Nghiên cứu tổng hợp dẫn chất isoniazid và thử tác dụng sinh học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

VŨ TRẦN ANH

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP DẪN CHẤT ISONIAZID
VÀ
THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SỸ Dược HỌC

C H U Y Ê N N G À N H : CÔ N G N G H Ệ Dược PH Ẩ M

v à bào c h ế th uố c

M Ã SỐ: 30 20 1

Cấn hộ hướn^ dẫn: T.s. Phạm Thị Minh Thuỷ
T.s. Ngô Mai Anh
Nơi thực hiện
: Bộ môn Hữu cơ
\
Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI 2001


ƠQl

Qi5/ of/Vi b à ụ tớ iồitạ. íùêí tUi iá u iắe. đ ố i a ổ ỉ

^ l u i n t Q^lti JItinli QhatX,

QUị A J/Íu ì cÂnh đ ũ tậ n tìn h hntỉníẬ. d ẫ n tô i trm nj, q u á trìn h th ự e k iên luíỊn oủn
nùip.
jetn í4tủn th à n h (íảtn đu eád thuiị. eả íịiá ơ , kẠ th u ậ t oièn
- Q mỉìUhậ.

m ô tt Jõũ'u eo'

họa 'Dưọíí '3ỖÙ Q ỉịỘì đ ã ỊIỈÚỊI đ õ , itỗng, tìiên tô i iM nụ, tỊẤtá trìn h

thự a h iên luíỊtt tùíti tíii ®í5 infill.
Qíôi dcùt e íiâ n th à n h eảrn đ tt (B an ^ J á m h lê u ỉníỀlnụ. 'ĩ ) « / ho ít n } n ’(fíí '3ÔÙ n ỗ i,
^ h ụ m Qfiamj. Q^ùiiạ, eúa eán /fậ p.hònạ. đ õ tạ d đ ỉễu hiên eíto tô i trtìn ạ q u á trìn h h ọ e tíỊp^.
<7(f5/ x h t eíiâ n th à n h earn ổn Q^.s.

n ạ id ê tn tm níỊ. t â m - ^ ạ l h oe ^ lừ ỉít '3C)Ù n ô i;
D L h ttn h ,

QIịịọíl Q'l'UMHh từi eúe.

(tá n

Im^ h ồ n ụ . t h í

Ễ/#tf Q /í/ Mộe, 3C.S. Q líịu ụ ỉit

Q ltịttụ ễ it ^ h i (V â n StìH (!fê m ô n
n ệ iị; Q^.S^JẼê QUịjỌ'rTĨOị; (túétíán bô eỉta (Viên '3ỖOÚ thuôứ. ^ ì ê n DChtìa h oe (ĩ)iê ỉ Qlxưn.
^ ồ i (iũm ị jein ehân th àn h cảm đn (Mil thầỊỊ, eâ íỊÌáo itã hitHtuj, d ã n , íịìÚ Ịi it ĩi

tổ!

q.nti trìn h h ọe tậft tạ !

' ĩ ) « / họíi n }lt’đ a '3ÙÙ nội.

Qí^aếỜ3^
D.s. VŨ TRẦN ANH


M ỤC LỤC

Đăt vấn đề

1

Chương 1: Tổng quan

2

1.1. Bệnh lao và thuốc điều trị

2

1.2. Isoniazid : cấu trúc hoá học và tác dụng sinh học

5

1.3. Tác dụng sinh học của dẫn chất hydrazon

6

1.4. Các phương pháp tổng hợp dẫn chất hydrazon

10

Chương 2: Nội dung, phương pháp, phương tiện nghiên cứu

12

2.1. Nội dung nghiên cứu

12

2.1.1. Tổng hợp dẫn chất của isoniazid

12

2.1.2. Nghiên cứu tác dụng sinh học của các dẫn chất tổng
hợp được

12

2.2. Phương pháp nghiên cứu

14

2.3. Phương tiện nghiên cứu

15

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

16

3.1. Tổng hợp các hợp chất trung gian

16

3.2. Tổng hợp isonicotinonyl của vanilin và các dẫn chất

23

3.3. Tổng hợp dẫn chất isonicotinoyl hydrazon của các

aldehyd

28

3.4. Tổng hợp dẫn chất isonicotinoyl hydrazon của các

ceton

31

3.5. Tóm tắt các kết quả tổng hợp hoá học

37

3.6. Xác nhận cấu trúc của các chất tổng hợp được

37

3.6.1. Biện giải phổ hồng ngoại

37

3.6.2. Biện giải phổ tử ngoại

38

3.6.3. Biện giải khối phổ

44

3.7. Thử tác dụng sinh học của các chất tổng hợp được

45

3.7.1. Thử test nhậy cảm với vi khuẩn lao

45

3.7.2. Thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm

50


Chương 4: Bàn luận

55

K ết luận

57

Tài liệu tham khảo

59

Phụ lục

63


CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Trong luận văn sử dụng một số chữ viết tắt sau:
DMF

