Nghiên cứu định lượng isoniazid trong dịch sinh học bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao tạo dẫn chất hoá trước cột

đào thị cẩm minh

bộ giáo dục & đào tạo

bộ y tế

trường đại học dược hà nội

ĐàO THị CẩM MINH


KIểM NGHIệM THUốC - ĐộC CHấT

NGHIÊN CứU ĐịNH LƯợNG ISONIAZID TRONG DịCH SINH HọC
BằNG PHƯƠNG PHáP SắC Ký LỏNG HIệU NĂNG CAO
TạO DẫN CHấT HóA TRƯớC CộT

luận văn thạc sĩ dược học


Hà nội - 2009

Hà Nội - 2009


bộ giáo dục & đào tạo

bộ y tế

trường đại học dược hà nội

ĐàO THị CẩM MINH

NGHIÊN CứU ĐịNH LƯợNG ISONIAZID TRONG DịCH SINH HọC
BằNG PHƯƠNG PHáP SắC Ký LỏNG HIệU NĂNG CAO
TạO DẫN CHấT HóA TRƯớC CộT

luận văn thạc sĩ dược học
Chuyên ngành: Kiểm nghiệm THUốC - độc chất
Mã số:

607315

Người hướng dẫn khoa học:

1. ts. nguyễn thị kiều anh
2. ts. PHạM THị THANH Hà

Hà Nội - 2009


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến
TS.Nguyễn Thị Kiều Anh – phòng thí nghiệm trung tâm trường Đại học
Dược Hà Nội và TS.Phạm Thị Thanh Hà – bộ môn Hóa phân tích-Kiểm
nghiệm trường Đại học Dược Hà Nội, đã tận tình hướng dẫn, quan tâm giúp
đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo ở Phòng đào tạo sau đại
học, Bộ môn Hóa phân tích-Kiểm nghiệm, Phòng thí nghiệm trung tâm
trường Đại học Dược Hà Nội, đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình
học tập và nghiên cứu.

Tôi xin tỏ lòng biết ơn chân thành đến Ban giám hiệu, Ban chủ nhiệm
Khoa Dược trường Đại học Y Dược Huế đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong
suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè,
đồng nghiệp đã động viên, khích lệ tôi rất nhiều để tôi có thêm sự nhiệt tình
và say mê nghiên cứu khoa học.
Hà Nội, tháng 12 năm 2009
Học viên
Đào Thị Cẩm Minh


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1
Chuơng 1.TỔNG QUAN........................................................................................ 3
1.1.TÌNH HÌNH BỆNH LAO THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM ........................................ 3

1.1.1.Tình hình bệnh lao trên thế giới ......................................................... 3
1.1.2. Tình hình bệnh lao tại Việt Nam ....................................................... 5
1.1.3.Phác đồ điều trị lao ............................................................................. 6
1.2.TỔNG QUAN VỀ ISONIAZID ....................................................................... 7

1.2.1.Tác dụng sinh học .............................................................................. 7
1.2.2.Tính chất hóa lý .................................................................................. 8
1.2.3.Các phương pháp định lượng Isoniazid ........................................... 10
1.3.VÀI NÉT VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO .......................................... 12

1.3.1.Khái niệm ......................................................................................... 12

1.3.2.Một số thông số đặc trưng ................................................................ 13
1.3.3.Các phương pháp định lượng bằng HPLC ....................................... 16
1.4.VÀI NÉT VỀ TỐI ƯU HÓA PHƯƠNG PHÁP ................................................ 17

1.4.1.Một số khái niệm .............................................................................. 17
1.4.2.Các phương pháp tối ưu hoá ............................................................ 18
1.5.THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP TRONG DỊCH SINH HỌC ............... 19
1.5.1.Khái niệm ......................................................................................... 19
1.5.2.Nội dung thẩm định .......................................................................... 20
Chương 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........ 22


2.1.NGUYÊN – VẬT LIỆU TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM ................................. 22

2.1.1.Hoá chất ............................................................................................ 22
2.1.2.Thiết bị ............................................................................................. 22
2.2.ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ........................................................................ 22

2.2.1.Trong nghiên cứu xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích ..... 22
2.2.2.Trong xác định nồng độ INH trong dịch sinh học của bệnh nhân
lao uống thuốc có chứa INH ........................................................... 23
2.3.NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .......................................................................... 23
2.4.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................... 24

2.4.1.Xây dựng và tối ưu hóa quá trình tạo dẫn chất trong phương pháp
phân tích .......................................................................................... 24
2.4.2.Thẩm định phương pháp .................................................................. 25
2.4.3.Định lượng INH trong dịch sinh học ............................................... 27
Chương 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM ......................................................................... 29
3.1.KẾT QUẢ XÂY DỰNG VÀ TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH TẠO DẪN CHẤT

TRONG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ......................................................... 29

