Nghiên cứu định lượng các hoạt chất pyridoxin hydroclorid naphazolinnitrat chlorpheniramin maleat và phanthenol trong một số thuốc nhỏ mắt đa thành phần bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Bộ YTẾ

Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

hoàng mỹ hường

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG CÁG HOẠT c HẤT
PYRIDOXIN HYDROCLORID, NAPHAZOLIN NITRAT,
CHLORPHENIRAMIN MALEAT VÀ PANTHENOL
TRONG MỘT SỐ THUỐC NHỎ MẮT ĐA THÀNH PHẦN
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC Ký LỎNG HIỆU Nă NG CAO (HPLC)

LUẬN
ÁN THỌC
SV
•
•

Dược
HỌC
•
•

^ ỉttn jê n n ụ à n h : ~Kỉểni m jíiiè iit íliiríe p li ẩ tn Oil itò í' ehíYt ito e

Jtlã s ấ : 3 .0 2 .0 5

NCÌƯỜI HƯỚNÍ Ỉ D Ẫ N K flO A HỌC ;
TS. THIÍI PHHN ỌUVNH NHƯ

íĩ '

TS. TR.ÍNH VÌỈN LRU

>. ' 'í ^

0 'ỹ

HÀ NỘI - 2000


MỤC LỤC
Trang
Đặt vấn đề

1

Chương 1 : Tổng quan
1.1.
Tổng quan về các hoạt chất pyridoxin hydroclorid,
naphazolin nitrat, chlorpheniramin maleat, panthenol
và phương pháp định lượng.
1.1.1. Pyridoxin hydroclorid
1.1.2. Naphazolin nitrat
1.1.3. Chlorpheniramin maleat
1.1.4. Panthenol
1.2.
Một số chương trình HPLC đã áp dụng để định lượng chế
phẩm đa thành phần có chứa pyridoxin hydroclorid,
naphazolin nitrat, chloipheniramin maleat, panthenol bằng

HPLC.
1.2.1. Một số khái niệm cơ bản về phưcmg pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao (HPLC).
1.2.1.1. Một số đại lượng đặc trưng
1.2.1.2. Phân loại các kỹ thuật HPLC và ứng dụng
1.2.1.3. Cách đánh giá píc (Diện tích và chiều cao) và các
phương pháp định lượng thường dùng trong HPLC
1.2.2. Một số chương trình HPLC định lượng 4 hoạt chất
pyridoxin
hydroclorid,
naphazolin
nitrat,
chlorpheniramin maleat, panthenol.
1.2.2.1 Một số công thức nhỏ mắt trên thị trường có chứa
thành phần pyridoxin hydroclorid, naphazolm nitrat,
chlorpheniramin maleat, panthenol.
1.2.2.2 .Một số chương trình HPLC định lượng 4 hoạt chất
pyridoxin
hydroclorid,
naphazolin
nitrat,
chloipheniramin maleat, panthenol.

3
3

Chương 2 : Đối tượng, nội dungvà phương pháp nghiên cứu
2.1. Đối tượng nghiên cứii
2.2. Hoá chất dụng cụ
2.3. Nội dung, phương pháp nghiên cứu

3
6
8

10
11

11
12
15
19
20

20

22

31
31
32
33


2.3.1.

Khảo
sát lựa chọn điềukiện sắc ký chương trình sắc ký 34
1: Định lượng pyridoxin hydroclorid, naphazolin nitrat,
chlorpheniramin maleat

2.3.2. Khảo
sát lựa chọn điềukiện sắc ký chương trình sắc ký 34
2: Đinh lượng panthenol
2.3.3. Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng đồng thời
35
pyridoxin
hydroclorid,
naphazolin
nitrat,
chlorpheniramin maleat, panthenol trong thuốc nhỏ mắt
đa thành phần
2.3.4. Đánh
giá khả năng ứngdụng thực tiễn của phương pháp 36
đinh lượng đã nghiên cứu
Chương 3 : Kết quả - Biện luận
3.1. Kết quả khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký thích hợp định
lượiìg 4 thành phần
3.1.1. Chương trình sắc ký 1; Đinh lượng đồng thời pyridoxin
hydroclorid, naphazolin nitrat, chlorpheniramin maleat
3.1.2. Chương trình sắc ký 2: Định lưọmg đồng thời Panthenol
3.2. Xác định độ ổn định của hệ thống sắc ký
3.3. Xác định khoảng tuyến tính của phương pháp định lượng
3.4. Xác định độ lặp lại của phương pháp
3.5. Xác định độ đúng của phương pháp xây dimg
3.6. Xây dựng phương pháp định lượng pyridoxin hydroclorid,
naphazolin nitrat, chlorpheniramin maleat
3.7.
Xây dựng phương pháp định lượng panthenol
3.8.
Áp dụng phương pháp định lượng để định lưọmg một số

mẫu đang lưu hành

37
37
38
41
43
44
46
49
52
53
55

Chương 4 : Kết luận - Đề nghị

58

Tài liệu tham khảo

61

Phụ lục


DANH MỤC
CÁC CHỮ VIẾT TẮT sử d ụ• n g t r o n g lu ậ•n á n
•
DT

Diện tích

ĐKSK

Điều kiện sắc ký

H PLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

mg%

mg/lOOml

nm

N anom et

SKS

Số kiểm soát

TCCS

Tiêu chuẩn cơ sở

TRA PHA CO

Công ty Dược phẩm và thiết bị vật
Bộ Giao thông vận tải

XNDPTW 2

X í nghiệp Dược phẩm Trung ưưiig

UV-VIS

Tử ngoại khả kiến
M icrom et

ịim

mcg

:

M icrolit

:

