Đánh giá sự tương đồng trình tự ADN ribosom ITS giữa loài bạc căn với loài hà thủ ô trắng và sàng lọc tác dụng ức chế tế bào ung thư của bạc căn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ QUỲNH HOA

ĐÁNH GIÁ SỰ TƯƠNG ĐỒNG TRÌNH TỰ
ADN RIBOSOM ITS GIỮA LOÀI
BẠC CĂN VỚI LOÀI HÀ THỦ Ô TRẮNG
VÀ SÀNG LỌC TÁC DỤNG ỨC CHẾ
TẾ BÀO UNG THƯ CỦA BẠC CĂN

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ QUỲNH HOA

ĐÁNH GIÁ SỰ TƯƠNG ĐỒNG TRÌNH TỰ
ADN RIBOSOM ITS GIỮA LOÀI
BẠC CĂN VỚI LOÀI HÀ THỦ Ô TRẮNG
VÀ SÀNG LỌC TÁC DỤNG ỨC CHẾ

TẾ BÀO UNG THƯ CỦA BẠC CĂN
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH : HÓA SINH DƯỢC
MÃ SỐ

: 60 73 25

Người hướng dẫn khoa học:
1. TS. Phùng Thanh Hương
2. Ths. Hà Thu

HÀ NỘI 2012


LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin phép được gửi lời cảm
ơn chân thành nhất tới :
TS. Phùng Thanh Hương
Ths. Hà Thu
Những người Thầy đã trực tiếp hướng dẫn tận tình, dìu dắt và giúp đỡ
em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Xin nói lời cảm ơn chân thành tập thể các Thầy, các Cô trường Đại học
Dược Hà Nội đã giúp em trang bị kiến thức cần thiết để hoàn thành khóa học
Thạc sĩ. Cảm ơn các phòng ban, đặc biệt là Phòng sau đại học, đã giúp đỡ em
nhiệt tình trong quá trình học tập.
Xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo, các chị kỹ thuật viên - bộ
môn Hóa sinh - trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi giúp
em hoàn thành luận văn.
Xin cảm ơn các anh, chị, em đang công tác tại Phòng Vi sinh phân tử Viện Công nghệ sinh học và Phòng Thử hoạt tính sinh học – Viện Hóa Học,
Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hết lòng giúp đỡ em trong quá

trình thực hiện đề tài tốt nghiệp.
Xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn luôn là động lực, là nguồn cổ vũ
giúp em hoàn thành khóa học và luận văn tốt nghiệp.
Học viên

Nguyễn Thị Quỳnh Hoa


MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH ẢNH
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................ 3
1.1. Tổng quan về ADN Ribosom ITS (ITS – rADN) ................................. 3
1.1.1. Cấu trúc của ADN Ribosom ITS ................................................... 3
1.1.2. Vai trò của ADN Ribosom ITS ...................................................... 6
1.1.3. Ứng dụng của ADN Ribosom ITS trong nghiên cứu cây thuốc ..... 7
1.2. Bạc căn (Streptocaulon kleinii Wight &Arn) ....................................... 9
1.2.1. Vài nét về họ Thiên lí (Asclepiadaceae) ........................................ 9
1.2.2. Vài nét về chi Streptocaulon........................................................ 10
1.2.3. Loài Bạc căn (Streptocaulon kleinii Wight &Arn) ....................... 13
1.2.4. Tình hình nghiên cứu và sử dụng một số cây thuốc cùng thuộc
phân họ Chu đằng, họ Thiên lý .............................................................. 13
1.2.5. Tình hình nghiên cứu và sử dụng loài Bạc căn (Streptocaulon
kleinii Wight &Arn) ............................................................................... 14
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 126
2.1. Nguyên liệu nghiên cứu...................................................................... 16
2.1.1. Hóa chất, sinh phẩm ..................................................................... 16

2.1.2. Trang thiết bị ................................................................................ 18
2.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................... 19


2.2.1. Thu mẫu và giám định tên khoa học ............................................. 19
2.2.2. Phương pháp tách chiết ADN tổng số........................................... 20
2.2.3. Phương pháp khuếch đại ADN bằng PCR .................................. 21
2.2.4. Phương pháp điện di ADN trên gel agarose.................................. 22
2.2.5. Phương pháp tách dòng ................................................................ 22
2.2.6. Phương pháp biến nạp ADN plasmid vào tế bào khả biến E.coli
chủng TOP10F’...................................................................................... 24
2.2.7. Phương pháp tách chiết ADN plasmid từ vi khuẩn ....................... 26
2.2.8. Phương pháp cắt ADN bằng enzym giới hạn ................................ 27
2.2.9. Phương pháp tinh sạch ADN plasmid ........................................... 27
2.2.10. Phương pháp giải trình tự ADN .................................................. 28
2.2.11. Phương pháp so sánh trình tự ADN ............................................ 30
2.2.12. Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư của loài Bạc
Căn (Streptocaulon kleinii Wight &Arn)................................................ 30
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................. 34
3.1. Trình tự ADN ribosom vùng ITS của loài Bạc Căn (Streptocaulon
kleinii Wight &Arn) .................................................................................. 34
3.1.1. Kết quả chiết tách ADN tổng số từ mẫu lá Bạc căn ...................... 34
3.1.2. Kết quả khuếch đại ADN bằng PCR............................................. 34
3.1.3. Kết quả tạo dòng gen ITS-rADN .................................................. 35
3.1.4. Kết quả tinh sạch plasmid tái tổ hợp ............................................. 37
3.1.5. Kết quả xác định trình tự ADN ribosom vùng ITS của loài Bạc Căn
(Streptocaulon kleinii Wight &Arn) ....................................................... 38
3.1.6. Kết quả so sánh trình tự ITS-rADN của loài Bạc căn với trình tự
của loài Hà thủ ô trắng ........................................................................... 39

