Nghiên cứu định lượng tobramycin trong một số thuốc nhỏ mắt bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector huỳnh quang tạo dẫn xuất sau cột

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
∗∗∗∗∗∗∗∗∗∗∗∗∗∗∗∗∗

Trần Thúy Hạnh

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG TOBRAMYCIN
TRONG MỘT SỐ THUỐC NHỎ MẮT BẰNG
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VỚI
DETECTOR HUỲNH QUANG - TẠO
DẪN XUẤT SAU CỘT

Luận văn Thạc sĩ Dược học

Hà nội - 2006


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦

Trần Thúy Hạnh

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG TOBRAMYCIN TRONG
MỘT SỐ THUỐC NHỎ MẮT BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU

NĂNG CAO VỚI DETECTOR HUỲNH QUANG - TẠO
DẪN XUẤT SAU CỘT
Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc - Độc chất
Mã số: 60 73 15

Luận văn Thạc sĩ Dược học

Người hướng dẫn:
PGS. TS. Thái Phan Quỳnh Như

Hà nội - 2006


LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Thái Phan Quỳnh
Như, người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong suốt quá trình
học tập và nghiên cứu thực hiện đề tài.
Xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, cảm ơn các thầy
cô Phòng Đào tạo sau đại học, Bộ môn Phân tích cùng các Bộ môn khác
của trường Đại học Dược Hà nội đã tạo điều kiện tốt cho chúng tôi trong
thời gian học tập tại trường.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc Viện Kiểm Nghiệm thuốc
trung ương, Phòng Hóa lý I nơi tôi đang công tác đã luôn quan tâm và tạo
mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành nhiệm vụ học tập và nghiên cứu
trong thời gian vừa qua.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, đồng nghiệp, bạn bè đã luôn động
viên, chia sẻ, khích lệ và giúp đỡ để tôi có thể có kết quả như ngày hôm
nay.

Trần Thúy Hạnh
Học viên cao học khóa 9, chuyên ngành
Kiểm nghiệm thuốc - Độc chất


MỤC LỤC
Trang
NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ

1

Phần 1: TỔNG QUAN

3

1.1. Vài nét về Tobramycin

3

1.2. Một số phương pháp được áp dụng để định lượng
Tobramycin

4

1.2.1. Phương pháp trong Dược điển

4

1.2.2. Phương pháp ngoài Dược điển

7

1.3. Cơ sở lý thuyết về huỳnh quang

12

1.3.1. Sự hình thành quang phổ huỳnh quang

12

1.3.2. Phép đo huỳnh quang

13

1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo huỳnh quang

17

1.3.4. Ứng dụng của phép đo huỳnh quang

21

1.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector
huỳnh quang - tạo dẫn xuất sau cột

22

1.4.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector
huỳnh quang

22

1.4.2. Tạo dẫn xuất sau cột

1.5. Phản ứng tạo dẫn xuất phát huỳnh quang của
Tobramycin

23
25

Phần 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU

26

2.1. Đối tượng nghiên cứu

26

2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

30

2.2.1. Lựa chọn điều kiện sắc ký

30

2.2.2. Đánh giá phương pháp

30


2.2.3. Xây dựng qui trình thử

33

2.2.4. Ứng dụng

33

2.3. Điều kiện nghiên cứu
Phần 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Lựa chọn điều kiện sắc ký

thử

34
35
35

3.1.1. Chọn cặp bước sóng kích thích và phát xạ

35

3.1.2. Khảo sát lựa chọn pha động

37

3.1.3. Khảo sát lựa chọn cách pha thuốc thử

39

3.1.4. Khảo sát tốc độ dòng pha động và tốc độ bơm thuốc

3.2. Qui trình thử

39
40

3.2.1. Chuẩn bị mẫu thử và mẫu chuẩn

40

3.2.2. Cách tiến hành đo

41

3.2.3. Cách tính kết quả

41

3.3. Đánh giá phương pháp

42

3.3.1. Tính thích hợp của hệ thống sắc ký

42

3.3.2. Tính đặc hiệu

44

3.3.3. Khảo sát khoảng tuyến tính

46

3.3.4. Khảo sát độ lặp lại

48

3.3.5. Khảo sát độ đúng

50

3.3.6. Kết quả và bàn luận chung

52

3.4. Ứng dụng

53

3.4.1. Áp dụng qui trình để định lượng một số thuốc nhỏ
mắt

53

3.4.2. So sánh với kết quả định lượng bằng phương pháp
vi sinh vật

55

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

56

TÀI LIỆU THAM KHẢO

58

PHỤ LỤC


NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT
BP

:

Dược điển Anh.