M icrogam


1

ĐẶT VẤN ĐỂ

Trong những năm gần đây, các thuốc đa thành phần có tác dụng dược lý
phối hợp được sản xuất, lưu hành và sử dụng rộng rãi trên thế giới cũng như ở
nước ta. Thuốc nhỏ mắt đa thành phần là một loại điển hình, ngày càng được

ưa dùng nên đã có nhiều biệt dược được sản xuất và lưu hành như : V-Rohto;
Tobiorb; Rohto-kodomo soft.; Naphacollyre; Rohto-Antibacteri. Thành phần
của các thuốc nhỏ mắt loại này thường có tối thiểu bốn hoạt chất trong số các
chất sau : kháng sinh hoặc sulfamid diệt khuẩn, nấm, virut (chloramphenicol,
gentamicin, natri sulfacetamid); kháng histamin (chorpheniramin); giảm nhãn
áp (neostigmin); co mạch ngoại vi, giảm sung huyết

(naphazolin, tetra

hydrozolin); dinh dưỡng giác mạc (pyridoxin, panthenol..).
Gần đây một số nhà sản xuất trong nước cũng đã nghiên cứu bào chế
thuốc nhỏ mắt (APOL của TRAPHACO, VIRONDO của XNDPTW2) với
công thức chứa các thành phần sau : Panthenol, naphazolin nitrat, pyridoxin
hydroclorid, chlorpheniưamin maleat
Trong các chuyên luận của các dược điển hiện nay mới chỉ có đinh tính,
định lượng riêng biệt từng thành phần trong các chế phẩm đơn thành phần
bằng các phương pháp như phương pháp thể tích, phương pháp đo thế [19]
[20][21][27][28][29][30][31][35][38][40][41][42][43][44], phương pháp đo
quang hoặc tạo mầu rồi đo quang [22][30][35][36]40][42][44], phương pháp
HPLC [36][38] hay phương pháp sắc ký khí [22]. Việc định lượng các thành
phần trong các chế phẩm đa thành phần bằng các phưomg pháp như trên đều
có nhược điểm tốn thời gian và công sức, dễ mắc sai số do phải chiết tách
phức tạp hoặc pha loãng quá nhiều lần, trong một số trường hợp nhiều khi
kliông tiến hành được do ảnh hưỏmg của tá dược.
Trong một số công trình đăng trên các sách, tạp chí và thông báo kiểm
nghiệm của Viện kiểm nghiệm có đề cập tới phản tích một số dạng thuốc đa
thành phần có chứa một số thành phần như đã nêu. Nhưng chúng tôi chưa
thấy có tài liệu nào đề cập một phương pháp có thể định lượng bốn thành
phần chính như trong thuốc nhỏ mat APOL và VIRONDO. Cũng có một số
công trình về phương pháp HPLC để định lượng các thành phần đã nêu, tuy

2
nhiên về mặt này hay mặt khác, việc áp dụng ở các phòng thí nghiệm của ta
hãy còn trở ngại. Do vậy, việc kiểm tra, quản lý, giám sát chất lượng các chế
phẩm có các thành phần như trên gặp rất nhiều khó khăn. Qua phân tích cấu
trúc, tứửi chất hoá lý của các thành phần chúng tôi nhận thấy có khả năng
phân tách chúng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Đổng
thời, việc áp dụng các phương pháp phân tích hiện đại với sự trợ giúp của máy
móc thiết bị đã trở thành xu hướng chung của ngành phân tích các nước trên
thế giới và trong khu vực nên chúng tôi chọn phương pháp HPLC là phương
pháp thích hợp để phân tích trực tiếp các thành phần đã nêu ở trên.
Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn của công tác kiểm nghiệm phục vụ việc
đảm bảo chất lượng thuốc sản xuất trong nước và thuốc ngoại nhập đang luu
hành trên thị trưcmg chúng tôi đã tiến hành đề tài : ‘Nghiên cứu định lượng
pyridoxin hydroclorid, naphazolin n itrat, chlorpheniram in

m aleat,

panthenol trong thuốc nhỏ m ắt đa thành phần bằng phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao” với mong muốn rằng phương pháp phân tích định lượng
bốn thành phần đã nêu trong thuốc nhỏ mắt đa thành phần này sẽ trở thành tài
liệu thường quy để có thể áp dụng định lưọng các thành phần trong các chế
phẩm mà có chứa những thành phần nêu trên.
Để giải quyết mục tiêu trên chúng tôi tiến hành các nội dung sau :
♦ Nghiên cứu, khảo sát, lựa chọn các điều kiên sắc ký thích hợp để đừứi
lượng trực tiếp pyridoxin, hydroclorid, naphazolin nitrat, chlorpheniramin
maleat, panthenol.
♦ Xác định độ ổn đinh của hệ thống sắc ký.
♦ Xác định khoảng tuyến tính của phương pháp.

♦ Xác định độ lặp lại của phương pháp.
♦ Xác định độ đúng của phương pháp.
♦ Xây dựng phương pháp đinh lượng pyridoxin hydroclorid, naphazolin
nitrat, chlorpheniramin maleat, panthenol trong thuốc nhỏ mắt đa thành
phần bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.
♦ Đánh giá khả năng ứng dụng thực tiễn của phương pháp bằng cách áp dụng
phương pháp vào định lượng một số mẫu đang liru hành.


3

Chương I

TỔNG QUAN

1.1. TỔNG QUAN VỂ CÁC HOẠT CHÂT PYRIDOXIN HYDROCLORBD,
NAPHAZOLIN

NưRAT,

CHLORPHENIRAMIN

MALEAT,

PANTHENOL VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG

1.1.1. Pyridoxin hydroclorid [23][38]
Cấu trúc hoá học

*

HO.