3.1.1.Khảo sát điều kiện sắc ký ................................................................. 29
3.1.2.Xây dựng qui trình dẫn chất hóa. ..................................................... 31
3.2.THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ................................................. 38

3.2.1.Tính chọn lọc .................................................................................... 38
3.2.2.Khoảng nồng độ tuyến tính .............................................................. 40
3.2.3.Độ chính xác..................................................................................... 41
3.2.4.Độ đúng ............................................................................................ 43
3.2.5.Độ tìm lại .......................................................................................... 43
3.2.6.Giới hạn định lượng ......................................................................... 45


3.2.7.Độ ổn định ........................................................................................ 45
3.3.ĐỊNH LƯỢNG ISONIAZID TRONG DỊCH SINH HỌC CỦA BỆNH NHÂN LAO .... 47

3.3.1.Nồng độ INH trong huyết tương bệnh nhân .................................... 51
3.3.2.Nồng độ INH trong dịch màng phổi của bệnh nhân. ....................... 52
Chương 4: BÀN LUẬN ....................................................................................... 53
4.1.VỀ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ISONIAZID TRONG DỊCH SINH HỌC .... 53

4.1.1.Về quá trình tạo dẫn chất hóa ........................................................... 53
4.1.2.Về xây dựng điều kiện sắc ký .......................................................... 54
4.1.3.Thẩm định phương pháp phân tích .................................................. 56
4.2.VỀ ỨNG DỤNG ......................................................................................... 59
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................. 60
TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................... 62
PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AFB

:

Trực khuẩn kháng cồn kháng acid

CA

:

Cinamaldehyd

CTCLQG

:

Chương trình chống lao quốc gia

DOTS

:

Điều trị liệu ngắn ngày có kiểm sát

FDA

:

Cục quản lý thuốc & thực phẩm Mỹ
The United States Food and Drug Administration

H20

:

Nước

HPLC

:

INH

:

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid
Chromatography)
Isoniazid

LOQ

:

Giới hạn định lượng (Limit of Quantification)

MeCN

:

Acetonitril

MeOH

:

Methanol

PA

:

Tinh khiết phân tích

PZA

:

Pyrazinamid

RMP

:

Rifampicin

Rs

:

Độ phân giải

RSD

:

S

:

Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard
Deviation)
Diện tích

TCA

:

Acid tricloroacetic

UV

:

Tử ngoại (Ultra Violet)

WHO

:

Tổ chức Y tế thế giới


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Tỷ lệ mắc và tử vong do lao trên thế giới ......................................... 4
Bảng 1.2: Một số nghiên cứu định lượng INH trong dịch sinh học................ 12
Bảng 2.1: Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn ....................................................... 26
Bảng 3.1: Các biến đầu vào và các mức ......................................................... 33
Bảng 3.2: Các biến đầu ra ............................................................................... 33
Bảng 3.3: Mô hình thiết kế thí nghiệm và kết quả .......................................... 33
Bảng 3.4: Các hệ số hồi quy của Y1 ................................................................ 34
Bảng 3.5: Các hệ số hồi quy của Y2 ................................................................ 34
Bảng 3.6: Phân tích phương sai cho Y1........................................................... 35
Bảng 3.7: Phân tích phương sai cho Y2........................................................... 35
Bảng 3.8: Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của INH ................... 40
Bảng 3.9: Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp phân tích ........... 42
Bảng 3.10: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp ................................. 43
Bảng 3.11: Kết quả khảo sát độ tìm lại của phương pháp .............................. 44
Bảng 3.12: Kết quả khảo sát giới hạn định lượng ........................................... 45
Bảng 3.13: Kết quả khảo sát độ ổn định của INH trong thời gian bảo quản ...... 46
Bảng 3.14: Kết quả nồng độ INH (µg/ml) trong dịch màng phổi bệnh nhân ....... 49
Bảng 3.15: Kết quả nồng độ INH (µg/ml) trong huyết tương bệnh nhân ....... 50


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 3.1: Sắc đồ của dịch sinh học trắng (a), dịch sinh học có INH (b), và
phổ UV của pic ứng với INH (c) ................................................... 30
Hình 3.2: Sắc đồ mẫu định lượng với nồng độ TCA 20 % ............................. 32
Hình 3.3a: Các đường đồng mức của Rs với nồng độ CA là 1% ................... 36