: Dimethylformamid

M

; Khối lượng phân tử

SKLM

: Sắc ký lớp mỏng

IR

: Phổ hồng ngoại

MS

: Phổ khối

uv

: Phổ tử ngoại


1

ĐẶT VẤN ĐỂ
•

Lao là một trong những bệnh xuất hiện rất sớm trong lịch sử y học.
Trước đây, trong nhân dân lao được coi là bệnh rất nguy hiểm và được xếp là
một trong tứ chứng nan y, một bệnh "cha truyền con nối", hầu như không có
thuốc điều trị lao đặc hiệu, vì thế tỷ lệ tử vong của bệnh lao rất cao. Từ thế kỷ
19 bắt đầu có những hiểu biết khoa học hơn về bệnh lao. Những thành tựu y

học đạt được trong nghiên cứu về bệnh lao, cùng với sự ra đời của hàng loạt
thuốc kháng sinh và hoá chất chống lao đã giảm được tỷ lệ mắc bệnh và chết
do bệnh lao trên thế giới [6]. Bệnh lao có lúc đã được coi là có thể thanh toán
được. Nhưng hiện nay bệnh lao đang trở lại và là nguyên nhân hàng đầu gây
ra tử vong trong số những người trẻ tuổi và trưởng thành trên thế giới [17].
Điều trị bệnh lao trở nên khó khăn hơn và thách thức hơn do sự phát triển của
lao kháng thuốc và vì mối liên quan giữa bệnh AIDS với sự gia tăng đáng kể
bệnh lao phổi và bệnh nhiễm khuẩn do vi khuẩn lao gây ra [23].
Trong số các loại thuốc được dùng để điều trị bệnh lao hiện nay,
Isoniazid vẫn được coi là thuốc hàng đầu [6],[22], [23]. Từ Isoniazid người ta
cũng đã điều chế ra 1 số dẫn chất có tác dụng với vi khuẩn lao [26]. Ngoài ra
các dẫn chất hydrazon còn có hoạt tính sinh học phong phú và đa dạng như
kháng khuẩn, kháng viêm, chống virus.
Sự phong phú về khả năng tổng hợp và sự đa dạng về tác dụng sinh học
của dãy chất hydrazon đã hướng chúng tôi nghiên cứu tổng hợp dẫn chất của
dãy này. Trong công trình này, chúng tôi dự kiến tổng hợp một số dẫn chất
hydrazon của Isoniazid và thử tác dụng sinh học của các dẫn chất này.
Chúng tôi hy vọng công trình này là một tài liệu tham khảo đóng góp
vào việc nghiên cứu tìm kiếm dẫn chất thuốc mới của Isoniazid có tác dụng
đối với vi khuẩn lao.


2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Bệnh lao và thuốc điều trị.
Bệnh lao là một bệnh nhiễm khuẩn do vi khuẩn Mycobacterium
tuberculosis gây ra (còn gọi là trực khuẩn Koch hay trực khuẩn BK). Đó là
loại vi khuẩn hình que, mảnh, dài từ 2 - 4 |Lim thuộc loài vi sinh vật trung gian

giữa nấm và vi khuẩn. Cấu trúc sinh hoá trực khuẩn lao rất đa dạng: có một vỏ
đặc biệt với những thành phần mycozit, sunfatit, murannyl dipeptit, các acid.
Trực khuẩn lao có thể sống trong đại thực bào, gây tổn thương đặc hiệu gọi là
bã đậu và trong một số điều kiện, có thể nằm im trong trạng thái "ngủ", tồn tại
nhiều năm trong cơ thể. Lao là bệnh mãn tính, kéo dài nhiều năm, có nhiều
biểu hiện khác nhau trên lâm sàng nhưng cũng có thể chỉ tiềm tàng với những
thay đổi đơn thuần sinh học[6]. Bệnh lao là bệnh nhiễm khuẩn mang tính xã
hội, truyền từ người này sang người khác. Các thống kê của WHO cho thấy
bệnh lao giết chết 8.000 ngưòi trong một ngày, 2 - 3 triệu người trong một
năm và một phần ba dân số thế giới mang trong người vi khuẩn lao. Bệnh này
giết chết nhiều người hơn bệnh AIDS hoặc sốt r é t , là bệnh cướp đi mạng sống
nhiều nhất trong số ngưòi trẻ tuổi và trưcmg thành trên thế giới. Bệnh lao là
nguyên nhân hàng đầu về tử vong của người nhiễm HIV, tính trung bình là
một phần ba của số người tử vong AIDS trên toàn cầu [17]. ở Việt Nam,
1,5% dân số có nguy cơ nhiễm lao mỗi năm, hàng năm có khoảng 110.000
người mắc bệnh lao mới, trong đó 50.000 người có phản ứng BK dương tính
và cứ 100.000 người có 60 người tử vong do bệnh lao [6].
Tổ chức y tế thế giới ước tính có thêm 10,2 triệu bệnh nhân lao mới vào
năm 2000, con số này xấp xỉ vào khoảng 11,9 triệu vào năm 2005. Tử vong do
bệnh lao sẽ là một trong những nguyên nhân số 1 trong bệnh nhiễm trùng đơn
độc và số người chết vì bệnh lao khoảng 3,5 triệu người vào năm 2005. Nếu
chương trình chống lao không được triển khai rộng khắp trên thế giới thì thập


