23. So sánh phương pháp E và phương pháp ISO khi tách chiết RNA của NoV
GI từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ được nhiễm chủ động virút…………………………..69
Bảng 3.24. So sánh phương pháp E và phương pháp ISO khi tách chiết RNA của NoV
GII từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ được nhiễm chủ động virút…………………………70
Bảng 3.25. Kết quả định lượng NoV GI và NoV GII trong 20 mẫu nhuyễn thể hai
mảnh vỏ khi tách chiết bằng cả phương pháp ISO và phương pháp E……………...72
Bảng 3.26. Kết quả định lượng các loại virút bằng RT-qPCR khi ứng dụng phương
pháp E để tách chiết 30 mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ thu thập tại Việt Nam………76
Bảng 3.27. Phân tích kết quả sử dụng phương pháp E định lượng RNA của HAV và
NoV trong 30 mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ thu thập tại Việt Nam…………………77
9
Luận văn thạc sĩ khoa học
Phạm Tiến Dũng
DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THI
Hình 1.1. Một số món ăn làm từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ…………………….......................13
Hình 1.2. Norovirus…………………………………………………………………………....17
Hình 1.3. Virút viêm gan A………………………………………………………………..…..18
Hình 1.4. Quy trình phân tích các loại mẫu theo tiêu chuẩn ISO……………………………24
Hình 1.6. Mengovirus……………………………………………………………………….....27
Hình 2.1. Thiết kế nghiên cứu xây dựng phương pháp mới dựa trên Trizol và màng silica
tách chiết và tinh sạch RNA virút đạt hiệu quả cao………………………………………..…35
Hình 2.2. Sự phân pha và kết tủa RNA trong phương pháp Trizol………………………..…38
Hình 2.3. Quy trình tinh sạch RNA bằng cột silica………………………………………...…39
Hình 3.1: Các bước chính trong quy trình tách chiết RNA virút từ mẫu nhuyễn thể hai mảnh
vỏ sau khi đã xây dựng xong………………………………………………………………..…55
Hình 3.2. Đồ thị so sánh lượng Norovirus GI phát hiện được giữa phương pháp ISO và
phương pháp E trong các mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ tự nhiên…………………………...73
Hình 3.3. Đồ thị so sánh lượng Norovirus GII phát hiện được giữa phương pháp ISO và
phương pháp E trong các mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ tự nhiên………………………...…74
Hình 4.1. Học viên Phạm Tiến Dũng quan sát TS. Elisabetta Suffredini làm thí nghiệm….80
10
Luận văn thạc sĩ khoa học
Phạm Tiến Dũng
MỞ ĐẦU
Phần lớn bệnh ngộ độc thực phẩm xuất phát từ một số nhóm virút đường ruột
như Norovirus (NoV), virút viêm gan A (HAV), Astrovirus, Sapovirus và Enterovirus.
Một nghiên cứu gần đây ở Mỹ ước tính rằng 59% các vụ ngộ độc thực phẩm là do yếu
tố virút. Đối với nhiều quốc gia, NoV trở thành độc tố thực phẩm thông báo. Khi so
sánh với NoV, ngộ độc do HAV thường ít gặp hơn. Tuy nhiên, virút này có thể dẫn đến
những chứng bệnh nghiêm trọng. Vụ ngộ độc do HAV lớn nhất (300.000 trường hợp ở
Thượng Hải, Trung Quốc, 1988) có liên quan đến việc tiêu thụ ngao nhiễm virút.
Dữ liệu gần đây ở Châu Âu cho thấy rằng nhuyễn thể hai mảnh vỏ sống (LBM)
là loại thực phẩm phổ biến nhất liên quan đến các vụ dịch ngộ độc thực phẩm do virút.
Trong một nghiên cứu được thực hiện ở 7 thành phố ven biển ở Trung Quốc trong
tháng 12 năm 2009 và tháng 11 năm 2011, NoV đã được phát hiện trong 13,3%
(112/840) của LBM. Tại Việt Nam, nhuyễn thể hai mảnh vỏ không chỉ là sản phẩm
thực phẩm giàu dinh dưỡng mà còn có chất lượng cảm quan đặc trưng, do đó thời gian
gần đây loại thực phẩm này đang rất được ưa chuộng cùng với sự đóng góp không nhỏ
vào kim ngạch xuất khẩu thủy hải sản của đất nước.