Hình 3.3b: Các đường đồng mức của S với nồng độ CA là 1% ..................... 36
Hình 3.4: Các đường đồng mức của diện tích S pic INH (a) và độ phân giải
Rs (b) với nồng độ CA là 1% ........................................................ 37
Hình 3.5: Sắc đồ mẫu huyết tương trắng (a) và dịch màng phổi trắng (b) ..... 38
Hình 3.6: Sắc đồ mẫu thêm INH vào huyết tương trắng (a), dịch màng phổi
trắng (b) ......................................................................................... 39
Hình 3.7: Sắc đồ mẫu thêm INH, PZA, RMP vào huyết tương trắng(a),
dịch màng phổi trắng (b) ............................................................... 39
Hình 3.8: Phổ hấp thụ cực đại tại thời gian lưu ứng với pic INH trong mẫu
huyết tương (a), dịch màng phổi (b).............................................. 39
Hình 3.9: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ INH
trong huyết tương .......................................................................... 41
Hình 3.10: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ INH
trong dịch màng phổi ..................................................................... 41
Hình 3.11: Biểu đồ minh họa giá trị RSD % của các nồng độ INH so với
yêu cầu phân tích thuốc ................................................................. 42
Hình 3.12: Biểu đồ minh họa độ ổn định của INH trong huyết tương ............. 46
Hình 3.13: Biểu đồ minh họa độ ổn định của INH trong dịch màng phổi ....... 47
Hình 3.14: Sắc đồ của huyết tương bệnh nhân 2VL87 (a), dịch màng phổi
bệnh nhân T5 (b) ........................................................................... 48
Hình 3.15: Biểu đồ phân bố bệnh nhân theo nồng độ INH trong huyết tương ........ 51


Hình 3.16: Tỷ lệ % bệnh nhân (có nồng độ INH trong huyết tương) ở các
khoảng điều trị ............................................................................... 51
Hình 3.17: Biểu đồ phân bố bệnh nhân theo nồng độ INH trong dịch màng phổi ..... 52
Hình 3.18: Tỷ lệ % bệnh nhân (có nồng độ INH trong dịch màng phổi) ở các
khoảng điều trị ............................................................................... 52
Hình 4.1: Sắc đồ mẫu dịch sinh học trắng thêm INH được nồng độ 10 µg/ml .......... 55
Hình 4.2: Sắc đồ mẫu dịch sinh học trắng thêm INH được nồng độ 10 µg/ml ........ 55

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Lao là một bệnh truyền nhiễm, đã được y học nói đến với cái tên đáng
sợ “dịch hạch trắng” vì rất dễ dàng lây từ người này sang người khác. Một
người bị lao có thể lây truyền cho 10 – 15 người khác trong một năm. Do sự
phát minh ra các thuốc hóa học chống lao khiến việc chữa lao đơn giản hơn
và hiệu quả hơn, đồng thời đã phát sinh tâm trạng lạc quan của y giới, làm
lãng quên căn bệnh nguy hiểm này. Ngày nay, bệnh lao đang xuất hiện trở lại
và cùng với đại dịch HIV/AIDS trở thành một trong những căn nguyên gây
mắc bệnh và tử vong chủ yếu, đặc biệt tại các nước đang phát triển.
Bệnh lao kháng thuốc xuất hiện khi có vi khuẩn lao kháng với một hoặc
nhiều loại thuốc chống lao, nguyên nhân có thể là do nhiều bệnh nhân không
hợp tác, không tuân thủ đúng nguyên tắc điều trị, hay do thầy thuốc kê đơn
không đúng, do không phối hợp đầy đủ các thuốc chống lao, liều lượng thuốc
không đủ, hướng dẫn bệnh nhân không đúng cách, điều trị không đủ thời gian
… Để đạt được hiệu quả điều trị cần giám sát nồng độ thuốc trong dịch sinh
học để sớm có điều chỉnh kịp thời đạt hiệu quả điều trị. Isoniazid là một trong
những thuốc thiết yếu của phác đồ điều trị lao trong chương trình chống lao
quốc gia (CTCLQG). Đã có nhiều phương pháp định lượng các hoạt chất
trong những dạng thuốc phối hợp (có isoniazid) điều trị lao ở dạng chế phẩm
[6],[7],[9],[10],[17],[19]. Còn trong dịch sinh học, việc định lượng isoniazid
tiến hành chủ yếu ở huyết tương hay nước tiểu của người [11], [23], [26], mà
ít có những phương pháp định lượng isoniazid tại cơ quan tổn thương cụ thể
là phổi, dịch màng phổi. Bên cạnh đó, khi tiến hành định lượng các hoạt chất
ở dạng phối hợp thì isoniazid lại cho kết quả chỉ dạng vết, khó xác định nồng
độ một cách chính xác, nhất là trong dịch màng phổi của bệnh nhân lao sau

2
khi uống thuốc này [11],[16]. Do đó, việc xây dựng phương pháp định lượng
mà giới hạn định lượng INH với độ nhạy cao để có thể xác định được nồng độ
isoniazid trong dịch sinh học của bệnh nhân lao là rất cần thiết.
Xuất phát từ thực tế, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu định
lượng Isoniazid trong dịch sinh học bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao tạo
dẫn chất hóa trước cột ” nhằm :
-Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng isoniazid trong dịch
sinh học bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao tạo dẫn chất hóa trước cột.
-Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng nồng độ isoniazid
trong dịch sinh học (huyết tương và dịch màng phổi) của bệnh nhân lao uống
thuốc này.