3

kỷ 90 sẽ có khoảng 90 triệu trưÒTig hợp lao mới và 30 triệu người chết vì bệnh
lao [33]
Các thuốc điều trị lao cho đến nay vẫn là biện pháp chính trong điều trị

và ngăn chặn bệnh lao [22],[23].
Điều trị lao bằng thuốc ngày nay có 2 mục đích, nhằm vào 2 nhóm trực
khuẩn lao trong cơ thể: nhóm sinh sản nhanh phát triển mạnh trong các tổn
thương viêm; nhóm phát triển chậm nằm trong các đại thực bào và chất bã đậu
[6],[22].
Ngày nay bệnh lao được điều trị bằng thuốc theo 2 nguyên tắc [6], [22].
- Phối hợp các loại thuốc để hạn chế khả năng kháng thuốc của vi

khuẩn.
- Điều trị theo 2 giai đoạn
+ Giai đoạn tấn công: dùng thuốc hàng ngày.
+ Giai đoạn duy trì: Dùng thuốc cách ngày, 2 - 3 lần trong 1 tuần.
Cho đến nay các thuốc hiện hành và kháng sinh chữa lao có khoảng 20
loại, chia thành 2 nhóm chính [23].
- Nhóm 1: Gồm các thuốc có hiệu lực cao nhất với mức độ độc tính
thấp, gồm Isoniazid, Rifampicin, Ethambutol, Streptomycin và Pyrazinamid.
- Nhóm 2: Trong trường hợp vi khuẩn kháng thuốc hoặc trường họfp
bệnh nhân nhiễm HIV thì điều trị bằng kháng sinh: Ofloxacin, Ciprofloxacin,
Ethionamid, Acid amino salicylic, Cycloserine, Amikacin, Kanamycin,
Capreomycin.
Theo Hiệp hội chống lao quốc tế (kháng cáo của u ỷ ban điều trị, 1988),
công thức chữa lao nên dùng; 2HRZ/ 4HR nghĩa là 2 tháng đầu dùng 3 loại
Isoniazid, Rifampicin và Pyrazinamid, 4 tháng sau dùng Isoniazid và
Rifampicin[6].


4

Bảng 1.1 ; Liều lượng của 1 số thuốc chống lao theo khuyến cáo của
Hiệp hội chống lao quốc tế [6 ].

Liều mg/kg thể trọng
Tên thuốc

Dùng hàng ngày

Dùng cách ngày

5

15

15-20

15-20

Rifampicin

10

15

Pyrazinamid

35

Isoniazid
Streptomycin

Ethambutol

50

X

3 lần/tuần

75

X

2 lần/tuần

25 (trong 2 tháng)

30

X

3 lần/tuần

sau đó 15

45

X

2 lần/tuần

Ở Việt Nam, chương trình chống lao quốc gia đề xuất 2 công thức điều
trị trong 9 tháng như sau:

- Công thức 1: Điều trị cho bệnh nhân mới mắc và bệnh nhân có BK
dưoỉng tính (phác đồ phổ cập cho bệnh nhân lao mới).
Công thức: 3SHZ/ 6 S2 H 2
Nghĩa là:
+ Trong 3 tháng đầu dùng hàng ngày 3 loại thuốc Streptomycin,
Isoniazid, Pyrazinamid.
+

6

tháng sau dùng 2 lần 1 tuần 2 loại thuốc Streptomycin, Isoniazid.

- Công thức 2: Điều trị cho bệnh nhân lao đã được điều trị nhưng không
khỏi (sau phác đồ phổ cập)
Công thức 3REH/ 6 R 2 E 2 H 2
Nghĩa là
+ 3 tháng đầu dùng hàng ngày 3 loại thuốc Rifampicin, Ethambutoi^
Isoniazid.
+

6

tháng sau dùng 2 lần 1 tuần 3 loại thuốc trên.


Trên đây là một vài nét tổng quát về bệnh lao và các phương pháp điều
trị bệnh lao. Trong số các thuốc điều trị bệnh lao isoniazid là thuốc có tác
dụng mạnh, diệt được cả vi khuẩn trong và ngoài tế bào. Sau đây là một vài
nét về cấu trúc hoá học cũng như tác dụng sinh học của isoniazid.
1.2. Isoniazid: C ấu trú c hoá học và tác dụng sinh học

1.2.1. Cấu trúc hoá học của isoniazid
Isoniazid là hydrazid của acid isonicotinic có công thức
CONHNH,

ộ
Isoniazid có khả năng tham gia vào các phản ứng hoá học.
- Phản ứng của nhân pyridin
+ Đốt với NajCOj tạo thành pyridin có mùi đặc biệt
+ Tác dụng với

C U 2SO 4

tạo thành phức mầu xanh da trời.