Phương pháp phổ biến nhất hiện nay được sử dụng để phân tích sự nhiễm tạp
của Norovirus và HAV trong thực phẩm là phương pháp ISO/TS 15216-2:2013; trong
phương pháp này, RNA virút được ly giải bằng proteinase K cùng với guanidine
thiocyanate sẽ được hấp thụ vào silica. Trình tự mục tiêu của RNA virút sau đó sẽ được
khuếch đại và phát hiện dựa trên kỹ thuật RT-qPCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao.
Hiện nay, đây là phương pháp tiêu chuẩn nhưng vẫn có những mặt hạn chế như yêu
cầu thiết bị NucliSENS miniMAG (Biomerieux) – thiết bị này không phải phòng thí
nghiệm nào cũng chuẩn bị được và hiệu suất thu hồi RNA virút rất thấp.
Vì những nhược điểm đó, mục tiêu của luận văn này là phát triển một phương
pháp tách chiết RNA virút từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ mới không yêu cầu cao về thiết
11
Luận văn thạc sĩ khoa học
Phạm Tiến Dũng
bị, ngoài ra có thể loại bỏ chất ức chế mà vẫn đạt hiệu suất thu hồi cao. Do đó, đề tài
“Nghiên cứu xây dựng và ứng dụng thử nghiệm quy trình tách chiết RNA virút từ
các loại nhuyễn thể hai mảnh vỏ” đã được thực hiện.
12
Luận văn thạc sĩ khoa học
Phạm Tiến Dũng
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN
1.1.
Tình hình tiêu thụ và xuất khẩu nhuyễn thể hai mảnh vỏ ở Việt Nam
Thời gian gần đây tại Việt Nam, trong số các sản phẩm thực phẩm không gia
nhiệt thì nhuyễn thể hai mảnh vỏ là sản phẩm được tiêu thụ với số lượng lớn do có chất
lượng cảm quan đặc trưng với hàm lượng chất dinh duỡng cao hơn những sản phẩm
cùng loại; đặc biệt, sản lượng xuất khẩu các loại nhuyễn thể hai mảnh vỏ của nước ta
sang các thị trường chung Châu Âu đã tăng nhanh trong những năm gần đây. Theo số
liệu của Hải Quan Việt Nam, trong 11 tháng đầu năm 2016 kim ngạch xuất khẩu của
nhuyễn thể hai mảnh vỏ đạt 75 triệu USD và dự kiến tới năm 2020 con số này sẽ tăng
gấp đôi lên 150 triệu USD, điều này cho thấy tầm quan trọng của việc xuất khẩu
nhuyễn thể hai mảnh vỏ cũng như tốc độ phát triển nhanh chóng của ngành.
Hình 1.1. Một số món ăn làm từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ
Tuy nhiên, trong sáu tháng đầu năm 2014, Cơ quan thẩm quyền Châu Âu (EU)
đã cảnh báo 23 lô hàng nhuyễn thể hai mảnh vỏ của Việt Nam về chỉ tiêu Norovirus.
Đến tháng 7 năm 2014, Cục quản lý chất lượng Nông lâm sản và Thủy sản thuộc Bộ
Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đã ra công văn số 1349 /QLCL-CL1 yêu cầu về
13
Luận văn thạc sĩ khoa học
Phạm Tiến Dũng
việc lấy mẫu giám sát nhuyễn thể hai mảnh vỏ [6]. Có thể nhận thấy, vấn đề nhiễm
Norovirus trong thực phẩm không những ảnh hưởng lớn đến sức khỏe người tiêu dùng
mà còn gây tác động không nhỏ đến nền kinh tế quốc dân và tính cạnh tranh lành mạnh
của thực phẩm Việt. Bên cạnh Norovirus, virút viêm gan A (HAV) là một trong những
loại virút có khả năng truyền nhiễm cao nhất, gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe cộng
đồng, đặc biệt là tại những quốc gia đang phát triển. Nguyên nhân chính của việc lây
nhiễm HAV là việc sử dụng nước và các sản phẩm thực phẩm tươi sống hoặc nấu
không kỹ, trong đó các loại nhuyễn thể hai mảnh vỏ là tác nhân phổ biến mang HAV
do kiểu sinh sống lọc nước để lấy thức ăn của chúng.
