nghiên cứu cải tiến quy trình tổng hợp nguyên liệu mesna và ứng dụng bào chế thuốc tiêm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐÀO NGUYỆT SƯƠNG HUYỀN

NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN QUY TRÌNH
TỔNG HỢP NGUYÊN LIỆU MESNA VÀ
ỨNG DỤNG BÀO CHẾ THUỐC TIÊM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI, NĂM 2019


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BỘ Y TẾ

ĐÀO NGUYỆT SƯƠNG HUYỀN

NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN QUY TRÌNH
TỔNG HỢP NGUYÊN LIỆU MESNA VÀ
ỨNG DỤNG BÀO CHẾ THUỐC TIÊM
LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM
& BÀO CHẾ THUỐC
MÃ SỐ: 62720402

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Đình Luyện
PGS.TS. Nguyễn Văn Hân

HÀ NỘI, NĂM 2019


Lời cam đoan
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số
liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công
bố trong bất kỳ công trình nào khác.
NCS. Đào Nguyệt Sương Huyền

i


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới PGS.TS. Nguyễn Đình Luyện và
PGS.TS. Nguyễn Văn Hân, là những người Thầy đã nhiệt tình hướng dẫn, hết lòng
giúp đỡ, dìu dắt, chỉ bảo, động viên, khích lệ để tôi có động lực hoàn thành luận án này.
Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới TS. Nguyễn Văn Hải, ThS. Nguyễn Văn
Giang, ThS. Trần Thúy Hạnh đã dành sự quan tâm đặc biệt, hỗ trợ tối đa cho tôi
trong quá trình nghiên cứu.
Tôi xin gửi lời cảm ơn PGS.TS. Từ Minh Koóng, PGS.TS. Nguyễn Văn Long,
PGS.TS. Nguyễn Ngọc Chiến, PGS.TS. Nguyễn Đăng Hòa đã dành cho tôi những
gợi ý quí báu trong quá trình thực hiện luận án.
Tôi xin gửi lời cảm ơn toàn thể các Thầy, Cô giáo, đồng nghiệp của tôi tại Bộ môn
Công nghiệp Dược, Phòng Khảo thí và Kiểm định chất lượng - Trường Đại học Dược
Hà Nội đã ủng hộ và động viên tôi trong suốt quá trình nghiên cứu.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến sự giúp đỡ, cộng tác của các Thầy cô, anh chị của các
Quý cơ quan: Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm

khoa học và Công nghệ Việt Nam, Khoa hóa học - Đại học Khoa học tự nhiên - Đại
học Quốc gia Hà Nội, Viện Công nghệ dược phẩm quốc gia.
Tôi xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, Ban giám hiệu, Phòng Sau đại học, Phòng Tổ
chức Cán bộ, các Phòng chức năng, Bộ môn chuyên ngành Công nghệ Dược phẩm và
Bào chế thuốc - Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá
trình học tập và hoàn thành luận án. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn GS.TS. Nguyễn
Thanh Bình, PGS.TS. Nguyễn Thị Song Hà đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn
thành luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn các học viên cao học, các thế hệ sinh viên dược K65,
K66, K67, K68 đã cùng tôi làm việc để hoàn thành được những kết quả trong luận án.
Cuối cùng, xin cảm ơn chồng, hai con tôi, bố mẹ, người thân và bạn bè đã luôn
động viên, giúp đỡ tôi trong suốt những năm qua.
NCS. Đào Nguyệt Sương Huyền

ii


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... ii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...................................... vii
DANH MỤC CÁC BẢNG ...................................................................................... ix
DANH MỤC CÁC HÌNH ..................................................................................... xiii
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ................................................................................... xiv
ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................... 1
Chương 1. TỔNG QUAN ........................................................................................ 3
1.1. Tổng quan về mesna ..................................................................................... 3
1.1.1. Nguồn gốc và tính chất lý hóa ............................................................... 3
1.1.2. Các phương pháp định lượng mesna...................................................... 7
1.1.3. Đặc điểm dược lý ................................................................................. 10
1.2. Các phương pháp tổng hợp mesna ............................................................ 14

1.2.1. Tổng hợp nguyên liệu natri 2-halogenoethansulfonat ......................... 14
1.2.2. Tổng hợp mesna qua trung gian muối thiouroni 3 ............................... 18
1.2.3. Tổng hợp mesna qua trung gian thioester ............................................ 20
1.2.4. Tổng hợp mesna qua trung gian muối xanthat ..................................... 22
1.2.5. Một số phương pháp khác .................................................................... 25
1.3. Một số quá trình tạo nhóm thiol ................................................................ 26
1.3.1. Tổng hợp nhóm thiol từ trithiocarbonat ............................................... 26
1.3.2. Tổng hợp nhóm thiol từ muối Bunte ................................................... 27
1.3.3. Tổng hợp nhóm thiol từ muối thiouroni .............................................. 28
1.3.4. Tổng hợp nhóm thiol từ thioester ........................................................ 28
1.3.5. Một số phương pháp khác .................................................................... 29
1.4. Phân tích và lựa chọn phương pháp tổng hợp mesna ............................. 31
1.5. Tổng quan về bào chế mesna ..................................................................... 32
1.5.1. Một số biện pháp chống oxy hóa trong thuốc tiêm của dược chất có chứa
nhóm thiol ...................................................................................................... 32
1.5.2. Một số nghiên cứu về dạng bào chế và độ ổn định của mesna ............ 35
Chương 2. NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ....................................................................................................... 38
2.1. Nguyên vật liệu, hóa chất và thuốc thử ..................................................... 38
2.2. Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm ....................................................................... 39
2.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................... 41
iii


2.3.1. Tổng hợp hóa học................................................................................. 41
2.3.2. Bào chế dung dịch tiêm mesna ............................................................ 41
2.4. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 42
2.4.1. Phương pháp tổng hợp và xác định cấu trúc mesna............................. 42
2.4.2. Phương pháp đánh giá chất lượng nguyên liệu mesna ........................ 44
2.4.3. Phương pháp thử độc tính cấp của nguyên liệu mesna ........................ 45

2.4.4. Phương pháp bào chế ........................................................................... 46
2.4.5. Phương pháp đánh giá chất lượng dung dịch tiêm mesna 100 mg/ml . 47
2.4.6. Phương pháp đánh giá độ ổn định ....................................................... 50
2.4.7. Phương pháp xử lý số liệu, kết quả nghiên cứu ................................... 50
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................................. 51
3.1. Tổng hợp và tinh chế mesna ở qui mô phòng thí nghiệm ....................... 51
3.1.1. Tổng hợp natri 2-cloroethansulfonat.................................................... 51
3.1.2. Tổng hợp mesna qua trung gian muối thiouroni .................................. 54
3.1.3. Tổng hợp mesna qua trung gian thioester ............................................ 62
3.1.4. Tổng hợp mesna qua trung gian muối Bunte ....................................... 67
3.1.5. Tổng hợp mesna qua trung gian trithiocarbonat .................................. 73
3.1.6. So sánh các phương pháp tổng hợp mesna .......................................... 83
3.1.7. Tinh chế mesna đạt tiêu chuẩn về hàm lượng theo BP 2015 ............... 85
3.2. Xây dựng qui trình tổng hợp và tinh chế mesna qui mô 100 g/mẻ......... 87
3.2.1. Tổng hợp natri 2-cloroethansulfonat.................................................... 87
3.2.2. Qui trình tổng hợp mesna qua trung gian muối thiouroni qui mô 100
g/mẻ ................................................................................................................ 88
3.2.3. Qui trình tổng hợp và tinh chế mesna qua trung gian monoalkyl
trithiocarbonat qui mô 100g/mẻ ..................................................................... 91
3.3. Triển khai qui trình tổng hợp mesna qua trung gian monoalkyl
trithiocarbonat qui mô 200 g/mẻ đạt tiêu chuẩn BP 2015.............................. 94
3.4. Đánh giá độ ổn định của nguyên liệu mesna ............................................ 97
3.4.1. Khảo sát điều kiện bảo quản nguyên liệu mesna ................................. 97
3.4.2. Đánh giá độ ổn định và xác định tuổi thọ của nguyên liệu mesna ...... 97
3.5. Đánh giá độc tính cấp của mesna ............................................................ 100
3.6. Xây dựng phương pháp định lượng mesna bằng HPLC....................... 101
3.7. Nghiên cứu bào chế dung dịch tiêm mesna 100mg/ml .......................... 102

iv

3.7.1. Khảo sát ảnh hưởng một số yếu tố công thức đến độ ổn định hóa lý của
dung dịch tiêm mesna .................................................................................. 102
3.7.2. Công thức và qui trình bào chế dung dịch tiêm mesna 100 mg/ml ... 107
3.7.3. Đề xuất tiêu chuẩn chất lượng của dung dịch tiêm mesna ................ 108
3.7.4. Đánh giá độ ổn định của dung dịch tiêm mesna ................................ 111
Chương 4. BÀN LUẬN ........................................................................................ 115
4.1. Phương pháp tổng hợp mesna ................................................................. 115
4.1.1. Phản ứng tổng hợp natri 2-cloroethansulfonat ................................... 115
4.1.2. Phản ứng tổng hợp mesna qua trung gian muối thiouroni ................. 117
4.1.3. Phản ứng tổng hợp mesna qua trung gian thioester ........................... 120
4.1.4. Phản ứng tổng hợp mesna qua trung gian muối Bunte ...................... 123
4.1.5. Phản ứng tổng hợp mesna qua trung gian alkyl trithiocarbonat ........ 126
4.2. Tinh chế nguyên liệu mesna đạt tiêu chuẩn Dược điển Anh ................ 132
4.3. Cấu trúc của các chất tổng hợp được...................................................... 133
4.3.1. Cấu trúc của natri 2-cloroethansulfonat ............................................. 134
4.3.2. Cấu trúc của các chất trung gian theo con đường muối thiouroni ..... 134
4.3.3. Cấu trúc của các chất trung gian theo con đường thioester ............... 136
4.3.4. Cấu trúc của chất trung gian theo con đường muối Bunte ................ 136
4.3.5. Cấu trúc của chất trung gian theo con đường trithiocarbonat ............ 138
4.3.6. Cấu trúc của mesna ............................................................................ 140
4.4. Nâng cấp qui mô tổng hợp mesna ........................................................... 142
4.4.1. Về lựa chọn nguyên liệu 1,2-dicloroethan ......................................... 142
4.4.2. Về nâng cấp qui mô tổng hợp natri 2-cloroethansulfonat từ 1,2dicloroethan .................................................................................................. 143
4.4.3. Về lựa chọn con đường tổng hợp mesna để nâng cấp qui mô ........... 144
4.5. Độ ổn định và độc tính của nguyên liệu mesna ...................................... 146
4.5.1. Độ ổn định của nguyên liệu mesna .................................................... 146
4.5.2. Độc tính cấp của nguyên liệu mesna.................................................. 146
4.6. Dung dịch tiêm mesna 100 mg/ml............................................................ 147
4.6.1. Về phương pháp định lượng mesna ................................................... 147

4.6.2. Về xây dựng công thức và phương pháp bào chế dung dịch tiêm
mesna ........................................................................................................... 149
4.6.3. Về đề xuất TCCS và theo dõi độ ổn định của dung dịch tiêm ........... 151
4.7. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án ............................... 153
v


KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ................................................................................. 155
KẾT LUẬN ....................................................................................................... 155
ĐỀ XUẤT .......................................................................................................... 156
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ .......................................... 157
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... I
PHỤ LỤC

vi


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

TT

Ký hiệu,
chữ viết tắt

1

13

2

1

C-NMR

H-NMR

3
4
5
6
7
8
9
10

AR
BP
CYP
δ
dd
DĐVN
DMSO
đvC

11

EP

12

ESI-MS

13

g

14

HPLC

15

ICH

16

IR

17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27

IFM
l
M
ml
ppm
ppb
Rf
RSD
SD
SKLM
Spic

Chú thích
Phổ cộng hưởng từ carbon 13 (Carbon-13 Nuclear Magnetic
Resonance Spectroscopy)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton Nuclear Magnetic
Resonance Spectroscopy)
Thuốc thử phân tích (Analytical reagent)
Dược điển Anh (The British Pharmacopoeia)
Cyclophosphamid
Độ dịch chuyển hóa học (ppm)
Dung dịch
Dược điển Việt Nam
Dimethyl sulfoxid
Đơn vị carbon
Dược điển Châu Âu
(The European Pharmacopoeia)
Phổ khối lượng phun mù điện tử
(Electrospray Ionization Mass Spectrometry)
Gam

Sắc ký lỏng hiệu năng cao
(High performance liquid chromatography)
Hội nghị hòa hợp quốc tế
(International Conference on Harmonisation)
Phổ hồng ngoại
(Infrared Spectroscopy)
Ifosfamid
Lít
Khối lượng phân tử
Mililít
Phần triệu
Phần tỉ
Hệ số lưu giữ (Retention factor)
Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation)
Độ lệch chuẩn (Standard Deviation)
Sắc ký lớp mỏng
Diện tích pic
vii


TT
28
29
30
31
32
33
34

Ký hiệu,

chữ viết tắt
t°nc
t°pư
tR
TB
TLTK
ν̅max
USP

Chú thích
Nhiệt độ nóng chảy
Nhiệt độ phản ứng
Thời gian lưu
Trung bình
Tài liệu tham khảo
Số sóng cực đại (cm-1)
Dược điển Mỹ (The United States Pharmacopeia)

viii


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Ưu, nhược điểm của một số phương pháp định lượng mesna .................... 9
Bảng 1.2. Thông tin về độc tính cấp của mesna ....................................................... 13
Bảng 1.3. Hiệu suất các phản ứng tổng hợp natri 2-halogenoethansulfonat ............ 17
Bảng 1.4. Một số chất được sử dụng điều chỉnh pH trong chế phẩm của một số thuốc
có chứa nhóm thiol .................................................................................................... 33
Bảng 1.5. Nồng độ thường dùng của một số chất chống oxy hóa trong thuốc tiêm nước
[79] ............................................................................................................................ 33
Bảng 1.6. Một số chất chống oxy hóa được sử dụng trong chế phẩm của dược chất có

chứa nhóm thiol ........................................................................................................ 34
Bảng 1.7. Một số dạng bào chế của mesna trên thị trường ....................................... 37
Bảng 2.1. Danh mục nguyên vật liệu, hoá chất và thuốc thử ................................... 38
Bảng 2.2. Danh mục dụng cụ, thiết bị....................................................................... 39
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ mol các chất tham gia phản ứng đến hiệu suất tổng hợp
chất 2 ......................................................................................................................... 52
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hiệu suất tổng hợp chất 2 ........... 53
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ thể tích dung môi nước : ethanol 96% đến hiệu suất
tổng hợp chất 2 .......................................................................................................... 53
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tổng thể tích dung môi đến hiệu suất tổng hợp chất 2 .... 54
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của một số xúc tác đến hiệu suất tổng hợp chất 3 ................. 55
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của tỉ lệ mol các chất tham gia phản ứng đến hiệu suất tổng hợp
chất 3 ......................................................................................................................... 56
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hiệu suất tổng hợp chất 3 ........... 56
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của thể tích nước đến hiệu suất tổng hợp chất 3 ................... 57
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất tổng hợp chất 4 ........................... 58
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của tỉ lệ mol NH3 : chất 3 đến hiệu suất tổng hợp chất 4 .... 59
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất tổng hợp mesna từ chất 4 .................. 61
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất tổng hợp 5 ................................. 63

ix


Bảng 3.13. Ảnh hưởng của tỉ lệ mol các chất tham gia đến hiệu suất tạo chất 5 ..... 63
Bảng 3.14. Ảnh hưởng của lượng nước đến hiệu suất tạo chất 5 ............................. 64
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất tổng hợp mesna từ chất 5 .......... 65
Bảng 3.16. Ảnh hưởng của tỉ lệ mol các chất tham gia phản ứng đến hiệu suất tổng
hợp mesna từ chất 5 .................................................................................................. 66
Bảng 3.17. Ảnh hưởng của thể tích nước đến hiệu suất tổng hợp mesna từ chất 5 .. 66
Bảng 3.18. Ảnh hưởng của tỉ lệ mol natri thiosulfat pentahydrat : chất 2 đến hiệu suất

tổng hợp chất 6 .......................................................................................................... 68
Bảng 3.19. Ảnh hưởng của tỉ lệ nước : ethanol 96% đến hiệu suất tổng hợp chất 6 68
Bảng 3.20. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất tổng hợp chất 6 ......................... 69
Bảng 3.21. Ảnh hưởng của tỉ lệ thể tích methanol : nước khi tinh chế đến hiệu suất
tổng hợp chất 6 .......................................................................................................... 69
Bảng 3.22. Ảnh hưởng của tỉ lệ thể tích 1,4-dioxan : nước đến hiệu suất tổng hợp
mesna từ chất 6.......................................................................................................... 71
Bảng 3.23. Ảnh hưởng của lượng dung môi đến hiệu suất tổng hợp mesna từ muối
Bunte 6 ...................................................................................................................... 71
Bảng 3.24. Ảnh hưởng của nồng độ acid đến hiệu suất tổng hợp mesna từ chất 6 .. 72
Bảng 3.25. Ảnh hưởng của nhiệt độ giai đoạn thủy phân đến hiệu suất tổng hợp mesna
từ chất 6 ..................................................................................................................... 72
Bảng 3.26. Ảnh hưởng của tỉ lệ mol natri trithiocarbonat : chất 2 đến hiệu suất tổng
hợp monoalkyl trithiocarbonat 7 ............................................................................... 74
Bảng 3.27. Ảnh hưởng của thể tích nước đến hiệu suất tổng hợp monoalkyl
trithiocarbonat 7 ........................................................................................................ 75
Bảng 3.28. Ảnh hưởng của tỉ lệ mol chất 2 : natri trithiocarbonat đến hiệu suất tổng
hợp dialkyl trithiocarbonat 7a ................................................................................... 77
Bảng 3.29. Kết quả tổng hợp dialkyl trithiocarbonat ................................................ 77
Bảng 3.30. Ảnh hưởng của tỉ lệ mol natri trithiocarbonat : chất 2 đến hiệu suất tổng
hợp mesna (con đường IV) ....................................................................................... 81

x


Bảng 3.31. Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng giữa chất 2 và natri trithiocarbonat đến
hiệu suất tổng hợp mesna (con đường IV) ................................................................ 81
Bảng 3.32. Ảnh hưởng của nồng độ acid đến hiệu suất tạo mesna (con đường IV) 82
Bảng 3.33. Ảnh hưởng của pH thủy phân đến hiệu suất tạo mesna (con đường IV) 82
Bảng 3.34. Khảo sát độ lặp lại của phản ứng tổng hợp mesna (con đường IV) ....... 83

Bảng 3.35. So sánh các phương pháp tổng hợp mesna ............................................. 84
Bảng 3.36. Ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất tinh chế mesna ........................ 86
Bảng 3.37. Ảnh hưởng của nhiệt độ hòa tan đến hiệu suất tinh chế mesna ............. 86
Bảng 3.38. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy đến hiệu suất tổng hợp chất 2.................. 87
Bảng 3.39. Độ lặp lại của phản ứng tổng hợp natri 2-cloroethansulfonat ................ 88
Bảng 3.40. Độ lặp lại của phản ứng tổng hợp 2-S-thiouroni ethansulfonat.............. 89
Bảng 3.41. Độ lặp lại của phản ứng tổng hợp guanidini 2-mercaptoethansulfonat.. 89
Bảng 3.42. Độ lặp lại của phản ứng tổng hợp mesna qui mô 100g/mẻ .................... 90
Bảng 3.43. Độ lặp lại của quá trình tinh chế mesna qui mô 100g/mẻ ...................... 91
Bảng 3.44. Ảnh hưởng cách thức nạp liệu đến hiệu suất tổng hợp mesna ............... 92
Bảng 3.45. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy trộn đến hiệu suất tổng hợp mesna.......... 93
Bảng 3.46. Độ lặp lại của qui trình tổng hợp mesna qua trung gian monoalkyl
trithiocarbonat qui mô 100 g/mẻ ............................................................................... 93
Bảng 3.47. Độ lặp lại của qui trình tinh chế mesna được tổng hợp qua trung gian
monoalkyl trithiocarbonat qui mô 100 g/mẻ. ............................................................ 94
Bảng 3.48. Kết quả tổng hợp mesna qui mô 200 g/mẻ ............................................. 96
Bảng 3.49. Ảnh hưởng của điều kiện bảo quản đến hàm lượng mesna và tỉ lệ tạp D97
Bảng 3.50. pH, hàm lượng mesna và tỉ lệ tạp D của các mẫu theo thời gian bảo quản
ở điều kiện lão hóa cấp tốc........................................................................................ 98
Bảng 3.51. pH, hàm lượng mesna và tỉ lệ tạp D của các mẫu theo thời gian trong thử
nghiệm dài hạn .......................................................................................................... 99
Bảng 3.52. Kết quả định lượng thuốc tiêm Uromitexan 100 mg/ml ...................... 102
Bảng 3.53. Ảnh hưởng của pH khoảng 5-10 đến hàm lượng mesna ...................... 103
xi


Bảng 3.54. Ảnh hưởng của pH (khoảng 7-8) đến hàm lượng mesna ..................... 103
Bảng 3.55. Ảnh hưởng của chất điều chỉnh pH đến độ ổn định của mesna ........... 104
Bảng 3.56. Ảnh hưởng của nồng độ dinatri edetat đến hàm lượng mesna ............. 105
Bảng 3.57. Ảnh hưởng của thời gian hấp đến hàm lượng mesna ........................... 106

Bảng 3.58. Ảnh hưởng của ánh sáng đến hàm lượng mesna .................................. 106
Bảng 3.59. Ảnh hưởng của sục khí nitơ đến hàm lượng mesna ............................. 107
Bảng 3.60. Công thức dung dịch tiêm mesna 100 mg/ml ....................................... 107
Bảng 3.61. Độ ổn định của dung dịch tiêm mesna (nguyên liệu được tổng hợp theo
con đường I) ............................................................................................................ 112
Bảng 3.62. Độ ổn định của dung dịch tiêm mesna (nguyên liệu được tổng hợp theo
con đường IV) ......................................................................................................... 113

xii


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cơ chế giải độc của mesna bằng cách tăng đào thải cystein .................... 12
Hình 3.1. Kết quả dự đoán tuổi thọ của mesna được tổng hợp theo con đường I tính
theo hàm lượng mesna và tỉ lệ tạp D ...................................................................... 100
Hình 3.2. Kết quả dự đoán tuổi thọ của mesna được tổng hợp theo con đường IV tính
theo hàm lượng mesna và tạp D .............................................................................. 100
Hình 3.3. Kết quả dự đoán tuổi thọ của dung dịch tiêm theo tỉ lệ tạp D và hàm lượng
mesna (nguyên liệu mesna được tổng hợp theo con đường I) ................................ 113
Hình 4.1. Hình ảnh phổ IR của muối guanidini 4 ................................................... 135
Hình 4.2. Hình ảnh phổ giãn 1H-NMR của monoalkyl trithiocarbonat 7 ............... 138
Hình 4.3. Hình ảnh phổ giãn 1H-NMR của dialkyl trithiocarbonat 7a ................... 139
Hình 4.4. Phổ IR tham khảo của mesna [32] .......................................................... 140
Hình 4.5. Phổ 1H-NMR của mesna được tổng hợp theo con đường IV ................. 141
Hình 4.6. Hiệu suất tổng hợp mesna từ chất 2 theo 4 con đường ........................... 144
Hình 4.7. Quang phổ hấp thụ tử ngoại của mesna [32] .......................................... 148

xiii

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1.1. Phản ứng oxy hóa các hợp chất thiol bởi các halogen .............................. 5
Sơ đồ 1.2. Phản ứng tạo disulfid với tác nhân là ion kim loại và oxid kim loại ......... 5
Sơ đồ 1.3. Cơ chế oxy hóa nhóm thiol trong môi trường base ................................... 6
Sơ đồ 1.4. Cơ chế oxy hóa nhóm thiol xúc tác bởi ion kim loại................................. 6
Sơ đồ 1.5. Cơ chế giải độc của mesna ...................................................................... 11
Sơ đồ 1.6. Các phương pháp chính tổng hợp mesna đã công bố .............................. 14
Sơ đồ 1.7. Phản ứng tổng hợp nguyên liệu natri 2-halogenoethansulfonat .............. 14
Sơ đồ 1.8. Phản ứng tổng hợp natri 2-bromoethansulfonat ...................................... 15
Sơ đồ 1.9. Phản ứng tổng hợp natri 2-bromoethansulfonat từ natri isethionat ......... 15
Sơ đồ 1.10. Phản ứng tổng hợp natri 2-cloroethansulfonat từ ethylen clorobromid 16
Sơ đồ 1.11. Phản ứng tổng hợp natri 2-cloroethansulfonat từ 1,2-dicloroethan ....... 16
Sơ đồ 1.12. Phản ứng tổng hợp natri 2-cloroethansulfonat từ carbyl sulfat ............. 17
Sơ đồ 1.13. Phản ứng tổng hợp mesna qua trung gian 2-S-thiouroni ethansulfonat 18
Sơ đồ 1.14. Phản ứng tổng hợp mesna qua trung gian thioester sử dụng NH3 ......... 20
Sơ đồ 1.15. Phản ứng tổng hợp mesna qua trung gian thioester sử dụng HCl ......... 22
Sơ đồ 1.16. Phản ứng tổng hợp mesna qua trung gian muối xanthat ....................... 22
Sơ đồ 1.17. Phản ứng tổng hợp muối của ethyl-2-sulfoethylxanthat ....................... 22
Sơ đồ 1.18. Tổng hợp mesna từ ethyl-2-sulfoethyl xanthat theo tác giả Schramm .. 23
Sơ đồ 1.19. Tổng hợp mesna qua trung gian muối xanthat theo tác giả J. Leveque hướng 1 ..................................................................................................................... 23
Sơ đồ 1.20. Phản ứng tổng hợp mesna qua trung gian muối xanthat tác giả J. Leveque
- hướng 2 ................................................................................................................... 24
Sơ đồ 1.21. Phản ứng tổng hợp mesna từ natri vinylsulfonat ................................... 25
Sơ đồ 1.22. Phản ứng tổng hợp nhóm thiol từ trithiocarbonat ................................. 26
Sơ đồ 1.23. Phản ứng thủy phân trithiocarbonat trong môi trường kiềm ................. 26
Sơ đồ 1.24. Phản ứng tổng hợp poly-(N-isopropylacrylamid)thiol .......................... 27

xiv

Sơ đồ 1.25. Phản ứng của ethanolamin và trithiocarbonat ....................................... 27
Sơ đồ 1.26. Phản ứng tổng hợp nhóm thiol từ muối Bunte ...................................... 27
Sơ đồ 1.27. Phản ứng tổng hợp acid 2,3-dimercaptosuccinic qua muối Bunte ........ 28
Sơ đồ 1.28. Phản ứng tổng hợp nhóm thiol qua muối thiouroni ............................... 28
Sơ đồ 1.29. Phản ứng tổng hợp thiol từ thioester ..................................................... 29
Sơ đồ 1.30. Phản ứng tổng hợp nhóm thiol từ alken và hydrogen sulfid ................. 29
Sơ đồ 1.31. Phản ứng tổng hợp dimercaprol ............................................................ 30
Sơ đồ 1.32. Phản ứng tổng hợp tiopronin từ 2-bromopropionyl bromid .................. 30
Sơ đồ 2.1. Các con đường thực nghiệm tổng hợp mesna ......................................... 41
Sơ đồ 2.2. Phản ứng tổng hợp natri 2-cloroethansulfonat (2) từ 1 ........................... 42
Sơ đồ 2.3. Các phản ứng tổng hợp mesna qua trung gian muối 2-S-thiouroni ......... 42
Sơ đồ 2.4. Các phản ứng tổng hợp mesna qua trung gian thioester .......................... 42
Sơ đồ 2.5. Các phản ứng tổng hợp mesna qua trung gian muối Bunte..................... 43
Sơ đồ 2.6. Các phản ứng tổng hợp mesna qua trung gian muối alkyltrithiocarbonat43
Sơ đồ 2.7. Nguyên tắc của phương pháp chuẩn độ thể tích ...................................... 45
Sơ đồ 3.1. Phương pháp tổng hợp mesna qua trung gian alkyl trithiocarbonat ........ 73
Sơ đồ 3.2. Qui trình tổng hợp mesna qua trung gian alkyl trithiocarbonat từ natri 2cloroethansulfonat qui mô 200g/mẻ.......................................................................... 95
Sơ đồ 4.1. Phản ứng Strecker tổng hợp muối alkyl sulfonat [125]......................... 115
Sơ đồ 4.2. Phản ứng tạo dinatri 1,2-ethandisulfonat ............................................... 116
Sơ đồ 4.3. Cơ chế phản ứng tổng hợp 2-S-thiouroni ethansulfonat [124] .............. 117
Sơ đồ 4.4. Cơ chế hình thành muối thiocyanat trong môi trường nước [110] ........ 117
Sơ đồ 4.5. Cơ chế phản ứng amoniac phân 2-S-thiouroni ethansulfonat [2] .......... 118
Sơ đồ 4.6. Phản ứng tạo sản phẩm phụ dimesna trong môi trường NH4OH .......... 119
Sơ đồ 4.7. Phản ứng trao đổi ion loại cation guanidini ........................................... 120
Sơ đồ 4.8. Cơ chế hình thành disulfid trong môi trường kiềm từ thiol [61], [103] 120
Sơ đồ 4.9. Cơ chế S-alkyl hóa tổng hợp thioester (5) [11] ..................................... 121
xv


Sơ đồ 4.10. Cơ chế amoniac phân thioester sử dụng tác nhân NH3 [103] .............. 122

Sơ đồ 4.11. Cơ chế phản ứng (SN2) tổng hợp muối Bunte từ natri 2-cloroethansulfonat
và natri thiosulfat [58] ............................................................................................. 123
Sơ đồ 4.12. Phản ứng tạo sản phẩm phụ natri O-(2-sulfonatoethyl) sulfothioat .... 124
Sơ đồ 4.13. Cơ chế phản ứng thủy phân natri S-(2-sulfonatoethyl)sulfurothioat tạo
acid 2-mercaptoethansulfonic [58] ......................................................................... 125
Sơ đồ 4.14. Cơ chế hình thành alkyl trithiocarbonat 7, 7a [41], [126] ................... 126
Sơ đồ 4.15. Cơ chế tạo mesna trong ethanol khi tinh chế chất 7 [51] .................... 128
Sơ đồ 4.16. Cơ chế thủy phân monoalkyl trithiocarbonat 7 thành mesna [41] ...... 130
Sơ đồ 4.17. Phản ứng phân hủy natri trithiocarbonat trong môi trường acid ......... 131
Sơ đồ 4.18. Cơ chế hình thành chất 6a [88]............................................................ 137
Sơ đồ 4.19. Cơ chế khóa ion kim loại của dinatri edetat ........................................ 150

xvi


ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo thống kê của tổ chức Y tế thế giới tỉ lệ các bệnh nhân ung thư ngày càng
gia tăng [13]. Các oxazaphosphorin như ifosfamid (IFM), cyclophosphamid (CYP)
có tác dụng hiệu quả trên nhiều loại ung thư khác nhau. Tuy nhiên nhóm dược chất
này gây độc tính cao trên tủy xương, thận và bàng quang [4], [9], [77]. Mesna (natri
2-mercaptoethansulfonat) là thuốc được chỉ định bắt buộc trong quá trình trị liệu, do
tương tác với các chất chuyển hóa (bao gồm cả acrolein) của các thuốc kháng ung
thư, làm giảm độc đối với đường tiết niệu [4]. Ưu điểm lớn nhất khi sử dụng mesna
là vừa có hiệu lực cao chống lại độc tính trên bàng quang của acrolein, hạn chế được
tác dụng không mong muốn của CYP và IFM, vừa không ảnh hưởng đến tác dụng
của các thuốc ung thư dùng đồng thời [4], [25], [31], [71], [78], [85], [133].
Cấu tạo của mesna có hai nhóm chức thiol và sulfonat, được nối bởi cầu ethylen.
Tuy cấu trúc đơn giản, nhưng dược chất này lại rất dễ bị oxy hóa, đặc biệt là trong
môi trường giàu khí oxy [61], [103]. Do vậy cần có biện pháp để tổng hợp, tinh chế
nguyên liệu đạt tiêu chuẩn và chống oxy hóa dược chất trong các dạng bào chế.

Sản xuất nguyên liệu làm thuốc ở Việt Nam còn thiếu do rất nhiều nguyên nhân
như qui trình sản xuất chưa khả thi, việc tinh chế loại tạp chất chưa đạt yêu cầu và
giá thành nguyên liệu còn cao so với các nước trên thế giới... Mesna nằm trong danh
mục thuốc thiết yếu của Việt Nam lần thứ VI với dạng bào chế viên nén 400 mg, 600
mg và dung dịch tiêm 100 mg/ml [7]. Là một dược chất được sử dụng nhiều trong
điều trị nhưng mesna chưa được nghiên cứu và sản xuất trong nước. Do vậy, vấn đề
nghiên cứu cải tiến các qui trình tổng hợp đã được công bố trên thế giới và tìm kiếm
các phương pháp mới tổng hợp mesna hướng đến sản xuất nguyên liệu và bào chế
thành phẩm trong nước là việc làm cần thiết. Từ thực tế đó, luận án được tiến hành
nhằm xây dựng các phương pháp tổng hợp mới, cải tiến qui trình tổng hợp cũ để thu
được nguyên liệu mesna ứng dụng trong bào chế thuốc tiêm. Các mục tiêu của luận
án như sau:
1. Thiết kế được phương pháp mới tổng hợp mesna.
2. Xây dựng được qui trình tổng hợp mesna qui mô 200 g/mẻ đạt tiêu chuẩn dược
dụng.
3. Đánh giá được độc tính cấp, độ ổn định của nguyên liệu mesna.
4. Xây dựng được công thức bào chế và đề xuất tiêu chuẩn cơ sở dung dịch tiêm
mesna 100 mg/ml.
Để hoàn thành được những mục tiêu trên, luận án cần thực hiện những nội dung
sau:
1


1. Tổng quan về các phương pháp tổng hợp mesna đã được công bố, các phương
pháp tạo nhóm thiol, đối sánh giữa các phương pháp, lựa chọn và đề xuất phương
pháp mới tổng hợp mesna.
2. Khảo sát các qui trình tổng hợp mesna bao gồm các phương pháp mới và một
số phương pháp đã công bố. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng và lựa chọn các phản ứng
tốt nhất.
3. Tìm kiếm các phương pháp thích hợp để tinh chế mesna đạt tiêu chuẩn Dược

điển Anh 2015.
4. Phân tích, đánh giá, lựa chọn phương pháp để xây dựng qui trình tổng hợp
mesna 200 g/mẻ.
5. Đánh giá độc tính của nguyên liệu mesna được tổng hợp theo phương pháp
mới.
6. Theo dõi độ ổn định của nguyên liệu mesna tổng hợp được.
7. Bào chế dung dịch tiêm mesna 100 mg/ml: xây dựng công thức và phương
pháp bào chế, đề xuất tiêu chuẩn cơ sở và phương pháp kiểm tra chất lượng, theo dõi
độ ổn định của dung dịch tiêm pha chế ở qui mô phòng thí nghiệm.

2


Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về mesna
1.1.1. Nguồn gốc và tính chất lý hóa
Mesna được tổng hợp và xác định cấu trúc từ năm 1954. Nghiên cứu lâm sàng
tác dụng bảo vệ đường tiết niệu của mesna được thực hiện bởi Bộ môn Dược lý của
Trường Đại học Bielefeld - Asta-Werke A.G. (nay là Frankfurt - ASTA Medica A.G.)
từ cuối năm 1970 [78] và bắt đầu đưa vào sử dụng từ những năm 1980 [109].
1.1.1.1. Tính chất vật lý
- Cấu trúc hóa học

- Công thức phân tử: C2H5NaO3S2
- Khối lượng phân tử: 164,17 đvC.
- Thành phần: C 14,63%; H 3,07%; Na 14,00%; O 29,24%; S 39,06%
- Tên khoa học: natri 2-sulfanylethansulfonat, natri 2-mercaptoethansulfonat.
- Mesna là bột kết tinh màu trắng hoặc vàng nhạt, dễ hút ẩm.
- Độ tan: tan tự do trong nước, không tan trong cyclohexan [116].
- Tiêu chuẩn kiểm nghiệm của nguyên liệu mesna theo BP 2015 như sau [116]:

+ Tính chất: Bột kết tinh màu trắng hoặc hơi vàng, hút ẩm, dễ tan trong nước, hơi
tan trong ethanol 96%, không tan trong cyclohexan.
+ Định tính: Phổ hồng ngoại của mẫu thử phải phù hợp với phổ hồng ngoại của
mesna chuẩn. Chế phẩm phải thể hiện phản ứng định tính của natri.
+ Độ trong và màu sắc của dung dịch (dd): phải đạt theo qui định.
+ pH: từ 4,5 - 6,0 (dd 10% trong nước).
+ Mất khối lượng do làm khô: không quá 1,0%.
+ Clorid: không quá 250 ppm.
+ Sulfat: không quá 500 ppm.
+ Dinatri edetat: không quá 500 ppm.
+ Kim loại nặng: không quá 10 ppm.
+ Tạp chất liên quan: tạp C không quá 0,2%; tạp D không quá 3,0 %; tạp A, B, E
không quá 0,3%; tạp khác không quá 0,1%; tổng tạp khác không quá 0,3%. Công
thức các tạp như sau:
Tạp A: Acid 2-(carbamimidoylsulfanyl)ethansulfonic

3


Tạp B: Acid 2-[[(guanidino)(imino)methyl]sulfanyl]ethansulfonic

Tạp C: Acid 2-(acetylsulfanyl)ethansulfonic

Tạp D: Acid 2,2’-(disulfandiyl)bisethansulfonic

Tạp E: Acid 2-(4,6-diamino-1,3,5-triazin-2-yl)sulfanylethansulfonic

+ Định lượng: chế phẩm phải chứa từ 96,0 - 102,0% theo chế phẩm đã làm khan.
1.1.1.2. Tính chất hóa học
Mesna là hợp chất có chứa nhóm thiol, vì vậy hóa tính của nó thể hiện tính chất

của nhóm này. Nhóm thiol tương tự như nhóm hydroxyl, với nguyên tử oxy được
thay thế bởi nguyên tử lưu huỳnh, cùng phân nhóm trong bảng hệ thống tuần hoàn
các nguyên tố hóa học, nên có thể tạo ra thioether, thioester…
a) Tính acid
Hợp chất chứa nhóm thiol thể hiện tính acid rất rõ rệt (đặc biệt là trong môi trường
có pH từ 10-11) vì thế trong môi trường base sẽ tạo ra các anion thiolat [87].
Dung dịch mesna 10% trong nước có pH từ 4,5-6 [82], [116].
b) Tính khử (dễ bị oxy hóa)
▪ Oxy hóa bởi các hợp chất peroxyd
Các sản phẩm hình thành trong hầu hết các trường hợp là disulfid, có thể dễ dàng
bị oxy hóa mạnh hơn bằng các chất oxy hóa dư thừa [63]. Nghiên cứu cho thấy tốc
độ phản ứng không phụ thuộc nồng độ thiol và tỉ lệ nghịch với căn bậc 2 của nồng độ
H+ [61], [103]. Điều này cho thấy bước chậm trong phản ứng liên quan đến sự hình
thành của các gốc linh động của peroxyd [20].
Một số ý kiến cho rằng phản ứng được tăng tốc độ khi có xúc tác là ion kim loại
nặng và giảm tốc độ khi có mặt các muối edetat [61], [103].

4


▪ Oxy hóa bởi các halogen
Các sản phẩm của quá trình oxy hóa nhóm thiol bằng các halogen khác nhau phụ
thuộc halogen và chất phản ứng. Các dd nước clo và brom phản ứng với thiol tạo
thành sulfonyl halogenid và acid sulfonic. Trong điều kiện khan nước tạo thành
disulfid, nếu halogen dư tạo thành trihalogen. Nếu thủy phân các trihalogen thu được
sản phẩm là các acid có lưu huỳnh (sơ đồ 1.1) [103].

Trong điều kiện khan:

Sơ đồ 1.1. Phản ứng oxy hóa các hợp chất thiol bởi các halogen

▪ Oxy hóa bởi các ion và oxid kim loại
Phức hợp Fe3+ như [Fe(CN)6]3- và sắt octanoat, oxy hóa thiol thành disulfid khi
không có mặt oxy (sơ đồ 1.2).

Sơ đồ 1.2. Phản ứng tạo disulfid với tác nhân là ion kim loại và oxid kim loại

Quá trình oxy hóa thiol bởi [Fe(CN)6]3- trong môi trường kiềm và acid đã được
nghiên cứu. Trong cả hai trường hợp disulfid là sản phẩm oxy hóa. Giống như các
ion sắt, các ion kim loại nặng khác trong trạng thái oxy hóa cao hơn của nó cũng phản
ứng với thiol để tạo ra các disulfid tương ứng, ví dụ Ce4+, Co3+ và V5+ trong môi
trường acid [121], [122]. Một số lượng lớn các oxid kim loại như MnO2, PbO2, CrO3,
Fe2O3, Co2O3, CuO oxy hóa thiol ở nhiệt độ thấp trong cloroform hoặc xylen để tạo
thành disulfid. Trong đó MnO2 là tác nhân mạnh nhất [103].
▪ Oxy hóa bằng khí oxy
Phản ứng oxy hóa bằng khí oxy được xúc tác bởi một số chất như: base, amin,
ion kim loại nặng.

5


- Xúc tác base: Tỉ lệ hấp thụ oxy của thiol nhanh hơn ở lúc đầu và đạt đến một
giá trị cố định sau khi phản ứng 20-30%. Điều này được giải thích do disulfid được
bổ sung tối đa vào môi trường phản ứng. Cơ chế phản ứng như sau [61], [103]:

Sơ đồ 1.3. Cơ chế oxy hóa nhóm thiol trong môi trường base

Tỉ lệ tiêu thụ oxy phụ thuộc nhiệt độ. Trong trường hợp nồng độ kiềm cao, khả
năng tiêu thụ oxy tăng lên 152% hình thành disulfid. Tốc độ oxy hoá dithiol và
monothiol phụ thuộc vào pH, pH càng cao thì tốc độ oxy hóa càng nhanh [61], [82].

- Xúc tác amin: Quá trình oxy hóa nhóm thiol được xúc tác bởi alkylamin, hình
thành "muối" alkylamin-thiol [91]. Nhóm -SH bị oxy hóa bởi oxy không khí nên tạo
thành disulfid và nước đồng thời có sự tái tạo amin. Tốc độ oxy hoá thiol phụ thuộc
nồng độ amin [61], [97], [123].

- Xúc tác ion kim loại: Việc thêm các muối kim loại nặng vào dd của các thiol
trong môi trường base làm tăng tỉ lệ hấp thu oxy. Quá trình oxy hóa chỉ tạo thành
disulfid mà không có bất kỳ sản phẩm nào khác (sơ đồ 1.4). Tăng nồng độ ion kim
loại, tỉ lệ hấp thu oxy không tăng theo. Tỉ lệ hấp thu oxy không phụ thuộc vào các
thiol nhưng lại khác nhau đối với các kim loại khác nhau [103].

Sơ đồ 1.4. Cơ chế oxy hóa nhóm thiol xúc tác bởi ion kim loại

Vai trò của ion kim loại là tạo phức chelat với nhóm thiol sau đó bị oxy hóa bởi
oxy tạo thành disulfid. Ngoài ra quá trình oxy hóa các hợp chất thiol còn được xúc
tác bởi dẫn chất của quinon, alken…[61], [103].

6


▪ Oxy hóa do bức xạ

Khi chiếu xạ tia 2500Å liên kết S-H bị đứt cung cấp gốc thioyl và nguyên tử
hydro. Sản phẩm chính của phản ứng là disulfid và phân tử hydro [103], [115].
▪ Oxy hóa bởi dimethylsulfoxid và các sulfoxid khác
Nghiên cứu cho thấy rằng, thiol bị oxy hóa bởi DMSO tạo thành disulfid tương
ứng với hiệu suất cao và dimethyl sulfid. Kết quả cho thấy tốc độ oxy hoá phụ thuộc
vào nồng độ acid trong thiol và mối tương quan giữa các pKa. Mức oxy hóa phụ
thuộc vào cấu trúc của sulfoxid [103], [120].

Theo một số tác giả, bước chậm trong quá trình là phản ứng cộng, tiếp theo là
một phản ứng nhanh với một phân tử thứ hai của thiol [82].
c) Vai trò như một hợp chất nuclephil
Nhóm thiol trong phân tử cũng đóng vai trò như một nucleophil, nên có thể tham
gia các phản ứng cộng hoặc phản ứng thế [2], [82].
1.1.2. Các phương pháp định lượng mesna
Nhóm thiol trong mesna rất dễ bị oxy hóa, có thể định lượng bằng phương pháp
chuẩn độ thể tích. Phương pháp này được Dược điển Anh 2015 [116], Dược điển Mỹ
38 [117] sử dụng để định lượng mesna nguyên liệu với chất oxy hóa là iod trong môi
trường acid. Iod dư được chuẩn độ bằng natri thiosulfat, chất chỉ thị màu là hồ tinh
bột [116].
Mesna là một chất không có đỉnh hấp thụ vùng UV-VIS [32], vì vậy các phương
pháp định lượng mesna bằng quang phổ hấp thụ tử ngoại đều đo hấp thụ dẫn chất của
mesna với các hợp chất khác nhau. