Nghiên cứu thu nhận beauverincin từ cordyceps spp và thăm dò khả năng ức chế tế bào ung thư

MỞ ĐẦU
Từ xa xưa, Cordyceps spp. hay Đông trùng hạ thảo được biết đến như một
loại dược liệu quý sử dụng trong y học. Trong Đông trùng hạ thảo Cordyceps
sinensis, Cordyceps militariss, Cordyceps takaomontana… có nhiều hoạt chất sinh
học có giá trị cao như adenosine, cordycepin, cordyceptic acid, D manitol,
Beauvericin, nhóm hoạt chất HEAA (Hydroxy – Ethyl – Adenosine – Analogs)…
với nhiều tác dụng như tăng cường khả năng miễn dịch, hỗ trợ điều trị ung thư, điều
trị hen và viêm phế quản, giảm khả năng suy thoái thận, kháng viêm, tiêu viêm, ức
chế nhiều loại vi sinh vật có hại trong đó có vi khuẩn lao… Không chỉ sử dụng
trong dược phẩm, Đông Trùng Hạ thảo còn được dùng làm thực phẩm chức năng hỗ
trợ điều trị một số bệnh trong đó có ung thư và nâng cao sức khỏe.
Hiện nay, trên thị trường Việt Nam đang lưu hành một số sản phẩm Đông
Trùng Hạ Thảo Cordyceps sinensis, Cordyceps militaris, Cordyceps takaomontana
đến từ Hàn Quốc, Thái Lan, Nhật Bản nhưng chủ yếu là từ Trung Quốc.
Trên thực tế, Cordyceps sinensis phân bố đặc thù ở Tây Tạng, việc nghiên
cứu nhân nuôi nhân tạo cho đến nay chưa hiệu quả, nguồn sản phẩm vẫn khai thác
từ tự nhiên nên giá thành rất cao. Cordyceps militaris đã được nghiên cứu nuôi nhân
tạo trên quy mô lớn ở một số nước như Trung Quốc, Thái Lan, Hàn Quốc… Việt
Nam hiện cũng đã tiến hành nhân nuôi quy mô nhỏ, tuy nhiên do chưa chủ động
được nguồn giống, còn phụ thuộc vào nước ngoài, nên bị động và khó kiểm soát
được chất lượng của giống cũng như sản phẩm tạo ra.
Trong khi đó, các nghiên cứu đã cho thấy, Cordyceps takaomontana có chứa
các hợp chất sinh học quý như trong Cordyceps militaris và Cordyceps sinensis tuy
hàm lượng thấp hơn. Đặc biệt, dẫn xuất nhóm acetoxyscirpenol chỉ có trong
Cordyceps takaomontana có tác dụng diệt nhiều loại tế bào ung thư với giá trị IC50
ở mức ng/ml [13, 26] và mạnh hơn so với thuốc chữa ung thư cisplatin từ 4 đến 6,6
lần [33] và beauvericin với 12 tác dụng gây độc các dòng tế bào ung thư và u ác
tính ở người với các liều lượng gây độc khác nhau, kháng được 10 loại vi khuẩn
1

gram dương và 9 loại vi khuẩn gram âm gây bệnh trên người... [42]. Tại Việt Nam,
Phạm Quang Thu và cộng sự (2009, 2010) đã phát hiện được Cordyceps takaomona
ở vườn quốc gia Tam Đảo. Còn tại khu bảo tồn tự nhiên Pù Huống, tại Nghệ An đã
thu thập được 29 mẫu, trong đó có Cordyceps takaomontana và một số loài có hoạt
tính sinh học cao như Cordycepssp2., Ophiocordyceps unilateralis…[58]. Tại Vườn
Quốc gia Pù Mát, Trần Ngọc Lân và cộng sự (2008) đã xác định được trong hơn 200
mẫu có chi nấm Cordyceps gồm 15 loài, đặc biệt chi Cordyceps takaomontana có 11
loài, trong đó Isaria tenuipes (thể vô tính của Cordyceps takaomontana) là loài phổ
biến.
Như vậy, nguồn gen nấm Cordyceps takaomontana ở Việt Nam rất phong
phú, có thể khai thác nên chủ động được nguồn giống. Ngoài ra, kỹ thuật nhân nuôi
không quá khắt khe, nguồn nguyên liệu đầu vào cho nghiên cứu và sản xuất loại nấm
này ở Việt Nam như gạo, nhộng tằm... rất dồi dào. Do đó, việc nghiên cứu khai thác,
phát triển nguồn gen nấm Cordyceps takaomontana tạo quả thể chứa hoạt chất sinh
học trong đó có Beauvericin, để sử dụng làm nguyên liệu cho ngành dược có tính
khả thi, có ý nghĩa khoa học và giá trị thực tiễn, góp phần nâng cao sức khỏe cộng
đồng và đặt cơ sở cho sự phát triển một số ngành nghề mới, đầy tiềm năng.
Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: ―Nghiên cứu thu nhận
Beauvericin từ Cordyceps spp. và thăm dò khả năng ức chế tế bào ung thƣ’’
Mục tiêu nghiên cứu
Tuyển chọn được chủng Cordcyeps spp. và tìm điều kiện thích hợp cho tạo
thể quả sinh hoạt chất sinh học Beauvericin có khả năng ức chế tế bào ung thư.
Nội dung nghiên cứu
-

Thu thập, phân lập, tuyển chọn và định tên chủng Cordyceps spp. có khả
năng tạo thể quả

-

Lựa chọn môi trường hoạt hóa giống trên thạch và trên môi trường lỏng

2


-

Nghiên cứu môi trường và các điều kiện nuôi thích hợp cho việc tạo thể quả
sinh hoạt chất Beauvericin

-

Thử nghiệm đánh giá khả năng ức chế tế bào ung thư

3


Chƣơng I. TỔNG QUAN
1.1.

Giới thiệu về nấm Cordyceps spp.

1.1.1. Giới thiệu về Cordyceps spp.
Cordyceps spp. là loại nấm túi, được các nhà khoa học Trung Quốc phát hiện
lần đầu tiên tại Cao nguyên Tây Tạng của Trung Quốc, loại dược liệu này thực chất
là hiện tượng sâu non (ấu trùng) của loài côn trùng thuộc chi Thiarodes hoặc
Hepialus bị nấm Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc.ký sinh. Thường gặp sâu non của
loài Thiatarodes baimaensis hoặc Thiarodes armoricanus, ngoài ra còn 46 loài khác
thuộc chi Thitarodes cũng có thể bị Cordyceps sinensis ký sinh. Theo một số tài
liệu, vào cuối mùa thu, đầu mùa đông các bào tử dính vào da của sâu non (ấu trùng),

phát triển trên sâu non và tạo ra các sợi nấm, các sợi nấm ăn sâu vào ấu trùng, sử
dụng dinh dưỡng của sâu non làm chất dinh dưỡng để phát triển. Đến đầu mùa hạ,
nấm phát triển mạnh, gây chết sâu sau đó chúng hình thành chồi, phát triển cao nhô
lên khỏi mặt đất, nhưng gốc vẫn dính vào đầu sâu. Vì vậy, dân gian thường gọi
Nấm Cordyceps spp. là Đông Trùng Hạ Thảo, Nhộng trùng Thảo hay Đông trùng
[55, 56, 60, 62].
Theo Holiday (2004), Cordyceps spp. được phân loại theo hệ thống phân loại
như sau:
Giới: Nấm (Fungi)
Ngành: Ascomycota
Lớp: Ascomycotes
Bộ: Hypocreales
Họ: Clavicipataceae
Chi: Cordyceps
Cordyceps spp. là loại nấm dược liệu rất quan trọng và được sử dụng rộng rãi
trong y học truyền thống, đặc biệt là trong Y học cổ truyển Trung Hoa. Các nhà
khoa học cho rằng chi Cordyceps có gần 400 loài khác nhau, tính riêng ở Trung
Quốc đã tìm thấy khoảng 60 loài Đông Trùng Hạ Thảo như Cordyceps