3

Chuơng 1
TỔNG QUAN
1.1.TÌNH HÌNH BỆNH LAO THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

1.1.1.Tình hình bệnh lao trên thế giới
Hiện nay, trên thế giới có khoảng 2,2 tỷ người đã nhiễm lao (chiếm 1/3
dân số thế giới). Bệnh lao mới mắc hàng năm trên toàn cầu là trên 8 triệu,
tổng số lao cũ và mới đang lưu hành là trên 16 triệu. Số người chết vì lao
hằng năm là 2 triệu trong đó có 300.000 trẻ em và 700.000 phụ nữ trong độ
tuổi sinh sản, chết do lao gấp 2 lần số chết do nguyên nhân sản khoa và phụ
khoa. Mỗi năm có 640.000 bệnh lao mới mắc có nhiễm HIV. Dịch HIV/AIDS
là một nguyên nhân làm cho bệnh lao lan truyền nhanh hơn trong cộng đồng
nhất là tại Châu Phi và Châu Á. WHO xác nhận lao hiện nay là bệnh giết

nhiều người nhất trong các bệnh nhiễm. Đến nay bệnh lao đã gia tăng nhiều
tại các nước đang phát triển với hình thức khó chẩn đoán hơn, phát bệnh sớm
hơn, chết nhanh hơn ở bệnh nhân lao có nhiễm HIV và dưới hình thức nguy
hiểm hơn đó là lao kháng thuốc và kháng đa thuốc lao. Tại các nước nghèo
hiện nay lao kháng đa thuốc thì không có khả năng chữa trị được [31], [32].
Khoảng 95% số bệnh nhân lao và 98% số người chết do lao ở các nước có thu
nhập vừa và thấp, 75% số bệnh nhân lao cả nam và nữ ở độ tuổi lao động.
Trong đó, có khoảng 80% số bệnh nhân lao toàn cầu thuộc 22 nước có gánh
nặng bệnh lao cao.
Tỷ lệ điều trị thành công trên toàn cầu đạt 82%, nhưng tỷ lệ phát
hiện chỉ đạt 37% số bệnh nhân ước tính. Như vậy, còn rất nhiều bệnh
nhân lao không được chữa trị đang tiếp tục lây bệnh cho cộng đồng, và
theo ước tính của TCYTTG, mỗi năm có thêm 1% dân số thế giới bị
nhiễm lao (65 triệu người).


4
Hơn 33% số bệnh nhân lao toàn cầu tại khu vực Đông-Nam Châu Á.
Dưới đây là ước tính tỷ lệ mắc và tử vong do lao ở các khu vực (WHO, 2004).
Bảng 1.1: Tỷ lệ mắc và tử vong do lao trên thế giới
Số BN (nghìn)

Khu vực

Tỷ lệ/100 000

Tử vong do lao
(bao gồm cả nhiễm HIV)

Các

thể

Các thể
(%)

AFB
(+)

Các
thể

AFB
(+)

Châu Phi

2354

(26%)

1000

350

149

556

83

Châu Mỹ

370

(4%)

165

43

19

53

6

Trung Đông

622

(7%)

279

124

55

143

28

Châu Âu

472

(5%)

211

54

24

73

8

2890

(33%)

1294

182

81

625

39

Đông
nam
Châu Á

SL
(nghìn)

TL/100000

Tây
Thái
Bình Dương

2090

(24%)

939

122

55

373

22

Toàn cầu

8797

(100%)

3887

141

63

1823

29

Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã tuyên bố tình trạng khẩn cấp toàn cầu
của bệnh lao và mối hiểm hoạ của nó trong tương lai là bệnh lao kháng thuốc.
Bệnh lao được báo động vì hiện nay lao vẫn là nguyên nhân gây tử vong trong
10 bệnh có số chết đứng hàng đầu tại các nước đang phát triển. Mắc bệnh lao và
tử vong vì lao chủ yếu ở thiếu niên và người lớn trong tuổi lao động sản xuất,
những người làm ra của cải vật chất nuôi sống gia đình và xã hội. Chính bệnh
lao đã làm cho xã hội nghèo khổ không phát triển được, ngoài ra xã hội còn phải


5
tiếp nhận số trẻ mồ côi mà những phần tử trụ cột trong gia đình đã chết vì lao để
lại và chính bản thân những người bị lao cũng chịu các di chứng tàn phế nếu họ
được phát hiện bệnh trễ và điều trị không đúng nguyên tắc [33].
Lao hiện nay là vấn đề khẩn cấp của sức khỏe toàn cầu
1.1.2. Tình hình bệnh lao tại Việt Nam