Bảng 1.1. Một số lô hàng nhuyễn thể Việt Nam xuất khẩu sang châu Âu bị
phát hiện nhiễm Norovirus
STT
1
2
3
4
5
6
7
8
Mặt hàng nhiễm
Norovirus
Ngao đông lạnh
Ngao nấu chín
đông lạnh
Ngao chần đông
lạnh
Ngao nguyên liệu
đông lạnh
Ngao trắng đã chế
biến đông lạnh
Ngao đông lạnh
nguyên con
Ngao trắng đông
lạnh
Ngao đông lạnh
nguyên vỏ
Nƣớc nhập
khẩu
Tây Ban Nha
Ngày lấy
mẫu
12/01/2014
Ngày thông
báo
07/02/2014
Mã trích
dẫn
2014.0186
Bồ Đào Nha
27/02/2014
13/03/2014
2014.ALZ
Tây Ban Nha
12/03/2014
01/04/2014
2014.AOH
Tây Ban Nha
28/03/2014
24/04/2014
2014.0558
Tây Ban Nha
27/06/2014
14/07/2014
2014.BDO
Ý
18/08/2014
26/08/2014
2014.BJO
Tây Ban Nha
19/02/2015
12/03/2015
2015.AKZ
Ý
24/03/2015
02/04/2015
2015.0424
Nguồn: CEERAM
Hiện nay, cùng với sự phát triển của kinh tế xã hội, sản lượng tiêu thụ các loại
nhuyễn thể hai mảnh vỏ ở nước ta có những bước nhảy vọt. Đặc biệt, một số loại
nhuyễn thể hai mảnh vỏ đã bước đầu được xuất khẩu sang Cộng đồng chung Châu Âu,
Nhật Bản và các nước trong khu vực. Điều này đặt ra nhu cầu cấp thiết phải có một
14
Luận văn thạc sĩ khoa học
Phạm Tiến Dũng
công cụ kiểm soát sự nhiễm tạp của NoV và HAV trong các sản phẩm nhuyễn thể hai
mảnh vỏ. Ngoài các số liệu báo cáo dịch tễ, những lô hàng nhuyễn thể xuất khẩu của
Việt Nam sang các nước châu Âu thường xuyên bị phát hiện chứa Norovirus.
Các lô sản phẩm xuất khẩu, chỉ với 1 mẫu bị phát hiện nhiễm Norovirus sẽ ngay
lập tức bị trả lại, tiêu hủy hoặc rút hết khỏi thị trường nước nhập khẩu. Với việc chiếm
tới 8-10% trong các mặt hàng thủy sản xuất khẩu, vấn đề nhuyễn thể bị trả lại gây ra
thiệt hại lớn về kinh tế. Hơn nữa, các lô hàng này chỉ được phát hiện nhiễm virus khi
đã chuyển sang nước đối tác, gây mất uy tín trên thị trường nhuyễn thể Thế giới. Tại
Việt Nam, còn hạn chế trong khâu kiểm tra chất lượng sản phẩm trước khi xuất khẩu.
Các phương pháp phát hiện Norovirus trong nhuyễn thể hiện nay tương đối phức tạp,
đòi hỏi kĩ thuật và chi phí cao để có thể phát hiện lượng Norovirus thấp trong các mẫu
nhuyễn thể.
1.2.