4


liangshanensis Zhang, Cordyceps gansuensis, Zhang, C. Shanxiensis Liu…Ngoài
ra, còn có các chủng Cordyceps Militaris, Cordyceps nutans Pat, C.tricentri
Yasuda, C.gunnii Berk. Tuy nhiên cho đến nay, các nước trên thế giới, mới chỉ
nghiên cứu và đưa vào nuôi trồng nhân tạo một số loại nấm như Cordyceps
sinensis, Cordyceps militaris, Cordyceps takaomontana…, các loài nấm này được
phân bố rộng ở cao nguyên Tây Tạng Trung Quốc, Bhutan Nepal, Vùng Đông Bắc
Ấn Độ, ở độ cao 3500 – 5000 so với mặt nước biển. Theo một số nghiên cứu cho
thấy, các chủng nấm Cordyceps khác cũng được tìm thấy tại Thái Lan, Hàn Quốc,

Nhật Bản, và Việt Nam [21, 47].

Hình 1.1: Nấm Cordyceps sinensis trong tự nhiên (Nguồn Mycotherapie.nl)
Theo các sách y học cổ truyền, các chủng nấm thuộc lớp Ascomycestes sống
ký sinh trên vật chủ là sâu non của loài bướm (Caterpilar) họ cánh vẩy, đặc biệt, ở
loài bướm đêm Hepialus armoricanus. Loài bướm này đẻ trứng, trứng nở thành ấu
trùng, rồi thành sâu non. Mùa đông, sâu non chui xuống đất sinh sống. Trong môi
trường ẩm, bào tử nấm Ascomycestes trên cơ thể sâu non, gặp điều kiện thích hợp sẽ
nảy mầm và phát triển trên thân sâu chuyển thành dạng sợi nấm. Ban đầu, hệ sợi có
màu trắng, dạng mảnh, dần về sau, chúng phát triển nhanh thành một khối dày,
chắc, một số biến thành màu vàng đậm cho tới nâu, một số vẫn phát triển thành màu
hồng nhạt, đến màu cam.Và khi nguồn dinh dưỡng cạn kiệt, hệ sợi nấm nhanh
chóng trở nên tối màu giống màu bùn từ 30 đên 60 ngày, khi đó toàn bộ thân sâu

5


chỉ còn là lớp vở bọc bao ngoài sợi nấm. Khi mùa hè đến, từ miệng sâu mọc ra
cuống nấm, nhô lên khỏi mặt đất, giữa cuống nấm phình ra, trên bề mặt cuống có
những mầm nhọn. Các mầm nhọn này nảy ra một số hạt tròn, trong chứa các bào tử
nấm.Thân cây cao gần 10 cm. Khi đào lên làm thuốc, người ta thấy gốc nấm còn
dính liền với đầu của xác sâu. Ấu trùng của bướm dài khoảng 3 đến 6 cm, dày 0.4 –
0.7 cm, sắc nâu vàng, mình ấu trùng với nhiều vạch ngang. Sâu có 8 cặp chân cụp ở
khúc bụng và 4 cặp chân khác hơi dài ở khúc trên. Cắt ngang mình sâu, thịt sâu ở
ruôt màu trắng hơi ngả vàng, xung quanh có màu vàng sẫm hơn.Cây nấm mọc ra từ
miệng sâu có đầu hình chùy chồi thuôn nhỏ lại. Cây màu nâu, đen sẫm lại, dài
khoảng 4 dến 8 cm, đường kính khoảng 0,3 cm.
1.1.2.

Chu trình sống và cơ chế xâm nhiễm

Hàng năm, việc đi tìm Đông trùng hạ thảo tự nhiên từ các vùng núi cao,

thường diễn ra và mùa hè. Điều đặt ra là tại sao mà người dân lại đi tìm vào mùa hè
mà không phải các mùa khác? Câu trả lời được đưa ra dựa vào vòng đời phát triển
của Cordyceps spp.

Hình 1.2: Cơ chế xâm nhiễm nấm Cordcyeps spp.vào côn trùng
Côn trùng sau khi biến đổi thành ngài, chúng để trứng vào trong đất, sau đó
trứng phát triển thành sâu non. Vào mùa đông, sâu non hoặc sâu trưởng thành của
một số loài nấm ở dưới đất hoặc có thể ở trên mặt đất, bị nấm ký sinh côn trùng
xâm nhiễm và sử dụng trực tiếp dinh dưỡng từ cơ thể con trùng làm thức ăn, làm

6


cho côn trùng chết. Giai đoạn này, nhiệt độ và độ ẩm không khí thấp, nấm ký sinh ở
dạng hệ sợi. Đến mùa hè, nhiệt độ và độ ẩm không khí cao, nấm chuyển sang giai
đoạn hình thành quả thể và nhú lên khỏi mặt đất, nhưng gốc vẫn dính liền thân sâu.
Quá trình xâm nhiễm nấm vào côn trùng trải quả các giai đoạn khác nhau.
Giai đoạn xâm nhập, bắt đầu từ khi bào tử nấm mọc mầm đến lúc kết thúc việc
xâm nhập vào trong cơ thể côn trùng. Bào tử nấm sau khi mọc mầm, phát sinh mầm
bệnh, giải phóng các enzyme ngoại bào tương ứng với các thành phần chính của lớp
vỏ cuticun của côn trùng để phân hủy lớp vỏ này như protease, chitinase, lipase,
aminopeptidase, carboxypeptidase A, esterase, cenlulolase. Các enzyme nay được
tạo ra một cách nhanh chóng, liên tục với mức độ khác nhau giữa các loài và ngay
cả trong một loài. Enyzm protease và chitinase hình thành trên cơ thể côn trùng,
tham gia phân hủy lớp da côn trùng (cuticula) và lớp biểu bì (thành phần chính là
protein). Quan trọng nhất là enzyme phân hủy protein (protease) và enzyme phân
hủy chitin (chitinase) của côn trùng. Hai enzyme này có liên quan trực tiếp đến hiệu
quả diệt côn trùng của nấm ký sinh côn trùng [2]

Giai đoạn tiếp theo, giai đoạn sống ký sinh của nấm. Hệ sợ nấm trong
khoang cơ thể tiếp tục phát triển, hình thành nhiều sợi nấm ngắn. Khi hệ sợi hình
thành trong cơ thể, nó phân tán khắp nơi, theo dịch máu, phá hủy và làm giảm tốc
độ lưu thông máu. Toàn bộ các bộ phân nội quan bị xâm nhiễm.nấm thường xâm
nhiễm vào hệ hô hấp, làm giảm khả năng hô hấp của ấu trùng khiến hoạt đông của
côn trùng trở nên chậm chạp và phản ứng kém với các tác nhân kích thích bên
ngoài. Kết quả làm vật chủ mất khả năng kiếm soát hoạt động sống và dẫn đến chết
[41].
Giai đoạn cuối cùng, giai đoạn phát triển sau khi vật chủ chết, sợi nấm phát
triển rất nhanh và tiết ra độc tố phá hủy hệ thống miễn dịch của côn trùng.Trong
giai đoạn gây độc vật chủ, một số loài nấm giết chết vật chủ trước khi gây độc toàn
bộ cơ thể côn trùng [6].
1.2.