Em

:

Bước sóng bức xạ (Emission).

EP

:

Dược điển châu Âu.

Ex

:

Bước sóng kích thích (Excitation).

HD

:

Hạn dùng.

HPLC

:

Sắc ký lỏng hiệu năng cao.

JP

:

Dược điển Nhật.

LT

:

Lý thuyết.

NSX

:

Ngày sản xuất.

RSD

:

Độ lệch chuẩn tương đối.

S

:

Độ lệch chuẩn.

SKS

:

Số kiểm soát.

TN

:

Thực nghiệm.

USP

:

Dược điển Mỹ.

UV - VIS

:

Quang phổ tử ngoại - khả kiến.

VSV

:

Vi sinh vật.


* Các đơn vị đo lường được viết tắt như sau:
- Đơn vị đo chiều dài:
Centimet

:

cm

Milimet

:

mm

Micromet

:

µm

Nanomet

:

nm

Gam

:

g

Miligam

:

mg

Microgam

:

µg

Lít

:

L

Mililit

:

mL

Microlit

:

µL

- Đơn vị đo khối lượng:

- Đơn vị đo thể tích:


DANH MỤC CÁC BẢNG

STT

Tên bảng

1

Bảng 2.1. Các chế phẩm thuốc nhỏ mắt được dùng để
nghiên cứu.

2

Trang

27

Bảng 2.2. Bốn mẫu chế phẩm thuốc nhỏ mắt
Tobramycin: M1, M2, M3 và M4.

32

3

Bảng 3.1. Kết quả đánh giá độ thích hợp của hệ thống.

42

4

Bảng 3.2. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính.

46

5

Bảng 3.3. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp.

49

6

Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp.

51

7

Bảng 3.5. Kết quả định lượng Tobramycin trong một số
thuốc nhỏ mắt đang lưu hành trên thị trường.

8

53

Bảng 3.6. So sánh kết quả định lượng giữa hai phương
pháp HPLC và vi sinh.

55


DANH MỤC CÁC HÌNH

STT

Ký hiệu

1

Hình 1.1

Nội dung

Trang

Phổ kích thích và phổ bức xạ của Vitamin B 1 .
R

R

16

(Dung dịch 1 µg/ml , cực đại EX = 370 nm, cực
đại EM = 425 nm)
2

Hình 1.2

Phổ kích thích và phổ bức xạ của Histamin.

16

(Dung dịch 1 µg/ml , cực đại EX = 350 nm, cực
đại EM = 440 nm)
3

Hình 1.3

Phổ huỳnh quang của Natri salicylat.

17

4

Hình 1.4

Sơ đồ cấu tạo của một detector huỳnh quang.

22

5

Hình 1.5

Sơ đồ cấu tạo của một máy HPLC với detector
huỳnh quang và bộ tạo dẫn xuất sau cột.

24

6

Hình 3.1

Phổ hấp thụ UV - VIS của dung dịch
Tobramycin 3 mg/ml pha trong pha động.

35

7

Hình 3.2

Phổ bức xạ huỳnh quang của dẫn chất
Tobramycin với thuốc thử o-phthalaldehyd.

36

8

Hình 3.3

Phổ kích thích huỳnh quang của dẫn chất
Tobramycin với thuốc thử o-phthalaldehyd.

36

9

Hình 3.4

Hình ảnh chồng các sắc ký đồ để so sánh thời
gian lưu và hình dạng píc của Tobramycin khi
thay đổi nồng độ natri sulfat trong pha động.

37

10

Hình 3.5

Sắc ký đồ của Tobramycin với pha động chứa
0,015 M natri pentansulfonat.

38

11

Hình 3.6

Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn Tobramycin.

43


12

Hình 3.7

Hình ảnh sắc ký đồ của 6 lần tiêm được chồng
khít lên nhau.

43

13

Hình 3.8

Hình ảnh minh họa hệ thống máy sắc ký lỏng
hiệu năng cao, detector huỳnh quang với bộ tạo
dẫn xuất sau cột, sử dụng cho các phép thử
nghiệm.

44

14

Hình 3.9

Sắc ký đồ của dung dịch thử Tobramycin.

45

15

Hình 3.10 Sắc ký đồ của dung dịch mẫu trắng, không có
Tobramycin.

45

16

Hình 3.11 Tín hiệu phát hiện dẫn xuất của Tobramycin với
OPA bằng detector UV - VIS.

46

17

Hình 3.12 Đường hồi qui tuyến tính của Tobramycin.