CH3

HO
. HCI

HO
CgHuNOj. HCl

PTL : 205,64

T ên k h o a học:

5-Hydroxy-6-Meứiylpyridin-3,4-Dimetìianol hydroclorid

T ín h c h ấ t :

- Bột kết tinh trắng hoặc gần trắng
- Nóng chảy ở 205°c kèm phân huỷ
- Tan trong 5 phần nước
- Tan trong 100 phần ethanol (96%)
- Thực tế không tan trong cloroform và ether
-Phổ tử ngoại [25]

+ Dung dịch 0,001% trong dung dịch acid hydrocloric 0,1M có cực đại
ở bước sóng từ 288nm đến 296nm với E( 1%, 1cm) từ 425 đến 445.

4
+ Dung dịch 0,001% trong dung dịch đệm phosphat chuẩn 0,025M có 2
cực đại ở bước sóng từ 248nm đến 266nm với E (l% ,lcm ) từ 175 đến 195 và
ở 320nm đến 327nm với E (l% ,lcm ) từ 345 đến 365.

Phương pháp định lượng :
Tuỳ theo pyridoxin hydroclorid ở dạng nguyên liệu hoặc thành phẩm
mà người ta sử dụng các phương pháp định lượng cho thích hợp.
- Đối với pyridoxin hydroclorid dạng nguyên liệu:
Dược điển Anh BP 1993 [23], Dược điển Châu Âu 1997 [29], Dược điển
Nhật 1996[44], Dược điển Ấn Độ 1996 [32], Dược điển Trung Quốc 1997 [42]
... định lượng bằng phương pháp chuẩn độ trong môi trường khan . Hoà tan
một lượng chế phẩm trong acid acetic khan và thêm một lưọfng nhất định
dung dịch thuỷ ngân II acetat và chuẩn độ bằng dung dịch acid percloric
0,lN.Phát hiện điểm kết thúc của phép định lưọng có thể dùng phương pháp
đo thế hoặc dùng chỉ thị màu là tím tinh thể.
- Để đinh lượng dung dịch tiêm pyridoxin hydroclorid , một số Dược
điển [38],[44] đã dùng phương pháp đo quang phổ dựa trên phản ứng của
pyridoxin với

2,6

- dicloroquinon clorimid trong isopropyl alcol tạo phẩm màu

indophenol, sau đó đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 650nm.
Cl
+

Cl — N:
Cl

H3C

CH, OH


5
Phương pháp này được ứng dụng để định lượng pyridoxin trong dung
dịch tiêm,trong viên nén ,viên nang[38],[44] hoặc trong một số dạng thuốc
multivitamin .
Ngoài ra người ta cũng áp dụng phương pháp đo quang phổ tử ngoại ở
291nm trong môi trường

acid hydrocloric

0 , 1M

để định lượng pyridoxin

trong thuốc tiêm và trong viên nén. Phương pháp này thực hiện đơn giản,
nhanh , nhưng chỉ áp dụng được cho các chế phẩm không chứa các chất phụ
gia có hấp thụ quang làm ảnh hưởng tới định lượng pyridoxm [41] [32].
Trong Dược điển Mỹ 23[38] đã ứng dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao(HPLC) với chương trình sau đây để định lượng pyridoxin hydroclorid ở
dạng nguyên liệu cũng như trong các dạng bào chế khác:
♦ Pha động: Trộn 20ml acid acetic khan với l,2g natri hexansulfonat và
khoảng 1400ml nước trong bình định mức 2000ml.Điều chỉnh pH của dung
dịch đến 3,0 bằng acid acetic hoặc natri hydroxyd IM . Sau đó thêm 470ml
methanol và thêm nước đến vạch , lắc đều và lọc.
♦ Dung dịch chuẩn nội: Hoà tan

acid p-hydroxybenzoic trong pha

động để thu được dung dịch có chứa 5mg acid p-hydroxybenzoic trong Iml
dung dịch chuẩn nội.
♦ Dung dịch thử và chuẩn: Được chuẩn bị sao cho mỗi dung dịch có
chứa khoảng 0,05mg pyridoxin hydroclorid và 0,05mg acid p-hydroxybenzoic
trong Iml pha động.
♦ Tiến hành sắc ký theo chương trình:
Cột sắc ký; Lichrosorb RP
Tốc độ dòng: 1,5ml/ phút.
Detector : ƯV- 280nm

8

( 25cm X 4,6mm,10 Ịim).


6

1.1.2. Naphazolin nitrat [16][36]
Cấu trúc hoá hoc :

. HNO3

c , 4H .,n ,.h n o ,

PTL : 273,3

T ên k h o a h ọ c : 2-(l- naphthyl methyl) -2 - Imidazolin nitrat.

Dạng naphazolin hydroclorid :
’
C,4 H,4 N 2 . HCl
PTL : 24 6,7
T ín h c h a t :
- Bột kết tinh trắng hoặc gần trắng, không màu hoặc gần như không màu.
- Tan được trong nước, tan trong ethanol 96%
- Tan không đáng kể trong cloroform, không tan trong ether.
- Dạng naphazolin hydroclorid tan ụr do trong nước, ethanol 96%
thực tế không tan trong ether.'
- Phổ tỉr ngoại [25]:Trong dung dịch acid sẽ hấp thụ cực đại ở các đỉnh
271, 281, 288, 291nm. ở 281nm có E (l% ,lcm ) là 321.

Phương pháp định lượng :
- Nguyên liệu dạng nitrat hoặc dạng hydroclorid ở các Dược điển đều
dùng phương pháp chuẩn độ trong môi trường khan: Chế phẩm được hoà tan
trong acid acetic khan thêm một lượng nhất định thuỷ ngân acetat và chuẩn


7
độ bằng dung dịch acid percloric 0,1M. Phát hiện điểm kết thúc của phép
đinh lượng có thể dùng phương pháp đo thế hoặc dùng chỉ thị mầu là tím tinh
thể hoặc methyl rosanilin [21][28][36][40][43]. Hoặc chuẩn độ đo kiềm đối
với dạng naphazolin hydroclorid : Hoà tan một lưọmg chính xác chế phẩm
trong một thể tích chính xác dung dịch acid hydrocloric 0,01 M, thêm ethanol
96%. Chuẩn độ bằng dung dịch natri hydroxyd 0,1M. Xác định điểm kết thúc
chuẩn độ bằng phưcfng pháp đo thế [2 1 ].
- Đối với các dung dịch nhỏ mắt, nhỏ mũi chỉ chứa naphazolin
hydrochlorid, một số Dược điển [36] [40] đã tiến hành định lượng bằng
phương pháp đo quang phổ tử ngoại ở bước sóng 280nm, dung môi là nước

hoặc methanol.
- Trong Dược điển Mỹ 23 [36] đã dùng phương pháp sắc ký lỏng để
định lượng dung dịch nhỏ mũi naphazolin hydroclorid đơn thành phần với
chương trình sắc ký sau:
♦ Pha động : Hoà tan 1,1 g natri 1-heptanesulfonat trong 400 ml nước.
Thêm 250 ml acetonitril và 10 ml acid acetic băng, thêm nước vừa đủ 1000
ml, lắc đều, lọc, đuổi khí. pH dung dịch pha động khoảng 3,5.
♦ Dung dịch chuẩn, thử : pha trong dung môi nước sao cho nồng độ
naphazolin hydroclorid chứa trong dung dịch chuẩn và dung dịch thử khoảng
25 mg/ lOOml.
*

♦ Điều kiện tiến hành :
Detetor :ưv 280nm
C ộ t: cột Phenyl, 4mm
Tốc độ dòng: 2ml/phút

X

30cm, 5|im hoặc lOịim. (cột LI 1)


8

1.1.3. Chỉorpheniramin lĩialeat [19][35]
Cấu trúc hoá hoc :

N
CH, . HO

PTL: 390,87

C„H„C1 N ,. C,H,04

Tên khoa học :
2- Pyridinepropanamin, y- (4- chlorophenyl)- N, N - dừnethyl-, (Z) -2butenedioat ( 1 : 1 )
T ín h c h ấ t : - Bột kết tinh trắng, có mùi.
- Tan tự do trong nước, tan trong cloroform, trong ethanol 96%;
tan không đáng kể trong ether.
- Phổ tử ngoại:Trong môi trường acid, đỉnh hấp thụ cực đại là
265nm; E (l% ,lcm )là 302 [25].

Phương pháp định lư ọng:
-

:

Đối với dạng nguyên liệu hầu hết các Dược điển đều dùng phưong

pháp chuẩn độ acid -base trong môi trường khan : Hoà tan một lượng chế
phẩm trong acid acetic khan, có hoặc không có mặt dung dịch thuỷ ngân
acetat, chuẩn độ bằng dung dịch acid percloric 0,1M. Phát hiện điểm kết thúc


9
của phép định lượng có thể dùng phương pháp đo thế hoặc dùng chỉ thị mầu là
methyl rosanilin clorid hoặc tím tinh thể [19] [35] [30] [42].
- Đối với một số dạng như dung dịch tiêm, dung dịch uống (Siro), viên
nén và bột [22][42][30] [35], người ta sử dụng phương pháp đo quang phổ hấp
thụ tử ngoại ở 265nm trong môi trường acid sulfuric (dung dịch 1/350 hoặc

0,25M) hoặc acid hydrocloric (dung dịch 1/100).
- Cũng có thể sử dụng phưomg pháp chiết cặp ion rồi đo quang phổ khả
kiến để định lượng chloipheniramin maleat trong các hỗn hợp: Dựa trên
nguyên tắc tạo cặp ion với methyl da cam (heliantin) ở pH=4,6 và chiết bằng
chloroform rồi xác định mật độ quang ở 422nm.[9]
- Đối với dung dịch uống (Elixir) đơn thành phần chlorpheniramin
maleat , Dược điển Mỹ 23 [22] dùng phương pháp sắc ký khí để định lượng
chlorpheniramin maleat
- Để định lượng chloipheniramin maleat trong dạng viên nang giải
phóng chậm , ƯSP 23 [35] đã áp dụng phương pháp sắc ký lỏng với chương
trình sắc ký như sau:
♦ Pha động : hoà tan 2,0g natri perclorat trong 350 ml nước, thêm
650ml methanol và 2,0 ml triethylamin. Lắc kỹ. Lọc. Đuổi khí.
♦ EXing dịch chuẩii và thử: Pha dung dịch chuẩii và thử frong acid hydrocloric
loãng (1 %) sao cho nồng độ chlorpheniramin maleat khoảng 0 , 12 mg/ml
♦ Điều kiện tiến hành :
Detetor :UV - 261nm
C ộ t: C18, 3,9mm X 15cm,10fim (cột L l)
Tốc độ dòng : Iml/phút
Hoặc có thể sử dụng cột Lichrosorb RP 18 (5|im) với pha động gồm: [6 ]
Acid phosphoric

19,6g

Diethylamin

14,6g

Methanol 10% vừa đủ lOOOml

10
PH pha động khoảng 4,5

1.1.4. Panthenol (Dexpanthenol) [27][20][37]
Cấu trúc hoá học :
H,c

CH3

o

C,H„N04

PTL: 205,26

Tên khoa học :
(R) - 2,4- dihydroxy - N- (3-hydroxy propyl) -3,3- dimethyl Butyramid.
T ín h c h ấ t :
- Chất lỏng sánh không màu hoặc vàng nhẹ hoặc bột kết tinh.
- Tan trong nước, tan tự do trong ethanol (96%), tan không đáng kể
trong ether.
- Phổ tử ngoại: Panthenol không có sự hấp thụ đáng kể ở 230 - 260nm,
mà hấp thụ ở vùng bước sóng ngắn 198-205nm[25].