Tác nhân gây ngộ độc thực phẩm phổ biến: Norovirus và HAV
Trên thế giới, việc đảm bảo chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm là một trong
những vấn đề được lưu tâm hàng đầu. Ở Mỹ, theo ước tính có khoảng 67% các bệnh do
thực phẩm gây ra bởi virút, nhiều gấp đôi so với nguyên nhân do vi khuẩn (30%) và ký
sinh trùng (3%). Nghiên cứu về nhóm các virút gây ô nhiễm nguồn nước có khả năng
lây nhiễm sang thực phẩm, có đến hơn 100 loại virút được tìm thấy trong đường ruột
người. Trong số các virút này, Norovirus (NoV) và Hepatitis A virus (HAV) là hai
virút gây bệnh phổ biến, chiếm tỉ lệ lần lượt là 83,7% và 12,8%, được tìm thấy nhiều
nhất ở nhóm thủy hải sản [18]. Nhuyễn thể hai mảnh vỏ có thể sống được cả ở vùng
nước ngọt và nước mặn, do tập tính lọc nước để lấy thức ăn nên chúng có thể tích trữ
rất nhiều loại virút trong ống tiêu hóa, nổi bật trong đó phải kể đến Norovirus và HAV.
15
Luận văn thạc sĩ khoa học
Phạm Tiến Dũng
1.2.1. Norovirus
Nghiên cứu dịch tễ học đầu tiên chứng minh mối liên hệ giữa virút gây viêm dạ
dày ruột và nhuyễn thể hai mảnh vỏ được thực hiện vào mùa đông năm 1976-1977 tại
Anh, nơi xảy ra 33 vụ ngộ độc riêng biệt với khoảng 800 người nhập viện do sử dụng
sò đã qua nấu chín. Norovirus là virút gây bệnh xuất hiện nhiều nhất trong các loại
nhuyễn thể hai mảnh vỏ, chiếm 83,7%, tiếp đến là HAV chiếm 12,8%. Rất nhiều các
nghiên cứu khẳng định sự có mặt của Norovirus trong nhuyễn thể hai bảnh vỏ đã được
thực hiện tại châu Âu, châu Đại Dương, Mỹ và Úc [22].
Theo các số liệu thống kê dịch tễ gần đây, Norovirus được coi là một trong những
nguyên nhân chính gây bệnh lan truyền do thực phẩm trên toàn thế giới. Ở Mỹ,
Norovirus là nguyên nhân của 2/3 các ca viêm dạ dày ruột do thực phẩm nhiễm khuẩn
(23 triệu ca/năm). Các đối tượng thường bị bệnh viêm dạ dày ruột do Norovirus bao
gồm trẻ em, người già, người bị suy giảm miễn dịch, nhân viên nhà hàng, bệnh viện,
quân đội, người đi du lịch đến các vùng có dịch [15]. Đối với trẻ em, Norovirus là
nguyên nhân thứ hai, sau Rotavirus gây ra bệnh viêm dạ dày ruột cấp tính ở trẻ dưới
năm tuổi. Ước tính hàng năm trên thế giới, Norovirus gây ra ít nhất trên 2 triệu ca viêm
dạ dày ruột cấp tính ở trẻ em với trên 200 000 trường hợp bị tử vong. Tại các nước phát
triển, Norovirus là nguyên nhân dẫn tới 900.000 ca nhập viện mỗi năm, trong đó có
64.000 ca ở trẻ dưới 5 tuổi . Ở các nước đang phát triển, ít nhất trên 1,1 triệu ca tiêu
chảy ở trẻ dưới 5 tuổi trong đó hơn 218.000 ca tử vong do Norovirus gây ra [28]. Đến
nay, vacxin Rotavirus đã được phổ biến tại nhiều quốc gia, nên Norovirus có nguy cơ
trở thành tác nhân gây bệnh đường ruột ở trẻ em phổ biến nhất trong tương lai gần.
