Xây dựng phương pháp định lượng vitamin d2 trong sữa bằng HPLC

BOY TE
TRÜÔNG DAI HOC DUOC HÀ NÔI

BÙIVIÊT PHlTONG

XÂY DUNG
PHlTONG PHÂP DINH
LÜÛNG
•
•
•
VITAMIN D2 TRONG SÜA BÂNG HPLC

KHOÂ LU A
• n TÔT NGHIÊP
• DUOC
• s i DAI
• HOC
•
KHOÂ 2002-2007
/ :A

. r]

i- * ■l ;■
' ' v/ *7

\

Ngudi hucmg dân:

[7 - \

Tin',. V

h

V

CN. DOÀN THIHÜÔNG
Th.S TRAN NGUYÊN HÀ

Noi thuc hiêri:
PHÔNG HOÂ DÔC THl/C PHAM
TRUNG TÂM KIÉM NGHIÊM- VIÊN DINH DIJON G
Thài gian thuc hiên: 01/2007-05/2007

HA NOI THANG 5 NAM 2007


LÔI CÂM ON
Triïôc hêt tôi xin bày tô long biét cm sâu sàc nhât tôi Th.S Tràn
Nguyên Hà, Th.S Tràn Quang Thuÿ, CN, Doàn Thi Hiïômg là nhüng nguôi
dâ truc tiép huorng dân, dâ dành nhiêu thôi gian và tâm suc, kinh phi giüp do'
tôi trong suot quâ trinh nghiên cüru và hoàn thành khoâ luân tôt nghiêp này.
Tôi cüng xin trân trong câm cfn câc thày cô giâo, cân bô kÿ thuât viên
trong bô môn Hoâ Phân Tîch - Truông dai hoc Duac Hà Nôi dâ nhiêt tînh giüp
dô tao moi dieu kiên thuân loi cho tôi hoàn thành khoâ luân này.
Tôi xin bày tô long biét on toi câc cân bô cüa phông hoâ dôc thuc
phâm, trung tâm kiëm nghiêm- viên Dinh Duông dâ giüp âd vê hoâ chat cho
tôi trong quâ trinh thuc hiên dé tài.

Tôi xin chân thành câm on thu viên trucfng Dai hoc Duoc Hà Nôi dâ
cung câfp nhüng tài lieu càn thiét cho tôi trong quâ trinh thuc hiên dè tài.
Cuôi cùng tôi xin câm on gia dînh, ban bè và nhüng nguôi thân dâ dông
viên và hét long giüp dô tôi hoàn thành khoâ luân này.

Hà Nôi, thâng 5 nâm 2007
Bùi Viêt Phuong


BÂNG CHÜ VIÊT TÂT

ACN

: Acetonitril

HPLC

: Sac kÿ long hiêu nâng

MeOH

: Methanol

NXB

: Nhà xuât bân

PA

: Tinh khiét phân tfch

PDA

: Photo Diod Array

PL

: Phu lue

STT

: So thu”tu

TB

: Trung binh

THF

: Tetrahydrofuran

UV

: Tir ngoai


MUC LUC
DAT VAN D E .................................................................... ...............................1
PHAN 1: TễNG QUAN................................................................................. 3
1.1. VitaminD...................................................................................... 3

1.1.1. Cụng thỷc cõ'u tao................... ....................................... .. 3
1.1.2. Nguễn gục...........................................................................3
1.1.3. Trnh chõt............................................................................. 3
1.1.4. Tac dung duoc l v ca chộ tac dung................................. 4
1.1.5. Chợ dinh..............................................................................4
1.1.6. Cõc phirang phõp dinh lirỗrng vitamin D .............................4
1.1.7. Mot s6 nghiờn curu vờ vitamin D ................... .....................5
1.2. K thuõt sõc k long hiờu nng cao............................................... 9
1.2.1. Khõi niờm cobõn................................................................ 9
1.2.2. Cõc dai lirỗmg dc tnmg...................................................... 9
1.2.3. Hờ thụ'ng HPLC.................................................................11
1.2.4. Phatợnh........................................... .................................. 11
1.2.5. Pha dụng..................... ..................................................... 12
1.2.6. Phirang phõp dinh liùỗfng v tmh kột quõ trong HPLC......14
1.3. Mot so thụng so thong kờ de xur l v dõnh gia kột quõ................. 15
PHAN 2: NGUYấN LIEU, THIấT BI, PHĩONG PHP V KET QU
NGHIấN CtTU.................................... ...........................................................16
2.1. Nguyờn lieu v thiột b i ................................................................ 16
2.1.1. Dụ'i tuỗmg nghiờn cỷu........................................................16
2.1.2. Thiột bi v dung e u .......................... .................................16
2.1.3. Hoõ chõt, dung mụi v thuụ'c thỷ ...................................... 16
2.2. Phuong phõp nghiờn ciợu..............................................................17


2.2.1. Chuan bi dung dich gục v dung dich lm viờc cỹa
viatamin D 2.......................................................................17
2.2.2. Du dinh mot so diờu kiờn chay sõc k ..............................17
2.2.3. Thdm dinh phuong phõp................................................... 18
2.3.