47

18

Hình 3.13 Hình ảnh chồng sắc ký đồ của các dung dịch
khảo sát khoảng tuyến tính.

47


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay trong lĩnh vực kiểm nghiệm dược phẩm, việc áp dụng phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV - VIS để phân tích các chất đã
ngày càng trở nên phổ biến. Phương pháp này thường cho kết quả phân tích
nhanh, chính xác và dễ thực hiện. Tuy nhiên, để định lượng các chế phẩm có

chứa hoạt chất với lượng nhỏ hoặc không có hấp thụ quang ở vùng tử ngoại - khả
kiến thì phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV - VIS lại không
áp dụng được.
Tobramycin là một kháng sinh thuộc nhóm aminoglycosid, có phổ tác
dụng tương tự như Gentamycin nhưng hoạt tính mạnh hơn đối với phần lớn các
chủng Pseudomonas aeruginosa, thường được chỉ định trong các bệnh nhiễm
khuẩn nặng. Cũng như các kháng sinh khác trong nhóm aminoglycosid,
Tobramycin không có hấp thụ quang ở vùng tử ngoại - khả kiến, vì vậy phương
pháp định lượng phổ biến vẫn là phương pháp vi sinh vật. Phương pháp này mất
nhiều thời gian và có độ chính xác không cao. Dược điển Mỹ đã áp dụng phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV - VIS, tạo dẫn xuất trước cột để
định lượng Tobramycin, nhưng qui trình tạo dẫn xuất này rất phức tạp. Gần đây
trong EP 2003 hay BP 2005, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với
detector điện hóa (detector đo dòng) đã được đưa vào sử dụng để thay thế
phương pháp vi sinh vật. Phương pháp này tiến hành nhanh, kết quả tin cậy,
song hầu hết các cơ sở kiểm nghiệm trong nước hiện nay không đáp ứng được
các điều kiện định lượng.


2

Xuất phát từ yêu cầu thực tế của phòng thí nghiệm cần xây dựng phương
pháp định lượng Tobramycin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để
thay thế phương pháp vi sinh vật, dựa trên một số tài liệu tham khảo được chúng
tôi tiến hành "Nghiên cứu định lượng Tobramycin trong một số thuốc nhỏ mắt
bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector huỳnh quang - tạo dẫn xuất sau
cột", với các nội dung nghiên cứu như sau:
- Khảo sát để lựa chọn hệ sắc ký tối ưu.
- Đánh giá phương pháp sắc ký đã xây dựng.
- Xây dựng qui trình phân tích mẫu.

- Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng trên một số mẫu
chế phẩm đang lưu hành.
Nhằm đạt được mục tiêu của đề tài là:
Xây dựng thành công Phương pháp định lượng Tobramycin trong một số
thuốc nhỏ mắt bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector huỳnh quang - tạo
dẫn xuất sau cột.


3

PHẦN 1. TỔNG QUAN

1.1. Vài nét về Tobramycin:
Tobramycin là một kháng sinh nhóm aminoglycosid thu được từ môi trường
nuôi cấy Streptomyces tenebrarius hoặc bằng các phương pháp khác.
Tên khoa học: 4-O-(3-Amino-3-deoxy-α-D-glucopyranosyl)-2-deoxy-6O-(2,6-diamino-2,3,6-trideoxy-α-D-ribo-hexopyranosyl)-L-streptamine.
Công thức phân tử

: C 18 H 37 N 5 O 9 .

Phân tử lượng

: 467,5.

Công thức cấu tạo

:

R

R

R

R

R

R

R

R

Tính chất: Bột trắng hoặc trắng ngà. Dễ tan trong nước, rất khó tan trong
ethanol 96%, thực tế không tan trong cloroform và ether. [α] D 20 từ +138o đến
R

RP

P

P

P

+148o [9] [15].
P

P

Dược lý và cơ chế tác dụng: [4] [9]
Tobramycin là một kháng sinh nhóm aminoglycosid có tác dụng với nhiều
vi khuẩn Gram âm hiếu khí và một số vi khuẩn Gram dương hiếu khí. Thuốc