Phương pháp định lượng

:

- Một số Dược điển đã định lượng panthenol ở dạng nguyên liệu bằng

phương pháp định lượng trong môi trường khan [20] [27]:
Cân chính xác khoảng 0,4g panthenol và chính xác 50ml acid percloric
0,1M, đun hồi liru tránh ẩm trong 5 giờ. Thêm 50ml 1,4- dioxan,thêm 0,2ml
chỉ thị mầu là dung dịch naphtolbenzein. Chuẩn độ bằng kali hydrophtalat.
Cũng có thể dùng chỉ thị tím tinh thể.[37].


11
Dược điển Ấn độ 1996 định lượng nguyên liệu panthenol bằng phương
pháp xác định hàm lượng nitơ toàn phần. Nguyên tắc và tiến hành cũng giống
Dược điển Việt Nam 2-tập 3: Xác đinh hàm lượng amoniac trong amonisulfat
thu được khi vô cơ hoá hợp chất hữu cơ có chứa nitơ bằng acid sulfuric [31].

1.2 MỘT SỐ CHƯƠNG TRÌNH SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
(HPLC) ĐÃ ĐƯỢC ÁP DỤNG ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG CÁC HOẠT CHẤT
TRONG THUỐC ĐA THÀNH PHẦN.

1.2.1- Một số khái niệm cơ bản về HPLC [30][34]:
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) còn được gọi là sắc ký
lỏng cao áp hay sắc ký lỏng hiện đại. Đây là một phương pháp phân tích sử
dụng kỹ thuật tách các chất trong hỗn hợp dựa vào ái lực khác nhau giữa các
chất với hai pha: pha tĩnh (cột hiệu năng cao) là chất rắn (hạt xốp, bột mịn)
hay một chất lỏng được giữ trên

1

chất rắn, pha động là chất lỏng(dung môi

rửa giải). Hai pha này luôn tiếp xúc nhau nhưng không hoà lãn vào nhau. Sự
tách sẽ đạt được bởi sự phân bố, hấp phụ hoặc các quá trình trao đổi ion... tuỳ

thuộc vào cột và kiểu sắc ký áp dụng .
Khi dung dịch chứa hỗn hợp các chất cần phân tích được đưa vào cột
chúng sẽ được hấp phụ hoặc liên kết với pha tĩnh tuỳ thuộc vào bản chất của
cột và kiểu sắc ký áp dụng, pha động (dung môi) được đưa qua cột dưới áp lực
của bơm cao áp .Tuỳ vào ái lực của các chất đối với hai pha mà chúng sẽ di
chuyển qua cột với tốc độ khác nhau dẫn đến sự phân tách. Sau khi tách, các
chất lần lượt được đưa ra khỏi cột đến detector. Tuỳ theo bản chất của các chất
cần phân tích mà sử dụng detector thích hợp (detector tử ngoại, detector độ
dẫn...). Detector hay được sử dụng nhất là ƯV-Detector. Máy ghi hoặc máy
tính ghi lại các tín hiệu dưới dạng pic trên sắc ký đồ.


12

1.2.1.1.M ột số đại lượng đặc trưng . [ 1 ] [2] [4] [24] [45]

Hình 1 : Các thông số thời gian mô tả trên sắc ký đồ

to : thời gian c h ế t:

là thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống tách

Ír : thời gian lưu :

(^m)
thời gian cần thiết kể từ khi chất được bơm vào cột cho
đến khi đạt đừợc nồng độ cực đại của nó, xuất hiện ở
thời điểm cuối của hệ thống tách.

Í r : thời gian

ỉ

ỉ ^ ' r•

lưu thực = tị^ - 1„
là thể tích chết của cột, thể tích liai,thể tích hiệu chỉnh
nếu tmc hoành của sắc đồ là đơn vị đothể tích.

Wg : chiều rộng pic ở đáy pic
W |^ : chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh


13

Bảng 1 : Một số đại lượng đặc trưng trong phương pháp HPLC

Các đại lượng

Công thức

Thông tin tóm tắt về các đại lượng

I

II

III

Thời

gian

- Là thông tin về mặt định tính của

lưu

chất trên sắc đồ.

(Retention time) :

- Là một hằng số đối vói 1 cấu tử

ÍR ÍU

đã cho khi tiến hành sắc ký trong
điều kiện không đổi
Hệ số dung

- Đặc tníiig cho tốc độ di chuyển 1

lượng

chất (tỷ lệ nghịch)

(thừa số dung lượiig, k' =
hệ số phân bố khối

VM

t

- k có giá trị từ 2 tới 5 là tối ưu; k'

lượng)

lớii dẫn đến sự doãng pic, độ nhậy

(Capacity factor)

thấp, thcd gian phân tích dài.
- k' của

1

chất thay đổi theo nồng

độ dung môi động

k'

2

chất chỉ được tách ra nếu chúng

có giá ứị k' khác nhau.
Hệ số chọn lọc (thừa

k’
2

- Để tách riêng 2 chất cần có oc >1

số chọn lọc, độ Imi giữ oc=------- (với k'2>k’,) (từ 1-2 ). oc lớii quá, thcfi gian phân
tỷ đối) (Selectivity
k’,
tích sẽ kéo dài
factor
or
relative
^R2 ■
- 1 số ảnh hưcmg tới cc : pha động,
retention)

pH pha động, T° cột, pha tĩnh, chất
tR , - to

a

xúc tác hoá học thêm vào pha
động.