Kột quõ nghiờn crùu..................................................................... 20
2.3.1. Nguyờn l xỹ l mõu.........................................................20
2.3.2. Xõc dinh diờu kiờn chay sõc k pha dõo...........................23
2.3.3. Khõo sõt su phự hỗfp cỹa hờ thong.................................... 25
2.3.4. Xõc dinh khoõng tuyộn trnh............................................. 26
2.3.5. Xõc dinh giụi han phõt hiờn v gioi han dinh luỗmg cỷa
vitamin D2.............................................................. ........ 29
2.3.6. Dõnh giõ dụ chrnh xõc cỹa phuong phõp..........................30
2.3.7. Xõc dinh tmh dung cỹa phuong phõp................................31

2.4.Bn luõn.........................................................................................34
PHAN 3: KẫT LUN V DE XUAT........................................................35
3.1. Ket luõn........................................................... ............................... 35
3.2. De xuõt............................................. .............................................. 35

ằ


DAT VAN DE
Dở tụn tai, phõt triởn, cõi thiờn noi giụng, co thở chỹng ta luụn cõn duoc
cung cap dy dỷ cõc chat dinh duụng v nguụn cung cõp cõc chat ny chfnh l
thuc phõm hng ngy. Cõc chat dinh duụng l cõc nhụm cung cõp nng luong
cho co thở nhu glucid, lipid, protein, nhụm cung cõp muụ'i khoõng, nhụm cung
cõp cõc loai vitamin v nuục. Trong dụ vitamin l nhụm cụ vai tro eue k quan
trong tụi sure khoố cua mụi con nguối.
Vitamin khụng thở thiộu duoc dụi vụi su ton tai v phõt triởn cỹa mụi co
thở sụng. Vitamin cụ vai trụ tao ra cõc coenzim cn thiột trong cõc phõn irng
chuyởn hoõ khõc nhau. Tõt cõ cõc quõ trinh sụng gõn liờn vụi su trao doi chat
trong co thở dờu cụ su tham gia truc tiộp cỹa vitamin. Nguụn cung cõp vitamin
chỷ yộu l tir thỹc n do võy trong co thở cụ thở thiộu hay thựa vitamin. Nộu

co thở bi thiộu vitamin no dụ sờ sinh ra mot s6 cõn bờnh nhõt dinh nhu thiộu
vitamin A dở dõn tụi bờnh mự lo, thiộu vitamin BI dờ bi bờnh tờ phự, thiộu
vitamin PP mõc bờnh pellagra, thiộu vitamin D bi bờnh rickets..., tuy nhiờn
mot sụ loai vitamin m du thựa cỹng cụ thở gõy tõc hai dụi vụi co thở nhu
vitamin A, D, K. Mot trong nhỹng loai vitamin khõ quan trong giỹp viờc hùnh
thnh, phõt triởn cõc tộ chirc xuong cỹa co thở khụng thở khụng dờ cõp dộn dụ
l vitaminD.
Rat nhiờu thuc phõm chỹa vitamin D nhu sỷa, bụt dinh duụng, cõc sõn
phõm cõ, trirng... Do dụ, xõc dinh hm luong vitamin D trong thuc phõm giỹp
dõnh giõ dung giõ tri dinh duụng cỹa thuc phõm v khuyộn cõo cho cõc b me
nuụi con nhụ, hay nguụi lụn tuội khi sỹ dung bo sung loai vitamin D ny.
Do dụ tụi tiộn hnh lm dờ ti: Xõy dung phuong phõp dinh luong
vitamin D2 trong sỷa bng HPLC.
Dờ ti ny nham mue tiờu:

1


Xây dung quy trînh kÿ thuât dinh luong vitamin D2 trong sûa dë ûng
dung trong kiëm soât chat luong sân phâm và chàm soc suc khoê công dông.
Chüng tôi hi vong ràng két quâ nghiên ciïu này së cô giâ tri thuc tiên
cao, gôp phàn vào viêc thuc dây ûng dung sàc kÿ long hiêu nâng cao dë dinh
luong câc chât trong thuc phâm.

2


PHAN 1. TÔNG QUAN
1.1

Vitamin D.[2],[4],[6]

1.1.1 Công thurc câu tao [6]

C27H440 ( M = 384,6)
Tên khoa hoc: ergocalciferol
1.1.2 Nguôn goc
Vitamin D co nhiêu trong câ bien, thit, trûng, süa và trong mot so thuc
phâm bô sung. Môt so nghiên cûu dua ra hàm luong vitamin D trong câ thu là
15|a,g/100g, trong gan bô l|ug/100g, trong trutng gà 2|ig/100g, trong nam rom
là 2|ig/100g
Trong co thë, vitamin D duoc tông hop à câc té bào ducfi da nhô ânh
sâng tu ngoai. Vai tro lôn nhàt cüa vitaminD là duy tri nông dô calci trong
mâu. Do do nhiêu bâo cao dua ra cân bo sung khoâng 400 don vi vitamin D
môi ngày trong khi uông calci diêu tri bêng loâng xuong.
Vitamin D côn co nguôn gôc tông hop hoâ hoc và sinh hoc.
1.1.3 Tmh chat [4]
Tinh thë hînh kim, không màu, không mùi, không tan trong nuôc, dë
tan trong câc dung môi htru co nhu ethanol, ether, cloroform, và câc chat béo.
Vitamin D không bên vôi nhiêt dô, không khi, ânh sâng.

3


1.1.4 Tac dung dirỗrc l v co chộ tac dung [2],[6]
Vitamin D tham gia vo quõ trinh tao xuong: lm tõng hõp thu calci v
phosphat ruụt, tõng hõp thu calci ụng luỗm gõn, tham gia vo quõ trinh
calci hoõ sun tõng truụng. Vi võy vitamin D rat cõn cho su phõt triởn binh
thucmg cỹa trờ em.
Diờu ho nụng dụ calci trong mõu: Nộu cõc quõ trinh trờn khụng cung

cõp du calci, lm nụng dụ calci mõu giõm thi vitamin D ( kột hop vụi hormon
tuyộn cõn giõp) sở phõt huy calci tuf xuong ra.
Ngoi ra vitamin D con tham gia biờt hoõ tộ bo biởu mụ. Gõn dõy cõc
nh khoa hoc dang nghiờn cỷu tõc dung ỷc chộ tõng sinh tộ bo ung thu.
Vi thộ khi thiộu vitamin D, ruụt khụng hõp thu dỹ calci v phospho lm
giõm calci huyột. Khi dụ calci bi huy dụng tự xuong ra gõy hõu quõ l trố em
chõm lụn, coi xuong, chõm biột di, chõm km thụp, nguụi lụn sở bi loõng
xuong, xop xuong.
1.1.5 Chù dinh [2],[6]
-Phong v diờu tri coi xuong do thiộu vitamin D.
-Phong v diờu tri loõng xuong, dờ gõy xuong.
-Chụng co giõt do suy tuyộn cõn giõp.
-Ha calci huyột.
-Mot sụ bờnh ngoi da nhu chiợng xo ciợng bi.
1.1.6 Cõc phuong phõp dinh liùomg vitamin D [4]
- Phuong phõp hụa hoc
+ Nguyờn tõc: Tiộn hnh lm mõu chuõn v mõu thỹr. Cho vitamin D tao
mu vng vụi thuục thỹ antimon clorid roi dem do quang buộe sụng 500 v
550 nm.

4


+ Nhân xét: Quy trinh thuc hiên rat phiïc tap, bao gôm câc giai doan xà
phong hoâ trong diêu kiên trânh oxy hoâ, chiét tâch và tinh ché qua câc côt
sâc kÿ bân diêu ché (su dung câc chât nhôi là dât tây màu và dât silic dùng
cho sâc kÿ), sau do tao màu và do quang. Do tién hành qua nhiêu giai doan
nên dô chmh xâc giâm.
- Phuong phâp sinh hoc.
+ Nguyên tâc: Hoat lue vitamin D duoc dânh giâ thông qua xâc dinh

mue dô vôi hoâ xuong trên thô hoâc chuôt.
+ Nhân xét: Phuong phâp này tién hành khâ phiîc tap. Két quâphu
thuôc nhiêu vào câc câ thë và doi hôi nguôi thur nghiêm phâi duocdào tao kl
luông.
- Phuong phâp sâc kÿ long hiêu nâng cao.
+ Nguyên tâc: Dua trên su phân bô khâc nhau cüa vitamin D giüa pha
dông và pha tînh so vôi câc thành phân hoat chât khâc.
+ Nhân xét: dây là phuong phâp hiên dai, ngày càng duoc âp dung phô
bién. Tuy nhiên cüng chî cô thë âp dung truc tiép vôi câc ché phâm don hoâc
da thành phân trong dô vitamin D cô hàm luong cao (> 500UI/1 don vi phân
liêu) côn vôi câc ché phâm cô hàm luong D thâp thi dôi hôi phâi cô bien phâp
xü lÿ mâu phù hop dë làm sach và làm giàu mâu.
1.1.7 Mot so nghiên cuti ve vitamin D [8],[10],[11],[12],[15]
Cùng vôi su phât triën cüa nên khoa hoc kÿ thuât tiên tién, su bùng no
cüa ngành công nghê thông tin trong thôi kÿ nên kinh té tri thtrc, hàng loat câc
hê thông mây phân tich hoâ hoc dâ duoc câi tién nâng câp, nhàm xâc dinh
duoc nhiêu loai chât hoâ hoc dông thefi nâng cao dô nhay cüa phép phân tfch
cüng nhu dô làp lai cüa két quâ. Câc nhà khoa hoc phân tich hoâ hoc trên thé
giôi nôi chung, phân tich thuc phâm nôi riêng dâ cô nhiêu công trinh nghiên