Tình hình nghiên cứu Cordyceps spp. trên thế giới

1.2.1.

Sự đang dạng và phân bố

7


Cordyceps spp có trên 400 loài khác nhau và theo hệ thống phân loại truyền
thống các loài này được xếp vào họ Clavicipitaceae. Dựa trên đặc điểm hình thái
cũng như đặc điểm về cấu trúc phân tử, chúng được xếp trong 162 đơn vị phân loại
(Sung et al. 2007). Cordyceps spp được phân bố ở các nước thuộc châu Á như
Trung Quốc, Nhật bản, Hàn Quốc, Thái Lan và Việt Nam [21, 47]
Mao X.L (2000) đã mô tả đặc điểm hình thái, công dụng và ảnh minh họa
cho 13 loài nấm thuộc chi Cordyceps phân bố ở Trung Quốc, đó là các loài :

Cordyceps barnesii Thwaites, Cordyceps capiata (Holmsk;Fk) Link, C.crassiora
Zang, Yang et Li, C.gunii (Berk), C.hawkesii Gray, Cordyceps kyushensis
Kobayasi, C.martialis Gray, C.militaris Link, C. nutans Pat, C.ophoglossoides
(Ehrenb) Link, C. sinensis (Beck) Sacc, C. sobolifera (Hill).Berk , C.tubeculata
(Leb), Maire [30].

Hình 1.3: Nấm Cordyceps sobolifera trong tự nhiên (nguồn )
Sung Jae Mo (2000) đã mô tả đặc điểm hình thái của 25 loài nấm thuộc chi
Cordyceps phân bố tại Hàn Quốc, bao gồm các loài sau: C.adaesanensis, C.agriota
Kawamura,

C.bifisispora, C.crassispora,

C.discoideocapiata,

C.formicarum,

C.gemiculata, C.gracilis, C.heteropoda, C.ishikariensis, C,kyushuensis, C martialis,
C.militaris,

C.nutans,

C.ochraceostroma,

C.ophoglossoides,

C.oxycepphala,

C.pentatoni, C.pruinosa, C.resea, C.scarabaeicola, C.sinensis, C.sphecocephala,
C.tricentri, C.yongmoones [49].

8


Hình 1.4: Chủng nấm Cordyceps gunnii trong tự nhiên (Nguồn Australianfungi)
Tại Nhật Bản, Tsuguo Hongo và Masana Izawa (1994) đã mô tả 33 loại
nấm Đông Trùng Hạ Thảo: C.arigota, C.Longissisma, C.yakushimensis, C.
sobolifera,

C.heteropoda,

C.crilalis,

C.militaris,

C.purpureostroma,
C.clavata,

C.tricentri,

C.takaomontana,

C.ferruginosa,

C.atrovirens,

C.coccidiicola,

C.neovolkiana,

C.nigripoda,

C.gracilioides,

C.nutans,

C.nakazawai,

C.roeostroma,

C.michiganensis,

C.ruinosa,

C.annullata,

C.subbssesillis,

C.stylophora, C.macularis, C.discoideocapitata, C.spheciceophala, C.japonensis,
C.japonica, C.ophioglossoides, C.capita, C.intermedia f.michiniluensis [51]
1.2.2.

Nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt chất sinh học
Trong các loài nấm Đông Trùng Hạ Thảo, 3 chủng nấm Cordyceps sinensis,

Cordyceps militaris, Cordyceps takaomontana và một số loài khác được quan tâm
nghiên cứu nhiều hơn cả thành phần hóa học và hoạt chất sinh học. Các phân tích
hoá học cho thấy, trong sinh khối (biomass) của Đông trùng Hạ thảo Cordyceps
militaris chứa 17 loại acid amin khác nhau. Ngoài ra còn có D-mannitol, lipid và
nhiều nguyên tố vi lượng (Al, Si, K, Na, Cu, Zn...). Quan trọng hơn là trong sinh

khối Đông trùng Hạ thảo có nhiều chất mang hoạt tính sinh học cao đang được các
nhà khoa học dần khám phá ra nhờ các tiến bộ của ngành hoá học các hợp chất tự

9


nhiên. Nhiều hoạt chất trên được chứng minh là có giá trị dược liệu thần kỳ. Trong
đó phải kể đến cordiceptic acid, cordycepin, adenosine và nhóm hoạt chất HEAA
(Hydroxy - Ethyl - Adenosine - Analogs) [1].
Ngoài ra, Đông trùng Hạ thảo còn chứa nhiều loại vitamin, như trong 100g
Đông trùng Hạ thảo có 0,12 g vitamin B12; 29,19 mg vitamin A; 116,03 mg vitamin
C, ngoài ra còn có vitamin B2 (riboflavin), vitamin E, vitamin K... Hơn nữa, rất
nhiều loại polysaccharides và một loạt các nguyên tố hóa học (K, Na, Ca, Mg, Fe,
Cu, Mn, Zn, Pi, Se, Al, Si, Ni, Sr, Ti, Cr, Ga, V) cũng được tìm thấy trong chi nấm
này [1].
Còn trong C. takaomontana có adenosin 0,1%, manitol 7,42%, 17 loại amino
acid, protein 40,24%, 6 loại acid béo trong đó cao nhất là Oleic acid 38,35%,
Linolenic acid 28,3%, Palmitic acid 17,08%, Linoleic 12,35%, Stearic acid 3,16%,
Palmitoeic acid 0,76% (In Pyo Hong 2007). Polysaccharides phân lập từ thể vô tính
của C. takaomontana có hoạt tính chống ung thư (Ban et al., 1998).
Đặc biệt các dẫn xuất nhóm acetoxyscirpenol là một thành phần hoá học
quan trọng đã được phát hiện ở thể vô tính của loài Cordyceps takaomontana. Các
hợp chất này thể hiện tác dụng diệt tế bào ung thư rất hiệu quả thông qua cơ chế gây
chết theo chương trình (apoptosis).
Beauvericin được phát hiện trong nhiều loài nấm ký sinh côn trùng như
Isaria tenuipes (thể vô tính của Cordyceps takaomontana). Beauvericin là một chất
chuyển hóa cyclohexadepsipeptide liên quan đến nấm sở hữu một loạt các hoạt
động sinh học như thuốc trừ sâu, điều trị nhiễm ký sinh trùng, kháng khuẩn, kháng
nấm, chống trùng sốt rét và ức chế ung thư (Shin et al., 2009).
1.2.3. Nghiên cứu về giá trị dược liệu của Đông Trùng Hạ Thảo

Trong các loài nấm Đông Trùng Hạ Thảo, loài nấm Cordyceps sinensis,
Cordyceps militaris, Cordyceps takaomontana được quan tâm nghiên cứu nhiều về
giá trị dược liệu.
Các nghiên cứu cho thấy, trong sinh khối (biomass) của Đông trùng Hạ thảo
Cordyceps militaris chứa nhiều chất có hoạt tính sinh học cao đã được chứng minh

10


là có giá trị dược liệu thần kỳ, có thể kể đến cordiceptic acid, cordycepin, adenosine
và nhóm hoạt chất HEAA (Hydroxy - Ethyl - Adenosine - Analogs) [1].
Cordiceptic acid: là một dạng D-manitol, chất này có tác dụng giảm ho và
hen suyễn, giảm đường huyết và kháng lại vi khuẩn nên rất tốt cho hệ miễn dịch
cũng như người mắc bệnh tiểu đường.
Cordycepin: là một dạng analoge của Adenosine (3’-deoxyadenosine), có tác
dụng ngăn chặn vi khuẩn, chống sự xâm nhiễm của virus, ngăn ngừa ung thư và có
tác dụng rất tốt cho những người mắc bệnh lao.
Adenosine: có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa năng lượng của
cơ thể, giúp cải thiện tuần hoàn ngoại biên và tim mạch, phục hồi năng lực cơ bắp,
ức chế sự tăng sinh của các tế bào ung thư, tăng cường khả năng vận chuyển oxi
trong máu...
Nhóm hoạt chất HEAA (Hydroxy - Ethyl - Adenosine – Analogs) có hoạt tính
sinh học rất mạnh, đang được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm do khả năng hỗ
trợ hệ miễn dịch, chống lại sự xâm nhiễm của một số retrovirus như virus HIV...
Các nhà y học cổ truyền ở Trung Quốc đã nghiên cứu dùng nấm Đông trùng
Hạ thảo điều trị thành công khá nhiều bệnh như: rối loạn lipit máu (hiệu quả đạt
76,2%), viêm phế quản mãn tính và hen phế quản, viêm thận mãn tính và suy thận
(đạt hiệu quả từ 44,7 - 70%), rối loạn nhịp tim (đạt hiệu quả 74,5%), tăng huyết áp,
viêm mũi dị ứng, viêm gan B mãn tính (đạt hiệu quả 70%), ung thư phổi và thiểu
năng sinh dục (đạt hiệu quả từ 31,57- 64,15%) [47].

Không những vậy, Đông trùng Hạ Thảo còn có nhiều tác dụng và đã được
các nghiên cứu về y học chứng minh. Với tác dụng bảo vệ thận: Chống lại các dụng
phụ của thuốc tân dược đối với thận ví dụ như đối với độc tính của Cephalosporin
A, bảo vệ thận trong trường hợp gặp tổn thương do thiếu máu, chống lại sự suy
thoái thận, đẩy nhanh quá trình tái sinh và phục hồi các tế bào ở thận, tăng cường
tác dụng nội tiết tố tuyến thượng thận và làm trương nở các nhánh khí quản; giữ ổn
định hệ tuần hoàn: giảm hiện tượng thiếu máu, tăng cường khả năng lưu thông, điều
tiết lượng đường, Cholesteron trong máu, chống xơ vữa động mạch và ổn định nhịp

11


tim; tăng khả năng miễn dịch, làm chậm quá trình lão hóa, ức chế vi sinh vật có hại;
đẩy nhanh tác dụng của nội tiêt tố….
Ngoài những tác dụng nêu trên, thì nấm Cordyceps còn trực tiếp ảnh hưởng
đến một số hệ cơ quan quan trọng khác trong cơ thể và đặc biệt có tác dụng ức chế
tế bào ung thư đã được mô tả bởi nhiều tài liệu [12, 24, 26, 34].
Y học phương Tây cũng đã công nhận tính năng bổ dưỡng của nấm
Cordyceps, dịch chiết của loại nấm này có khả năng nâng cao thể lực, điều hòa khí
chất, đặc biệt những người do tính chất công việc phải ngồi liên tục và ít vận động.
Dựa trên kết quả nghiên cứu về tác dụng nâng cao sức luyện tập, khả năng chịu
đựng và làm giảm mệt mỏi ở những người trong độ tuổi trung niên 40 đến 70, các
nhà khoa học thuộc trung tâm Pharmanex, California đã phát triển một loại thuốc
lấy tên là Cordymax chứa chiết xuất của nấm Cordyceps và được thử nghiệm trên
131 người tình nguyện trong 12 tuần và cho kết quả khả quan [44]
Nấm Cordyceps takaomontana Yakushiji & Kumazawa chứa hợp chất 4 acetyl - 12,13 – epoxyl - 9-trichothecene-3,15 - diol. Đây là hợp chất được dùng để
hỗ trợ điều trị bệnh ung thư, đặc biệt là bệnh máu trắng ở người [7, 14, 31]. Nấm
Paecilomyces tenuipes (Peck) Samon (=Isaria japonica Yasuda hoặc Isaria tenuipes)
là thể vô tính của Cordyceps takaomontana Yahushiji et al Kumazawa [38]. Quả
thể của nấm Paecilomyces tenuipes có giá trị cao về mặt dược liệu do chứa các hoạt

chất như Leucinostatins A,

D,

Polygalactosamine kháng khối u, Saintopin,

Sphingofungins E và F, UCE1002, Paeciloquinones A, B, C, D, E và F, Ergosterol
peroxide, Acetoxyscirpenediol…[11, 19, 27]. Các hoạt chất Ergosterol peroxide và
Acetoxyscirpenediol tách chiết từ nấm Paecilomyces tenuipes nuôi cấy nhân tạo có
khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư dạ dày, ung thư gan, ung thư ruột kết, ruột
thẳng với giá trị IC50 rất thấp (thậm chí ở mức ng/ml) (Lee et al 2006, Han et al
2004, Chung et al., 2003; Bunyapaiboonsri et al., 2009) và mạnh hơn so với thuốc
chữa ung thư cisplatin từ 4 đến 6,6 lần (Nam et al., 2001). Ngoài ra lớp chất này
cũng có tác dụng ức chế protein vận chuyển SGLT-1 liên quan đến bệnh tiểu đường
[Yoo et al 2006].

12


Năm 2009, Sung Hak Lee và cộng sự tiến hành nghiên cứu sản xuất
polysaccharides bằng nuôi lỏng Cordyceps takaomontana và tìm hiểu ảnh hưởng
của chúng tới tế bào ung thư neuroblastoma người. Hiệu quả ức chế của IPS và EPS
tới sự phát triển của tế bào SKN-SH được thử nghiệm đánh giá với nồng độ IPS và
EPS là 0.5, 1, 2 mg/ml tương ứng với các thời gian 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ. Ảnh
hưởng ức chế trên các tế bào ung thư SK-N-SH đạt 64,6% khi IPS ở nồng độ
2mg/ml trong 72 giờ. Kết quả này chỉ ra rằng, IPS có tiềm năng trong việc ức chế tế
bào neuroblastoma (Sung Hak Lee và cộng sự, 2009).

Hình 1.5: Nấm Cordyceps takaomontana trong tự nhiên
(nguồn Cordyceps.us)

1.2.4. Tình hình nuôi trồng thể quả nấm Cordyceps trên thế giới
Nghiên cứu nuôi trồng thể quả nấm Cordyceps spp được tiến hành ở nhiều
nước trên thế giới như Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Mỹ … Tại Trung Quốc,
thủ phủ của Đông trùng hạ thảo, có một số khu nuôi chuyên biệt cho loại nấm
Cordyceps tại một số tỉnh như: Thượng Hải, Quảng Châu, Vân Nam…Mỗi năm, tại
mỗi khu nuôi nấm này đưa ra thị trường với một sản lượng khá lớn. Ví dụ tại
Kaiping, Quảng Châu, một năm thu được hang trăm kilogram sản phẩm [28].
Tại Hàn Quốc, một số phòng thí nghiệm đã sử dụng giá thể là tằm, nhộng để
nuôi trồng thể quả [19]. Tại thành phố Hayward, Bang California, Mỹ, Công ty

13


Công nghệ sinh học BIOKEN đã nuôi trồng quy mô công nghiệp Cordyceps
militaris trên giá thể gạo. Sản phẩm của các khu nuôi của các nước được tiêu thụ tại
nội địa và xuất ra nước ngoài.

Hình 1.6: Thể quả của Cordyceps militaris trên giá thể gạo lứt
(Nguồn anamuriel.org/medicinal-mushrooms/)
Sản phẩm nấm Đông trùng hạ thảo và Nhộng trùng thảo từ nuôi trồng nhân
tạo đã có mặt ở nhiều nước trên thế giới và mang lại lợi nhuận cao cho người nuôi
trồng (Li Cui et al., 2008).
1.3.

Tình hình nghiên cứu Cordyceps trong nƣớc

1.3.1. Sự đa dạng và phân bố của Chi Cordyceps
Trịnh Tam Kiệt (1996) và đồng tác giả năm (2001) đã đưa ra danh mục các
loài nấm Cordyceps có ở Việt Nam thuộc Họ Clavicitaceae, trong đó có 3 loài thuộc
chi Cordyceps đó là Cordyceps marialis Speg., Cordyceps sinensis (Berk) Sacc. và

loài Cordyceps sobolifera (Hill) Berk & Br. Các tác giả đã ghi nhận nấm Đông
Trùng hạ thảo có phân bố ở các tỉnh của Việt Nam như: Lai Châu, Lào Cai, Yên
Bái, Tuyên Quang, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Bắc Giang, Hà
Nội, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Đà Nẵng, Quảng Nam, Lâm Đồng,
Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận, Tây Ninh [4,5]. Năm 2009, Phạm Quang

14


Thu đã phát hiện thêm hai loài nấm Đông trùng hạ thảo mới tại Việt Nam có phân
bố ở Bắc Giang và Vĩnh Phúc, đó là hai loại nấm: Cordyceps nutans và Cordyceps
gunnii [7].
Tại vườn quốc gia Hoàng Liên, tỉnh Lào Cai đã phát hiện nấm Đông trùng
Hạ thảo Cordyceps militaris.
Năm 2009, Phạm Thị Thùy đã thu thập nấm Cordyceps ở vườn quốc gia Cúc
Phương, tỉnh Ninh Bình. Tác giả đã xác định được loài Đông trùng Cordyceps
militaris, đây là loài lần đầu tiên được phát hiện và mô tả ở Việt Nam. Loài nấm
này phân bố ở rừng tự nhiên có độ cao từ 1.900m đến 2.100m so với mực nước
biển. Ký chủ của loài này là nhộng thuộc bộ cánh vẩy Lepidoptera, nấm dài 2 6,5cm, hình chùy, phần thân và cuống nhỏ, phần đầu phình to có chiều rộng đến
0,6cm. Màu sắc của phần cuống nấm và phần sinh sản khác nhau, phần cuống nấm
nhẵn và có màu da cam nhạt, phần sinh sản có màu da cam đậm và có nhiều mụn nhỏ.
Thể quả dạng chai được cắm rất lỏng lẻo hoặc cắm sâu một phần vào mô của nấm ở
phần sinh sản. Túi bào tử có kích thước 300-510µm x 3,5-5µm, phần mũ gắn trên túi
thể quả có kích thước 3,5-5µm.
Một số khu vực khác cũng đang được triển khai tìm kiếm và nghiên cứu nấm
Cordyceps, thường thì Cordyceps ở Việt Nam phân bố ở những khu rừng nhiệt đới
thường xanh, có độ cao từ 800m đến 2.000m.
Trong chương trình nghiên cứu nghị định thư giữa Việt Nam và Trung Quốc
cấp nhà nước về nghiên cứu nấm Đông trùng Hạ thảo Cordyceps militaris, PGS.TS
Phạm Thị Thùy - Viện Bảo vệ thực vật đã chủ trì đề tài phát triển nấm Đông trùng

Hạ thảo làm nguyên liệu thực phẩm chức năng cho người. Kết quả đã nghiên cứu và
xác định được 3 loài nấm Đông trùng Hạ thảo đó là:
- Cordyceps nutans ở Cúc Phương - Ninh Bình và Tam Đảo - Vĩnh Phúc.
- Cordyceps militaris ở Vũ Quang, Hà Tĩnh.
- Cordycep spl ở Sơn Động, Bắc Giang.

15


Các tác giả cũng đã xác định được một số giá trị dược liệu của Cordyceps
militaris ở Việt Nam gồm chất Cordycepin, Adenosin, HEAA, một số vitamin và
một số nguyên tố vi lượng.
Nấm Cordyceps gunnii (Berk.) Berk thuộc họ Clavicipitaceae, bộ
Hypocrales, lớp Sordariomycetes, ngành nấm túi Ascomycota, là loài nấm nhỏ, đỉnh
nấm nhọn được mọc từ phần đầu của sâu non. Toàn bộ cây nấm màu trắng xám, khi
non phần gốc nấm to hơn phần ngọn, nơi chứa các cơ quan sinh sản của nấm. Sâu
non bị nấm kí sinh nằm ở tư thế thẳng đứng và bị đất vùi kín. Toàn bộ chiều dài cây
nấm lúc thu hái là 55mm, phần nhô lên khỏi mặt đất dài 30 mm. Khi thành thục
cuống màu trắng dài 10 - 90mm, rộng 2 - 3mm, đỉnh nấm màu xám đến đen, hình
trứng đến ống dài, mọc đơn, phân nhánh hoặc mọc thành chùm, chiều dài 8 22mm, rộng 5 - 8mm, màu sắc giữa phần cuống và phần đỉnh khác nhau. Thể quả
hình trứng dài hoặc hình bình, chiều dài 700 – 900µm, chiều rộng 200 - 300µm,
ngập sâu trong mô của nấm. Khi thành thục miệng lộ ra ngoài. Túi bào tử hình ống,
kích thước 200-250 x 6,5-7,5µm, chứa 8 bào tử hình sợi, khi thành thục, bào tử túi
hình sợi dễ dàng đứt đoạn thành đoạn bào tử túi hay bào tử túi thứ sinh, kích thước
4-6,5 x 2-3µm. Bào tử túi thứ sinh dễ nảy mầm, khi chưa phóng ra khỏi túi một số
bào tử nảy mầm thành sợi nấm dài gấp mấy lần bào tử. Nấm ký sinh trên sâu non ở
dưới đất, nên thường bị nhầm là Đông trùng Hạ thảo Cordyceps sinensis (Berk.)
Sacc [7]. Nấm Cordyceps gunnii (Berk.)Berk. phân bố trong rừng tự nhiên lá rộng
thường xanh, ở độ cao trên 800 m so với mực nước biển. Tính đa dạng các loài cây
gỗ ở kiểu rừng này rất cao với rất nhiều loài đại diện của các họ Đậu (Fabaceae), họ

Dầu (Dipterocarpaceae), họ Xoan (Meliaceae), họ Trám (Burseraceae), họ Sim
(Myrtaceae) và họ Xoài (Anacardiaceae). Đây là kiểu rừng đang bị xuống cấp
mạnh. Sâu non là ký chủ của nấm vẫn còn nguyên hình dạng, nằm ở trong lớp đất
mặt có độ sâu 2 - 7 cm. Loài nấm này ưa ẩm, phân bố dọc theo khe cạn, nấm hình
thành quả thể trong điều kiện có ánh sáng tán xạ yếu, độ tàn che thích hợp từ 0,5 0,6.

