Nghiên cứu ứng dụng các phương pháp phân tích vào đánh giá sinh khả dụng viên ketoprofen 200mg tác dụng kéo dài

BỘ G IÁO DỤC VÀ ĐẢO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG Đ Ạ I HỌC D ư ợ c HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THANH LÂM

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÁC PHƯƠNG PHÁP
PHÂN TÍCH VÀO ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG
VIÊN KETOPROFEN 200MG TÁC DỤNG KÉO DÀI

LUẬN VĂN THẠC s ĩ D ư ợ c HỌC

Chuyên ngành : KIỂM NGHIỆM Dược PHẨM - ĐỘC CHẤT HỌC
M ã sô

: 030205

N gười h ư ớ n g d ẫ n k h o a h ọ c : 1. PGS. P h ạm G ia H u ệ

I


X Ờ 9 VxÂM ƠQl

Trong quá trình thực hiện luận VUI “ Nghicn cứu ứng dụng các phương
pháp phân tích vào đánh giá chấl lượng viên Ketoprofen 200 mg tác
dụng kéo d à i” . Tôi đã nhận được sự giúp đỡ quý báu của các thầy, cô giáo bộ
mồn Hoá Phân tích - Độc chất và Phòng Đào tạo sau đại học- Trường Đại học
Dược Hà Nội.

Nhân dịp này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:
PGS. Phạm Gia Huệ
Th.s Nguyễn Thị Kiều Anh
Là những người dã tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc, Phòng phân tích 2 và các cán bộ,
nhân viên trung tâm kiểm nghiệm Dược phẩm- Mỹ phẩm Hà Nội đã tạo điều
kiện cho tôi hoàn thành đề tài này.
Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả các thầy, cô giáo trường Đại học Dược
Hà Nội đã giảng dạy và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập.

Hà Nội, ngày 25 tháng 12 năm 2002
Học viên

Nguyễn Thị Thanh ỉ Am


CHỮ VIẾT TẮT

ACN

Acelonilril

AcOH

Acid acetic

AUC

Diện tích dưới đường cong nồng độ-lhời gian

BP

Dược điển Anh

CE

Điện di mao quản

Cinax

Nồng độ thuốc cực đại Irong máu

FDA

Cục quản lý thuốc và thực phẩin của Mỹ

GC

Sắc ký khí

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IS

Chuẩn nội

KET

Ketoprofen

MeOH

Methanol

MS

Khối phổ

RIA

Phóng xạ miễn dịch

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối

SD

Độ lệch chuẩn

SKD

Sinh khả dụng

TDKD

Tác dụng kéo dài

TE
Tmax

Trielhylamin
Thời gian thuốc cực đại trong máu

USP

Dược điển Mỹ


MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
MỞ ĐẦU

1

Chương ]. TỔNG QUAN
1.1. M ột số phương pháp phân tích dùng để đánh giá chất
lượng thuốc viên

3

1. 1. 1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao.

3

1.1.2.

Phương pháp thử độ hòa tan (Dissolution Test)

6

1.1.3.

Phương pháp quang phổ uv - vis

8

1.2. Vài nét về Ketoprofen

IỊ

1.2.1.

Tính chất

11

1.2.2.

Tác dụng dược lý và dược động học

12

1.2.3.

Chỉ định

13

1.2.4.

Chống chỉ định

13

1.2.5.

Tác dụng không mong muốn

13

1.2.6.

Liều dùng

13

1.2.7.

Dạng bào chế

13

1.2.8.

Các phương pháp định lượng

14

1.3. Vài nét về sinh khả dụng

15

1.3.1.

Các khái niệm cơ bản

1.3.2.

Xác định sinh khả dụng in

1.3.3.

Sinh khả dụng của thuốc viên nén

1.4. Vài nét về thuốc viên tác dụng kéo

16
vivo của thuốc

dài

Chương 2. Đ ố i TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ú u

17
18
19


2.1. Đối tượng - Nguyên vậl liệu

21

2.2. Thiết bị

21

2.3. Phương pháp nghiên cứu

22

2.3.1.

Xác định hàm lượng Ketoprofcn trong chế phẩm

22

2.3.2.

Phương pháp thử độ hoà tan

23

2.3.3.

Đánh giá sinh khả dụng in vivo

23

2.3.4.

Phương pháp chiết Ketoprofen từ huyết tương

24

2.3.5. Định lượng Ketoprofen trong huyết tương
2.4. Phương pháp xử lý kết quả

26
26

Chương 3: KẾT QUẢ THựC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN
3.1. Kiểm tra chất lượng (hoá học) viên nén Ketoprofen lác
dụng kéo dài
3.1.1
3.1.2

Định lượng

27
27

Độ đồng đều hàm lượng

27

3.2. Xác định sinh khả dụng in vitro của Ketoprofen

28

3.2.1

Theo dõi độ ổn định mật độ quang của Ketoproícn
trong môi trường hoà tan Iheo thời gian