4

không có tác dụng với Chlamydia, nấm, virus và đa số vi khuẩn yếm khí.
Tobramycin rất giống Gentamycin về tính chất vi sinh học và độc tính, tuy nhiên
đặc điểm quan trọng nhất của Tobramycin là có hoạt tính đối với phần lớn các
chủng Pseudomonas aeruginosa.
Mặc dù cơ chế tác dụng chính xác chưa biết đầy đủ, nhưng có lẽ
Tobramycin ức chế sự tổng hợp protein ở các vi khuẩn nhạy cảm bằng cách gắn
không thuận nghịch với các tiểu đơn vị 30S của Ribosom.
Chỉ định: [4]
Được chỉ định trong các bệnh nhiễm khuẩn nặng đe dọa tới tính mạng, đặc
biệt với các bệnh mà nguyên nhân chưa rõ ràng hoặc bị nhiễm khuẩn huyết do vi
khuẩn Gram âm.
Dạng thuốc và hàm lượng: [4]
Thuốc không hấp thu qua đường uống, thường được dùng dưới các dạng:
Lọ 5 mL 0,3% để nhỏ mắt. Tuýp 3,5 g mỡ tra mắt 0,3%. Thuốc tiêm: Lọ
20 mg/2 mL; 60 mg/6 mL; 80 mg/8 mL; 80 mg/2 mL; 1,2 g/30 mL.

1.2. Một số phương pháp được áp dụng để định lượng Tobramycin:
1.2.1. Phương pháp trong Dược điển:
1.2.1.1. Phương pháp vi sinh vật:
U

Xác định hoạt lực kháng sinh của Tobramycin bằng phương pháp vi sinh

vật theo BP 2001 hay JP 14 [14] [23].
1.2.1.2. Phương pháp HPLC 1: [15] [17]
U

U

* Điều kiện sắc ký:
-

Cột styren-divinylbenzen copolymer (4,6 x 250 mm, 8 µm).


5

-

Nhiệt độ cột: 55oC.

-

Pha động: Hỗn hợp pha trong nước đã loại carbon dioxyd chứa: 52 g/L

P

P

natri sulfat khan; 1,5 g/L natri octansulfonat; 3 mL/L tetrahydrofuran và
50 mL/L dung dịch kali dihydrophosphat 0,2 M đã được chỉnh pH về 3,0
bằng acid phosphoric loãng.
-

Tốc độ dòng: 1 mL/phút.

-

Dung dịch tạo dẫn xuất sau cột: Dung dịch natri hydroxyd 2% pha trong
nước đã loại carbon dioxyd. Tốc độ 0,3 mL/phút.

-

Detector: Detector điện hóa (detector đo dòng) hoặc các thiết bị tương tự.
Nhiệt độ detector đặt ở 35oC.
P

P

-

Thể tích tiêm: 20 µL.

-

Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: khoảng 0,1 mg/mL trong nước.
* Tiến hành:
Lần lượt tiêm các dung dịch chuẩn và thử. Dựa vào đáp ứng của píc

Tobramycin trong các dung dịch chuẩn, thử và hàm lượng dung dịch chuẩn, tính
lượng Tobramycin có trong chế phẩm.
1.2.1.3. Phương pháp HPLC 2: [28]
U

U

* Điều kiện sắc ký:
-

Cột RP 18 (3,9 mm x 30 cm).

-

Pha động: Hoà tan 2,0 g tris(hydroxymethyl)aminomethan trong khoảng
800 mL nước. Thêm vào dung dịch này 20 mL dung dịch acid sulfuric 1
N, sau đó pha loãng bằng acetonitril tới 2000 mL, lắc đều. Để nguội rồi
lọc qua màng lọc 0,2 µm. Có thể điều chỉnh nếu cần.


6

-

Thuốc thử 2,4-dinitrofluorobenzen: Dung dịch 2,4-dinitrofluorobenzen 1%
trong ethanol 96%. Dung dịch này nếu bảo quản lạnh có thể sử dụng được
trong vòng 5 ngày sau khi pha.

-

Thuốc thử tris(hydroxymethyl)aminomethan: Pha dung dịch gốc
tris(hydroxymethyl)aminomethan 1,5% trong nước. Chuyển 40 mL dung
dịch thuốc thử gốc này vào bình định mức 200 mL. Bổ sung dimethyl
sulfoxid đến vạch bằng cách thêm từ từ dimethyl sulfoxid, vừa thêm vừa

lắc đều. Dung dịch thuốc thử này được dùng trong vòng 4 giờ sau khi pha.
Nếu bảo quản lạnh dưới 10oC, dung dịch này có thể được dùng trong vòng
P

P

8 giờ sau khi pha. (Với dung dịch thuốc thử gốc 1,5%, nếu bảo quản lạnh
có thể sử dụng được trong vòng 1 tháng sau khi pha).
-

Tốc độ dòng: 1,2 mL/phút.

-

Detector UV-VIS: 365 nm.

-

Thể tích tiêm: 20 µL.