16
Luận văn thạc sĩ khoa học
Phạm Tiến Dũng
Hình 1.2. Norovirus
Ở nước ta, theo số liệu thống kê của Cục An toàn vệ sinh thực phẩm Bộ Y tế,
trong năm 2008, trên toàn quốc đã xảy ra 205 vụ ngộ độc thực phẩm làm 7.828 người
mắc và 61 người tử vong. Theo thống kê năm 2008, các vụ ngộ độc thực phẩm xảy ra
tập trung chủ yếu tại bếp ăn gia đình (54,6%), bếp ăn tập thể (15,6%), đám cưới/giỗ
(16,6%), tại các cơ sở thức ăn đường phố. Một nghiên cứu được thực hiện từ tháng
12/1999 đến tháng 11/2000, trong 448 mẫu phân trẻ em tiêu chảy tại Bệnh viện Nhi
Đồng I và Nhi Đồng II có 72 mẫu dương tính với Norovirus [9]. Nghiên cứu dịch tễ
học phân tử thực hiện năm 2007 (Nguyễn Vân Trang và cộng sự) đã chỉ ra trong 501
mẫu phân trẻ em bị viêm dạ dày ruột tại viện Nhi TW có 180 mẫu dương tính với
Norovirus [19].
1.2.2. Virút viêm gan A
Trong các vi sinh vật gây bệnh thực phẩm, các virút là một trong những tác nhân
gây bệnh thường gặp nhất. Theo các số liệu thống kê ở Mỹ, các virút là nguyên nhân
gây ra 66,6% các trường hợp ngộ độc thực phẩm trong khi đó Salmonella và
Campylobacter chỉ gây ra lần lượt 9,7% và 14,2% các vụ ngộ độc 13. Ước tính tại
Mỹ, hàng năm có khoảng 80000 ca nhiễm viêm gan A mới được ghi nhận 23. Ở Châu
Âu, Norovirus (NoV) và virút viêm gan A (HAV) được coi là các tác nhân gây bệnh
phổ biến nhất nếu xét về số lượng vụ dịch và số người bị mắc 6. Hai loại virút này
17
Luận văn thạc sĩ khoa học
Phạm Tiến Dũng
đều có khả năng lây nhiễm rất cao và có thể gây ra các vụ dịch lớn. Ví dụ như trong vụ
dịch ở Thượng Hải (Trung Quốc) vào năm 1988, đã có 250 000 người bị nhiễm HAV
sau khi tiêu thụ các loại ngao bị nhiễm 8.
Hình 1.3. Virút viêm gan A
Ở nước ta, cho đến thời điểm này vẫn chưa có các báo cáo về số lượng các vụ ngộ
độc thực phẩm do HAV nói riêng và virút gây bệnh thực phẩm nói chung. Tuy nhiên,
một nghiên cứu đã chỉ ra rằng có đến 97% số người có kháng thể kháng HAV trong
máu tại khu vực đồng bằng sông Cửu Long 10. Điều này cho thấy đa số người dân ở
nước ta đều đã tiếp xúc với HAV qua con đường thực phẩm.
1.3.
Khó khăn khi phát hiện virút trong thực phẩm
Phát hiện virút trong thực phẩm là một nhiệm vụ rất khó khăn vì các lý do chủ
yếu sau: virút không thể sinh trưởng bên ngoài vật chủ nên không thể sử dụng phương
pháp tăng sinh như đối với vi khuẩn, nồng độ virút trong thực phẩm thường rất thấp và
tồn tại nhiều chất ức chế phản ứng PCR trong thực phẩm. Trong việc phát hiện virút
trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ nói riêng, tồn tại một loại polysaccharide là glycogen có
mặt rất nhiều trong cơ thể khiến cho thành phần này thường có mặt trong mẫu sau khi
18
Luận văn thạc sĩ khoa học
Phạm Tiến Dũng
tách chiết RNA dẫn đến sự ức chế của phản ứng RT-PCR khi phát hiện virút. Điều này
đòi hỏi cần sử dụng thêm các phương pháp khác để loại bỏ chúng [7].
1.4.
Chiến lƣợc phát hiện virút trong thực phẩm
Hiện nay, chiến lược chung để phát hiện virút trong thực phẩm bao gồm 3 bước:
1) tách chiết virút, 2) tinh sạch RNA virút và 3) phát hiện RNA sau khi đã được tinh
sạch. Trong quá trình tách chiết virút, hạt virút được tách ra từ matrix thực phẩm, sau
đó được kết tủa xuống thể tích nhỏ và cuối cùng là loại bỏ các thành phần như
polysaccharide, protein và lipid gây ức chế khả năng phát hiện RNA [18, 44, 47].