14

2

Số đĩa lý thuyết
(Plate number)

III

lí

I

L

= ---- lớn là cột có hiệu lực cao.

N = 16

H
2

N
= 5,54

- Biểu thị hiệu lực cột săc ký : N
- Các ảnh hưởng thưc tế tới giá tri
N.
• Cỡ hạt nhồi cột, tốc độ thẳng của

W.^

dung môi (u) (tỷ lệ nghịch)
V ới:

• Độ nhớt của pha động (tỷ lệ

L : Chiều dài cột

nghịch)

H : Chiều cao đĩa lý • Nhiệt độ
thuyết
• k> 2 ảnh hưởng ít (tỷ lệ thuận
nếu k < 2 )
• Sự doãng pic (sự mở rộng dải)
• Lượiig chất lớn (mg) và thể tích
lớii (lO^ịil) sẽ làm giảm N
- Đặc trưng cho hiệu lực tách của
Độ phân giải
(Resolution)

Klioàug cách giữa 2 pic

R .=

quy trình sắc ký (cột), thực tế

hay sử dụng phân giải Rs giữa 2

Đ ộ rộn g trung bìnli củ a pic

Rs

1

2 (Íeì2 ■Íri)

pic cạnh nhau.
- Độ phân giải phụ thuộc vào :

( Wp, + w„)
a-1

Rs=(l/4)

Vn

a (thay thành phần pha động hoặc
k' pha tĩnh) - có ảnh hưỏnig mạnh;
N (độ dài cột, độ nhóít của pha
động, cỡ hạt nhồi cột, tốc độ thẳng
của dung môi (U)-ảnh hưcmg ít;
K' (thay đổi thành phần pha động)
thường phụ thuộc vào K'2.


15

12.1.2.

Phân loại các kỹ thuật HPLC và ứng dụng[l][46]

- Dựa trên bản chất hiện tượng sắc ký (sắc ký hấp phụ, sắc ký phân bố,
sắc ký trao đổi ion, sắc ký trên gel) mà người ta chia phương pháp HPLC làm
4 loại kỹ thuật HPLC. Việc lựa chọn kỹ thuật sắc ký nào trước hết phải căn cứ
vào các tính chất của các chất trong hỗn hợp cần tách : Khối lượng phân tỉr,
tứứi chất tan,độ phân cực ( pKa...hợp chất ion hay không ion), độ hấp thụ tỉr

ngoại,khả kiến...
♦ Sắc ký phân b ố hiệu năng cao :
Dựa vào bản chất của pha tĩnh là chất lỏng được gắn kết với chất mang
như thế nào mà ta có

2

loại sau :

- Nếu pha tĩnh được bao trên bề mặt hấp phụ của các hạt chất mang
(support) thì được gọi là : sắc ký lỏng - lỏng (LLC). Cột thường mất dần hiệu
lực do pha tĩnh thưòỉng bị dung môi (pha động) hoà tan và mất dần (cột chảy
máu). Vì vậy, kỹ thuật này ngày nay ít được dùng.
- Nếu pha tĩiứi được gắn hoá học (liên kết) với chất mang (hạt silicagel)
để tạo nên hợp chất cơ siloxan thì được gọi là : sắc ký pha liên kết (BPC Bonded phase chromatography).
Sắc ký pha thuận (truyền thống) : pha tĩnh phân cực hơn pha động.
Sắc ký pha đảo (sắc ký pha ngược) : pha tĩnh lại ít phân cực hơn pha
động.
Ngày nay sắc ký pha đảo (reversed phase chromatography) được dùng
rất rộng rãi vì nó cho kết quả tách tốt với rất nhiều đối tượng tách.
♦ Sắc ký hấp phụ hiệu năng cao (sắc ký lỏng - rắn : LSC)
- Là kỹ thuật phát triển sớm nhất và được dùng phổ biến, thành công để
tách các hỗn hợp trong đó các chất có tính chất gần tương tự nhau, đồng thời
chúng phải thuộc loại không phân cực hoặc phan cực yếu, tmng bình.
Trong kỹ thuật này chất tan bị giữ lại trên bề mặt pha tĩnh (tức là chất hấp phụ
: silicagel, nhôm oxit,...) và bị dung môi đẩy ra (phản hấp phụ - pha động).


16
Các chất càng phân cực càng bị lưu giữ mạnh và ra chậm khi rửa giải.

Các dung môi có thông số sức dung môi 8 *^tăng dần thì khả năng đẩy các chất
ra khỏi pha tĩnh (sức rửa giải) tăng dần.
♦ Sắc ký ừ-ao đổi ỉon hiệu năng cao :
- Pha tĩnh : các nhựa trao đổi ion (ionit) dưới dạng bột mịn, đó là những
hợp chất cao phân tử có chứa những nhóm chưa có khả năng trao đổi.
- Các ionit (cationit, anionit) không tan trong nước, khi tiếp xúc với
dung dịch hỗn hợp ion thì xảy ra sự trao đổi (diễn ra cân bằng trao đổi ion).
- Quá trình rửa giải cũng chính là quá trình hồi nguyên (tái sinh) ionit.
♦ Sắc kỷ lỏng hiệu năng cao trên gel (sắc ký rây phân tử)
Là kỹ thuật mới phát triển và được ứng dụng chủ yếu cho các chất có
phân tử lượng lớn (MW>2000) và các chất này là loại hợp chất không có khả
năng phân ly thành ion . Như vậy việc tách các phân tử lófn như các protein rất
thích hợp với kỹ thuật sắc ký này. Hoặc có thể sử dụng tách các đường trong
nước quả, ...
Trong kỹ thuật này chất nhồi là những hạt xốp của silicagel hay polữne
có kích thước nhỏ (khoảng 10 jj.m).Pha tĩnh là dung môi nằm trong các lỗ xốp
của hạt, pha động là dung môi chảy giữa các hạt.
Khi phân tử chất tan có phân tử lượng lớn (cỡ lớn, cỡ trung bình của các
lỗ xốp) thì sẽ không bị lưu giữ và di chuyển theo dung môi (tóc là bị loại). Các
phân tử nhỏ hcm có thể khuếch tán, vào lỗ xốp. Các phân tử rất nhỏ so với lỗ
xốp sẽ đi sâu vào lỗ này, và ra chậm. Khi rửa giải các phân tử sẽ lần lượt ra
theo cỡ từ lớn đến nhỏ.
Có 2 loại : - sắc ký lọc trên gel (các gel ưa nước được dùng với pha
động là dung dịch nước).
- Sắc ký thẩm thấu trên gel (các gel kỵ nước được dùng với pha động là
các dung môi hữu cơ không phân cực hoặc ít phân cực).


17
Trong phạm vi đề tài nghiên cứu, chúng tôi ứng dụng :Kỹ thuật cặp

ion trong sắc ký pha đảo
-Sắc ký lỏng pha đảo (RPC - Reversed phase chromatography) [4] [34]:

Pha tĩnh

Có các loại cột

Phạm vi sử dụng

(không phân cực)

C .8 (ODS)

43,8%

C -8

31,8%

C-4

4,9%

Phenyl

14,3%

C ./Q

5,1%

Hay dùng

Trong đó, tại Viện kiểm nghiệm -Bộ y tế cột C18(0DS) được sử dụng phổ biến
nhất.
Cột C18 ở trong các tài liệu được ký hiệu khác nhau ví dụ : trong ƯSP
làL l,....

••• S i — o — Si — (CH2) i 7CH3

Si • ■■OH
\
Si

/ \

d ị

R

CH3

• • • Si — o — Si — (CH2) i 7CH3
^------- N-y'------- ^

K

\

Cí%

R

R là octadecyl (một nhóm ít phân cực)

Hình 2 : Cấu trúc bề mặt cột C-18 trong sắc ký pha đảo (ODS Bonded)


18
- Pha động phân cực : Nước và các hỗn họp dung môi trộn lẫn theo các tỷ
lệ.
Các dung môi hay được sử dụng (sức rửa giải tăng dần) : nước,
methanol, acetonitril, isopropanol, dioxan, tetrahydrofuran, hỗn hợp của các
chất trên.
Nói chung dung môi cho hệ pha đảo thường dùng là: nước cất, methanol,
acetonitril...một số acid hay bazơ hữu cơ tan tốt trong nước, một vài amin hay
aminoacid.
- Thứ tự rửa giải : các chất phân cực ra tiirớc, các chất ít phân cực và
không phân cực ra sau.
- ứ ig dụng : Đinh tính, định lượng các chất trung tính, acid và base
yếu, các chất khác
- Đối với các chất ở dạng ion, người ta hay chuyển chúng về dạng phân
tử để quá trình rửa giải diễn ra không quá nhanh (tăng thời gian lưii) bằng
cách làm thay đổi pH (để phương trình phân ly diễn ra theo chiều ngược lại)
hay sử dụng kỹ thuật tạo cặp ion.
Kỹ thuật sắc ký cặp ion có nguồn gốc từ phương pháp chiết cặp ion mà
cơ chế là khi cho một ion trái dấu (ion tạo cặp) vào trong pha nước có chứa
các ion, các ion chất tan sẽ tạo với ion trái dấu thành một cặp ion không mang
điện và các cặp ion này sẽ chuyển từ pha động phân cực sang pha tĩnh ít phân
cực (đối với các base hĩm cơ - cation hay sử dụng các muối alkylsulfonat làm

chất tạo cặp).

+ B' => (A"^ B‘)

Pha động (phân cực)

~ 4 ệ ----------------------- ^---------------- ----

(A"^ B )

Pha tĩnh (ít phân cực)


19

1.2.1.3.Cách đánh giá pic( diện tích, chiều cao) và các phương
pháp định lượng thường dùng trong HPLC [10] [33] [4]
♦ Đánh giá pic:
-

Diện tích pic của một chất tương ứng với tổng lượng chất đó

Để đánh giá diện tích píc, hiện nay người ta dùng tích phân kế hoặc dùng máy
tính đã cài đặt sẵn chưcíng trình.
Việc xác định diện tích pic sẽ gặp khó khăn khi cường độ pic quá lớn,
píc bị doãng, không đối xứng hoặc khi đường nền bị nhiễu, pic bị biến dạng,
xuất hiện pic lạ do hiệu ứng hoá học hay detector bị nhiễu[26].
-Chiều cao pic( khoảng cách giữa đường nền và đỉnh pic) là một đại lượng tỷ
lệ với diện tích pic khi pic cân đối. Nó cũng có thể được dùng để đánh giá sắc
phổ. Một điều kiện để áp dụng việc đánh giá bằng chiều cao pic là các chỉ số