-

Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: khoảng 0,22 mg/mL trong dung dịch
acid sulfuric 0,004 N.
* Tiến hành:

-

Các dung dịch chuẩn và thử phải được tạo dẫn xuất với các thuốc thử 2,4
dinitrofluorobenzen và tris(hydroxymethyl)aminomethan trước khi tiêm

sắc ký: Hút chính xác 4,0 mL dung dịch chuẩn, dung dịch thử và nước cất
vào các bình định mức 50 mL riêng biệt. Thêm vào mỗi bình 10 mL dung
dịch thuốc thử 2,4-dinitrofluorobenzen và 10 mL dung dịch thuốc thử
tris(hydroxymethyl)aminomethan, lắc đều, đậy nút. Đặt các bình vào trong
cách thủy ở nhiệt độ 60oC ± 2oC trong 50 phút ± 5 phút. Sau thời gian trên,
P

P

P

P

lấy các bình ra, để yên 10 phút. Thêm acetonitril vào các bình đến dưới


7

vạch định mức khoảng 2 mL, để nguội xuống nhiệt độ phòng, sau đó pha
loãng tiếp bằng acetonitril đến vạch, lắc đều: Thu được các dung dịch
chuẩn, dung dịch thử đã tạo dẫn xuất và mẫu trắng. Chú ý phải tiến hành
tạo dẫn chất trong cùng một thời gian và cùng điều kiện đối với tất cả các
dung dịch thử nghiệm.
-

Lần lượt tiêm mẫu trắng, các dung dịch chuẩn và thử đã tạo dẫn xuất. Dựa
vào đáp ứng của píc dẫn xuất Tobramycin trong các dung dịch chuẩn, thử
và hàm lượng dung dịch chuẩn, tính lượng Tobramycin có trong chế
phẩm.
1.2.2. Phương pháp ngoài Dược điển:

1.2.2.1. Định lượng Tobramycin bằng phương pháp vi sinh vật theo tiêu
U

chuẩn cơ sở của một số chế phẩm sản xuất trong nước: [6] [7]
U

a. Chủng vi khuẩn: Bacillus pumilus NCTC 8241.
b. Dung dịch đệm phosphat pH 8,0 ± 0,1:
Dikali hydrophosphat

16,75 g.

Kali dihydrophosphat

0,523 g.

c. Môi trường định lượng:
Cao men bia

3,0 g

Pepton

6,0 g

Casein pancreatic

4,0 g

Glucose

1,0 g

Cao thịt

1,5 g

Thạch
Nước cất
pH sau khi tiệt trùng

15,0 g
100 mL
8,2 ± 0,2


8

d. Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch thử:
+ Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 25,0 mg Tobramycin chuẩn,
hòa tan trong dung dịch đệm phosphat 8,0 để được dung dịch chuẩn gốc có nồng
độ chính xác khoảng 1000 IU/mL. Dung dịch gốc được bảo quản ở nhiệt độ dưới
25oC. Từ dung dịch chuẩn gốc này tiếp tục pha loãng với dung dịch đệm
P

P

phosphat pH 8,0 để được các dung dịch chuẩn thí nghiệm có nồng độ
Tobramycin chính xác khoảng 10 IU/mL, 20 IU/mL và 40 IU/mL.
+ Dung dịch thử (chế phẩm): Hút chính xác 5,0 mL chế phẩm (tương ứng

với khoảng 3 mg Tobramycin), thêm 10,0 mL dung dịch đệm phosphat pH 8,0,
được dung dịch thử gốc có nồng độ khoảng 1000 IU/mL. Tiếp tục pha loãng với
dung dịch đệm phosphat pH 8,0 để được các dung dịch thử có nồng độ
Tobramycin khoảng 10 IU/mL, 20 IU/mL và 40 IU/mL.
+ Tiến hành thử và tính toán kết quả theo phương pháp xác định hoạt lực
kháng sinh - Dược điển Việt nam III.
1.2.2.2. Phương pháp HPLC 3: [16]
U

U

* Điều kiện sắc ký:
-

Cột Purospher® STAR RP-18e (4 x 55 mm, 3 µm, Merck).

-

Pha động: Acetonitril - nước (50 : 50).

-

Tốc độ dòng: 1,3 mL/phút.

-

Dung dịch tạo dẫn xuất: Dung dịch 1-naphthyl isothiocyanat (NITC) trong

P

P

pyridin.
-

Detector UV-VIS: 230 nm.

-

Thể tích tiêm: 10 µL.

-

Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: khoảng 5 µg/mL trong nước.