Ngoài ra, virút cũng cần được cô đặc bởi vì thông thường chúng chỉ có mặt với liều
lượng rất thấp trong thực phẩm. Đối với nhuyễn thể hai mảnh vỏ, mức nhiễm tạp thông
thường từ 102 đến 104 phiên bản thể gen của virút trên 1 gam ống tiêu hóa [12, 32, 33].
Trong suốt quá trình phát hiện, kết quả âm tính giả và dương tính giả đều có thể xuất
hiện. Kết quả âm tính giả là do sự ức chế trong phản ứng phát hiện còn dương tính giả
là kết quả do khả năng nhiễm chéo. Vì vậy, trong quá trình phát hiện thường sử dụng
kiểm chứng âm và kiểm chứng dương.
1.5.
Quy trình tách chiết virút từ thực phẩm
Có rất nhiều quy trình đã được sử dụng để tách chiết virút từ thực phẩm, các quy
trình này có thể được chia làm 3 cách tiếp cận chính: 1) rửa giải virút và sau đó là cô
đặc - quy trình thông thường ; 2) xử lý bằng proteinase K - quy trình tiêu chuẩn mà
ISO đang sử dụng; và 3) tách chiết trực tiếp tiếp virút bao gồm cả quá trình rửa giải và
cô đặc – quy trình trong đề tài này được sử dụng.
1.5.1. Quy trình tách chiết virút từ thực phẩm bằng cách rửa giải và cô đặc virút
Quá trình này dựa trên việc sử dụng một loại đệm có khả năng rửa để tách virút
ra khỏi bề mặt thực phẩm và sau đó cô đặc dung dịch rửa giải virút và thường được sử
dụng đối với các loại thực phẩm chứa nhiều carbohydrate, nhiều chất béo, protein và
19
Luận văn thạc sĩ khoa học
Phạm Tiến Dũng
nhuyễn thể hai mảnh vỏ. Nhìn chung, bước rửa thường là sử dụng các loại đệm kiềm
tính hoặc trung tính. Để cô đặc, rất nhiều phương pháp được sử dụng như kết tủa với
PEG (polyethylene glycol), siêu ly tâm, siêu lọc, cô đặc miễn dịch và phân tách cation.
Rửa giải virút
Trong hầu hết các trường hợp, đệm kiềm tính với pH 9 – 10,5 được sử dụng để
giải phóng virút ra khỏi bề mặt thực phẩm. Môi trường kiềm cho phép hạt virút tách ra
khỏi matrix thực phẩm. Môi trường axit, ngược lại khiến cho virút càng bám chặt vào
bề mặt thực phẩm hơn [58]. Đệm trung tính có thể được sử dụng khi áp dụng siêu ly
tâm để cô đặc virút [1,45]. Một vài loại đệm khác đã được sử dụng như đệm phosphate
pH 7.6 đã được sử dụng để rửa giải HAV từ rau diếp và dâu tây [4] hay dùng để rửa
giải NoV và HAV từ hàu [34].
Dịch chiết thịt bò và glycine thường được sử dụng kết hợp để rửa giải virút vì
chúng làm giảm khả năng bám của virút vào matrix thực phẩm. Hơn nữa, nồng độ
protein lớn của dịch chiết thịt bò khiến cho NoV bị kết tụ lại cùng với PEG [29]. Đệm
kiềm tính với 1% dịch chiết thịt bò đã được sử dụng để tăng hiệu suất thu hồi HAV,
NoV và RoV từ quả mâm xôi lên đến 7; 3,5 và 5,7 lần. Tuy nhiên quá trình phát hiện
bằng phương pháp sinh học phân tử lại cho kết quả âm tính giả do sự có mặt của chất
ức chế [27, 47, 58]
Đệm Glycine nồng độ 0,05 M được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu [48,
52]. Pectinase cũng thường được bổ sung vào dịch rửa giải virút khi tách chiết từ các
thực phẩm dạng lỏng giàu carbohydrate bởi khả năng phá vỡ các liên kết pectin trong
hoa quả và rau xanh [34]. Bột đậu tương được sử dụng để giải phóng virút từ bề mặt
thực phẩm khi sử dụng phương pháp siêu ly tâm với hiệu suất tăng lên 10 lần [45].