5


cuu vờ phuong phõp xõc dinh hm luong vitamin D trong thuc phõm nhu thit,
cõ, sỷa,...
Mụt nghiờn cỹu dõ dua ra cõch xỷ l mõu nhu hinh lv diờu kiờn phõn
tfch hm luong vitamin D trong thuc phõm, dụ thu hụi cua phuong phõp l 90110% dụi vụi D2 v D3 [10].
ễ mụt cụng trinh nghiờn cỹu khõc ta lai cụ cõch xỷ l mõu nhu hinh 2
dụ thu hụi cỹa phuong phõp l 93- 107% [8].
Ngoi ra cụn nhiờu cụng trinh nghiờn cuu xõc dinh hm luong vitamin

D trong mõu v huyột thanh, trong thuc v õt...
Hiờn nay Viờt Nam chua cụ 1 dờ ti eu thộ no vờ dinh luong vitamin
D trong thuc phõm.
Trong khuụn khụ cỹa dờ ti ny, chỹng tụi sau khi tham khõo cõc ti
liờu, cõn eu vo nõng lue trang thiột bi hiờn cụ cỹa labo, dua ra phuong phõp
phõn tfch phự hop. Qua dụ chỹng tụi khõo sõt diờu kiờn chay mõu, phõn tfch
mụt sụ dụi tuỗmg mõu nhu sỷa bụt, sỷa chua...lm thỹ nghiờm lap lai dở xõc
dinh dụ chum, xõc dinh dụ dung, khoõng tuyộn tfnh, giụi han phõt hiờn, giụi
han dinh luong dở dõnh giõ hiờu lue cỹa phuong phõp.
Trong thuc phõm tu nhiờn nụi chung hay thuc phõm bụ sung nụi riờng
hm luong vitamin D cỹng khõ thõp, nờn viờc tõch chiột l võn dờ rat quan
trong. Chỹng ta cõn phõi chỹ cõc khõu, cụng doan õnh hucfng dộn hm luong
vitamin D trong mõu nhu õnh sõng, diờu kiờn thu phõn mõu.

6


Hinh 1. So âô chiê't mâu

1


Hînh 2. Sa dô chiê't mâu

8


1.2

Kÿ thuât sâc kÿ long hiêu nâng cao [2], [3], [5], [4]

1.2.1 Khâi niêm ca ban.
-

Sac kÿ long hiêu nâng cao( HPLC) là môt phuong phâp tâch hoâ lÿ

dua vào âi lue khâc nhau cüa câc chât khâc nhau vôi 2 pha luôn tiép xüc và
không dông tan vcfi nhau goi là pha dông và pha tlnh. Pha dông là chât long
chày qua côt vôi môt toc dô nhât dinh, côn pha tïnh chiïa trong côt là mot chât
ran dâ duoc phân chia duoi dang tiëu phân hoâc môt chât long phü lên mot
chât mang rân hay mot chât mang dâ duoc biên d6i bàng liên két hoâ hoc vôi
câc nhôm hüru co. Quâ trinh sâc kÿ xây ra do câc co ché: hâp thu, phân bô,
trao doi ion hoâc rây phân tir.
- Nguyên tac cüa quâ trinh sâc kÿ trong côt:
Pha tïnh là yéu tô quan trong quyét dinh bân chât cüa quâ trinh sâc kÿ
và loai sâc kÿ. Néu pha tïnh là chât hâp phu ta cô sâc kÿ hâp phu, néu pha tïnh
là chât trao doi ion ta cô sâc kÿ trao doi ion, pha tïnh là chât dâ duoc gân pha
liên két ta cô sac kÿ phân bô, néu pha tïnh là gel ta cô sâc kÿ gel hay sâc kÿ
rây phân tu. Quyét dinh hiêu quâ su tâch à dây là tong hop câc tuong tâc:
Chât tan

Tong cüa 3 tuong tâc này së quyét dinh chât nào duoc rüa giâi ra truôc
tiên khi lue luu giü là nhô nhât và nguoc lai.
1.2.2 Câc dai luong dàc trimg
+Thdi sian lm (tD): Cüa 1 chât là thcfi gian tmh tù lue tiêm mâu vào côt
dén khi chât dô ra khôi côt dat giâ tri eue dai và cho pic trên sâc kî dô. So sânh

9

thcfi gian liru cỹa mõu thu v mõu chuan lm trong cựng diờu kiờn ta sở dinh
tmh duoc chõt dụ.
+ Thi sian chef L,: l thcfi gian luu cỹa 1 chõt khụng bi luu giỹ ( tire l
chõt cụ toc dụ bang toc dụ di chuyộn trung binh cỹa cõc phõn tỹ dung mụi khi
di qua cụt).
+ Thựa soduns luons