Tại Việt Nam dịch lao là một vấn đề y tế công cộng quan trọng. Năm
1999, WHO xếp Việt Nam ở vị trí thứ 11 trong số 22 nước trên toàn thế giới
có tổng số bệnh lao nhiều nhất (80% tổng số lao toàn cầu). Năm 2000 cả nước
(có 61 tỉnh với 76 triệu dân) đã phát hiện và điều trị 90.756 bệnh lao các thể
trong đó có 53.169 lao phổi mới có vi khuẩn lao trong đàm. Tình hình vi
khuẩn lao kháng thuốc ban đầu ở Việt Nam cũng rất cao 32,5% kháng từ 1 –
4 thuốc cơ bản Streptomycin, Isoniazid, Rifampicin, Ethambutol trong đó có
2,3% lao đa kháng thuốc lao (điều tra năm 1997). Dịch HIV/AIDS đã tăng
nhanh trong các năm gần đây. Tổng số người Việt Nam nhiễm HIV từ 1990 –
2000 có báo cáo là 28.661 (trong đó có 4.728 ca AIDS và 2510 tử vong). Số
bệnh lao có nhiễm thêm HIV cả nước có báo cáo là 1564 ca. Tỷ lệ tử vong ở
bệnh nhân lao có nhiễm HIV là rất cao 31,3%. Chương trình chống lao Việt
Nam đã triển khai thực hiện chiến lược Hóa trị liệu ngắn ngày có giám sát
trực tiếp (DOTS) điều trị lao với phác đồ hóa ngắn ngày trong vòng 8 tháng
có kiểm soát tại quận huyện phường xã từ 1989 và đạt được kết quả lành bệnh
lao các thể khoảng 90% [31].
Điều mà CTCLQG cần làm là sự đồng tình hỗ trợ của mọi người, mọi
gia đình và mọi đoàn thể trong nước và quốc tế cùng với chính quyền trong
việc thực hiện chiến lược chống lao DOTS điều trị lao có kiểm soát với phác
đồ hóa ngắn ngày cho 100% bệnh nhân lao trong cả nước. Đó là biện pháp
duy nhất có được để ngăn chặn dịch lao trong tình hình hiện nay.


6
1.1.3.Phác đồ điều trị lao
Lao là bệnh nhiễm khuẩn lây truyền có từ lâu đời và tác nhân gây bệnh
chính là trực khuẩn hình que được nhà bác học Robert Kock tìm ra trong đàm
của người bị lao phổi từ năm 1882. Bệnh lao có 2 thể: lao phổi và lao ngoài
phổi. Lao phổi chiếm từ 70% đến 80% trong tổng số lao chung. Lao phổi là
thể lây chủ yếu theo đường hô hấp từ người bệnh sang người lành. Người

bệnh lao khi ho khạc hay hắt hơi làm bắn ra bên ngoài nhiều vi khuẩn lao nằm
trong các hạt đàm nhớt li ti bay lơ lửng trong không khí. Con người sẽ bị
nhiễm lao nếu hít phải không khí có chứa vi khuẩn lao. Lao phổi tìm có vi
khuẩn lao trong đàm soi trực tiếp là nguồn lây lao chính cho cộng đồng. Mỗi
bệnh nhân lao phổi có thể lây cho 20 – 30 người lành trong 2 năm nếu không
được điều trị lành.
Các phác đồ. chính điều trị lao hiện nay được áp dụng ở Việt Nam [5],
[7], [15].
- Lao phổi mới ở người lớn: 2 (Streptomycin, Isoniazid, Pyrazinamid)/
6 (Isoniazid, Ethambutol)
- Lao phổi tái phát, lao phổi mạn tính và thể lao nặng: 2 (Streptomycin ,
Rifampicin, Isoniazid, Pyrazinamid, Ethambutol)/ 1 (Rifampicin, Isoniazid,
Pyrazinamid, Ethambutol)/ 5 (Rifampicin, Isoniazid. Ethambutol)
Lao mới là bệnh nhân chưa được điều trị lao bao giờ hoặc đã điều trị
chưa được 1 tháng.
Lao phổi tái trị là những bệnh nhân đã được chẩn đoán mắc lao trước
đây, được điều trị (đủ hoặc chưa đủ thời gian) với kết quả triệu chứng đã hết
hoặc thuyên giảm trong 1 tháng hoặc hơn. Bệnh nhân quay lại với triệu chứng
lâm sàng và (hoặc) xét nghiệm (ví dụ AFB dương tính) của một bệnh đang
tiến triển. Lao tái trị bao gồm:


7
+Điều trị lại sau bỏ trị: Bệnh nhân không dùng thuốc 2 tháng trong quá
trình điều trị, nay quay lại điều trị với AFB (+) trong đờm.
+Tái phát: Bệnh nhân được điều trị lao đủ thời gian, được thầy thuốc
xác định khỏi bệnh hoàn thành điều trị nay mắc bệnh trở lại.
+Thất bại: Bệnh nhân có AFB (+) trong đờm sau điều trị thuốc lao
5 tháng.
Lao mạn tính: Bệnh nhân có xét nghiệm đờm dương tính hoặc trở nên

dương tính sau khi đã được điều trị lại đầy đủ thời gian bằng công thức tái trị
và có giám sát trực tiếp.
Thể lao nặng: lao kê, lao màng não, lao màng tim, lao nhiều bộ phận.
1.2.TỔNG QUAN VỀ ISONIAZID

1.2.1.Tác dụng sinh học
Isoniazid là một trong những thuốc hóa học đầu tiên được chọn trong
điều trị lao. Thuốc có tính đặc hiệu cao, có tác dụng chống lại Mycobacterium
tuberculosis và Mycobacterium không điển hình khác như: M.bovis,
M.kansasii. Cho đến nay thế giới vẫn coi Isoniazid là một trong những thuốc
quan trọng nhất được sử dụng trong điều trị tất cả các thể lao [4].
1.2.1.1.Dược động học
INH được hấp thu nhanh qua đường tiêu hóa. Thời gian sau uống liều
300 mg nồng độ tối đa trong huyết tương đạt tới 3-8 µg/ml. Thức ăn và các
thuốc chứa nhôm làm giảm hấp thu thuốc. INH khuếch tán nhanh vào các tế
bào, dịch màng phổi, dịch cổ trướng và dịch não tủy. Nồng độ INH trong dịch
não tủy tương đương với nồng độ trong máu [4]. Sau khi uống thuốc 2 giờ,
phần lớn các cá thể có nồng độ INH cao nhất, Cmax của INH là 3-6 µg/ml.
INH chuyển hóa qua gan bằng phản ứng acetyl hóa, tốc độ phản ứng
phụ thuộc vào yếu tố di truyền.


8
Thận là cơ quan thải trừ chủ yếu của INH. Sau dùng 24giờ, INH thải
trừ khoảng 75-95% dưới dạng đã chuyển hóa. Một lượng nhỏ thải qua phân.
Thuốc có thể loại khỏi máu bằng thẩm phân thận nhân tạo hay thẩm phân
màng bụng [7].
1.2.1.2.Cơ chế tác dụng
Cơ chế tác dụng của INH vẫn chưa biết chính xác, có thể do thuốc ức
chế tổng hợp acid mycolic và phá vỡ thành tế bào vi khuẩn lao. Nồng độ ức

chế tối thiểu in vitro đối với trực khuẩn lao từ 0,02-0,2 µg/ml [8].
1.2.1.3.Chỉ định, liều lượng, cách dùng
INH được chỉ định phòng và điều trị mọi thể lao trong và ngoài phổi,
sơ nhiễm và tái phát.
Liều tấn công: 5mg/kg/24h dùng hàng ngày.
Liều duy trì: 10mg/kg/lần x 3 lần/tuần hoặc 15mg/kg/24h x 2lần/tuần.
Tốt nhất là uống thuốc trước khi ăn 1h hoặc sau ăn 2h. Có thể uống thuốc
cùng với bữa ăn nếu bị kích ứng đường tiêu hóa [9].
1.2.2.Tính chất hóa lý
1.2.2.1.Công thức hóa học
-Công thức phân tử: C6H7N3O ; M=137,1
-Công thức cấu tạo:


9
-Tên khoa học: 4-pyridin carboxylic acid hydrazid (hydrazid của acid
isonicotinic)
1.2.2.2.Tính chất vật lý
Bột kết tinh màu trắng, không mùi, dễ tan trong nước (1/8), hơi tan
trong ethanol 96% (1/45), khó tan trong cloroform (1/1000), rất khó tan trong
ether. Độ chảy 170-174ºC [9].
Hấp thụ UV: λmax = 266 nm (trong nước), E1cm1% = 378
λmax = 265 nm (trong HCl 0,001 N), E1cm1% = 420.
Phổ hấp thụ hồng ngoại có các đỉnh tại bước sóng 1653, 1541, 1621,
676, 992, 845 cm-1 (đĩa KBr).
1.2.2.3.Tính chất hóa học và khả năng tạo dẫn chất
Isoniazid có khả năng tham gia vào các phản ứng hóa học do các yếu tố
cấu trúc là nhân pyridin và nhóm hydrazin [9], [28].
-Phản ứng của nhân pyridine:
 Đun chế phẩm với natri carbonat khan, giải phóng pyridin có mùi

đặc biệt.
 Dung dịch chế phẩm trong nước, tác dụng với đồng sulfat tạo phức
màu xanh da trời.
 Ngoài ra còn tạo phức với carbon, kẽm, mangan
-Phản ứng của nhóm chức hydrazin
 Tác dụng với dung dịch bạc nitrat và tạo tủa đen của bạc kim loại


10

+ AgNO3 →

+Ag↓ +N2↑+H2O

 Phản ứng ngưng tụ với aldehyd, ceton tạo hydrazon ít tan trong nước,
có điểm chảy xác định. Phản ứng này được ứng dụng để tạo ra nhiều dẫn chất
của INH.

+

→

+ H2O

1.2.3.Các phương pháp định lượng Isoniazid
a.Đối với nguyên liệu, chế phẩm:
 Phương pháp đo Brom :
Trong môi trường acid với sự có mặt của kali bromid, chuẩn độ chậm
bằng dung dịch kali bromat 0,1N, dùng chỉ thị màu đỏ methyl hoặc
ethoxychrysoidin, hoặc xác định điểm kết thúc bằng đo thế [9].

 Chuẩn độ trong môi truờng khan :
Chuẩn độ bằng acid percloric trong môi trường acid acetic có mặt của
anhydrid acetic, chỉ thị p-naphtholbenzein [7].
 Định lượng bằng phương pháp đo iod :
Oxy hóa INH bằng brom thừa trong môi trường acid, sau đó thêm một
lượng KI dư rồi chuẩn độ iod giải phóng bằng natri thiosulfat với chỉ thị hồ
tinh bột [9].


11
 Đo quang phổ hấp thụ tử ngoại:
Cho isoniazid phản ứng với dung dịch 6-methyl-2-pyridinecarboxaldehyd
0,025 % trong ethanol và đệm KCl/HCl pH 1, để nóng hỗn hợp này trong nước
10 phút sau đó hoà loãng với nước. Đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng
328 nm [19].
Đo độ hấp thụ của các dung dịch chuẩn và thử trong môi trường dung
dịch acid hydrocloric loãng ở bước sóng 267±1nm trong cốc đo dày 1 cm,
mẫu trắng là acid hydrocloric 0,1 N [19].
 Chương trình HPLC [28] :
-Điều kiện sắc ký:
Cột sắc ký (4,6 mm x 25 cm) C18
Detector UV: 254nm
Tốc độ dòng: 1,5ml/phút
-Pha động: hòa tan natridocusat trong methanol, thêm nước, chỉnh pH của
dung dịch này về pH = 2,5 bằng acid sulfuric 2N.
Dung dịch chuẩn và dung dịch thử nồng độ khoảng 0,32mg/ml trong dung
môi pha động [28].
b.Đối với dịch sinh học

12
Bảng 1.2: Một số nghiên cứu định lượng INH trong dịch sinh học
Tài
liệu
11

Mẫu thử

Pha động

Huyết tương Acetonitril,
người

Tốc độ

Pha tĩnh
đệm Cột

dòng

Inertsil 1,3

phosphate pH 7,5, OSD

Bước
Nhận xét

sóng
(λmax)
265nm

-Trực tiếp
-LOQ=1 μg/ml

ml/phút

chạy theo chương (250x4,6mm;5
μm)

trình
16

Dịch sữa gia Methanol:
súc

đệm Cột Li 100-CN

acetate (40:60, tt/tt)

(250x4,6mm;5

1,0

330nm

ml/phút

cinnamaldehyd

μm)

18

Huyết tương Isopropanol:nước
chuột

22

27

Cột LC-CN

(5:95)

-Dẫn chất bằng
-LOQ=0,1 μg/l

1,0

313nm

ml/phút

-Dẫn chất
-LOD=0,1μg/ml

Huyết tương Ethanol:nước

YMC-ODS

người

:chloroform:acetoni

(150x4,6mm; 5 ml/phút

fluor-

tril (55:40:4:1)

μm)

carboxaldehyd.

Huyết

Pha

A:

50mM C8

tương, nước KH2PO4
tiểu người

(250x4,6mm;5

1,3

1,0
ml/phút

337nm

254 nm

-Dẫn chất bằng 2-

-trực tiếp
-LOQ=1 μg/l

Pha B: Acetonitril: μm)
isopropanol (4:1)

1.3.VÀI NÉT VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

1.3.1.Khái niệm
Sắc ký lỏng hiệu năng cao hay sắc ký lỏng cao áp (HPLC) là kỹ thuật
phân tích dựa trên cơ sở của sự tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột,
nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao. Pha tĩnh có thể là
chất rắn dưới dạng hạt mịn hoặc chất lỏng được bao trên bề mặt chất mang
rắn đã được liên kết hóa học với một chất hữu cơ. Quá trình sắc ký xảy ra
theo cơ chế: hấp phụ, trao đổi ion, phân bố hoặc rây phân tử [1], [2].


13
Hiện nay, sắc ký phân bố pha đảo được dùng nhiều vì nó cho kết quả
tách tốt đối với nhiều đối tượng phân tích [2], [12].
Tùy thuộc vào tính chất các pha mà ta có những phương pháp sắc ký
khác nhau. Trong đề tài này, chúng tôi chỉ đề cập đến sắc ký phân bố pha đảo.
-Sắc ký phân bố pha đảo gồm có: Sắc ký lỏng – lỏng

Sắc ký pha liên kết
Trong sắc ký phân bố pha liên kết, pha tĩnh được gắn hóa học với chất
mang tạo nên dẫn chất Siloxan; nếu pha tĩnh là những nhóm chức không phân
cực (C8, C18, …) dung môi phân cực như: Methanol, Acetonitril thì ta có sắc
ký pha đảo.
Trong sắc ký pha đảo thứ tự rửa giải các chất là : chất phân cực ra
trước, các chất ít phân cực và không phân cực ra sau.
Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký là tổng của các mối tương tác:
-Giữa chất phân tích và pha tĩnh.
-Giữa chất phân tích và pha động.
-Giữa pha tĩnh và pha động
Chất tan
(A,B,…)

Pha tĩnh

Pha động

1.3.2.Một số thông số đặc trưng
1.3.2.1.Hệ số dung lượng k’
Quá trình tách trong cột sắc ký là sự tương tác của các chất phân tích
với pha tĩnh (nhồi trong cột) dưới tác động của pha động, do đó bản chất của


14
quá trình sắc ký là sự phân bố chất tan giữa hai pha. Sự phân bố này được đặc
trưng bằng hệ số dung lượng k’; k’ được xác định bằng tỷ số giữa lượng chất
tan trong pha tĩnh và pha động theo công thức sau:
K'A =

Q A (S)
Q A (M)

Trong đó QA(S) và QA(M) là lượng chất tan A phân bố trong pha tĩnh và trong
pha động [1]
Các chất trong hỗn hợp được tách trong cột và được pha động đẩy đến
detector để phát hiện, tín hiệu đo được bộ phận ghi tiếp nhận và cho kết quả
dưới dạng pic sắc ký. Số liệu được xử lý cho các giá trị như: thời gian lưu,
diện tích pic, chiều cao pic, độ cân xứng của pic, độ phân giải của hai pic liền
kề, số đĩa lý thuyết của cột.
Tùy theo tính chất, cấu trúc của chất phân tích mà người ta sử dụng các
detector khác nhau để phát hiện như: huỳnh quang, UV-Vis, điện hóa …
Trong đó, UV-Vis được dùng phổ biến nhất vì nó đơn giản, khả năng ứng
dụng rộng, độ nhạy cao đáp ứng nhu cầu phân tích và kinh tế.
1.3.2.2.Thời gian lưu (tR)
Thời gian lưu của một chất (tính bằng phút, giây) là thời gian tính từ
lúc tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký đến lúc xuất hiện đỉnh pic của nó trên sắc
đồ [2].
So sánh thời gian lưu của chất phân tích trong mẫu thử và mẫu chuẩn
làm trong cùng điều kiện ta sẽ định tính được chất đó.
1.3.2.3.Số đĩa lý thuyết
Số đĩa lý thuyết biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc ký
nhất định. Mỗi đĩa lý thuyết trong cột sắc ký như là một lớp pha tĩnh có chiều


15
cao là H, lớp này có tính chất động, tức là một khu vực của hệ phân tách mà
trong đó một cân bằng nhiệt động học được thiết lập giữa nồng độ trung bình
của chất tan trong pha tĩnh và trong pha động [1], [2], [12].
Số đĩa lý thuyết N được tính theo công thức sau:

t 
N = 16  R 
W

Trong đó:

2

 t 
hoặc N = 5.54  R 
 W1 / 2 

2

tR: thời gian lưu (phút)
W: chiều rộng của pic đo ở đáy pic (phút)
W1/2: chiều rộng của pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh (phút)

Tùy từng phép phân tích mà yêu cầu N khác nhau. Trong thực tế N nằm trong
khoảng 2500 đến 5500 là vừa đủ, tối thiểu là 1000.
1.3.2.4.Độ phân giải RS
Là đại lượng biểu thị mức độ tách của các chất ra khỏi nhau trong điều
kiện sắc ký đã cho. Độ phân giải của 2 pic cạnh nhau được tính theo công
thức sau:
RS =

2(t R,B − t R,A )
WA + WB

hoặc R S =

1,18( t R ,B − t R ,A )
W1 / 2 ( A ) + W1 / 2 ( B )

Trong đó:
tR,A, tR,B: thời gian lưu của 2 pic liền kề của 2 chất tan A và B
WA,WB: độ rộng đo ở các đáy pic của chất A và B
W1/2(A), W1/2(B): độ rộng đáy pic đo ở nửa chiều cao pic của chất A và B
Trong thực tế nếu các pic cân đối tuân theo phân bố chuẩn (Gauss) thì
độ phân giải để 2 pic có độ lớn bằng nhau tối thiểu là 1,0. Trong phép định
lượng Rs=1,5 là phù hợp.