29

3.2.2

Đường chuẩn Ketoprofen trong môi trường hoà
tan

30

3.2.3

Đánh giá sinh khả dụng in vitro

31

3.3. Khảo sát phương pháp chiết ketoprofen trong huyết tương

33

3.4. Khảo sát điều kiện định lượng ketoprofen trong huyết
tương

34

3.5. Xây đựng phương pháp định lượng ketoprofen trong huyết
tương

37

3.6. Đánh giá sinh khả dụng viên nén ketoprofen 200mg tác
dụng kéo đài

41

3.7. Bàn luận

47

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

52

TÀI LIỆU THAM KHẢO

54

PHỤ LỤC

DANH MỤC CẮC BẢNG
STT

Bảng

1

Bảng 1.1

2
3

Bảng 3.1
Bảng 3.2

4

Bảng3.3

5

Bảng 3.4

6

Bảng 3.5

7

Bảng 3.6

8

Bảng 3.7

9

Bảng 3.8

10 Bảng 3.9
11 Bảng 3.10
12 Bảng 3.1 la
13 Bảng 3.1 lb
14 Bảng 3.12
15 Bảng 3.13
16
17

Bảng 3.14
Bảng 3.]5

18

Bảng 3.16

19

Bảng 3.17

Nội dung
Điều kiện định lượng ketoprofen trong huyết
tương bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao
Kết quả định lượng ketoprofen Irong viên
Kết qủa xác định độ đồng đều hàm lượng của viên
ketoprofen
Kết quả theo dõi sự biến đổi của mật độ quang
theo thời gian
Kết quả biểu Ihị sự phụ thuộc giữa mật độ quang
và nồng độ ketoprofen.
Kết quả % ketoprofen giải phóng Iheo thời gian
cho từng viên
Hiệu suất chiết ketoprofen trong huyết tương (cần
làm bay hơi dung môi)
Hiệu suất chiết ketoprofen trong huyết tương
(không cần làm bay hơi dung môi)
So sánh hai qui trình chiết ketoprofen trong huyết
tương
So sánh các hệ pha động
Kết qủa xây dựng đường chuẩn ketoprofen trong
huyết tương
Xác định tính chính xác của phương pháp
Xác định tính chính xác của phương pháp (làm
ngày khác)
Xác định tính đúng của phương pháp
Theo dõi sự ổn định của ketoprofen trong mẫu
theo thời gian bảo quản
Kết quả kiểm tra sức khoẻ người tình nguyện
Nồng độ ketoprofen trong huyết lương theo thời

gian của các cá thể (khảo sát thời gian lấy mẫu)
Nồng độ ketoprofen trong huyết lương theo thời
gian của các cá thể (đánh giá sinh khả dụng in
vivo)
Các thông số dược động học

Trang

27
28
29
30
31
33
33
34
36
38
39
39
40
41
42
43
45

47


DANH MỤC CẮC HÌNH

STT

Ilình

1

Hình 1.1.

2

Hình 1.2.

Nội dung
Phân bố log - normal
Minh hoạ cách lính kết qua llieo phương pháp dường

Trang
7
1I

chuẩn
3

Hình 1.3.

Sơ đồ giải phóng hoạt chất của viên nén theo John

18

G.W agner
4

Hình 2.1.

Chiết Keloprofen trong huyết tương theo phương

25

pháp có bay hơi dung môi
5

Hình 2.2.

Chiêì Ketoprofen trong huyết tương theo phương

26

pháp không bay hơi dung môi
6

Hình 3.1.

Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa mật độ quang và

30

nồng độ ketoprofen trong đệm phosphat pH = 6,8
7

Hình 3.2.

Đường biểu diễn sự giải phóng ketoprofen lừ viên

32

Ketoprofen tác dụng kéo dài 200mg
8

Hình 3.3.

Đường chuẩn định lượng ketoproícn trong huyết

38

tương theo thời gian (khảo sát thời gian lấy mẫu)
9

Hình 3.4.

Đường cong nồng độ ketoprofen trong huyết í ương

10

Hình 3.4a Đường cong nồng độ keloprofen trong huyết tương

44
46

theo thời gian (đánh giá sinh khả dụng ill vivo)

11

Hình 3.4b Đường cong trung bình nồng độ keloprofen trong
huyết tương theo thời gian

46


1

MỞ ĐẦU

Ở nước ta hiện nay trên thị trường các thuốc hóa dược với nguyên liệu
hầu hết được nhập ngoại. Thuốc rất phong phú về chủng loại và với số lượng
khá đầy đủ. Vì vậy, một trong các nhiệm vụ chủ yếu của ngành Dược nước ta
hiện nay là đảm bảo chất lượng thuốc một cách có hệ thống từ nguyên liệu
đưa vào sản xuất, kiểm tra chất lượng trong quá trình bào chế đến kiểm
nghiệm thành phẩm và đánh giá nồng độ thuốc đạt được trong máu. Tức là
đảm bảo chất lượng thuốc sẽ xuyên suốt quá trình từ khi nghiên cứu trong
phòng thí nghiệm, chuẩn bị cho sản xuất tới khâu cuối cùng là thuốc ở trong
cơ thể được giải phóng và hấp thu như thế nào.
Việc nghiên cứu sinh khả dụng (SKD) của thuốc, ra đời vào những năm
1960 [26], đã tạo ra một cuộc cách mạng trong ngành Dược. Nghiên cứu SKD
giúp các nhà bào chế tìm ra được công thức bào chế có khả năng kiểm soát
quá trình giải phóng và hấp thu thuốc vào máu như vậy sẽ nâng cao tác dụng
của thuốc, đồng thời nó giúp cho các nhà điều trị đánh giá được nồng độ thuốc
trong máu của từng bệnh nhân mà cho liều dùng hợp lý. Đánh giá SKD của
thuốc viên nén gồm đánh giá SKD in vitro (độ hoà tan) và SKD in vivo (sự hấp
thu thuốc vào máu trong cơ thể người).
Ớ nước ta, nhu cầu thuốc hạ nhiệt, chống viêm, giảm đau là rất lớn.