3.2. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư của loài Bạc Căn
(Streptocaulon kleinii Wight &Arn) .......................................................... 40
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN .......................................................................... 48
4.1. Về quy trình xác định trình tự ITS-rADN của loài Bạc căn ................ 48
4.2. Về sự tương đồng trình tự ITS-rADN giữa loài Bạc căn và loài Hà thủ
ô trắng ....................................................................................................... 49
4.3. Về tác dụng ức chế tế bào ung thư của loài Bạc Căn (Streptocaulon
kleinii Wight &Arn). ................................................................................. 51
KẾT LUẬN ................................................................................................. 56
ĐỂ XUẤT ................................................................................................... 56


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
A,T,G,C

Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin

ADN

Acid deoxyribonucleic

ADNr

ADN mã hóa cho ARN ribosom

ATCC

American Type Culture Collection

bp

Base pair

DMEM

Dulbecco’s modified Eagle’s
medium

DMSO

Dimethylsulfoxid

dNTP

Deoxyribonucleotid triphosphat

E.coli

Escherichia coli

EDTA

Ethylen diamin tetra acetic acid

EtBr

Ethidium Bromid

FBS

Foetal Bovine serum

Huyết thanh bào thai bò

HepG2

Hepatocellular carcinoma

Tế bào ung thư gan người

ITS

Internal Transcribed Spacer

Vùng phiên mã nội

ITS- rADN

Trình tự ADN ribosom
đoạn ITS

IPTG

Isopropyl β-D-1thiogalactopyranosid

Kb

Kilo base

KB

Human epidermic carcinoma

Tế bào ung thư biểu mô
người

LB

Lauria Bertani

Lu

Human lung carcinoma

Tế bào ung thư phổi người

MCF7

Human breast carcinoma

Tế bào ung thư vú người


MTT

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyl tetrazolium bromid

PCR

Polymerase Chain Reaction

RPMI

Roswell Park Memorial Institute

SDS

Sodium Dodecyl Sulphat

TAE

Tris - Acetic acid - EDTA

Taq

Thermus aquaticus

X-gal

5-bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-DGalactosid


DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Kích thước và phần trăm G+C của vùng ITS1 và ITS2
của một số loài thực vật hạt kín

4

Bảng 2.1. Cặp mồi dùng trong phản ứng PCR

16

Bảng 3.1. Tỉ lệ % tế bào bị ức chế bởi cao chiết rễ cây Bạc căn ở
nồng độ 5µg/mL trên dòng tế bào KB

41

Bảng 3.2. Tỉ lệ % tế bào bị ức chế bởi cao chiết rễ cây Bạc căn ở
nồng độ 5µg/mL trên dòng tế bào HepG2

41

Bảng 3.3. Tỉ lệ % tế bào bị ức chế bởi cao chiết rễ cây Bạc căn ở
nồng độ 5µg/mL trên dòng tế bào Lu

41

Bảng 3.4. Tỉ lệ % tế bào bị ức chế bởi cao chiết rễ cây Bạc căn ở
nồng độ 5µg/mL trên dòng tế bào MCF7

41

Bảng 3.5. Tỉ lệ % tế bào bị ức chế bởi cao chiết rễ cây Bạc căn
trên dòng tế bào KB

43

Bảng 3.6. Tỉ lệ % tế bào bị ức chế bởi cao chiết rễ cây Bạc căn

trên dòng tế bào HepG2

44

Bảng 3.7. Tỉ lệ % tế bào bị ức chế bởi cao chiết rễ cây Bạc căn
trên dòng tế bào Lu

45

Bảng 3.8. Tỉ lệ % tế bào bị ức chế bởi cao chiết rễ cây Bạc căn
trên dòng tế bào MCF7

46

Bảng 3.9. Tổng hợp kết quả thử độc tính tế bào của cao chiết rễ
cây Bạc căn trên 4 dòng tế bào ung thư khác nhau

47


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Trang
Hình 1.1. Cấu trúc của vùng ADN ribosom ITS

3

Hình 1.2. Bạc căn (Streptocaulon kleinii Wight & Arn) và Hà thủ ô

12

trắng (Streptocaulon juventas (Lour.) Merr)
Hình 2.1. Vector tách dòng PCR 2.1

23

Hình 2.2. Phản ứng chuyển MTT thành formazan

31

Hình 2.3. Các giếng tế bào sau khi xử lí với MTT

31

Hình 3.1. Ảnh điện di sản phẩm tách chiết ADN tổng số

34

Hình 3.2. Ảnh điện di sản phẩm PCR

35

Hình 3.3. Ảnh điện di thể hiện plasmid tách từ các dòng tế bào E.coli

36

sau khi biến nạp
Hình 3.4. Ảnh điện di thể hiện sản phẩm cắt plasmid bằng enzym giới

37

hạn EcoRI
Hình 3.5. Ảnh điện di thể hiện sản phẩm tinh sạch plasmid mang gen

38

ITS-rADN
Hình 3.6. Trình tự nucleotid đoạn ITS-rADN của loài Bạc căn

39

Hình 3.7. So sánh trình tự đoạn ITS-rADN giữa loài Bạc căn và loài

40

Hà thủ ô trắng bằng công cụ BLAST
Hình 3.8. Khả năng ức chế sự phát triển của cao chiết rễ cây Bạc căn
ở nồng độ 5µg/mL trên 4 dòng tế bào ung thư

42


Hình 3.9. Tác dụng của cao chiết rễ cây Bạc căn trên dòng tế bào KB

43

Hình 3.10. Tác dụng của cao chiết rễ cây Bạc căn trên dòng tế bào

44

HepG2

Hình 3.11. Tác dụng của cao chiết rễ cây Bạc căn trên dòng tế bào Lu

45

Hình 3.12. Tác dụng của cao chiết rễ cây Bạc căn trên dòng tế bào

46

MCF7
Hình 4.1. Biểu đồ thể hiện quan hệ tiến hóa giữa một số loài thuộc

50

phân họ Chu đằng (Periplocoideae) ở Việt Nam.
Hình 4.2. Ellipticin

54

Sơ đồ 2.1. Các phương pháp nghiên cứu

19


ĐẶT VẤN ĐỀ
Một quy luật thường gặp trong nghiên cứu cây thuốc là: các loài thuộc
cùng một bậc phân loại (loài, chi, họ) thường có đặc điểm chung về hình thái,
thành phần hóa học và tác dụng sinh học. Cơ sở khoa học của quy luật này
chính là sự tương đồng về di truyền giữa các loài cùng bậc phân loại (taxon),
đặc điểm di truyền tương tự nhau là yếu tố quan trọng dẫn tới sự giống nhau
về các tính trạng biểu hiện bên ngoài. Mức độ tương đồng về trình tự ADN

càng cao, thể hiện sự gần gũi về mức độ tiến hóa thì càng có sự tương đồng về
hình thái, thành phần hóa học và tác dụng sinh học. Do vậy, các chỉ thị phân
tử đã được sử dụng như một công cụ bổ sung hiệu quả cho các đặc điểm hình
thái để phân loại thực vật cũng như xác định mối quan hệ tiến hóa giữa các
loài. Để đánh giá sự tương đồng về di truyền giữa các loài thực vật, một trong
những chỉ thị phân tử thường được dùng để so sánh là trình tự ADN ribosom
đoạn ITS (ITS-rADN), do tính chất vừa bảo thủ, vừa siêu biến giữa các loài
[14], [18], [44].
Phân họ Chu Đằng là một trong hai phân họ chính của họ Thiên lí [2].
Một số loài thuộc phân họ Chu đằng đã được nghiên cứu và sử dụng làm
thuốc ở nhiều nước trên thế giới như: Hà thủ ô trắng (Streptocaulon juventas
Merr.) với tác dụng bồi bổ sức khỏe, chống ung thư, chữa sốt rét, lợi sữa [4],
[11] và ức chế sự nhân lên của một số dòng tế bào ung thư [42], [43]. Một
loài khác thuộc phân họ Chu đằng là Ẩn lân (Cryptolepis buchananii) cũng
được biết đến với tác dụng kháng khuẩn, chống ung thư [29]. Trình tự một số
đoạn ADN điển hình của hai loài này đã được công bố trên ngân hàng gen thế
giới. Trong khi đó, loài Bạc căn (Streptocaulon kleinii Wight & Arn), mặc dù
cũng thuộc phân họ Chu đằng nhưng hầu như chưa được nghiên cứu về thành
phần hóa học, tác dụng sinh học và trình tự ADN. Đáng chú ý là có sự giống
nhau về hình thái giữa Bạc căn và Hà thủ ô trắng. Do đó, theo kinh nghiệm
1
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa - Hóa sinh dược - 2012


dân gian, khi thu hái Hà thủ ô trắng để làm thuốc, người dân thường thu hái
lẫn với Bạc căn. Liệu sự tương đồng về hình thái giữa Bạc căn và Hà thủ ô
trắng có liên quan đến sự tương đồng cao về trình tự ADN giữa hai loài này
và các loài cây thuốc khác cùng phân họ? Mặt khác, nếu trình tự đoạn ITSrADN của loài Bạc căn được xác định sẽ giúp cung cấp thêm dữ liệu về mối
quan hệ di truyền cũng như đánh giá đa dạng di truyền của các loài cây thuộc
phân họ Chu đằng nói riêng và họ Thiên lý nói chung.

Hơn nữa, bên cạnh sự giống nhau về hình thái, liệu Bạc căn có tác dụng
chữa bệnh giống như Hà thủ ô trắng hay không?
Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, chúng tôi tiến hành đề tài:
“Đánh giá sự tương đồng trình tự đoạn ADN ribosom ITS giữa loài
Bạc căn với loài Hà thủ ô trắng và sàng lọc tác dụng ức chế tế bào ung
thư của Bạc căn”
Nhằm các mục tiêu sau:
- Xác định trình tự nucleotid đoạn ADN ribosom ITS của loài Bạc căn
(Streptocaulon kleinii Wight & Arn) thu hái ở tỉnh Hòa Bình.
- So sánh trình tự đoạn ADN ribosom ITS của loài Bạc căn
(Streptocaulon kleinii Wight & Arn) với trình tự đoạn ADN ribosom ITS đã
công bố của loài Hà thủ ô trắng (Streptocaulon juventas).
- Sơ bộ sàng lọc tác dụng ức chế tế bào ung thư của rễ cây Bạc căn
(Streptocaulon kleinii Wight & Arn).

2
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa - Hóa sinh dược - 2012


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1.

Tổng quan về ADN Ribosom ITS (ITS – rADN)

1.1.1. Cấu trúc của ADN Ribosom ITS
Để nghiên cứu về ADN thực vật, có ba loại ADN thường được chọn
làm đối tượng nghiên cứu, đó là: ADN nhân, ADN lạp thể và ADN ty thể.
Trong số đó, ADN nhân tỏ ra có nhiều ưu thế trong nghiên cứu phân loại thực
vật bởi ADN nhân có mức độ tiến hóa nhanh hơn, cho phép phân tích được sự
khác biệt về di truyền ngay cả giữa các loài trong cùng một chi hay giữa các

cá thể của cùng một loài. Trong cả chuỗi ADN nhân của tế bào thực vật, khu
vực được nghiên cứu nhiều nhất là vùng ADN ribosom 18S-26S và hai vùng
phiên mã nội (internal transcribed spacer – ITS) với nhiều đoạn lặp về trình tự
nucleotid [14].
Vùng phiên mã nội ITS của ADN ribosom được sử dụng phổ biến cho
nghiên cứu phân loại loài của thực vật hạt kín. Vùng ITS có ba phần: ITS1,
5,8S và ITS2 (hình 1.1.), trong đó tiểu đơn vị 5,8S là vùng có trình tự bảo tồn
tiến hóa cao.

18S ADNr nhân

26S ADNr nhân

Vùng ITS
Hình 1.1. Cấu trúc của vùng ADN ribosom ITS [16]

3
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa - Hóa sinh dược - 2012


Ở một số loài thực vật có hoa, kích thước của vùng ITS1 và ITS2
thường nhỏ hơn 300bp (ITS1: 187-298bp; ITS2 : 187-252bp), với các loài
động vật có xương sống thì ngược lại. Vùng tiểu phân 5,8S có kích thước
không đổi là 163-164bp. Ở thực vật, kích thước của toàn bộ vùng ITS xấp xỉ
500-700bp ở thực vật hạt kín và khoảng xấp xỉ 1500-3700bp ở thực vật hạt
trần [14].
Vùng ITS1 thường có kích thước lớn hơn vùng ITS2, ví dụ như ở một
số loài sau: Adoxaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Canellaceae, Malvaceae,
Onagraceae, Polemoniaceae, Ranunculaceae, Salicaceae, Saxifragaceae,
Styracaceae và Winteraceae. Ngược lại, ở một số loài vùng ITS2 có kích

thước lớn hơn vùng ITS1 như: Betulaceae, Cucurbitaceae, Scrophulariaceae
và Viscaceae. Ở loài Solanaceae, hai vùng này có kích thước bằng nhau. Đối
với những họ lớn như: Fabaceae, Poaceae và Rosaceae, vùng ITS1 có kích
thước dài hơn hoặc ngắn hơn vùng ITS2. Vùng ITS1 và ITS2 khác nhau cả về
kích thuớc và % GC, mặt khác trình tự nucleotid của vùng ITS2 tiến hoá
nhanh hơn vùng ITS1 [21].
Bảng 1.1. Kích thước và phần trăm G+C của vùng ITS1 và ITS2
của một số loài thực vật hạt kín [16]
ITS1
Loài

Kích thước

ITS2
% G+C

(bp)
Adoxaceae, Viburnum, 28 loài

Kích thước % G+C
(bp)

224-231

59-69

215-227

59-69

215

49

224

52

Apioideae

204-221

49-58

215-226

43-61

Asteraceae, Madiina, 42 loài

254-261

48-51

216-223

50-53

Asteraceae, Lactucea, 45 loài.