Ngoài ra còn tạo phức với cacbon, kẽm, mangan.
- Phản ứng của nhóm hydrazin
+ Nhóm hydrazin dễ bị oxy hoá nên có thể khử hoá thuốc thử Fehling
và dung dịch bạc nitrat trong NH3

o = c - NH - NH,

COOH

AgNO^/ NH3

+ N,

+ H ,0

'N '

'N

+ Phản ứng ngưng tụ với aldehyd, ceton tạo hydrazon ít tan trong nước,
có điểm chảy xác định
0 = ọ - NHNH 2

ộ

+

0=C-NH-N=C-R
0 = C-R,

ộ

Ro

+ H, 0


6

1.2.2. Tác dụng sinh học của isoniazid
Isoniazid có tác dụng kìm hãm với trực khuẩn lao phát triển chậm, có
tác dụng diệt khuẩn với nhóm trực khuẩn lao phát triển mạnh. Isoniazid dễ
dàng thấm qua màng tế bào, làm biến đổi màng tế bào vi khuẩn, cụ thể là ức
chế sự tổng hợp acid béo mạch dài tham gia vào thành phần cấu tạo màng vi
khuẩn. Khi vào cơ thể được hấp thụ dễ dàng và gần như hoàn toàn, thuốc có
thể khuyếch tán tới tất cả các cơ quan và dịch cơ thể, kể cả dịch não tuỷ. [22],

[23]. Trong điều trị người ta thưòfng dùng phối hợp Isoniazid với các thuốc
chữa lao khác nhằm tăng tác dụng, giảm liều các thuốc phối hợp và làm chậm
sự kháng thuốc của trực khuẩn lao.
1.3. Tác dụng sinh học của dẫn chất hydrazon.
1.3.1. Tác dụng kháng khuẩn của dẫn chất hydrazon
Đây là tác dụng quan trọng nhất của các dẫn chất hydrazon, đáng chú ý
nhất là dẫn chất hydrazon của 5-nitrofurfural có công thức chung:

0.N

CH = N -NH- R

Vi khuẩn gây bệnh lao(Mycobacterium tuberculosis) là loại vi khuẩn rất
khó tiêu diệt nên tác dụng kháng lao của các hydrazon là một đặc tính cực kỳ
quý giá.
Năm 1948 G.Drmaỵk đã tổng hợp được Tibion (Thiosemicarbazon của
aldehyd para-acetylaminobenzoic) có tác dụng chống lao và đã áp dụng vào
thực tế lâm sàng có kết quả tốt với các tên biệt dược như TBI, Corteben,
Livazon.
o
H,c - c - N H ^

s
V c H = N - NH - c - NH2


7

Thông thường người ta hay phối hợp Tibion với PAS (Acid paraamino
salicylic) để làm tăng tác dụng của PAS trong điều trị lao màng nhầy, lao da,

lao khoang miệng.
Năm 1948 MN.Soulina và E.Michina đã tổng hợp được 1 dẫn chất khác
của Thiosemicarbazon có tác dụng chống lao lấy tên là Cutizon có công thức
như sau:

CH,

H3C - CH

„

s
II

CH = N - NH - C - NH ,

Dãy có tác dụng kháng lao mạnh thứ hai là dẫn chất isonicotinoyl
hydrazon như:
CO - NH - N = CH

Phtivazit (Vanizit) (Isonicotinoylhydrazon của
3 - m etoxy - 4 - hydroxybenzaldehyd)

CO - NH - N = CH

- (o v

HOOC

Ạ

OCH,

^OCH,

Saluzit (Isonicotinoylhydrazon của 2 - carboxy
- 3, 4 - dim etoxybenzaldehyd)

Năm 2000, các tác giả Trần Viết Hùng, Nguyễn Quang Đạt, Lê Ngọc
Vân, Lê Thị Tập đã nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng chống lao của một số
dẫn chất thiosemicarbazon và isonicotinoyl hydrazon của isatin và 5-halogen
isatin [5]. Kết quả cho thấy tất cả các chất tổng hợp được đều có tác dụng
mạnh trên chủng Mycobacterium tuberculosis

H 37R V .

Ngoài ra có 6 dẫn chất

của 3-isonicotinoyl hydrazon của isatin và 5-halogen isatin có tác dụng cả trên
chủng vi khuẩn lao đã kháng isoniazid[5].
1.3.2.

Tác dụng chống khối u của dẫn chất hydrazon

Trong vài thập niên trở lại đây do sự gia tăng của bệnh ung thư người ta
chú ý đặc biệt vào việc nghiên cứu ra các loại thuốc mới để thanh toán căn


8

bệnh nan y này. Trong quá trình nghiên cứu bước đầu người ta phát hiện ra
một số dẫn chất có cấu trúc hydrazon có tác dụng kìm hãm sự phát triển của
các tế bào ung thư, đặc biệt đáng chú ý là các dẫn chất của N,N bis-2chloroethylhydrazon .
Bis (2,2 - dicloroethylhydrazon của 5 - nitrofurfuraldehyd)
^CH2-CH2-CI
O2N

CH = CH - CH = N - N

\

CH^ - CH 2 - CI

Bis thiosemicarbazon của 5 - nitrofurfurylglyoxan
s
N-NH-C-NH 2
s
" „
II
c - CH = N - NH - C - NH,