Nhưng nhược điểm của nhóm thuốc này là hay gây kích ứng dạ dày và phải
dùng nhiều lần trong ngày [1], [6 ]. Để hạn chế tác dụng phụ, tăng khả năng
điều trị và tiện lợi cho người sử dụng, người ta đã và đang nghiên cứu, sản
xuất các dạng thuốc tác dụng kéo dài (TDKD) của chúng. Chưa có sản phẩm
thuốc TDKD nào do các cơ sở trong nước sản xuất. Dạng bào chế này mới
đang ở giai đoạn nghiên cứu và thử nghiệm. Đây là một trong những hướng


2

nghiên cứu quan trọng tại Trường Đại học Dược Hà Nội. Trong Dược điển
Việt Nam III năm 2002 vẫn chưa có chuyên luận thuốc tác dụng kéo dài Ị2|.
Trong các chế phẩm thuốc TDKD, Ketoprofen, một loại thuốc giảm đau
phi steroid LI ] là dược chất được FDA của Mỹ cho phép đưa vào sử dụng năm
1986 [28], đã được sử dụng nhiều và có hiệu quả điều trị tốt.
Để góp một phần nhỏ vào sự phát triển dạng thuốc TDKD, đặc biệt là
đánh giá chất lượng thuốc TDKD, chúng tôi chọn đề tài:
□Nghiên cứu ứng dụng các phưưng pháp phân tích vào đánh giá
sinh khả dụng viên Ketoprofen 200 mg tác dụng kéo dàiũ.

MỤC TIÊU CỦA ĐỂ TÀI NÀY LÀ

1. Xác định sinh khả dụng invitro của viên Ketoprofen 200 mg tác dụng
kéo dài.
2. Xây dựng phương pháp xác định ketoprofen trong huyết tương bằng kỹ
thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
3. Đánh giá sinh khả dụng in vivo của viên nén TDKD ketoprofen
200mg.

3

Chương 1
TỔNG QUAN

1.1. Một sô phương pháp phân tích dùng đê đánh giá chất lượng
thuốc viên
1.1.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao [5], [9], [18], [21]
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (high performance liquid chromatography)
còn gọi là sắc ký lỏng cao áp hay sắc ký lỏng hiện đại ra đời vào những năm
cuối 1960. Nó được xây dựng và phát triển không ngừng và ngày càng thể
hiện rõ tính ưu việt của nó đặc biệt là trong lĩnh vực nghiên cứu sinh dược học
của thuốc.
Trong phân tích sinh dược học và kiểm nghiệm, người ta hay sử dụng
phương

pháp

sắc

ký

lỏng

phân

bố

pha

liên

kết

(Bonded

phase

chromatography).
* Đ ặc điểm của phương pháp.
Trong sắc ký lỏng phân bố pha liên kết, pha tĩnh được gắn hoá học( liên
kết) với chất mang (silicagel) tạo nên hợp chất cơ siloxan.

I

— Si— OH
I

+

“ 3

C l— Si— R -------►
L

ch3

J.

í ”3

— S i— o — Si— R
I
1

ch3

Nhóm silanol

Dẫn chất

Dẫn chất

của silicagel

clorosilan

siloxan

-

+ HC1

Nếu R là một nhóm ít phân cực như octyl (Cg), octadecyl (C18) hay

phenyl và dung môi phân cực như methanol, acetonitril thì có sắc ký pha đảo
(sắc ký pha ngược).


4

- Nếu R là nhóm khá phân cực như alkylamin -(CH^)n- NH2 hay alkyl
nitril -(CH2)n - CN và dung môi là ít phân cực như hexan thì ta có sắc ký pha
thuận.
- Cách chọn pha: thường chọn pha tĩnh có tính phân cực giống các chất
cần tách và khác với pha động.
* M ột sô thông sô đặc trưng của HPLC.
- Thời gian lưu tR (phút) là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào hệ thống
sắc ký đến lúc xuất hiện đỉnh của pic. So sánh thời gian lưu của mẫu thử và
mẫu chuẩn làm trong cùng điều kiện ta sẽ định tính được chất đó.
- Thời gian chết tM (phút) là thời gian lưu của một chất không bị lưu giữ
(tức là chất có tốc độ bằng tốc độ di chuyển trung bình của các phân tử dung
môi khi đi qua cột).
- Thừa số dung lượng k ’ dùng để mô tả tốc độ di chuyển của một chất.
t'

7»_ 1 R

_

t —1tM

1R

Thừa số chọn lọc oc : Mô tả tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất.
a

=

ìc'B t ,R,B

K
k'
t'1 R, A
a A

—- -

Quy ước B là chất bị lưu giữ mạnh hơn A nên a >1. Để tách riêng 2 chất
thì a > l , thường là từ 1,05- 2,0.
- Số dĩa lý thuyết N : Biểu thị hiệu lực cột sắc ký.
7V = 16

Trong đó : W B

r V
X

í .
h o ặ c N = 5,54

\2

X

: chiều rộng pic ở đáy pic

W 1/2 : chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh
- Độ phân giải R s: là đại lượng đo mức độ tách hai chất trên một cột sắc

5

t R,A

ịiK+ir,)

Để tách riêng 2 chất, R s phải > 1(khi hai sắc đồ có độ lớn cùng cỡ).
- Giới hạn phát hiện (LOD): Được tính bằng tỷ số giữa tín hiệu của pic
cần quan tâm s và nhiễu đường nền N.
S = 3N
Trong đó:
s

: Chiều cao pic của thành phần cần quan tâm trong sắc ký đồ của
dung dịch chuẩn.

N

: Giá trị tuyệt đối của chiều cao nhiễu lớn nhất lệch khỏi đường
nền trong khoảng sắc đồ thu được khi tiêm dung dịch mẫu trắng.

- Chiều cao pic hay diện tích pic là đại lượng đặc trưng cho định lượng
của chất. Khi so sánh chiều cao pic hay diện tích pic của mẫu thử và chuẩn
trong cùng điều kiện làm ta tính được hàm lượng hoạt chất trong mẫu thử.
* Cách tính kết quả trong phương pháp HPLC
- Phương pháp chuẩn ngoại (External Standard method):
Nồng độ chất cần định lượng được xác định bằng cách so sánh đáp ứng
(diện tích hoặc chiều cao pic) của dung dịch thử với đáp ứng thu được của
dung dịch chuẩn.
- Phương pháp chuẩn nội (Internal Standard method):

Hòa tan chất cần định lượng (chuẩn hoặc thử) và chất chuẩn nội với một
lượng bằng nhau. Nồng độ chất thử được xác định bằng cách so sánh tỉ số giữa
chiều cao hay diện tích pic của chất cần định lượng và chuẩn nội của dung
dịch thử và dung dịch chuẩn.
- Phương pháp chuẩn hóa (Normalisation procedure):


6

Hàm lượng phần trăm chất định lượng được tính bằng cách bằng % diện
tích pic của chất đó chia cho tổng diện tích các pic, trừ pic dung môi, thuốc
thử và pic thấp hơn giới hạn phát hiện.
- Phương pháp đường chuẩn (Calibration procedure):
Lập mối quan hệ giữa đáp ứng (diện tích hoặc chiều cao pic) y và lượng
chất X trong dãy dung dịch chuẩn. Tính kết quả của chất phân tích dựa trên đồ
thị của mối quan hệ giữa y vào X. Yêu cầu đáp ứng của dung dịch định lượng
phải nằm trong khoảng đáp ứng của dãy dung dịch chuẩn.
Trong phân tích sinh dược học ta hay sử dụng cách tính kết quả theo
phương pháp đường chuẩn.
1.1.2.

Phương pháp thử độ hòa tan (dissolution test) [5], [8], [9], [27], [29]

Phương pháp thử độ hoà tan được áp dụng để đánh giá độ hòa tan của
viên nén, cốm, viên nang, viên đặt, dịch treo, gel, kem và thuốc mỡ...
Tốc độ hòa tan của dược chất được biểu thị bằng phương trình NoyesNernst:
dC
dt

D.A.(CS - c )

h.v

dC/dt

: tốc độ hòa tan

D

: hệ số khuếch tán

A

: diện tích bề mặt của chất rắn hòa tan

Cs

: độ tan bão hòa của dược chất ở lớp dung dịch trên
bề mặt chất rắn

c

: nồng độ chất tan trong dung dịch ở thời điểm t

h

: bề dày của lớp khuếch tán

V

: thể tích môi trường hòa tan

Phần trăm dược chất hòa tan tại thời điểm t có thể tính theo công thức:
%w.

w

=^xioo
K

Wt,Woo là số gam dược chất trong dung dịch ở thời điểm t và 00.