9

* Tiến hành:
Dung dịch chuẩn và dung dịch thử được tạo dẫn xuất với dung dịch thuốc
thử 1-naphthyl isothiocyanat trong pyridin ở 70oC. Lần lượt tiêm các dung dịch
P

P

chuẩn và thử đã được tạo dẫn xuất. Dựa vào đáp ứng của píc dẫn xuất
Tobramycin trong các dung dịch chuẩn, thử và hàm lượng dung dịch chuẩn, tính
lượng Tobramycin có trong chế phẩm.
1.2.2.3. Phương pháp HPLC 4: [20]
U

U

* Điều kiện sắc ký:
-

Cột Xterra® RP-18 (2,1 x 250 mm, 5 µm).

-

Nhiệt độ cột: 30oC.

-

Pha động A: Thêm 0,7 mL dung dịch amoni hydroxyd 28-30% vào 1 lít

P

P

P

P

nước Milli-Q®. Sử dụng dung dịch natri hydroxyd 2,5 N để chỉnh pH của
P

P

pha động A đến 11,0.

-

Pha động B: Acetonitril.

-

Tiến hành sắc ký theo chương trình gradient dung môi như sau:
Thời gian (phút)

Pha động A (%)

Pha động B (%)

0

100

0

10

0

100

-

Tốc độ dòng: 0,2 mL/phút.

-

Detector khối phổ.

-

Thể tích tiêm: 4 µL.

-

Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: khoảng 0,35 mg/mL trong nước muối
0,9%.


10

* Tiến hành:
Lần lượt tiêm các dung dịch chuẩn và thử. Dựa vào đáp ứng của píc
Tobramycin trong các dung dịch chuẩn, thử và hàm lượng dung dịch chuẩn, tính
lượng Tobramycin có trong chế phẩm.
1.2.2.4. Phương pháp HPLC 5: [19]
U

U

* Điều kiện sắc ký:
-

Cột Ultrasphere RP 8 (4,6 x 250 mm, 5 µm).

-

Pha động: Acetonitril - đệm phosphat 0,05 M (62 : 38), điều chỉnh về pH
3,5 bằng acid phosphoric. (Đệm pH 0,05 M: Hòa tan 6,8 g kali
dihydrophosphat trong 1000 mL nước).

-

Tốc độ dòng: 2,5 mL/phút.

-

Dung dịch thuốc thử acid 2,4,6 trinitrobenzensulfonic: Hòa tan 2,5 g acid
2,4,6 trinitrobenzensulfonic trong vừa đủ 10 mL hỗn hợp (Acetonitril nước) (80 : 20).

-

Detector UV-VIS: 340 nm.

-

Thể tích tiêm: 20 µL.

-

Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: khoảng 0,02 mg/mL trong đệm phosphat
pH 7,4. (Đệm phosphat pH 7,4: Thêm 1803 mL dinatri hydrophosphat
dihydrat 11,88 g/L vào 197 mL kali dihydrophosphat 9,08 g/L).
* Tiến hành:
Dung dịch chuẩn và dung dịch thử được tạo dẫn xuất với dung dịch thuốc

thử acid 2,4,6 trinitrobenzensulfonic ở 70oC. Lần lượt tiêm các dung dịch chuẩn
P

P

và thử đã được tạo dẫn xuất. Dựa vào đáp ứng của píc dẫn xuất Tobramycin


11

trong các dung dịch chuẩn, thử và hàm lượng dung dịch chuẩn, tính lượng
Tobramycin có trong chế phẩm.
● Ngoài các phương pháp HPLC nêu trên, người ta cũng đã nghiên cứu
phương pháp định lượng Tobramycin bằng sắc ký lỏng detector tán xạ bay hơi,
sắc ký lỏng trao đổi anion với detector điện hóa (detector đo dòng) và định lượng
một số kháng sinh nhóm aminoglycosid bằng sắc ký lỏng detector huỳnh quang
tạo dẫn xuất sau cột [18] [21].
● Các phương pháp định lượng Tobramycin nêu trên thường mất nhiều thời
gian (phương pháp vi sinh vật) hoặc tiến hành phức tạp và đòi hỏi phải có thuốc
thử, trang thiết bị đặc biệt (phương pháp HPLC). Vì vậy, với các trang thiết bị và
thuốc thử có sẵn ở phòng thí nghiệm chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu xây dựng
một qui trình định lượng Tobramycin đơn giản và dễ thực hiện, có thể đưa vào sử
dụng trong công tác kiểm nghiệm - góp phần quản lý chất lượng các sản phẩm
chứa Tobramycin.
● Vấn đề khó khăn khi định lượng Tobramycin là do nó có cấu trúc của
một aminoglycosid, không hấp thụ quang ở vùng tử ngoại - khả kiến, do đó khó
có thể định lượng bằng phương pháp hoá học hoặc phát hiện bằng quang phổ.
Một trong các biện pháp thường được sử dụng để phát hiện ra các chất không có
khả năng hấp thụ quang ở vùng tử ngoại - khả kiến bằng các detector quang phổ
là cho nó phản ứng với một thuốc thử để tạo thành dẫn xuất có khả năng đáp ứng

với các detector đó. Tobramycin là hợp chất aminoglycosid, tương tự như các
hợp chất amin khác nó cũng có khả năng tạo dẫn xuất phát huỳnh quang với một
số thuốc thử. Việc phát hiện các chất bằng quang phổ huỳnh quang có tính đặc
hiệu cao và rất nhạy, do đó chúng tôi đã chọn hướng nghiên cứu là định lượng
Tobramycin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector huỳnh quang.


12

1.3. Cơ sở lý thuyết về huỳnh quang
1.3.1. Sự hình thành quang phổ huỳnh quang
1.3.1.1. Khái niệm hiện tượng phát quang
U

Hiện tượng phát quang nói chung là tính chất của các chất có khả năng
phát quang dưới các tác nhân kích thích khác nhau. Các tác nhân đó có thể do ma
sát, do nhiệt, do hiệu ứng các phản ứng hóa học, do tác nhân chiếu xạ của các
bức xạ điện từ... (được gọi là: nhiệt phát quang, điện phát quang, hóa phát quang,
sinh phát quang...). Khi tác nhân kích thích là các tia tử ngoại hoặc phần có bước
sóng ngắn của ánh sáng khả kiến ta có hiện tượng phát quang quang học hay còn
gọi là huỳnh quang [3] [5] [8].
1.3.1.2. Sự tạo thành phổ huỳnh quang - Cơ chế của sự phát quang
U

Theo thuyết lượng tử, mỗi hạt sơ cấp (nguyên tử, ion, phân tử) có một hệ
thống duy nhất các trạng thái năng lượng. Trạng thái năng lượng thấp nhất gọi là
trạng thái cơ bản (S 0 ). Khi bị kích thích, như được hấp thụ photon ánh sáng thì
R

R

năng lượng của photon sẽ được truyền sang hạt và hạt sẽ được chuyển sang một
năng lượng cao hơn gọi là trạng thái kích thích S 1 ; S 2 ... (ở mỗi trạng thái phân
R

R

R

R

tử có thể tồn tại ở các phân mức năng lượng khác nhau 0; 1; 2; 3...) sau một thời
gian rất ngắn (10-6 → 10-9 giây) các hạt ở trạng thái kích thích sẽ trở về trạng thái
P

P

P

P

cơ bản ban đầu theo một trong các hiện tượng sau đây:
- Hiện tượng bất hoạt (Deactivation; Vibrational relaxation): Các phân tử
ở mức năng lượng cao của trạng thái này trở về mức năng lượng thấp nhất của
trạng thái và giải phóng ra năng lượng dưới dạng nhiệt năng do va chạm giữa các
phân tử làm tăng nhiệt độ môi trường, gọi là hiện tượng phục hồi không bức xạ


13

hay là sự "thư giãn" để phục hồi dao động sau khi bị kích thích (thời gian phục
hồi < 10-12 giây).
P

P

- Hiện tượng chuyển nội (Internal conversion): Các nguyên tử từ mức thấp
nhất của trạng thái kích thích về trạng thái cơ bản giải phóng ra năng lượng bằng
cách bức xạ các photon ánh sáng, gọi là sự phục hồi có bức xạ, ánh sáng bức xạ
này chính là huỳnh quang (kéo dài 10-9 → 10-6 giây).
P

P

P

P

- Hiện tượng vượt nội hệ: (Intersystem crossing ). Các phân tử trạng thái
kích thích S 1 không chuyển về trạng thái cơ bản S 0 mà chuyển sang trạng thái
R

R

R

R

siêu bền T 1 , rồi mới từ T 1 chuyển về S 0 và bức xạ các photon ánh sáng làm cho
R

R

R

R

R

R

quá trình phát quang xẩy ra chậm gọi là huỳnh quang chậm hoặc lân quang (10-3
P

P

→ 10 giây).
♦ Trong hiện tượng phát quang, một phần năng lượng của ánh sáng kích
thích bị tiêu tốn chuyển thành nhiệt năng do hiện tượng bất hoạt vì vậy năng
lượng ánh sáng kích thích bao giờ cũng lớn hơn năng lượng ánh sáng bức xạ, hay
nói cách khác, bước sóng ánh sáng bức xạ luôn dài hơn bước sóng của ánh sáng
kích thích, tạo ra sự dịch chuyển cực đại phát quang về phía bước sóng dài hơn
so với cực đại hấp thụ, gọi là sự dịch chuyển Stock. Chất nào có độ dịch chuyển
Stock càng lớn thì phép đo huỳnh quang càng chính xác (vì ít bị ảnh hưởng của
phổ hấp thụ ) [8].
1.3.2. Phép đo huỳnh quang
1.3.2.1. Đo cường độ huỳnh quang
U

Phương pháp huỳnh quang dựa trên nguyên tắc: Khi chiếu một chùm tia tử

ngoại (bức xạ kích thích) vào một số chất, các chất này phát ra bức xạ nhìn thấy


14

có bước sóng xác định tùy thuộc từng chất và có cường độ phụ thuộc vào hàm
lượng của chúng [5] [8] [10].
Nếu ta chiếu xạ mẫu bằng một dòng bức xạ đơn sắc chứa photon có năng
lượng ứng với hiệu năng lượng cần thiết cho quá trình hấp thụ thì một phần của
cường độ bức xạ tới I 0 sẽ bị hấp thụ và cường độ bức xạ truyền qua I sẽ nhỏ hơn
R

R

cường độ bức xạ tới I 0 [5].
R

R

Trong những điều kiện nhất định, cường độ bức xạ huỳnh quang I h sẽ tỉ lệ
R

R

thuận với cường độ bức xạ hấp thụ (I 0 - I) theo:
R

R

I h = k (I 0 - I)

R

R

R

(1.1)

R

Hằng số k phụ thuộc vào chất phân tích, môi trường và có quan hệ với
hiệu suất phát ra photon của nguyên tử hoặc phân tử khi từ trạng thái kích thích
trở về trạng thái cơ bản. Cường độ bức xạ truyền qua có quan hệ với nồng độ
chất phân tích theo định luật Beer như sau:
I = I 0 . 10-εlC
R

R

P

RR
P

(1.2)
Thế phương trình (1.2) vào phương trình (1.1) ta được:
I h = kI 0 (1 - 10-εlC )
R

R

R

R

P

RR
P

(1.3)

Phương trình (1.3) có thể được triển khai thành chuỗi Taylor để cho kết
quả là:
2
3


(
2 ,303εlC ) (2 ,303εlC )
+
− ...
I h = kI 0  2 ,303εlC −
3!
2!



(1.4)

Với εlC < 0,01 thì các số hạng có bậc cao trong chuỗi sẽ có giá trị bé hơn
1% so với I h nên có thể bỏ qua và như vậy thì:
R

R


15

I h = 2,303 kI 0 εlC
R

R

R

(1.5)

R

Trong đó:
I0

:

Cường độ bức xạ tới.

:

Cường độ bức xạ truyền qua.

:

Cường độ bức xạ huỳnh quang.

ε

:

Hệ số hấp thụ mol của chất phân tích.

l

:

Chiều dày của lớp dung dịch (cm).

C

:

Nồng độ chất phát quang trong dung dịch (mol/L).

I

R

R

R

R

Ih
R

R

Tóm lại, trong điều kiện nồng độ bé (tức là có độ hấp thụ nhỏ, εlC < 0,01)
thì cường độ bức xạ huỳnh quang sẽ tỉ lệ thuận với nồng độ chất phân tích và với
cường độ bức xạ tới I 0 . Đây là cơ sở của phương pháp huỳnh quang phân tử
R

R

dùng xác định nồng độ C của chất phân tích theo cường độ huỳnh quang I h [5].
R

R

Nếu dung dịch có nồng độ lớn hơn (εlC > 0,01) thì sẽ xảy ra sự tắt huỳnh quang,
không còn sự tuyến tính giữa cường độ huỳnh quang và nồng độ nữa [8].
1.3.2.2. Đo phổ huỳnh quang [8]
U

U

a). Phổ kích thích: Excitation spectrum (EX)
Là đường biểu diễn sự phụ thuộc của cường độ phát quang tương đối
(relative intensity) theo bước sóng của ánh sáng kích thích.

Bước sóng cực đại của phổ kích thích cũng chính là bước sóng cực đại hấp
thụ của chất được kích thích (được hoạt hóa) vì vậy phổ kích thích cũng chính là
đường biểu diễn mối quan hệ giữa cường độ hấp thụ của chất đó và bước sóng
bức xạ hấp thụ.
b). Phổ bức xạ (phổ huỳnh quang):

Emission spectrum (EM)
Fluorescence spectrum (FL)