O2N

Bis guanylhydrazon của 5 - nitrofurfurylglyoxan
NH
N -N H -C -N H ,
0 .N

o

c - CH = N - NH - C - NH2

1.3.3. Các tác dụng khác của dẫn chất hydrazon
Ngoài các tác dụng chính kể trên một số hydrazon có tác dụng chống
viêm, chống virus, chống ký sinh trùng.
= N - NH - C

OH

o

V___ J

Nifuroxazide (4-hydroxybenzoic acid

[(5- nitro -2 furanyl methylen)]hydrazid)

Nifuroxazide có tác dụng sát khuẩn đường ruột và sát trùng ngoài da.
C1

I ~ CH = N - NH V-^I

- NH2

Guanabenz
(Hydrazin carboximidamid, 2 [2,6- dicloro
phenyl) methylen])

Guanabenz có tác dụng điều trị tăng huyết áp.
Sau đây là bảng tổng kết một số dẫn chất hydrazon được sử dụng làm thuốc.

9

Bảng 1.2: Một số hydrazon, semicarbazon và thiosemicarbazon được
sử dụng làm thuốc
STT

Công thức cấu tạo
CO - NH - N = CH

Tên khoa học
■OH

1

'OCH3

Isonicotinoylhydrazon
của 3 metoxy 4- hydroxybenzaldehyd

Ạ

Tác
dụng

Ftivazit

Chống

Vanizit

lao

Isonicotinoylhydrazon

CO - NH - N =

của 3, 4 dimetoxy -

2
Q

Tên thuốc

HOOC

^'-^3

Ạ
o

Saluzit

2-carboxybenzaldehyd
Thiosemicarbazon của

3

aldehyd - p - acetyl —

Tibion

aminobenzoic

CH3

s

I

4

H ,C-CH^

V

cH

Thiosemicarbazon của

= N-NH-C-NH2

Cutizon
p-isopropylbenzaldehyd

Chống
lao

Chống

lao

Chống
lao

,N - NH - C - NH,

>

ìr

^

S

5

1-Guanylhydrazon
3-Thiosemicarbazon của

N - NH - C - NH.

ìr

-

Tiogin

Chống
lao

Indandion

NH

6

o

O2N

'CH = N - NH - C - NH,

Semicarbazon của
Furacillin
5 - nitro - 2 furfuraldehyd

Kháng
khuẩn

l-(5'nitro -

7

O2N

CH = N -

2'- furfuryliden amino) 1, 3, 4 - Triazol

Furazonal

Kháng
khuẩn


10

1.4. Các phương pháp tổng hợp dẫn chất hydrazon
Có ba phương pháp chính để tổng hợp dẫn chất hydrazon [29
1.4.1.Ngưng tụ giữa hydrazin với các hợp chất carbonyl

ZNHNH,

/

+

/ Ri

R,
-► ZNHN = c

0 =c\

+

\

H^O

Đây là phản ứng thuận nghịch nhưng nghiêng về chiều thuận. Cơ chế
phản ứng được giải thích như sau: Trước hết là phản ứng cộng hợp ái nhân của
phân tử hydrazin vào nhóm carbonyl, tiếp theo là phản ứng loại nước tạo
hydrazon.
R

R

c =0 +

/

/
R2
R

c -O H +

Ri

\

H jN -N H -Z

^

r;

+

ỌH,

\

/

/
c

C -O H

r;

'n +

Ri

'n +

\ N H -N H -Z

-H .o

R,
\

/

ỌH
NH 2 -N H -Z

-H"

c

/
R.

+

R,

\

c = N -N H -Z

N H -N H -Z

Xúc tác cho phản úng là acid vô cơ hoặc acid hữu cơ, lượng acid dùng
làm xúc tác ảnh hưcmg đến tốc độ phản ứng. Mỗi cặp hydrazin-carbonyl có
một trị số pH đặc trưng, ở pH đó nồng độ [R 1 -COR 2 ] [HjN-N H-Z] đạt được
cực đại và hiệu suất của phản ứng là cao nhất. Tuỳ theo hợp chất ban đầu và
hydrazon tạo thành mà chọn dung môi, xúc tác, nhiệt độ, thời gian phản ứng
thích hợp.


11

1.4.2. Phản ứng kết hợp muối diazoni với hợp chất có chứa nhóm
methylen hoạt động (Công thức Z -C H 2 -Z')

____
_
Z -C H 2 -Z '

+

ArNH,

AcONa
------ ----- ►

Z-C =N -N H A r

^
^
.........
‘
Z'
.
z, Z ’ có thế là Ị3-keto este, f3-keto amid, este malonic, nitro alkan.
Cơ chế phản ứng có thể là phản ứng thế ái điện tử
Z’
Z-CH 2-Z ’

..... " ... >

Z-CH<“>

+

N=N-Ar

----------►

(-)
Z -C H -N =N -A r

---------- ►

Z-C =N -N H -A r

1
Z’

I

Z’

1.4.3. Phản ứng phân cất liên kết đôi bằng ỉon hydranium hoặc muối
diazoni
R,C=CR, +

NH^-NH"

----------- ►

R2CH2 +

R2C=N-NH2
+

PhCH=CHMe +

A 1-N2"

H ,0

---------------- ► PhC H -CH M e

-------------►

N =N Ar

+
OH2
P h C H -ổH M e
N =NA r

-------------►

PhCH
N -N H A r

+

0=C H M e


12

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP
PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN

cứu

2 . 1 . N ộ i d u n g n g h iê n c ú t i:

2.1.1. Tổng hợp dẫn chất của isoniazid
Trong các phương pháp tổng hợp dẫn chất hydrazon, căn cứ vào các
chất chúng tôi dự kiến tổng hợp và căn cứ vào điều kiện phòng thí nghiệm
chúng tôi chọn phương pháp ngưng tụ hợp chất hydrazin với hợp chất chứa
nhóm carbonyl.
Để tổng hợp dẫn chất của isoniazid chúng tôi dùng phản ứng ngưng tụ
của isoniazid với các aldehyd và ceton.
Phản ứng tổng quát
/■
CONHNH 2
[ 0

V

1

C O N H N =C

+ o = c^
^R,

o

+

H2O

V

Tóm tắt các hợp chất aldehyd và ceton mà chúng tôi sử dụng để tiến
hành nghiên cưú được trình bày ở bảng 2.1 và 2.2 trang 13, 14.
2.1.2. Nghiên cứu tác dụng sinh học của các dẫn chất tổng hợp được
- Thử tác dụng kháng

khuẩn

của các chất tổng hợp với 9 chủng vi

khuẩn.
- Thử tác dụng kháng nấm của các chất tổng hợp với 1 chủng nấm.
- Thử tác dụng với vi khuẩn lao của một số chất tổng hợp. Chủng vi
khuẩn kiểm định là chủng chuẩn Mycobacterium tuberculosis H3-7RV và

chủng Mycobacterium tuberculosis được xác định là đã kháng isoniazid.


13

Bảng 2.1. Các aldehyd được sử dụng để tiến hành nghiên cứu
Công thức cấu tao

Tên

CHO
Vanilin

I

OCH,

ÒH
CHO
5-nitro vanilin
O .N

OH
CHO
5-bromo vanilin

g /

T

'OCH3

ÒH
CHO
5-cloro vanilin
C1

OH
CHO
5-iodo vanilin

Benzaldehyd

CHO
Paradimethyl amino
benzaldehyd

Ỵ

ch ,

Furfural

o

ìĩ

0


14

B ảng 2.2. C ác ceton được sử dụng để tiến h ành n g h iên cứu

Stt

Công thức cấu tạo

1

Tên
Acetophenon

C-CH,
'II

o

O^C-CHj
2

Paramethyl acetophenon

CH,

0

3

=
COOH

/\

4

5

/K

coo-

0 0

X

-

Acid pinonic

Menthyl pinonat

Phenyl pinonat

2.2. Phương pháp nghiên cúli:
- Sử dụng các phương pháp thực nghiệm trong hoá học hữu cơ để tổng
họfp các chất dự kiến.
- Theo dõi quá trình phản ứng bằng SKLM.
- Xác định độ tinh khiết của sản phẩm tổng hợp được bằng SKLM, đo
nhiệt độ nóng chảy.
- Xác nhận cấu trúc của các chất tổng hợp được dựa trên phân tích phổ

IR ,uv, MS.


15

- Thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của các chất tổng hợp dựa trên
phương pháp khuy ếch tán trên thạch theo quy định trong dược điển Việt Nam.
- Thử tác dụng trên vi khuẩn lao của các chất tổng hợp dựa trên phương

pháp thử độ nhạy cảm của vi khuẩn lao với chất thử theo phương pháp tỷ lệ
Canetti - Grosset.
- Dùng phương pháp trung bình cộng để xử lý các số liệu thu được.
2.3. Phương tiện nghiên cứu:
- Các hoá chất sử dụng là loại p, PA do phòng Giáo tài trưcmg Đại học
Dược cung cấp.
- Sắc ký lớp mỏng trên màng mỏng silicagel Kieselgel 60

F254

- Nhiệt độ nóng chảy đo trên máy Gallenkamp tại Bộ môn Hữu cơ
trường Đại học Dược Hà Nội.
- Phổ hồng ngoại (IR) ghi trên máy Perkin Elmer tại phòng Thí nghiệm
trung tâm, trường Đại học Dược Hà Nội với kỹ thuật làm viên nén KBr. Ghi
trong vùng 4.000 - 500 em ’.
- Phổ tử ngoại (ƯV) ghi trên máy Cary lE u v - Visible spectrometer
Varian tại phòng Thí nghiệm trung tâm, Trường Đại học Dược Hà Nội.
- Phổ khối lượng tỷr; Ghi trên máy 5989B - HP - MS bằng phương pháp
va chạm electron với năng lượng bắn phá 70eV.
- Thử tác dụng kháng khuẩn tại bộ môn Vi sinh học (Đại học Dược Hà
Nội). Thử tác dụng trên vi khuẩn lao tại khoa Vi sinh (Viện lao và bệnh phổi).


16

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u

3.1. Tổng hợp các hợp chất trung gian
Chúng tôi sử dụng phản ứng ngưng tụ của isoniazid với các aldehyd và
ceton để tạo ra các hợp chất hydrazon. Một số aldehyd và ceton mà chúng tôi

sử dụng không có sẵn trong phòng thí nghiệm, vì vậy chúng tôi phải tiến hành
tổng hợp các họp chất trung gian này.
3.1.1. Tổng hợp 5-bromo vanilin
Sơ đồ phản ứng:
0 = C -H

10°-15°c

+

o

0 = C -H

Br, ----

'0 C H 3

OH

Vanilin

HBr
Br

r

0CH 3

OH

5-bromo vanilin

Tiến hành:
Dụng cụ gồm có: bình nón dung tích 500ml, nhiệt kế.
Cho vào bình nón 30ml acid acetic đặc, thêm vào 15,2g (O,lmol)
vanilin, lắc cho tan hết. Làm lạnh bình đến 5-10°C bằng nước đá. Thêm từ từ
từng ít một vào hỗn hợp phản ứng 5,5ml brom (0,1 mol) trong 15ml acid acetic
đặc đã được làm lạnh bằng nước đá (vừa cho vừa lắc và giữ nhiệt độ phản ứng
không quá 15“C). Lắc và giữ nhiệt độ phản ứng từ

10-15”c

trong thời gian 30

phút. Phản ứng kết thúc. Lọc lấy tủa 5-bromo vanilin trên phễu Buchner. Rửa
tủa nhiều lần bằng nước cất đến hết acid. Kết tinh lại trong ethanol tuyệt đối.
Sấy khô, thu được 18,84 g sản phẩm. Đó là bột kết tinh màu trắng.
Nhiệt độ nóng chảy : 164-166°c
Hiệu suất 81,57%.
Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng SKLM với dung môi hoà tan
là DMF, hệ dung môi khai triển là methanol-cloroform=l:13.


17

3.1.2. Tổng hợp 5-cloro vanilin
Sơ đồ phản ứng:
0 = C -H

0 = C- H
CH3COOH

o

+ CL

+

--------- ►

HCl

'0 C H 3

OH

Vanilin

C1

OH

5-cloro vanilin

Tiến hành:
♦ Điều chế clo
Phản ứng:
2 K M n 0 4 + 1 6 H C l ------ ► 5 CI2 + 2KC1 + 2MnCl2 + 8 H 2 O
Trong bình phản ứng điều chế khí clo, cho một lượng KMn 0 4 .Lắp ống

dẫn khí và phễu nhỏ giọt trong có HCl đặc. Nhỏ từ từ acid HCl từ phễu nhỏ
giọt vào bình phản ứng, khí clo sẽ thoát ra theo ống dẫn khí.
♦ Điều chế 5-cloro vanilin
Dẫn khí clo đã điều chế ở trên vào bình cầu chứa 8,8g vanilin (0,005
mol) đã hoà tan trong 32 ml acid acetic đặc. Tiến hành phản ứng trong 30
phút, thu được tủa 5-cloro vanilin. Lọc, rửa tủa trên phễu Buchner nhiều lần
bằng nước cất đến hết acid. Kết tinh lại trong ethanol tuyệt đối.
Sấy khô, thu được 7,1 g sản phẩm hình kim hoặc mảnh vuông nhỏ màu
trắng.
Sản phẩm rất ít tan trong nước, ít tan trong cloroform, methanol và
ethanol lạnh, tan trong methanol và ethanol nórỊgt^^ổêT^.trong DMF và
aceton.

^

^

Nhiệt độ nóng chảy : 163-164°c
Hiệu suất 76,1%.
Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng SKLM-"vér^ung môi hoà tan
là DMF, hệ dung môi khai triển là methanol-cloroform=l:9.


18

3.1.3. Tổng hợp 5-iodo vanỉỉin
Sơ đồ phản ứng:
0 = C -H

+ h

o

^ r^ O C H a

10°-15°c
--------- ^
NaOH

0 = C- H

HI

fV ^ '^ O C H a

OH

Vanilin

+

o

OH

5-iodo vanilin

Tiến hành :
- Trong 1 cốc thuỷ tinh hoà tan 10,4 g iod tinh thể cùng 7g KI với
khoảng 8ml nước cất, khuấy đều cho tan hoàn toàn.

- Trong 1 cốc thuỷ tinh khác, hoà tan 6g vanilin (« 0,04mol) với alcol
ethylic 70° đến khi tan hoàn toàn.
Cho từ từ dung dịch (KI+I2 ) vào dung dịch vanilin, khuấy đều, đồng
thời cho vào khoảng 0,4g NaOH tinh thể làm xúc tác. Sau đó dùng nước đá để
làm lạnh hỗn hợp phản ứng sẽ thấy kết tủa xuất hiện. Để hỗn họp phản ứng ở

nhiệt độ phòng khoảng 30 phút. Sau đó lọc hút chân không qua phễu Buchner
lấy tủa. Rửa tủa nhiều lần bằng nước cất.
Tinh chế sản phẩm bằng ethanol 70°. Trong quá trình tinh chế trung hoà
NaOH bằng acid acetic (thử bằng giấy quỳ đến môi trưòfng acid). Sấy khô thu
được 6,1 g sản phẩm. Đó là những tinh thể hình kim màu trắng.
Sản phẩm rất ít tan trong nước, ít tan trong cloroform, methanol và
ethanol lạnh, tan trong methanol và ethanol nóng, dễ tan trong DMF .
Nhiệt độ nóng chảy : 179-180°c
Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng SKLM với dung môi hoà tan
là DMF, hệ dung môi khai triển là methanol-cloroform=l:9.
3.1.4. Tổng hợp 5-nitro vanilỉn
Sơ đồ phản ứng:


19

0 = C- H

o

5-10°C

0 = C-H

+ HNO,
ete ethylic
khan
t=2 giờ

OCH,

OH

Vanilin

o
„

+

H ,0

r ^och3

NO2 OH

5-nitro vanilin

Tiến hành:
Dụng cụ phản ứng: Nhiệt kế, sinh hàn khí, bình nhỏ giọt, que khuấy từ.
Lắp dụng cụ, cắm nhiệt kế. Đong 150 ml ete vào bình 3 cổ, lắp sinh
hàn. Chuẩn bị đá làm lạnh đến khi nhiệt độ chất lỏng trong bình đạt 5-10°C.
Cân 10 g vanilin cho vào bình. Đong

H N O 3

bình nhỏ giọt, lắp vào bình 3

cổ. Cho máy khuấy chạy rồi bắt đầu nhỏ acid xuống hỗn hợp trong khoảng 10
phút.Tiếp tục khuấy ở nhiệt độ từ 5-10°C trong 2 giờ. Sau đó khuấy tiếp ở
nhiệt độ phòng trong 30 phút. Kết tủa xuất hiện . Để yên qua đêm, lọc, rửa tủa
trên phễu Buchner 2 lần, mỗi lần với khoảng 10 ml ete. Rửa tiếp bằng nước
lạnh đến khi nước rửa trung tính với giấy quỳ. Sấy tủa ở nhiệt độ 60-70°C
trong 12 giờ.
Thu được sản phẩm kết tinh màu vàng có nhiệt độ nóng chảy 175-

176°c. Sản phẩm

ít tan trong nước, dễ tan trong alcol nóng, cloroform,

aceton.
3.1.5 Tổng hợp acid pỉnonỉc, menthylpinonat và phenyl pinonat
Acid pinonic, menthyl pinonat và phenyl pinonat đều không phải sẵn có
trong phòng thí nghiệm. Chúng tôi tổng hợp acid pinonic đi từ nguyên liệu
ban đầu là tinh dầu thông. Từ acid pinonic chúng tôi tiếp tục tổng hợp menthyl
pinonat và phenyl pinonat. Quá trình tổng hợp này đi qua nhiều giai đoạn, sau
đây là các bước cụ thể.
3.1.5.1. Bán tổng hợp acidpinonic từ a- pinen
- Cất phân đoạn tinh dầu thông thu a-pinen


20

154-156“c

T in h dầu thông
cất phân đoạn

Tinh dầu thông mà chúng tôi sử dụng là chất lỏng linh động màu vàng
nhạt, mùi đặc trưng, không lẫn nước và tạp chất khác. Để tách riêng a-pinen
ra khỏi tinh dầu thông chúng tôi dựa vào nhiệt độ sôi khác nhau của a-pinen
và Ị3-pinen.
Trong bình Wurtz dung tích 500ml, cho vào 300ml tinh dầu thông, lắp
sinh hàn ngang, đun cách cát. Khi nhiệt độ lên tới 154°c thì bắt đầu hứng dịch
chảy ra, nhiệt độ lên đến 157°c thì ngừng cất. Thu được 190ml a-pinen, hiệu
suất là 63,3%­
- Bán tổng hợp acid pinonic
Sơ đồ phản ứng:

[0]

0

=
COOH

KMnO,
a pinen

acid pinonic

Tiến hành:

^/
ho

Trong bình cầu dung tích 200ml cho vào khoảng 750g đá đập nhỏ, sau
đó cho vào khoảng 79g kalipermanganat tinh khiết, tiếp tục cho vào 16,5g
amoni sulfat, cuối cùng cho nhanh 34 g a-pinen (20ml). Thêm 50 ml nước cất,
lắp máy khuấy vào bình và tiến hành khuấy trong 3 giờ. Để tiếp 12 giờ thì
thuốc tím mất màu hoàn toàn, loại tủa mangandioxyd và rửa tủa vài lần bằng
50 ml nước cất trên phễu lọc Buchner. Dịch lọc thu được có màu vàng cam.
Trong trường hợp dịch lọc chưa được kiềm hoá phải kiềm hoá bằng dung dịch
amoni hydroxyd. Dịch thu được gồm acid pinonic, oxy pinocamphon và có thể
acid norpinic ở dạng muối kali hoặc amoni.