7

Để mô tả % hòa tan dược chất theo thời gian của phép thử độ hòa tan in
vitro của viên nén hoặc viên nang, người ta có thể dùng phân bố log-normal.
Phân bố này tuân theo động học bậc nhất:
ln(100 — %Ft ) = a — k.t
Ft = % hoạt chất giải phón
theo thời gian
t

= Thời gian

k

= Độ dốc

t

Hình 1.1: Phân bố log-normal
Các vếu tô ánh hương tới phép thử đỏ hòa tan [4]
Có 6 nhóm chính:
- Các yếu tố liên quan tới đặc tính hóa lý của dược chất như: dạng kết
tinh, độ hòa tan của dược chất.
- Các yếu tố liên quan đến công thức sản xuất của thuốc: tá dược, kích
thước hạt, phương pháp xát h ạ t ...
- Các yếu tố liên quan tới dạng bào chế: qui trình sản xuất, kích thước
hạt, tương tác dược chất -tá dược, lực nén, độ rã, điều kiện bảo quản...
- Các yếu tố liên quan tới thiết bị thử độ hòa tan: tốc độ khuấy, độ rung,
cách lấy mẫu, vị trí lấy mẫu, vị trí của chế phẩm, loại thiết bị...
- Các yếu tố liên quan tới các thông số thử độ hòa tan: môi trường hòa
tan, nhiệt độ ...
- Các yếu tố khác: độ hấp thụ, độ ẩm, sai số phát hiện...
Các thiết bi thử đô hòa tan
Các thiết bị thử độ hòa tan hay dùng:
- Thiết bị rổ quay (Rotating basket apparatus): Thường dùng để đánh giá
độ hòa tan của nang cứng, viên nén có tỷ trọng thấp, rã chậm.


8

- Thiết bị cánh khuấy (Paddle apparatus): Dùng cho hầu hết các loại viên
nén.
- Thiết bị dòng chảy (Flow-through cell apparatus): Dùng cho dược chất
ít tan.
Ngoài ra, tùy từng trường hợp cụ thể mà thiết bị có sử cải tiến cho phù
hợp với từng chế phẩm như phương pháp cánh khuấy dùng hai loại dung môi
không trộn lẫn vào nhau (Paddle method using organic as receivor).
1.1.3. Phương pháp quang p h ổ u v ỉ I VIS[2], [5]

Phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến dựa trên sự hấp thụ năng lượng
các bức xạ tử ngoại khả kiến làm thay đổi mức năng lượng của điện tử do đó
nó còn được gọi là phổ điện tử.
Đ ại lượng đặc trưng
Độ hấp thụ án h sáng A (mật độ quang D hay độ tắt E)
Độ hấp thụ A: của một dung dịch là logarit thập phân của nghịch đảo độ
truyền quang T khi cho ánh sáng đơn sắc đi qua. Nó được biểu thị bằng
phương trình:
A = log.o

1
------T

= log ,0

lo
------I

Trong đó:
I

: Cường độ ánh sáng đơn sắc sau khi đã truyền qua dung dịch

I0 : Cường độ ánh sáng đơn sắc tới.
T

: Độ truyền quang

Nếu không kể đến sự có mặt của các yếu tố hoá lý, độ hấp thụ A tỷ lệ với
độ dài quang trình d của ánh sáng truyền qua dung dịch ( độ dày lớp dung

dịch) và nồng độ c của dung dịch chất khảo sát được biểu thị bằng phương
trình:
A = £ X c X d


9

Trong đó £ là độ hấp thụ mol khi d được biểu thị bằng cm và c biểu thị
bằng nồng độ mol.
A(\%-,\cm) =

=

M

E\

Trong đó, M là trọng lượng phân tử của mẫu thử.
A (1%; 1cm): độ hấp thụ riêng của một chất tan là độ hấp thụ của dung
dịch chất tan ở nồng độ 1% (kl/tt) trong một cốc đo có chiều dày 1 cm; đo ở
một bước sóng xác định; ở nhiệt độ 19 - 21°c.
* Các yếu tô ảnh hưởng đến độ hấp thụ ánh sáng
♦> Các yếu tố thuộc về cấu trúc phân tử
- Hiệu ứng cảm ứng
- Hiệu ứng không gian.
❖ Các yếu tố thuộc về môi trường
- Dung môi:
Dung môi có thể hấp thụ các bức xạ u v - VIS. Trong trường hợp này,
phải mở rộng khe sáng để tăng cường độ sáng; nhưng khi mở rộng khe sáng,
tia sáng kém đơn sắc đi và độ nhạy của phép đo giảm.

Mỗi dung môi dùng cho bức xạ u v - VIS thường chỉ dùng với một
khoảng bức xạ nhất định.
-

Tương tác giữa hai lưỡng cực (Dipole - Dipole):

Khi dùng dung môi lưỡng cực như nước, methanol, acetonitril

nếu

chất thử cũng là chất lưỡng cực thì có tương tác Dipole - Dipole xuất hiện.
Tương tác này có ảnh hưởng:
+ Khoảng cách chuyển dịch 71 —> n* ngắn lại do đó bước sóng của bức xạ
hấp thụ cực đại tăng lên (hiệu ứng bathochromic).
+ Khoảng cách chuyển dịch 7X—> TU* mở rộng ra do đó bước sóng của bức
xạ hấp thụ cực đại ngắn lại (hiệu ứng hypsochromic).

%


10

Vậy khi thay đổi dung môi bước sóng bức xạ hấp thụ cực đại thay đổi
theo tức là có sự chuyển dịch của cực đại hấp thụ.
-

pH: Tuỳ chất thử có tính acid hay base mà pH của dung môi có ảnh

hưởng làm chuyển dịch cực đại hấp thụ về phía bước sóng ngắn hay bước sóng
dài.

* Các kỹ thuật định lượng dùng quang p h ổ hấp thụ u v - VIS
❖ Đo phổ trực tiếp
Đo độ hấp thụ A của dung dịch ở bước sóng cực đại và tính nồng độ c
của dung dịch dựa vào E\ (hoặc s) biết trước.

c%=-4
E\

♦> Phương pháp so sánh: đo độ hấp thụ Ax, Ac của dung dịch thử có nồng
độ Cx (chưa biết) và của dung dịch chuẩn có nồng độ Cc (đã biết).
Ax x C c

c'X = ----- --------A.c
♦♦♦Phương pháp thêm: đo độ hấp thụ Ax của dung dịch cần tìm nồng độ
Cx. Thêm một lượng chất tan a ứng với nồng độ C0 (đã biết) vào dung
dịch, đo độ hấp thụ A'x của dung dịch tạo thành.

Ax X c 0

c =
A'x - Ax
♦> Phương pháp đường chuẩn: pha 5 đến 8 dung dịch chuẩn, đo độ hấp
thụ A của chúng ở bước sóng đã chọn. Lập đồ thị của A theo c. Đo Ax
của dung dịch thử và xác định Cx dựa vào đường chuẩn.


11

Hình 1.2. Minh họa cách tính kết quả theo phương pháp đường chuẩn
❖ Phương pháp chuẩn độ đo quang: phát hiện điểm tương đương bằng

phương pháp đo quang.
X
(chất thử)

+

R

-»

(thuốc thử)

p
(sản phẩm)

Trong ba chất trên, ít nhất phải có một chất hấp thụ ánh sáng ở bước sóng
khảo sát. Tại điểm tương đương, xuất hiện điểm gãy của đồ thị biểu diễn sự
biến thiên độ hấp thụ A của dung dịch.
1.2. Vài nét về Ketoprofen
1.2.1. Tính chất [8], [9], [18]:
CH3

C H ------COOH


12

- Phân tử lượng: 254,29
- Tên khoa học: 2 (- benzoyl phenyl) propionic acid
- Tính chất:

Bột kết tinh trắng, không mùi. Thực tế không tan trong nước ở 20°c, tan
hoàn toàn trong kiềm mạnh, ethanol 96%, aceton, cloroform và ether. pKa =
5,94 trong hỗn hợp methanol - nước (3:1). Hệ số phân bố trong n- octanol nước là 0,97 (pH = 7,4). Cực đại hấp thụ trong methanol ở bước sóng 255 nm.
Nhiệt độ nóng chảy khoảng 95°c.
1.2.2. Tác dụng dược lý và dược động học [6], [24], [25] [28]:
- Tác dụng: ketoprofen là thuốc chống viêm phi steroid có tác dụng hạ
nhiệt, giảm đau, chống viêm; có tác dụng ức chế quá trình tổng hợp
prostaglandin và leukotriene; ức chế sự kết dính tiểu cầu.
- Hấp thu: dạng viên qui ước và viên TDKD khác nhau ở đặc tính giải
phóng hoạt chất. Viên qui ước ketoprofen giải phóng hoạt chất nhanh ở dạ
dày, còn viên TDKD điều khiển sự giải phóng hoạt chất ở pH cao hơn (trong
ruột).
Thức ăn ảnh hưởng lớn tới thời gian hấp thu của thuốc nhưng sinh khả
dụng (AUC) không thay đổi. Sinh khả dụng tuyệt đối của dạng viên qui ước và
giải phóng kéo dài khoảng 90%.
Dạng viên qui ước, ketoprofen được hấp thu tốt và nhanh, thời gian đạt
nồng độ cực đại trong máu là từ 0,5 đến 2 giờ. Sau khi uống viên ketoprofen
200mg TDKD thời gian đạt nồng độ cực đại trong máu khoảng 7 giờ, nồng độ
cực đại trung bình khoảng 3,4 mg/1; nồng độ duy trì ở ở mức khá cao sau khi
uống 24 giờ. Khoảng điều trị khoảng 0,4 - 6 mg/1
- Chuyển hoá: chủ yếu, liên kết với acid glucuronic tạo thành acyl glucuronic không ổn định. Một nửa chất chuyển hoá có thể chuyển lại thành
dạng hợp chất ban đầu do đó chuyển hoá cung cấp dạng chất có hiệu lực.


13

- Thải trừ: Sau khi uống viên ketoprofen, 50 - 90% được thải trừ qua nước
tiểu, 1 - 8 % thải trừ qua phân. 80% thải trừ qua thận ở dạng liên kết
glucuronic; thời gian bán thải của dạng viên qui ước là 2 - 4 giờ, dạng viên
TDKD là từ 4 -7 giờ. Đối với người lớn tuổi, hấp thu không thay đổi, thời