Cuối cùng là Cat-floc đã được sử dụng để kết tụ virút từ mẫu thực phẩm rắn.
20
Luận văn thạc sĩ khoa học
Phạm Tiến Dũng
Bảng 1.2. Đệm rửa giải và các chất thêm vào để tách chiết virus từ mẫu thực phẩm [53]
Thành phần/ Điều kiện
Chi tiết
Chức năng
pH trung tính kiềm
pH 9,5 to 10,5 (kiềm) hoặc
pH 7 (trung tính)
Loại bỏ các hạt virus khỏi bề mặt
thực phẩm
Hệ đệm pH
Đệm Tris(−HCl)
Đệm Phosphate
Ngăn chặn giảm pH do tính axit
của nước trái cây hoặc rau củ
Cao thịt bò
1% to 3% (w/v)
Tạo điều kiện thuận lợi cho việc
kết tủa virút bằng PEG
Glycine
0,05 – 0,5 M
Giảm sự hấp thụ không đặc hiệu
của protein hoặc virút
Cat-floc® TL
Cải thiết kết tụ thực phẩm rắn
Chloroform và n-butanol
Phân tách pha hữu cơ (lipid) và
pha nước (virút)
Cô đặc virút
Phƣơng pháp kết tủa PEG: đây là phương pháp thường được sử dụng để cô
đặc hỗ trợ quá trình phát hiện sau này. Polyethylene glycol (PEG) thường được sử
dụng cho mục đích này bởi khả năng kết tủa virút ở pH trung tính ở nồng độ ion cao
mà không bị kết tủa cùng với các thành phần hữu cơ khác [36]. Trong nhuyễn thể hai
mảnh vỏ, rửa giải và kết tủa PEG đã cho kết quả hiệu suất thu hồi khác nhau khi phát
hiện NoV từ các toàn bộ cơ thể hay chỉ ở phần ống tiêu hóa của nhuyễn thể. Một số
nghiên cứu đã thu hồi được 5 – 22,4 phiên bản NoV trong 1,5 – 25 g mô nhuyễn thể [2,
16]. Trong khi nghiên cứu khác lại thông báo khả năng phát hiện cao hơn: 3 x 103
phiên bản NoV trong 1,25 g ống tiêu hóa của hàu [51]. Cách tiếp cận này đã được sử
dụng để chỉ ra mức nhiễm tạp của AdV và NoV ở loại vẹm ở Ma rốc và hàu ở Pháp
[28]. Đệm kiềm tính và trung tính cùng với kết tủa PEG đã được áp dụng trong phát
hiện NoV trong 2 vụ dịch liên quan đến hàu và ngao [17].
21
Luận văn thạc sĩ khoa học
Phạm Tiến Dũng
Phƣơng pháp siêu ly tâm: phương pháp này đã được sử dụng để cô đặc hạt
virút của HAV và NoV từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ và các nguồn thực phẩm giàu
carbohydrate và lipid. Khi so sánh với phương pháp kết tủa PEG, phương pháp siêu ly
tâm cho kết quả hiệu suất thu hồi thấp hơn với 0,1% ở NoV và 2,5% ở HAV khi tách
chiết virút từ dâu tây và quả mâm xôi [45]. Trong quá trình ly tâm, hạt virút sẽ được
kết tủa bởi lực ly tâm lên tới 120000 g. Phương pháp có một số nhược điểm như thiết
bị đắt tiền, vấn đề loại bỏ các thành phần của mẫu khỏi dịch rửa giải và kết tủa thường
rất khó để hòa tan [1].
Phƣơng pháp siêu lọc: đây là phương pháp cô đặc hạt virút dựa trên khối lượng
phân tử. Màng lọc được trang bị lỗ màng cho phép dịch lỏng và những phân tử nhỏ (50
– 100 kDa) đi qua còn virút được giữ lại trên màng lọc [32]. Tương tự như phương
pháp siêu ly tâm, dịch rửa giải virút phải cần thêm bước làm sạch trước để tránh tắc
màng. Ưu điểm của phương pháp này là những thành phần ức chế phản ứng RT-PCR
được phân tách khỏi hạt virút . Hiệu suất thu hồi có thể tăng lên bằng cách xử lý màng
lọc với bovine serum albumin (BSA) hoặc siêu âm [50]. Hiệu suất thu hồi của phương
pháp này khi tách chiết NoV từ rau xanh có thể lên tới 9% nhưng vẫn thấp hơn phương
pháp kết tủa PEG với 23%. Tuy nhiên, trong nghiên cứu khác khi tách chiết NoV từ
dâu tâu và quả mâm xôi phương pháp này lại hiệu quả hơn kết tủa PEG
Cô đặc miễn dịch: trong kỹ thuật này, bi từ được bao bọc bởi kháng nguyên có
khả năng gắn với hạt virút. Đối với NoV, kháng nguyên có thể là histo-bloodgroup
antigens (HBGA) nhóm A, B và H hoặc porcine gastric mucin - một loại protein trong
dạ dày lợn chịu được pH thấp [53]. Đối với HAV, kháng nguyên có thể là kháng thể
đơn dòng K3-2F2 [4]. Phương pháp này đã thành công khi ứng dụng trên một số loại
rau và hoa quả [40]. Ưu điểm của phương pháp này là khả năng gắn rất đặc hiệu với
virút khiến việc loại bỏ chất ức chế PCR không mấy khó khăn nhưng nhược điểm lại
cần thời gian dài để virút gắn được.
22
Luận văn thạc sĩ khoa học
Phạm Tiến Dũng
Phân tách cation: đây là phương pháp dựa trên giả thiết rằng virút mang điện
âm có khả năng gắn với hạt bi từ mang điện dương. Phương pháp này sử dụng hệ thống
làm giàu mẫu PathatrixTM (Matrix MicroScience, Newmarket, UK) đã ứng dụng để cô
đặc HAV từ một số loại thực phẩm như rau xanh, quả, hàu và bánh với hiệu suất thu
hồi dao động từ 17,0% đến 81,7% . Tuy nhiên, hiệu suất thu hồi NoV từ các loại thực
phẩm này lại thấp hơn rất nhiều trong nghiên cứu khác [40]. Hiệu quả của phương
pháp này cần phải được xem xét thêm nhưng nhược điểm của nó tương tự như phương
pháp siêu ly tâm vì đòi hỏi cao về thiết bị.
Bảng 1.3. Thuận lợi và khó khăn của các phương pháp được sử dụng để cô đặc hạt virút
Phƣơng pháp cô đặc
Ƣu điểm
Nhƣợc điểm
Kết tủa PEG
Rẻ và đơn giản
Cần điều chỉnh về pH trung tính
Siêu ly tâm
Kết quả ổn định
Cần các trang thiết bị chuyên dụng. Yêu cầu
mẫu thực phẩm không chứa virus khác
Miễn dịch
Đơn giản
Phụ thuộc vào độ đặc hiệu của kháng thể
1.5.2. Quy trình tách chiết virút từ thực phẩm bằng cách xử lý proteinase K
Phương pháp hiện nay được sử dụng phổ biến là xử lý bằng proteinase K và đun
nóng ở 65oC [26]. Trong phương pháp này, quá trình xử lý enzyme và nhiệt sẽ phá hủy
vỏ virút để giải phóng axít nucleic [43]. Cho đến nay, phương pháp này mới chỉ được
áp dụng trên nhuyễn thể nhưng đã cho kết quả đáng tin cậy trong nhiều vụ dịch NoV
và chính thức trở thành phương pháp tiêu chuẩn của ISO.
23