246-253

52-54

220-222

53-58

Betulaceae, Alnu, 11 loài

215-216

58-64

228-229

53-65

Apiaceae, Daucus, 1 loài

4
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa - Hóa sinh dược - 2012


Betulaceae, Betula, 3 loài

214-219

62-63

226-231

63-65

Betulaceae, Ostrya,1 loài

215

61

227

62

Brassicaceae,

268

57

187

55

Brassicaceae, Sinapis, 1 loài

265

51

188

54

Canellaceae, Canella, 1 loài

272

63

209

63

216

56

237

60

187-229

51-60

245-525

54-66

221-231

55-60

207-217

50-54

Fabaceae, Vicia, 1 loài

235

52

208

50

Fabaceae, Vigna, 1 loài

205

60

220

59

240-244

53-62

211-216

54-60

287

58

229

60

Malvaceae

277-298

49-53

240

57

Poaceae, Pooideae,10 loài

217-223

55-64

213-221

59-67

Poaceae, Sorghum, 1 loài

207

56

217

67

Poaceae, Oryza, 1 loài

194

73

233

77

Polemoniace, 38 loài

242-262

42-65

187-195

48-62

Ranunculace, 27 loài

214-246

Arabidopsis,1

loài

Cucurbitaceae,

Cucumis, 1

loài
Cucurbitaceae, Cucurbita, 2
loài
Fabaceae, Galegeae, 31 loài

Onagraceae,

Epilobium, 22

loài
Malvaceae, Gossypium, 1 loài

Rosaceae, Fragaria, 1 loài
Rosaceae, Maloideae, 20 loài

198-216

249

68

207

65

208-221

65-72

211-224

67-72

5
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa - Hóa sinh dược - 2012


Rosaceae, Prunus, 1 loài

242

62

209

69

Rosaceae, Rosa, 1 loài

249

60

207

57

Rosaceae, Spiraea, 1 loài

251

65

230

70

Salicaceae, Populus, 1 loài

214

67

207

70

Saxifragace, 28 loài

256-267

224-238

Scrophulariaceae,Mimulus, 8

189-214

44-49

203-225

45-48

217

68

217

71

216

69

217

65

loài
Solanaceae, Lycopersicon, 1
loài
Solanaceae, Nicotiana, 1 loài
Styracaceae, Styrax, 19 loài
Viscaceae,

Arceuthobiu, 22

255-264
208

208-221
31-36

226

30-37

loài
Winteraceae, 11 loài

235-252

213-226

1.1.2. Vai trò của ADN Ribosom ITS
Trình tự nucleotid của vùng ITS vừa mang tính bảo thủ (ở đoạn 5,8S)
vừa mang tính siêu biến (ở đoạn ITS1 và ITS2) nên cho phép phân biệt được
giữa các đơn vị ở bậc phân loại thấp (dưới giống - genus). Vùng ITS – rADN
là vùng gen mang nhiều biến dị có khả năng phản ánh quan hệ giữa những
loài có nguồn gốc tiến hóa gần gũi trong khi đó trình tự nucleotid của vùng
18S có mức độ bảo thủ quá cao nên không đủ chi tiết để phân định giữa các
loài lân cận trong cùng chi [44].

6
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa - Hóa sinh dược - 2012


Trình tự nucleotid vùng ITS đã được nghiên cứu nhiều và số lượng các
trình tự nucleotid của vùng này đã được công bố trong ngân hàng gen thế giới
khá phong phú, thuận lợi cho phân tích so sánh.
Một số ưu điểm khác của vùng ITS trong nghiên cứu phát sinh loài của
thực vật hạt kín: thứ nhất là vùng ITS có độ lặp lại cao trong ADN nhân của
thực vật, mỗi đoạn ADN được sắp xếp lặp lại hàng nghìn bản copy ở nhiễm
sắc thể, số lượng trình tự lặp lại này thuận lợi cho việc phát hiện, khuếch đại,
xác định trình tự ADN nhân. Ưu điểm thứ hai và quan trọng nhất là xét từ
quan điểm tái hiện cấu trúc phát sinh loài, sản phẩm PCR của ADN nhân có
thể sử dụng cho thông tin nghiên cứu phát sinh loài của nhiều loài, thứ ba là
vùng ITS có kích thước nhỏ (< 700bp ở thực vật hạt kín) nên dễ dàng khuếch
đại [26].
Vùng ITS có một số ứng dụng như: tính toán các đột biến điểm trong
quá trình hình thành loài, đo lường sự giống nhau bên trong trình tự ADN,
dùng các phần mềm chuyên dụng tạo ra cây tiến hóa loài. Trong thực tế, trình
tự ITS được coi là một công cụ hữu ích để thiết lập mối quan hệ di truyền

giữa các loài và đánh giá sự đa dạng di truyền trong một bậc phân loại [21].
1.1.3. Ứng dụng của ADN Ribosom ITS trong nghiên cứu cây thuốc
Việc sử dụng các thảo dược và các sản phẩm có nguồn gốc dược liệu
làm thuốc là một xu hướng ngày càng phát triển. Theo khảo sát của Trung
Quốc, các dược liệu có tác dụng chữa bệnh bao gồm khoảng 11146 loài thuộc
2309 chi của 383 họ [46]. Vì vậy cần có một công cụ hỗ trợ cho việc xác định
các loài dược liệu để tránh nhầm lẫn, đảm bảo an toàn khi sử dụng. Thuật ngữ
“mã ADN” được Hebert định nghĩa đầu tiên vào năm 2003, sau đó dành được
sự chú ý của giới khoa học. Các nghiên cứu thường tập trung vào các đối
tượng là các gen ở nhân. Trong đó, vùng ITS là vùng thường được lựa chọn
7
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa - Hóa sinh dược - 2012


nghiên cứu. Kress và cộng sự đã nghiên cứu mối quan hệ chặt chẽ của 7 họ
thực vật và 88 loài thuộc 88 chi trong 53 họ thực vật dựa vào trình tự ITS
[18].
Sau đây là một số ví dụ ứng dụng đoạn ADN Ribosom ITS trong
nghiên cứu cây thuốc:
* Chi Zanthoxylum có hơn 200 loài như Zanthoxylum piperitum,
Zanthoxylum schinifolium và Zanthoxylum bungeanum. Trong nền y học cổ
truyền của Trung Quốc, quả của các loài trong chi này được dùng làm thuốc
để điều trị đau thượng vị và thuốc bổ máu. Zanthoxylum là một chi phức tạp
có nhiều điểm khác biệt giữa các loài, vì vậy phương pháp dựa vào các đặc
tính hình thái bên ngoài và các đặc tính sinh lí không thể phân biệt một cách
chính xác quan hệ của các loài. Để giải quyết khó khăn này, ngày nay các nhà
nghiên cứu đã sử dụng trình tự gen để xác định hệ thống phát sinh loài. Trong
nghiên cứu của Sun Yan-Lin đã lựa chọn vùng ITS để phân biệt các loài trong
chi Zanthoxylum. Kết quả nghiên cứu không những cung cấp trình tự ITS của
loài Zanthoxylum piperitum mà còn giúp phân biệt được Zanthoxylum

piperitum với loài Zanthoxylum schinifolium để giải thích quan hệ giữa các
loài trong chi Zanthoxylum [45].
* Một nghiên cứu khác trên chi Phyllanthus, với các dược liệu được
dùng phổ biến trong điều trị viêm gan là P. amarus, P. niruri, P. urinaria.
Tuy nhiên các loài trong chi Phyllanthus rất giống nhau về mặt hình thái vì
vậy rất khó phân biệt giữa các loài dược liệu này. Vì vậy một nghiên cứu đã
xác định và so sánh trình tự ITS của các dược liệu P. amarus, P. niruri, P.
urinaria. Kết luận khẳng định được P. amarus và P. niruri là hai loài độc lập,
đồng thời đưa ra những chỉ thị ADN đặc hiệu để nhận biết từng loài [31].
* Trong những năm gần đây, một số nghiên cứu đã chứng minh cây
Trinh nữ hoàng cung (Crinum Latifolium), một loài thuộc họ Náng có chứa
8
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa - Hóa sinh dược - 2012


các hợp chất alcaloid có tác dụng hỗ trợ trong việc điều trị một số bệnh như u
xơ tuyến tiền liệt, u xơ tử cung rất hiệu quả. Tuy nhiên, trên thực tế có rất
nhiều loại cây cùng họ với Trinh nữ hoàng cung như cây Náng hoa trắng và
cây Huệ biển do vậy rất dễ gây nhầm lẫn. Để xác định chính xác cây Trinh nữ
hoàng cung nhằm cung cấp nguyên liệu cho sản xuất các loại dược phẩm,
thực phẩm chức năng, các nhà khoa học đã sử dụng kĩ thuật sinh học phân tử
để định tên các loài thực vật. Kết quả cho thấy khi sử dụng các cặp mồi đặc
hiệu để khuếch đại đoạn gen ITS, có thể xác định chính xác được đến cấp độ
loài. Trình tự nucleotid vùng ADN ribosom ITS của loài Trinh nữ hoàng cung
đã được đăng kí trên ngân hàng gen thế giới với mã hiệu AY139137 [13].
1.2.

Bạc căn (Streptocaulon kleinii Wight &Arn)

1.2.1. Vài nét về họ Thiên lí (Asclepiadaceae)

Phân loại, vị trí họ Thiên lí
• Về phân loại:
Họ Thiên lí (Asclepiadaceae) là một trong những họ lớn và đa dạng trong
hệ thực vật Việt Nam cũng như trên thế giới. Hệ thống phân loại của nhiều tác
giả đều xếp họ Thiên lí nằm trong bộ Long đởm [3], [4], [5].
Theo hệ thống phân loại phổ biến nhất hiện nay là hệ thống phân loại về
ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) của A. Takhtajan thì họ Thiên lí thuộc lớp
Ngọc lan, phân lớp Hoa môi, bộ Long đởm [3].
Theo trung tâm dữ liệu thực vật Việt Nam, trên thế giới có 290 chi và 2000
loài thuộc họ Thiên lí, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới, một số ít ở vùng cận
nhiệt đới và ôn đới. Ở Việt Nam có khoảng 50 chi và 110 loài. Họ Thiên lý
gồm hai phân họ là: Periplocoideae và Cynanchoideae.
• Về vị trí, họ Thiên lí được sắp xếp như sau:

9
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa - Hóa sinh dược - 2012


Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)
Phân lớp Hoa môi (Lamidae)
Bộ Long đởm (Gentianales)
Họ Thiên lí (Asclepiadaceae)
Đặc điểm thực vật họ Thiên lí
Dạng thực vật: cây thường là dây leo, cây cỏ nhiều năm, cây bụi, ít khi
là cây gỗ.
Lá: lá đơn, nguyên, thường mọc đối, đôi khi mọc vòng. Không có lá
kèm. Toàn cây có nhựa mủ trắng hay trong.
Cụm hoa: thường là xim, có khi là chùm hoặc trông như tán. Hoa đều,
lưỡng tính, mẫu 5. Đài 5, dính nhau ở gốc thành ống ngắn. Tràng 5, dính liền

thành ống, tiền khai hoa vặn, thường có phần phụ ở mặt trong và có tuyến
mật. Nhị 5, bao phấn dính với núm nhụy khối 5 mặt; hạt phấn dính nhau tạo
thành khối 4 hạt phấn hoặc thành khối phấn có chuôi và gót dính để dính vào
sâu bọ, chúng đưa khối phấn này vào sang hoa khác để thụ phấn cho hoa sau.
Bộ nhụy gồm 2 lá noãn, bầu trên, rời nhau ở bầu và vòi, chỉ dính nhau ở núm
ngụy, nhiều noãn.
Quả: quả gồm 2 đại. Hạt thường có mào lông ở một đầu [3].
1.2.2. Vài nét về chi Streptocaulon
Trên thế giới, phân họ Chu đằng (Periplocoideae) có 33 chi với 195 loài
[20], ở Việt Nam gồm 11 chi với 16 loài. Chi Streptocaulon thuộc phân họ
Chu đằng (Periplocoideae), họ Thiên lí (Asclepiadaceae) [3].
Đặc điểm thực vật chi Streptocaulon

10
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa - Hóa sinh dược - 2012


Chi Streptocaulon thường dưới dạng cây cỏ hay cây bụi leo. Lá mọc đối.
Cụm hoa xim các chùy, tam phân, không cuống hay có cuống theo trật tự
khác nhau, thường có lông mềm, ở nách những lá mọc đối và ở ngọn; cuống
hoa thường có lông nhung; nụ rất nhỏ, hoa rất nhỏ. Đài nhỏ, chia 5 với 5 vảy
ở gốc phía trong. Tràng hình bánh xe; ống rất ngắn, thùy hình trái xoan, hơi
phủ sang bên phải. Tràng phụ gồm có 5 sợi đính trên lưng của các chỉ nhị,
Nhị đính ở gốc của tràng; chỉ nhị ngắn, xen kẽ với các tuyến nhỏ; bao phấn
thuôn, dính ở đỉnh của vòi nhụy lõm ở giữa; phần phụ trung đới nhỏ, dính ở
đỉnh của vòi; chuôi gồm những tuyến dính gắn gần đỉnh của vòi nhụy; khối
phấn 2 trong mỗi ô, gồm những hạt lớn chứa mỗi cái 3-4 hạt phấn xếp thành
hàng hay tứ tử. Nhụy gồm 2 lá noãn, rời, vòi nhụy ngắn; đầu nhụy có 5 góc.
Quả gồm 2 quả đại. Có lông mềm; hạt dẹp, mang một mào lông mềm, vỏ
mỏng, phôi nhũ hẹp; lá mầm xoan - thuôn [5].

Phân bố và vị trí của chi Streptocaulon
• Phân bố
Có khoảng 5 loài phân bố ở Châu Á. Ở Việt Nam có 3 loài:
Streptocaulon juventas (Lour.) Merr - Hà thủ ô nam, Streptocaulon kleinii
Wight & Arn - Bạc căn, Streptocaulon wallichii Wight - Bạc căn wallich
[2].
Theo Trần Thế Bách, khi so sánh hình thái - một phương pháp truyền
thống trong phân loại thực vật đã xác định khóa định loại các loài của chi
Streptocaulon ở Việt Nam như sau [2]:
1A. Cuống hoa có lông
2A. Gân bên 14-20 cặp. Cơ quan truyền phấn dài khoảng
350µm......................................................................................1. S. Juventas

11
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa - Hóa sinh dược - 2012


2B. Gân bên ít hơn 13 cặp. Cơ quan truyền phấn dài khoảng
540µm.........................................................................................2. S. Kleinii
1B. Cuống hoa nhẵn ..........................................................3. S. Wallichii
Như vậy, có thể thấy hai loài Bạc căn (Streptocaulon kleinii Wight &
Arn) và Hà thủ ô trắng (Streptocaulon juventas (Lour.) Merr) có nhiều đặc
điểm hình thái tương tự nhau (Hình 1.2).

Hình 1.2. Bạc căn (Streptocaulon kleinii Wight & Arn) và Hà thủ ô
trắng (Streptocaulon juventas (Lour.) Merr)
• Vị trí
Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)
Phân lớp Hoa môi (Lamidae)

Bộ Long đởm (Gentianales)
Họ Thiên lí (Asclepiadaceae)
Phân họ Chu đằng (Periplocoideae)
Chi Streptocaulon
12
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa - Hóa sinh dược - 2012


1.2.3. Loài Bạc căn (Streptocaulon kleinii Wight &Arn)
• Đặc điểm thực vật
Dây leo, thân có lông, dày ở ngọn, lúc già có mủ trắng. Lá có phiến bầu
dục thon ngược, rộng ở phần trên, mặt dưới đầy lông trắng, mặt trên có
lông thưa, cuống 4-5 mm. Tụ tán kép, nụ cao 3,5 mm, vành hình thúng,
không có lông ở trong, màu hoe. Mang nang cụng đầu, dày 10-11 cm, hột
dài 3-4 mm, lông mào dài 2 cm [8].
• Phân bố
Ninh Thuận (Phan Rang), Bình Thuận (Phan Thiết), Bình Dương, Bình
Phước, Bà Rịa - Vũng Tàu (Vũng Tàu). Còn có ở Campuchia, Thái Lan
[1].
Vị trí phân loại (dựa trên đặc điểm hình thái)
Giới thực vật
Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)
Phân lớp Hoa môi (Lamidae)
Bộ Long đởm (Gentianales)
Họ Thiên lí (Asclepiadaceae)
Phân họ Chu đằng (Periplocoideae)
Chi Streptocaulon
1.2.4. Tình hình nghiên cứu và sử dụng một số cây thuốc cùng thuộc
phân họ Chu đằng, họ Thiên lý

Trong số các loài thuộc phân họ Chu đằng (Periplocoideae), dược liệu
được nghiên cứu nhiều nhất là Hà thủ ô trắng (Streptocaulon juventas Merr.).
13
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa - Hóa sinh dược - 2012


Trong y học cổ truyền, dịch chiết nước rễ cây Hà thủ ô trắng dùng giải độc,
chữa cảm sốt, trị vết sưng đau, vết thương do rắn cắn [4], [11]. Mặt khác, dịch
chiết Hà thủ ô trắng có khả năng ức chế sự phát triển của kí sinh trùng sốt rét
Plasmodium falciparum chủng FCR-3 kháng chloroquin [41]. Các thử nghiệm
về hoạt tính kháng ung thư cho thấy dịch chiết methanol rễ cây Hà thủ ô trắng
có độc tính chọn lọc đối với năm dòng tế bào ung thư là tế bào ung thư cổ tử
cung người Hela, tế bào ung thư phổi người A549, tế bào ung thư chuột colon
26-L5, tế bào ung thư phổi chuột LLC và tế bào ung thư ruột kết chuột B16BL6 [42], [43]. Nghiên cứu của Bùi Xuân Hào và cộng sự đã xác định và
phân lập được các thành phần hóa học của rễ cây Hà thủ ô trắng [7]. Một loài
khác thuộc phân họ Chu đằng là Ẩn lân (Cryptolepis buchananii) cũng được
biết đến với tác dụng chống viêm, kháng khuẩn [28], [29], điều hòa miễn
dịch, ức chế tế bào ung thư [27]... Các loài này được liệt kê trong danh mục
cây thuốc ở nhiều quốc gia trên thế giới như Ấn Độ, Trung Quốc, Mỹ,
Philipin....Trên ngân hàng gen quốc tế đã công bố trình tự ADN Ribosom ITS
của cây Hà thủ ô trắng với mã hiệu DQ916865 và Ẩn lân với mã hiệu
DQ916838 [24]. Điều này gợi ý cho việc tiếp tục nghiên cứu các loài khác
thuộc phân họ Chu đằng (Periplocoideae), họ Thiên lí (Asclepiadaceae) để
xem xét sự tương đồng, từ đó mở ra triển vọng nghiên cứu thành phần hóa
học và tác dụng chống ung thư, sốt rét,... của các loài thực vật vốn rất phổ
biến ở Việt Nam.
1.2.5. Tình hình nghiên cứu và sử dụng loài Bạc căn (Streptocaulon kleinii
Wight &Arn)
Hiện nay trên thế giới và Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về loài Bạc
căn (Streptocaulon kleinii Wight &Arn). Một điều đáng chú ý là khi thu hái

Hà thủ ô trắng để làm thuốc ở nhiều vùng của nước ta, người dân vẫn thu hái
14
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa - Hóa sinh dược - 2012