gian bán thải kéo dài và giảm sự thanh thải toàn phần. Ở người suy gan và
thận, giảm độ thanh thải huyết tương và tăng thời gian bán thải.
1.2.3. C hỉ định [6], [24], [25], [28]:
- Thấp khớp mãn tính, đặc biệt viêm đa khớp dạng thấp.
- Thoái hoá khớp nặng.
- Dạng viên nang còn dùng để giảm đau.
1.2.4. Chông chỉ định [6], [24], [25], [28]:
- Dị ứng với ketoprofen, aspirin và các thuốc chống viêm phi steroid
cùng loại.
- Loét dạ dày - tá tràng tiến triển.
- Suy thận nặng, suy gan tế bào nặng.
- Phụ nữ có thai (3 tháng cuối) và cho con bú.
1.2.5. Tác dụng không mong muốn [6], [24], [25], [28]:
- Đường tiêu hoá, khó chịu vùng dạ dày ruột, đau dạ dày, buồn nôn, nôn
mửa, tiêu chảy; nặng thì loét dạ dày, xuất huyết đường tiêu hoá, thủng ruột.
- Nhức đầu, chóng mặt, buồn ngủ.
1.2.6. Liều dùng [6], [24], [25], [28]:
- Viên nang: Viên 75 mg, lviên/lần X 3 lần/ngày. Viên 50 mg, 1 viên/lần
X 4 lần/ngày. Uống trong bữa ăn.
- Viên TDKD: Viên 200 mg, 1viên/ngày. Uống vào bữa ăn.
1.2.7. D ạng bào c h ế [6], [28]:


14

- Viên nang 25 mg; 50 mg; 75 mg.
- Viên nén 100 mg; 150 mg.
- Viên bao tan ở ruột 50 mg.
- Viên bao TDKD 200mg.
- Viên nang TDKD 100 mg; 150 mg; 200mg.

- Thuốc tiêm 100 mg.
- Thuốc mỡ 2,5%.
1.2.8. Các phương pháp định lượng
Phương pháp định lượng ketoprofen dạng nguyên liệu và dạng bào
chê :
- Phương pháp acid - base: định lượng ketoprofen nguyên liệu. Dung dịch
chuẩn độ là natri hydroxyd 0,1N; xác định điểm tương đương bằng chỉ thị đỏ
phenol hoặc bằng phương pháp đo điện thế [8], [9], [ 11J, [29].
- Phương pháp HPLC pha đảo: định lượng ketoprofen trong huyết tương
[7], [10], [12], [14], [15], [20J, [22] và xác định tạp chất trong nguyên liệu [9],
[11], [29].
- Phương pháp quang phổ: Ketoprofen có cực đại hấp thụ ở 255 nm trong
Methanol 75%. Phương pháp này được ứng dụng để định lượng ketoprofen
trong chế phẩm bào chế và đánh giá độ hòa tan của viên [9] [24],
- Phương pháp điện di mao quản và điện di mao quản kết hợp với khối
phổ (CE - MS): định lượng ketoprofen trong huyết tương, trong nước tiểu và
tách đồng phân của ketoprofen [12], [13], [30].
Phương pháp HPLC định lượng ketoprofen trong huyết tương
Để đánh giá sinh khả dụng viên ketoprofen, chúng ta phải xác định được
nồng độ thuốc trong máu người sau khi uống thuốc trong một khoảng nồng độ
rất lớn. Do đó phương pháp được lựa chọn phải vừa có khả năng tách, định


15

lượng, có độ nhậy cao, đồng thời đáp ứng được độ chính xác và tin cậy cho
định lượng. Có nhiều tác giả đã sử dụng các điều kiện để định lượng ketoprofen
trong huyết tương bằng phương pháp HPLC, được trình bày ở bảng 1.1.
Bảng 1.1. Các điều kiện định lượng KET trong huyết tương
Tài

liệu
12

D u ng m ôi chiết
ACN

P ha động

C ột

C huẩn nội

Bước sóng
(nm)

ACN - amoni

Econosphere

Isobutyl

254

acetat 20 mM pH

CN 1 5 0 x 4 ,6

m ethylxan-

7,0 (20 : 80)

10

Nước
(Siêu ly tâm)

mm. 10

Diethyl ether

C l8 |_iBondapak

Isopropyl

acetic 1%

300 X 3,9 mm.

phenazon

Diethyl ether

ACN - Đệm

c , 8 ịaBondapak

phosphat 50 raM

300 X 3,9 mm.

ACN - KH2P 0 4

10 mM pH 3,5

15

Ethyl acetat

20

Diethyl ether

c,g Utrasphere
250

X

4,6 mm.

5 |im

ACN - Đệm

Spherisorb ODS
250

X

5 |0.m

ACN -M eO H -

Spherisorb ODS

pH 6,5 (50 : 10 :

263

Calci

254

200

X

fenoprofen

Flurbiprofen

258

A cid 2 (4 —

260

4,6 mm.

(40 : 60)

N a2H P 0 4 10 mM

Naproxen

10 |im

(40 : 60)

phosphat pH 3,2

254

10 |am

pH 7 ,0 (1 0 : 90)
7

thin

ACN — Acid

(38 : 62)
22

|Lim

4,6 mm.

5 I^m

benzoylphen
yl butyric)

135)

1.3. Vài nét về sinh khả dụng
Để đánh giá được chính xác chất lượng của thuốc, người ta phải nghiên
cứu sự giải phóng của dược chất ra khỏi dạng thuốc, sự hấp thu dược chất khi
vào cơ thể, tức là nghiên cứu sinh khả dụng của thuốc.


16

1.3.1. Các khái niệm cơ bản
Sinh khá dung [16], [17], [19], [23]:
Sinh khả dụng là mức độ và tốc độ hấp thu của hoạt chất từ dạng bào ch ế
của nó vào đại tuần hoàn.
-

Mức độ hấp thu được xác định bằng diện tích dưới đường cong (Area

Under Curve, AƯC) của đường biểu diễn nồng độ dạng hoạt tính trong máu
biến đổi theo thời gian.
AUC thường được tính theo phương pháp hình thang:

AUC = Ị; ỵ ( T „ , - T l) x ( C l + C M) + - ị 2 to
k
Trong đó:
Cj :

là nồng độ dược chất trong huyết tương ở thời điểm Tị.

Cn :

là nồng độ dược chất trong huyết tương đo được tại thời điểm cuối
cùng.

k

: là hằng số tốc độ thải trừ.
.

0,693

« = _—
T1 / 2

T 1/2 là thời gian bán thải của thuốc (thời gian cần thiết để nồng độ thuốc
trong máu giảm 50%) được xác định bằng đồ thị bán logarit của nồng độ dược
chất trong máu của pha thải trừ theo thời gian.
Thông thường thời gian lấy mẫu > 10 T i r tùy theo từng thuốc.
Việc theo dõi nồng độ thuốc trong máu rất quan trọng vì giữa nồng độ
thuốc trong máu và hiệu lực điều trị có liên quan chặt chẽ với nhau. Ta phải
biết được nồng độ thuốc trong máu để đảm bảo thuốc nằm trong khoảng phát
huy hiệu lực điều trị và dưới mức độc để chỉ định liều dùng và tần xuất sử
dụng thuốc hợp lý.


4- Tốc độ hấp thu của thuốc được xác định bằng nồng độ cực đại Cmax
thuốc trong máu và thời gian đạt được nồng độ cực đại Tmax.
Thuốc tác dụng kéo dài thường nằm trong đường tiêu hóa trong thời gian
dài, vì vậy môi trường hấp thu (dịch trong đường tiêu hóa) có ảnh hưởng lớn

tới các giá trị SKD.
1.3.2. Xác định SKD in vỉvo của thuốc [16], [23], [29]
Đối tương thử:
- Động vật: Thuốc mới, thuốc đang nghiên cứu thường được thử sơ bộ
trên động vật như chó, khỉ, thỏ, chuột ... tuỳ theo dạng bào chế trước khi thử
trên người.
- Người tình nguyện khoẻ mạnh:
+Tuổi: 18 - 50. Nếu là nữ phải kiểm tra để đảm bảo họ không mang thai
khi tham gia nghiên cứu.
+ Kiểm tra sức khoẻ: thể trạng, tiền sử bệnh tật, các phép thử lâm sàng
(huyết áp, nhịp tim,...)
+ Không được hút thuốc, không uống rượu, không dùng thức ăn và đồ
uống chứa xanthin trước khi thử ít nhất 48 h và đến khi phép thử hoàn tất.
+ Không được chụp X- quang trước khi thử ít nhất 2 tuần và đến khi phép
thử hoàn tất.
Mô hình thử thuốc liều đơn:
- Người thử phải nhịn 10 giờ trước và 4 giờ sau khi dùng thuốc. Uống
thuốc với 240 ml nước.
- Nước có thể được dùng ít nhất là trước và sau khi dùng thuốc 1 giờ.
- Thức ăn được tiêu chuẩn hoá và cho các cá thể thử dùng với lượng như
nhau.
- Thời gian giữa hai lần thử thuốc phải đủ để thuốc được thải trừ hoàn
toàn khỏi cơ thể. Thời gian tối thiểu là 10 lần thời gian bán thải của thuốc .
- Nếu là đánh giá tương đương sinh học: Thử theo mô hình chéo ngẫu
, two periods, two sequences crossover).


18

Lấy mẫu

Mẫu máu được lấy từ mạch máu tại thời điểm 0 và ít nhất là 4 lần ở pha
hấp thu và 6 lần ở pha thải trừ sau khi dùng thuốc. Máu được để lạnh ngay sau
khi lấy mẫu, sau đó ly tâm và để lạnh — 30° c tới khi phân tích.
Theo dối các cá thể
Các cá thể được đo huyết áp, đếm nhịp tim llần / giờ.
Phân tích mẫu máu
Dùng các phương pháp phân tích thích hợp để định lượng hoạt chất trong
mẫu thử. Đường chuẩn dùng để tính kết quả phải được xây dựng theo từng
ngày phân tích.
Các sô liêu nghiên cứu
Tính AUC, tmax, Cmax
1.3.3. Sinh khả dụng của thuốc viên nén
Thuốc viên nén là dạng thuốc chiếm tỷ lệ lớn trong số các thuốc dùng
thoe đường uống. Khi được đưa vào cơ thể, nó trải qua các giai đoạn giải
phóng, hòa tan, hấp thu và được biểu diễn theo sơ đồ sau:

Hình 1.2. Sơ đồ giải phóng hoạt chất của viên nén
theo John G. W agner [4], [27]