16


Ký chủ của nấm Cordyceps gunnii (Berk.)Berk. ở ngoài tự nhiên ký sinh trên
sâu non. Sâu non thuộc bộ cánh vẩy Lepidoptera có da đen bóng, có miệng dạng gặm
nhai, có 3 đôi chân thật và 2 đôi chân giả, trên các chân giả có móc [2].Năm 2010,
Phạm Quang Thu và Nguyên Mạnh Hà phát hiện thêm loài nấm Đông Trùng Hạ
Thảo Cordyceps takaomontana nâng tổng số loài nấm Đông trùng hạ thảo được
phát hiện tại Việt Nam. Kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, loài nấm này phân bố ở
rừng nhiệt đới lá rộng thường xanh, ở độ cao từ 800 – 1000m so với mặt nước biển tại
Vườn Quốc gia Ba Vì (Hà Nội) và Vườn Quốc gia Tam Đảo (Vĩnh Phúc) [8]

Hình 1.7: Chủng nấm Cordyceps nutans trong tự nhiên
(Nguồn Phạm Quang Thu)
Loài Cordyceps nutans: nấm mọc ở phần đầu, ngực và phần cuối bụng bọ
xít, nhưng chủ yếu ở phần đầu và ngực. Nấm khi còn non hình thuôn nhọn hoặc
hình lưỡi liềm, khi già chia thành 2 phần rõ rệt: phần cuống nấm có màu hơi đen và
phần đầu nấm hình chùy có màu đỏ da cam đặc trưng. Số lượng nấm trên một ký
chủ từ 1 – 5 cây nấm, nấm trưởng thành thu được có chiều dài từ 60 – 180mm,
chiều ngang phần thân nấm từ 2 – 2,5mm. Phần đầu nấm hay còn goi là cơ quan
sinh sản của nấm, chiếm từ 1/6 đến 1/4 chiều dài của cả cây nấm, chiều ngang từ
2,5 – 4mm. Trên phần sinh sản màu đỏ da cam chứa thể quả dạng chai, chìm sâu,
vách không màu, mọc xiên, cổ cong, miệng thể quả vẫn nhìn thấy trên thể hình
chùy. Kích thước của thể quả 550-810 x 130-210 µm. Túi bào tử hình trụ, chiều dài

760-780µm, đường kính 7-8 µm. Mỗi túi bào tử chứa 8 bào tử. Bào tử túi rất dễ gãy
17


thành những đoạn nhỏ được gọi là ―đoạn bào tử‖. Đoạn bào tử hình trụ hoặc hình
tang trống, hơi phình to ở đoạn giữa, hai đầu bằng, kích thước 9-14,8 x 1,2-2 µm.
Nấm ký sinh trên bọ xít và được tìm thấy trong rừng tự nhiên, ở độ cao từ 4001400m, gần khe suối, ven đường mòn…Nấm mọc nhô lên khỏi lớp thảm mục rừng,
phần thể quả có màu đỏ da cam nổi lên khỏi lớp thảm mục. Ký chủ của nấm là bọ
xít vẫn còn nguyên hình dạng hoặc còn một phần nhưng rất dễ nhận dạng, nằm ngay
dưới lớp thảm mục [10].
Loài nấm Isaria tenuipes (Peck.) Samson thuộc họ Clavicipitaceae, bộ
Hypocrales, lớp Sordariomycetes, ngành phụ nấm túi Ascomycota, là giai đoạn vô
tính của nấm Cordyceps takaomontana Yakushiji & Kumazawa. Hình thái của quả
thể nấm bao gồm 2 phần chính: cuống nấm và tế bào sinh bào tử vô tính. Cuống của
nấm màu vàng chanh, kích thước rất biến động tùy thuộc vào điều kiện mọc và số
lượng quả thể có trên một ký chủ, thường từ 0,5 - 4,5mm. Phía trên của cuống nấm
là các tế bào sinh bào tử vô tính được phân thành nhiều nhánh và căng phồng chứa
đầy bào tử bụi màu trắng, khô và rất dễ rời khỏi tế bào sinh bào tử. Bào tử vô tính
hình hạt đậu, hơi cong ở giữa, có kích thước nhỏ 0,5-1,0 x 2,5-3,0µm. Loài nấm
Isaria tenuipes (Peck.) Samson phân bố trong rừng tự nhiên lá rộng thường xanh á
nhiệt đới đến nhiệt đới, ở độ cao trên 400 - 1800m, so với mực nước biển. Đây là
một loài nấm ưa ẩm, phân bố dọc theo khe cạn và dưới lớp thảm mục rừng. Nấm
hình thành quả thể trong điều kiện có ánh sáng tán xạ yếu, độ tàn che thích hợp từ
0,5-0,8. Tổ thành thực vật chủ yếu là các loài thuộc họ Sồi, Dẻ (Fagaceae), họ Đậu
(Fabaceae), họ Mộc lan (Magnoliaceae). Ký chủ của loài nấm này là nhộng thuộc
bộ Cánh vẩy Lepidoptera [9]. Nấm Cordyceps takaomontana Yakushiji &
Kumazawa tồn tại ở 2 thể hữu tính và vô tính, ở thể vô tính, được gọi bằng những
tên khác nhau là Isaria tenuipes, Paecilomyces tenuipes, Isaria japonica [8,44].
+ Thể hữu tính: Nấm (stromata) mọc đơn lẻ hoặc mọc thành cụm, chùm trên
nhộng thuộc bộ Cánh vảy, nấm màu vàng chanh nhạt, cuống nấm hình trụ, kích

thước 10-45 x 1-1,5mm. Thể quả dạng chai (perithecia), có hình dạng bình nổi trên
bề nặt của phần chóp nấm.Túi bào tử hình chùy, kích thước 1100-1200 x 2,2-

18


3,0µm, phần mũ của túi bào tử có hình trứng đến gần cầu, kích thước 2,5 x 3,0µm.
Bào tử túi dài, mảnh và dễ bị gãy thành đoạn bào tử, đoạn bào tử có kích thước 6-8
x 0,5-0,8µm [8]
+ Thể vô tính: Hình thái của thể quả nấm (synnemata) bao gồm 2 phần
chính: Cuống nấm và tế bào sinh bào tử vô tính (conidiogenous structure). Cuống
của nấm màu vàng chanh, kích thước rất biến động tùy thuộc vào điều kiện mọc và
số lượng thể quả có trên một ký chủ, thường có chiều dài từ 0,5 đến 4,5cm. Phía
trên của cuống nấm là các tế bào sinh bào tử vô tính được phân thành nhiều nhánh
và căng phồng chứa đầy bào tử bụi màu trắng, khô và rất dễ rời khỏi tế bào sinh bào
tử. Bào tử vô tính có hình hạt đậu, hơi cong ở giữa, có kích thước nhỏ 0,5 - 1,0 x 2,5
- 3,0µm [8].
Cordyceps takaomontana Yakushiji & Kumazawa phân bố chủ yếu trong
rừng tự nhiên lá rộng thường xanh, ở độ cao trên 800-1000 m so với mực nước biển.
Đây là loài nấm ưa ẩm, phân bố dọc theo khe cạn, nấm hình thành quả thể trong
điều kiện có ánh sáng tán xạ yếu, độ tàn che thích hợp từ 0,7-0,8. Màu sắc và kích
thước của thể quả thay đổi theo độ che phủ của rừng [8]
1.3.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học và giá trị dược liệu của nấm Đông
trùng hạ thảo
Đỗ Tất Lợi (1977) đã viết, Đông trùng hạ thảo là một vị thuốc bổ, dùng để
chữa thần kinh suy nhược, chữa ho, bổ tinh khí, chữa đau lưng, bổ thận. Liều dùng
6-12 gram theo cách ngâm rượu.
Nguyễn Lân Dũng, Dương Văn Hợp và Nguyễn Thế Hải (2005) đã tổng
quan các tài liệu nghiên cứu của Trung Quốc, Hàn Quốc và tài liệu ở các nước
phương Tây về giá trị dược liệu của loài nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps

militaris và Cordyceps sinensis. Các loài nấm này có thể dùng đễ chữa trị cho 25
loại bệnh khác nhau nên các tác giả đã gọi nấm Đông trùng hạ thảo là thần dược.
Thành phần hóa học trong nấm ký sinh côn trùng được Đái Duy Ban và cs.
(2009) lần đâu tiên phân tích và mô tả loài Isaria cerambycidae, một loại nấm ký
sinh trên xén tóc, lần đầu tiên được phát hiện tại Việt Nam. Trong loài nấm này có

19


chứa 17 loại acid amin, điều đặc biệt là hàm lượng các acid amin trong sâu và nấm
của loài này là tương tự nhau. Giống như Isaria tenuipes, qua phân tích Viện Khoa
học và Công nghệ Việt Nam đã xác định thành phần adenosine có trong nấm Isaria
cerambycidae.
Nguyễn Mậu Tuấn (2011) phân tích về thành phần sinh hóa trong nấm
―Đông trùng hạ thảo tằm dâu‖ (Paecilomyces tenuipes) cho thấy, hàm lượng protein
59.61 - 70.45%, hàm lượng mannitol 1.21 - 1.78%, tổng acid amin 27.75 - 48.02%
với các thành phần vi lượng và vitamin cao.
1.3.3. Nghiên cứu về nhân nuôi thể quả nấm tại Việt Nam
Hiện nay, vấn đề nghiên cứu và nuôi trồng thể quả nấm Codyceps tại Việt
Nam vẫn đang ở mức độ phòng thí nghiệm và quy mô nhỏ, chủ yếu tập trung vào
chủng Cordyceps militaris. Phạm Quang Thu và cs (2012) đã báo cáo tổng kết đề
tài ―Nghiên cứu xây dựng quy trình nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps
militaris (L.:Fr.) Link có giá trị dược liệu và thương mại cao‖. Đây là nghiên cứu
nhân nuôi đầu tiên tại Việt Nam về loài nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps
militaris.
Cùng với việc phát hiện ra loài Isaria cerambycidae, Đái Duy Ban và cs.
(2009) đã tiến hành phân tích thành phần hóa sinh và thử nghiệm nhân nuôi loài
này. Sử dụng một số cơ chất để nuôi cấy nhân tạo bước đầu cho thấy chúng phát
triển rất tốt và khi phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao, mẫu nuôi được có chứa các
hợp chất sinh học quan trọng so với mẫu tự nhiên.

Tại Bảo Lộc, Nguyễn Mậu Tuấn và cs (2010) ở trung tâm Nghiên cứu thực
nghiệm Nông Lâm nghiệp Lâm Đồng đã nghiên cứu nhân nuôi thành công nấm đông
trùng hạ thảo tằm dâu (Cordyceps takaomontana hay Paecilomyces tenuipes) chủng Hàn
Quốc và chế biến một số sản phẩm như rượu, viên nang, viên nén.

20


Hình 1.8: Một dòng sản phẩm từ chủng Cordyceps takaomontana
(Nguồn Trung tâm Nghiên cứu Thực nghiệm Nông Lâm nghiệp Lâm Đồng)
1.4. Ảnh hƣởng của các điều kiện lên men tới khả năng tạo thể quả sinh hoạt
chất Beauvericin của chủng Cordyceps takaomontana
Quá trình tạo thể quả của nấm được nuôi trên hai môi trưởng lỏng và trên
môi tường rắn. Việc lên men trên môi trường trường lỏng để tạo thể quả có một số
lợi ích nhât định khi so sánh với lên men bề mặt, đặc biệt là sự tiêu thụ ít năng
lượng. Tuy nhiên, khi nuôi trên môi trường lỏng để thu thể quả còn tồn tại một số
hạn chế là sản lượng thể quả thu được thấp, thời gian lên men lâu, khó triển khai
trên quy mô công nghiệp. Lên men rắn đã khắc phục được những hạn chế của việc
lên men trên môi trường lỏng tạo thể quả. Lên men bề mặt tiêu thụ ít năng lượng
của môi trường dinh dưỡng, có thể thu được khối lượng thể cao cao hơn rất nhiều so
với lên men tạo thể quả trên môi trường lỏng. Đặc biệt, nguồn nguyên liệu cho quá
trình lên men dễ kiếm, rẻ tiền dẫn tới hạ giá thành sản phẩm đầu ra. Cơ chế hoạt
động của lên men bề mặt đơn giản. Các thông số nhiệt độ, độ ẩm, cường độ sáng
được điều khiển tự động trên quy môi phòng thí nghiệm, và xa hơn nữa có thể nhân
nuôi trực tiếp dưới ánh nắng mặt trời với các điều kiện thích hợp.
Trong quá trình lên men bề mặt, nấm Cordyceps chịu tác động trực tiếp của
các yếu tố môi trường bao gồm: điều kiện môi trường, thành phần môi trường (hàm
lượng gạo lứt, độ pH, nhiệt độ…) các nghiên cứu đã chỉ ra rằng lựa chọn chính xác
21

hàm lượng cơ chất và các thông số ảnh hưởng sẽ mang tính quyết định nhằm tối ưu
quá trình tạo thể quả và các sản phẩm trao đổi chất, các yếu tố vật lý và hóa học
cũng ảnh hưởng tới khả năng tạo ra các sản phẩm đích.
1.4.1. Hàm lượng cơ chất (gạo lứt) và tốc độ thông khí
Hàm lượng gạo lứt là thành phần chính của môi trường dinh dưỡng, đảm bảo
cho sự phát triển của sinh vật và tạo các hợp chất trong Cordyceps như Adenosine,
Beauvericin…. Khi cố định dung tích bình nuôi, khối lượng gạo lứt trên một bình
không chỉ ảnh hưởng tới hàm lượng dinh dưỡng cung cấp cho sự phát triển của thể
quả, mà còn ảnh hưởng tới mật độ oxy. Khi hàm lượng gạo lứt tăng, tương đương
với hàm lượng dinh dưỡng tăng đồng thời hàm lượng oxy giảm xuống, không cung
cấp đủ cho thể quả hô hấp và phát triển. Và ngược lại, khi hàm lượng gạo lứt giảm
xuống, mật độ oxy trong bình tăng nhưng hàm lượng dinh dưỡng không cung cấp
đủ để nuôi thể quả. Do vậy, việc lựa chọn khối lượng gạo lứt trên một bình là cần
thiết cho quá trình sinh trưởng và phát triển của thể quá để đạt được khối lượng thế
quả cao nhất.
1.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ là một trong những yếu tố ngoại cảnh then chốt trong quá trình
nhân nuôi Nấm Cordyceps tạo thể quả. Quá trình nhân nuôi thể quả của Cordyceps
trải qua 3 giai đoạn, giai đoạn đầu – giai đoạn phát triển của hệ sợi. Tại giai đoạn
này, nhiệt độ thích hợp cho hệ sợi phát triển là 24oC cho đến 25oC. Sau khi hệ sợi
phủ kín bề mặt và chuyển màu, nhiệt độ nuôi được chuyển sang giai đoạn hai – giai
đoạn kích thích tạo thể quả. Ở giai đoạn này, nhiệt độ được hạ thấp xuống dưới
20oC, với từng loài Cordyceps khác nhau, nhiệt độ kích thích tạo quả thể khác nhau.
Giữ vùng nhiệt độ thấp dưới hai mươi độ đến khi xuất hiện các mầm quả thể nhú
lên trên môi trường gạo, khi đó chuyển sang nhiệt độ nuôi tại 25oC - giai đoạn 3, là
nhiệt độ tối ưu cho quá trình phát triền của thể quả. Nếu nhiệt độ tăng lên trên 25oC
độ, thể quả phát triển kém, vì nhiệt độ cao, ảnh hưởng tới sự thoát hơi nước của quả
thể. Khi nhiệt độ giảm xuống dưới 24oC, quả thể phát triển chậm. Trong 3 giai
đoạn, giai đoạn nảy mầm là giai đoạn quan trọng. Khi nhiệt độ không kiểm soát tốt,

22


thì không xảy ra quá trình nảy mầm của thể quả. Đặc biệt, nhiệt độ ảnh hưởng rất
lớn tới quá trình sinh Beauvericin. Beauvericin được sinh ra khi nhiệt độ ở ngưỡng
23oC – 25oC. Tại 25oC là nhiệt độ tối ưu cho quá trình sinh Beauvericin, khi nhiệt
độ tăng lên 30oC, quá trình tổng hợp Beauvericin dừng lại.
1.4.3. Ảnh hưởng của pH
Giá trị pH ban đầu ảnh hưởng không nhỏ tới quá trình sinh trưởng và sinh
tổng hợp của vi sinh vật, các quá trình trao đổi chất và giai đoạn tổng hợp các hoạt
chất trung gian đòi hỏi những điều kiện nuôi cấy nhất định. pH ban đầu tác dụng
đến sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật, tạo điều kiện thích hợp cho những giai
đoạn đầu của quá trình đồng hóa, tích tụ những bán thành phẩm để tổng hợp phân tử
và các hợp chất cần thiết. pH phù hợp cho sự phát triển tạo thể quả từ 4 – 9. Mỗi
chủng Cordyceps khác nhau, giá trị pH tạo thể quả cũng khác nhau nhưng chỉ dao
động trong khoảng từ 4 đến 9. khi giá trị pH xuống dưới 4, hệ sợi và thể quả vẫn
phát triển, nhưng phát triển chậm, khi pH tăng lên trên 9, thể quả phát triển kém.
Giá trị pH cũng ảnh hưởng tới quá trình sinh Beauvericin.
1.4.4. Ảnh hưởng của cường độ sáng và độ ẩm môi trường
Hàm lượng ẩm và cường độ ánh sáng của môi trường nuôi ảnh hưởng trực
tiếp tới quá trình sinh trưởng của thể quả. Khi độ ẩm thấp, quá trình hình thành thể
quả không xảy ra, và khi độ ẩm đạt giá trị trong khoảng 95% – 100 %, thể quả có
hiện tượng bị hỏng khi đã mọc, đọng nước bề mặt khi chưa hình thành, gây ức chế
quá trình hình thành và phát triển của thể quả. Cường độ ánh sáng ảnh hưởng tới
quá trình kích thích nảy mầm và tốc độ phát triển của thể quả. Mỗi chủng nấm
Cordyceps khác nhau có giá trị chiếu sáng kích thích nảy mầm và phát triển thể quả
khác nhau. Có những loài chịu được cường độ ánh sáng chiếu cao lên tới 2000 lux
như Cordyceps militaris, nhưng có những loài chỉ mọc khi cường độ ánh sáng yếu
từ 150 lux – 200 lux, như Codyceps takaomontana.

1.5.

Sơ lƣợc về Beauvericin

1.5.1. Cấu tạo hóa học Beauvericin

23


Beauvericin là một ―cyclic hexadepsipeptide‖, là một loại độc tố được sản
xuất bởi nhiều loại nấm như Beauveria basiana, Fusarium, Isaria… đồng thời hoạt
chất này cùng thuộc nhóm kháng sinh. Nó có chứa hai tiểu phần Dhydroxyisovaleryl và N-methylphenylalanyl.

Hình 1.9: Cấu trúc hóa học của

Hình 1.10: Cấu trúc không gian của

Beauvericin

Beauvericin

Công thức phân tử: C45H57N3O9.
Tên theo IUPAC: (3S, 6R, 9S, 12R, 15S, 18R)-3,9,15-Tribezyl-6,12,18triisopropyl-4,10,16

trimethyl-1,7,13-trioxa-4,10,16-triazacyclooctadecane-

2,5,8,11,14,17-hexone
Về mặt Hóa học, beauvericin là một hexadepsipeptide cyclic xen kẽ methylphenylalanyl và hydroxy-iso-valeryl dư lượng, có khả năng tạo phức ion cho phép
beauvericin vận chuyển kim loại kiềm thổ và các ion kim loại kiềm qua màng tế
bào.

1.4.2. Con đường tổng hợp Beauvericin
Theo các nghiên cứu tổng hợp Beauvericin, theo hình A ― nguồn Nito có thể
là bất kỳ amino axit có thể cung cấp L-phenylalanine hoặc valine bằng sự vẫn
chuyển từ nhóm amino sang keto axit. Ngoài ra, nguồn cơ chất là đường 5C và
đường 6C có thể là nguồn cacbon thay thế glucose. Theo Xu et al [18] glucose là
chất tốt nhất trong 7 nguồn cac bon cho quá trình sinh tổng hợp Beauvericin. Bước

24


cuối quá trình chuyển hóa ở hình A, là chìa khóa của quá trình sinh Beauvericin là
sự có mặt của axit amin L-phenylalanine (L-Phe), axit amin D-hydroxy
hydroxyisovaleric (D-HYIV), ATP/ Mg2+, S-adenosyl-methionine (AdoMet), và
enzyme tổng hợp beauvericin. Enzym tổng hợp Beauvercin là một enzyme đa chức
năng xúc tác hình thành depsipeptide và là một chuỗi polypeptide đơn với khối
lượng phân tử khoảng 250kDa. Beauvericin sinh tổng hợp nhờ enzyme xúc tác tổng
hợp qua một tiểu phần ribosom, theo cơ chế thiol. Năm bước trung gian quan trọng
tổng hợp Beauvericin. Đầu tiên,hai tiểu phần enzyme tổng hợp Beauvericin được
hoạt hóa bởi L-Phe và D-HYIV, đó là đồng hóa trị gắn liền với 4'phosphopantetheinyl cánh tay enzyme-ràng buộc như thioesters. Tiếp theo, tiểu
phần L-phenylalanyl được N-methyl hóa bởi AdoMet. Theo sau đó, một peptit được
hình thành. Kế tiếp, chuỗi hexadepsipeptide tuyến tính trung gian được tổng hợp.
Trong bước cuối cùng, các hexadepsipeptide tuyến tính được cyclized để tạo
beauvericin. pH tối ưu cho sự hình thành Beauvericin là pH 7.2, và nhiệt độ tối ưu
là 25 ~ 27 ° C, Enzym tổng hợp beauvericin đã không hoạt động khi nhiệt độ cao
hơn 30 ° C [35,37]. Cho đến nay, các chuỗi axit amin và các gen mã hóa synthetase
beauvericin chưa rõ ràng. [ 38, 39, 40].

25