Dựng dở mụ ta tục dụ di chuyởn cỹa 1 chõt.
VR t Rt M

+ Thựa sochon loc a : mụ ta tục dụ di chuyởn tợ dụi cỹa 2 chõt
k' d
fv
a = B _
k' A

t'll R, B
t'1 R,A

Quy uục B l chõt luu giỷ manh hon A nờn a > 1. Dở tõch riờng 2 chõt
thi a > 1, thuụng l tựr 1,05 - 2,0.
+ So õùa ly thuy et N : Biởu thi bng hiờu lue cụt sõc k N
N = 16x

' t* D *
\ WsJ

hoõc

N

= 5,54x

\w
yy\n y

Trong dụ: WB: chiờu rụng cỹa dõy pic
W1/2: chiờu rụng pic do cf nỹa chiờu cao cỹa dợnh
+ Dụ phõn giai R,: l dai luong do mỷc dụ tõch 2 chõt trờn mot cụ sõc
k
n
ẽ ,B
ẽ ,A
ôo
=-;---------r

10

r


Pha tïnh trong HPLC là chât nhôi côt dë làm nhiêm vu tâch môt hôn
hop chât phân tfch. No là nhüng chât rân, xôp, kfch thuôc hat rât nhô, duông
kfnh cô hat tù 3 - 10|Jm, diên tfch bê mât hat thuofng tù 50 -500m2/g.
* Phân loai
- Cân câ theo bân chât chfnh cüa quâ trinh sâc kÿ trong côt tâch, ngirài
ta chia nô thành nhiêu loai nhu hâp phu, phân bô, trao doi ion và rây phân tü.
Tuong üng vôi loai chât nhôi nhir thê nguôi ta cô 1 loai sâc kÿ riêng trong kÿ
thuât HPLC.
- Cân cü theo trang thâi rân hay long cüa pha tïnh, nguôi ta chia nô

thành 2 loai, néu pha tïnh là chât rân ta cô sac kÿ long- ran(LSC), néu pha tïnh
là chât long ta cô sac kÿ lông-lông(LLC)
- Cân cü theo dô phân eue cüa pha tïnh và pha(dôpg, cô câc loai: Sac kÿ
pha thuân, sâc kÿ pha dâo, sâc kÿ pha dâo tao câp ion và sac kÿ trao dôi ion.
- Cân cü" theo câu truc xôp cüa pha tïnh là câc hat rân, nguôi ta chia nô
thành 2 loai là xôp toàn phân hat và xôp bê mât hat ( xôp chî lôp vô ngoài ).
* Diêu kiên dôi vôi 1 pha tïnh
- Phâi tro và bên vüng dôi vôi câc diêu kiên cüa môi trucmg sâc kÿ
- Cô khâ nâng tâch chon loc
- Tfnh chât bê mât phâi ôn dinh
- Cân bang dông hoc cüa su tâch phâi xây ra nhanh và lâp lai tôt
- Cô hat phâi tuong dôi dông nhât
1.2.5 Pha dông
Pha dông là dung môi dùng dë rüa giâi chât tan (chât cân phân tfch) ra
khôi côt tâch dë thuc hiên 1 quâ trinh sâc kÿ. Dây là môt yéu tô rât linh dông
và dê dàng thay dôi. Nô cô thë là môt dung môi hoâc hôn hop nhiêu dung môi

12


trụn lõn vụi nhau theo nhỷng t lờ nhõt dinh. No cỹng cụ thộ l dung dich cõc
muụ'i cụ chỷa cõc chat dờm, chõt tao phỷc.
Pha dụng l mot trong nhỷng yờii to quyột dinh hiờu suõt tõch sõc k
cỹa mụt hụn hỗfp mõu. Nụ quyột dinh thdi gian luu giCr cõc chõt phõn tich v
hiờu quõ quõ trợnh sõc k. Pha dụng cụ thở õnh hurụng dộn:
+ Dụ chon loc cỹa hờ pha,
+ Thdi gian liru giiợ cua chõt tan,
+ Hiờu lue cỹa cụt tõch,
+ Dụ phõn giõi cõc chõt trong 1 pha tợnh,
+ Dụ rụng v su cõn doi cỹa pic sac k.

- Dieu kiờn doi voi 1 pha dụng
+ Phõi tro doi vcfi pha tợnh,
+ Hoõ tan duỗfc chõt cn phõn tich,
+ Bờn vỹng theo thdi gian,
+ Cụ dụ tinh khiột cao,
+ Phõi nhanh dat cõc cõn bõng trong quõ trợnh sõc k,
+ Phự hỗfp cõc loai detetor dựng dộ phõt hiờn cõc chõt phõn tich,
+ Cụ tợnh kinh tộ v khụng quõ hiộm.
- Cõc yộu tụ chmh cn chu trong lua chon pha dụng:
+ Bõn chõt, thnh phõn cỹa dung mụi lua chon lm pha dụng,
+ Toc dụ dụng pha dụng,
+ pH cỹa pha dụng(dõc biờt chu sõc k trao doi ion v sac k cap
ion).

13


1.2.6. Phuong phõp dinh lutfng v tmh kột quõ trong HPLC.
Tõt cõ cõc phuong phõp dinh luỗfng bang sc k dốu dira trờn nguyờn tõc
l: Nong dụ cỷa chõt t lờ vụi chiờu cao hoac diờn tich pic cỹa nụ.
Dõnh giõ theo diờn tich pic: Diờn tich pic cỹa 1 chõt tirong ỹng vụi tong
ltfỗfng chõt dụ.
Dõnh giõ theo chiờu cao pic: khi pic cụ dang khụng doi thi chiờu cao
pic l 1 dai ltfỗmg t lờ vụi diờn tich pic v nụ cỹng cụ thộ dựng dở dinh luang
chõt phõn tich
Cụ 4 phuong phõp dinh lirỗmg duoc sur dung trong sac k:
* Phuong phõp ngoai chuõn
* Phuong phõp nụi chuõn
* Phuong phõp thờm
* Phuong phõp phõn trõm diờn tich pic (hoac phõn tram chiờu cao pic).

- Cõch tmh kột quõ trong phuong phõp HPLC
* Phuong phõp ngoai chuõn: L phuong phõp dua trờn co sa so sõnh
mõu chuõn v mõu thur trong cựng diờu kiờn. Kột quõ cỹa chõt chua biột duoc
tmh toõn so vụi mõu chuõn dõ biet truục nong dụ hoc suy ra tir duụng chuõn.
* Phuong phõp nụi chuõn: L phuong phõp cho thờm vo cõ mõu thỹ v
mõu chuõn mot luong chõt khụng doi, m trong cựng diờu kiờn sc k nụ cụ
thoi gian luu gõn vụi thcfi gian luu cỹa chõt cõn phõn tich trong mõu thỹ. Nụ
duoc tõch hon ton v cụ nong dụ gõn bng nong dụ cỷa chõt cõn phõn tich
v cụ cõu truc hoõ hoc tirong tu.
* Phuong phõp thờm chuõn: Chỹ yộu duoc sỹ dung trong k thuõt
HPLC khi cụ võn dờ õnh hucfng cỷa chõt phu nhu tõ duoc. Dung dich mõu thir
duoc thờm mot luong nhõt dinh chõt chuõn. Cõc pic thu duoc cỹa cõ hai dung

14


dich mõu thỹ v mõu thỹ thờm chu an phõi duoc tiộn hnh trong cựng mụt dieu
kiờn sc k. Kột quõ duỗfc tmh toõn dua vo su chờnh lờch nụng dụ( luỗfng
chõt chuõn thờm vo) v dụ tõng cỷa diờn tfch hoõc chiốu cao cỹa pic.
*

Phuong phõp tmh theo phõn trõm diờn tfch pic (hoõc phõn trm chiờu

cao pic): Nụng dụ cỹa mõu thỹ duoc tmh toõn dua trờn diờn tfch pic ( hoõc
chiờu cao pic) tmh theo tợ le phõn trõm diờn tfch pfc ( hoõc chiờu cao pic) chõt
thỹ trờn tong ton bụ diờn tfch pic trờn sõc dụ. Trong phuong phõp HPLC,
phuong phõp ny chợ dung khi cụ su dõp ỹng cỹa detector trờn tõt cõ cõc chõt
l nhu nhau, nộu khụng nhu nhau khi dụ vụi mụi chõt cõn cụ hờ so hiờu chợnh.
1.3. Mot so dac trung thong kờ dở xỷ l v dõnh giõ kột quõ.
Cõc thong so thuc nghiờm duỗfc xỹ l bang phuong phõp thụng kờ thụng

qua cõc dac trung sau:
- Giõ tri trung binh:

- Dụ lờch chuõn:



1 n

x = -V x ,
n M

SD ='

- Dụ lờch chuõn tuong doi :

/=1

n- 1

RSD =

en

x

x 100 (%)

Trong dụ Xj l giõ tri do mõu thỹ i v
x l giõ tri trung binh cỹa cõc ln phõn tfch.

15


PHN H. NGUYấN LIấU, THIấT BI, PHĩONG PHP
V KấT QU NGHIấN CtJtJ
2.1 Nguyờn lieu v thiet bi
2.1.1 Doi tiùtfng nghiờn cuti
- Sỹra bot XO (HSD 24/10/2007, hng Namyang Hn Quoc).
2.1.2 Thiột bi dung eu
- Hờ thong sõc k long cao õp Finnigan voti detector PDA.
- Cụt chay pha dõo: cụt RP |18^5|am, 250 x 4,6 mm), Supelco;
cụt Inertsil ODS- 3 (5 |am, 250 x 4,0 mm), Japan;
cụt Symmetry: Shield RP |l8 j5 jum, 150 x 4,6 mm),
Waters.
- Cụt chiột pha ran SPE
- Cõn phõn tich Frecisa.
- Tỹ sõy Sellab.
- May cõt quay chõn khụng. ' '
- Phờu chiột.
- Binh dinh miợc chmh xõc 50ml.
- ễng dong 20ml, 50 ml.
- Pipet chmh xõc 1ml, 2ml, 5ml, 10ml.
- Coc cụ mụ v cõc dung eu thu tinh khõc.
- Mõy do quang Shimadzu.
2.1.3 Hoõ chõt, dung mụi, thuoc thỹr
- VitaminD2 chõt chuõn hm ltfỗmg 99,56% ( Supelco)
- n- hexan hoõc ete dõu hoõ PA (Merck)
- Ete etylic PA (Merck)
- Methanol HPLC (Merck)

- THF HPLC
- Ethanol HPLC (Merck)

16


- ACN (HPLC) ( Merck)
- Ethanol (Trung Qudc)
- Nirôc cât
- NaCl tinh khiét
- KOH (Trung Quoc)
- Acid ascobic ( Trung Quoc)
2.2 Phuong phâp nghiên ctifu
2.2.1 Chuân bi dung dich chuân goc và chuân làm viêc cüa vitaminD2
- Chuân nong dô lOOOppm: Hoà tan chuân vitamin D2 vào trong dung môi
ethanol. Khâo sât tim buôc sông À max. Do dô hâ'p thu lôn nhât à buôc sông 265
nm.
Tmh nong dô thuc cüa dung dich chuân vôi hê sô hâp thu phân tü là s =
18843 vôi vitamin D2.
C = Abs xlOOOO/s (|ag/mL) /
Trong dô: C là nông dô cüa dung dich vitamin D2
Abs là dô hâp thu cüa vitamin D2 à buôc sông 265 nm.
- Pha câc dung dich chuân làm viêc vôi nông dô tù 0,01 dên 0,2, mcg/ml tù
dung dich gôc trong methanol.
2.2.2 Du dinh mot so diêu kiên chay sac kÿ
* Pha dông: Du dinh pha dông là câc pha phân eue vôi hôn hçfp dung môi
theo câc tÿ lê thay doi.
- Hôn hop MeOH : H20 ,
- Acetonnitrile : MeOH,
- MeOH: THF: H20

* Côt tâch: Du dinh khâo sât trên câc loai côt sau:
-Côt pha dâo RP 18,5(im, 250 x 4,6 mm cüa Supelco,
-Côt inertsil ODS -3, 5fim, 250 x4,0 mm cüa Japan,
-Côt SymmetryÔShield RP18, 5|im, 150x4,6mm cüa Waters
* Luu luçmg dông: Khâo sât luu luong dông tù 0,5-1,5 ml/phüt.


* Buôc sông: Detector UV ô buôc sông 265nm, buôc sông 280 và buôc sông
254 nm
2.2.3 Tham dinh phuong phâp
- Giôi han phât hiên (LOD): Là nông dô nhô nhât cûa chât phân tfch
trong mâu thû cô thë phât hiên duoc nhung không nhât thiét dë cô thë dinh
luçmg duoc.
*Câch xâc dinh: Tuÿ thuôc vào phuong phâp phân tfch và diêu kiên thf
nghiêm ta cô thë lua chon câch tmh sau.
+ Giôi han phât hiên duoc xâc dinh bang phuong phâp phân tfch mâu
thü cô chât phân tfch dâ biét nông dô và xâc dinh nông dô tôi thiëu mà tai dô
cô thë doc duoc dâp irng cüa chât phân tfch. Phuong phâp này âp dung cho
phuong phâp phân tfch không dung eu và câ phuong phâp dung eu.
+ Giôi han phât hiên duoc xâc dinh bang nông dô cüa chât phân tfch mà
tai dô chiêu cao cüa pic bang ba làn chiêu cao cüa nhiêu duông nên. Phuong
phâp này âp dung cho phuong phâp phân tfch công eu.
+ Giôi han phât hiên duçfc tmh bàng giâ tri trung binh mâu tràng công
vôi ba làn dô lêch chuân cüa mâu tràng.
LOD = YB+ 3Sb
Trong dô

YBgiâ tri trung binh cüa mâu tràng.
SBDô lêch chuân cüa két quâ phân tfch mâu tràng.

+ Dua vào dô lêch chuân cüa dâp üng, LOD cô thë tmh nhu sau
LOD = SD x 3,3/a
Trong dô

SD dô lêch chuân cüa dâp ûng.
a là dô dôc cûa duông chuân. Dô doc cô thë tmh dua vào

duefng chuân cüa chât phân tfch
- Giôi han dinh luçfng(LOQ): Là luong nhô nhât cüa chât phân tfch
trong mâu thü dë cô thë dinh luong duçfc vôd dô dung và dô chmh xâc thfch
hçfp.

18


* Câch xâc dinh: Tuÿ thuôc vào phuang phâp phân tich và diêu kiên thf
nghiêm ta cô thé lua chon câch tmh sau.
+ Giôi han dinh luçmg cô thé xâc dinh bâng phân tich mâu thir cô chât
phân tich dâ biét nông dô và xâc dinh nông dô toi thiéu mà tai dô cô thé dinh
lirçmg duçfc chât càn phân tich vôi dô dung và dô chmh xâc cô thé châp nhân
dirac. Phucmg phâp này âp dung cho phép phân tich không dung eu và phân
tich dung eu.
+ Dua vào tÿ le dâp irng so vôi nhiêu, giôi han dinh luçmg duçfc xâc
dinh bang nông dô mà tai dô chiêu cao cüa dâp lîng bang 10 làn chiêu cao cüa
nhiêu.
+ Giôi han dinh luçmg duçfc tmh bàng giâ tri trung binh mâu trâng công
vôi muefi làn dô lêch chuàn cüa mâu trâng.
LOQ = YB+ 10SB
Trong dô

YBgiâ tri trung bînh cüa mâu trâng.
SBDô lêch chuàn cüa kêt quâ phân tich mâu trâng.

+ Dua vào dô lêch chuan cüa dâp ring, LOQ cô thé tînh nhu sau
LOQ = SD x 10 /a
Trong dô

SD dô lêch chuàn cüa dâp üng.
a là dô doc cüa duefng chuàn. Dô doc cô thé tînh dua vào

duông chuàn cüa chât phân tich
-

Khoâng tuyê'n tmh. Là khoâng câch giüa nông dô trên và nông dô duôi

cüa chât phân tich mà dâp ûng cüa nô tÿ lê vôi nong dô.
* Câch xâc dinh: Khoâng xâc dinh duçfc lây tù nghiên cûu cüa dô tuyén
tmh. Xây dung khoâng xâc dinh nham khang dinh quy trinh phân tich cô dô
tuyén tmh, dô chmh xâc, dô dung châp nhân duçfc khi âp dung dinh luçmg
mâu thü vôi hàm luçmg nam trong khoâng eue dai và eue tiéu cüa khoâng xâc
dinh.

19


- Dô tuyén tmh: Dô tuyén tmh cüa mot quy trinh phân tich diên tâ két
quâ phân tich thu duoc tÿ lê vôi nong dô ( trong khoâng nhât dinh) cüa chât
phân tich trong mâu thu. Dô tuyén tmh biëu thi qua hê so hôi quy r.
*

Câch xâc dinh : Sau khi pha loâng dung dich chuân gôc thành câc

dung dich làm viêc ( ft nhât 5 nông dô) tién hành phân tich nhu phuong phâp
yêu câu de xâc dinh câc dai luong cân thiêt nhu diên tich, chiêu cao hay dô
hâp thu ... Sau dô xây dung dô thi liên quan giûa nông dô chât phân tich vôi
mot trong nhûng dai luong trên. Qua duông chuân dô cho ta phuong trinh hôi
quy tuyén tmh, hê sô hôi quy tuyén tmh.
Y = ax+ b
Yêu càu r > 0,9990
- Dô lêch chuân và hê sô bién thiên. Dô lêch chuân (dô làp lai) diên tâ
dô chrnh xâc cüa mot quy trinh phân tich trong cùng diêu kiên thi nghiêm.
Dë thuc hiên xâc dinh dô lêch chuân, hê sô bién thiên tién hành phân
tich lap lai 5-10 làn trong cùng diêu kiên vôi môi mâu thü nghiêm.
- Hê sô thu hôi (Dô dung). Dô dung cüa mot quy trinh phân tich biëu
diên sai lêch giùa giâ tri tim thây vôi giâ tri thuc hoàc giâ tri doi chiéu duoc
châp nhân.
- Dë xâc dinh dô thu hôi chüng tôi tién hành phân tich trên mâu và mâu
nap chuân ( luong chuân thêm vào sao cho nông dô cuôi sau khi chiét mâu
xong nâm trong khoâng tuyén tmh).
2.3. Két quâ nghiên cufu
2.3.1. Nguyên lÿ xür lÿ mâu
Mâu duoc xà phông hoâ trong môi truông KOH / Etanol, Vitamin D
duoc chiét ra tù dich không duoc xà phông hoâ bôi dung môi n-hexan hay ete
dâu hoâ. Dich chiét duoc làm sach và bom vào hê thông HPLC vôi detector
PDA à buôc sông 265nm.

20


Pham vi âp dung: Quy trinh này âp dung duoc cho câc loai thuc phâm nhu

süa và sân phâm tir sûa, bôt dinh duông...
* Tién hành: quy trinh xû lÿ mâu theo hinh 4.

21