k' hằng định.Với các pic có đường nền bị nhiễu việc xác định chiều cao pic sẽ
dễ dàng hơn xác đmh diện tích pic.
♦ Phương pháp ngoại chuẩn:
Là phương pháp dựa trên cơ sở so sánh pic( diện tích pic, chiều cao pic)
của mẫu thử và mẫu chuẩn được phân tích trong cùng điều kiện. Kết quả của
chất chưa biết được tính toán so với mẫu chuẩn đã biết trước nồng độ (Với yêu
cầu nồng độ mẫu chuẩn và mẫu thử gần tưong đương nhau)hoặc suy ra từ
đường chuẩn( với yêu cầu nồng độ mẫu thử phải nằm trong vùng nồng độ
nghiên cứu và phải định kỳ kiểm tra, xác định lại đường chuẩn).
♦ Phương pháp nội chuẩn:
Là phương pháp mà nồng độ chất thử được xác định gián tiếp so với
chất chuẩn bằng cách cho thêm vào mẫu chuẩn và mẫu thử một lượng chất
không đổi (chất chuẩn nội) mà trong cùng điều kiện sắc ký nó có thòd gian lưu
gần thời gian lim của chất cần phân tích trong mẫu thử. Nó được tách hoàn
toàn với các chất khác và có nồng độ gần bằng nồng độ chất phân tích và có


20
cấu trúc hoá học tương ứng.Phương pháp này cho phép giảm sai số và đạt độ
lặp lại cao
♦ Phương pháp thêm chuẩn :
Được sử dụng chủ yếu khi có vấn đề ảnh hưcmg của chất phụ. Dung dịch mẫu
thử được thêm một lượng xác định chất chuẩn.Các pic thu được của cả hai
dung dịch mẫu thử và mẫu thử thêm chất chuẩn phải được đo trong cùng một
điều kiện phân tích. Phương pháp thêm chuẩn có thể thực hiện một lần , hai
lần hay nhiều lần. Trong tmofng hợp đơn giản nhất với thêm một lần thêm chất
chuẩn, nồng độ chưa biết của mẫu được tính bằng sự chênh lệch nồng độ
(lượng chất chuẩn thêm vào) và độ tăng của độ lớn pic. Nếu thêm nhiều lần
chất chuẩn, nồng độ mẫu được tính toán bằng phương pháp phân tích hồi
qui.Phương pháp thêm chuẩn có độ chính xác cao và loại trừ được các yếu tố

ảnh hưỏmg như chất phụ, sự thay đổi nhiệt độ, áp suất... Nó thường được sử
dụng để xác định độ đúng của phép định lưcmg.
♦ Phương pháp phần trăm diện tích pic (hoặc % chiều cao pic):
Là phương pháp tmh toán hàm lượng

chất chưa biết dựa trên diện tích

pic(hoặc chiều cao pic) của nó tính theo phần trăm trên tổng số toàn bộ pic có
trong sắc ký đồ. Trong phương pháp HPLC, cách tính này chỉ đúng khi sự đáp
ứng của detector trên các chất là như nhau. Nếu không như nhau, mỗi chất cần
có hệ số hiệu chỉnh.

1.2.2. Một sô chương trình sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) đã
được áp dụng để định lượng các thuốc đa thành phần.
1.22.1. M ột số công thức nhỏ mắt trên thị trường có chứa các
thành

phần

pyridoxin

hydrocỉoríd,

naphazolin

nitrat,

chlorphenỉramin maleat, panthenol
♦ Thuốc nhỏ mắt V-ROHTO
( sản phẩm của ROHTO PHARMACEUTICAL c o . , LTD DJAPAN )

20
cấu trúc hoá học tương ứng.Phương pháp này cho phép giảm sai số và đạt độ
lặp lại cao
♦ Phương pháp thêm chuẩn :
Được sử dụng chủ yếu khi có vấn đề ảnh hưởng của chất phụ. Dung dịch mẫu
thử được thêm một lượng xác định chất chuẩn.Các pic thu được của cả hai
dung dịch mẫu thử và mẫu thử thêm chất chuẩn phải được đo trong cùng một
điều kiện phân tích. Phương pháp thêm chuẩn có thể thực hiện một lần , hai
lần hay nhiều lần. Trong trưòfng hợp đơn giản nhất với thêm một lần thêm chất
chuẩn, nồng độ chưa biết của mẫu được tính bằng sự chênh lệch nồng độ
(lirọng chất chuẩn thêm vào) và độ tăng của độ lớn pic. Nếu thêm nhiều lần
chất chuẩn, nồng độ mẫu được tính toán bằng phương pháp phân tích hồi
qui.Phương pháp thêm chuẩn có độ chính xác cao và loại trừ được các yếu tố
ảnh hưởng như chất phụ, sự thay đổi nhiệt độ, áp suất... Nó thường được sử
dụng để xác định độ đúng của phép định lượng.
♦ Phương pháp phần trăm diện tích pỉc (hoặc % chiều cao pic):
Là phương pháp tính toán hàm lượng

chất chưa biết dựa trên diện tích

pic(hoặc chiều cao pic) của nó tính theo phần trăm trên tổng số toàn bộ pic có
trong sắc ký đồ. Trong phương pháp HPLC, cách tíiih này chỉ đúng khi sự đáp
ứng của detector trên các chất là như nhau. Nếu không như nhau, mỗi chất cần
có hệ số hiệu chỉnh.

1.2.2. Một sô chương trình sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) đã
được áp dụng để định lượng các thuốc đa thành phần.
I.2.2.I. M ột số công thức nhỏ mất trên thị trường có chứa các

thành

phần

pyridoxin

hydroclorid,

naphazolin

nỉtrat,

chlorpheniramin maỉeat, panthenol
♦ Thuốc nhỏ mắt V-ROHTO
( sản phẩm của ROHTO PHARMACEUTICAL c o . , LTD DJAPAN )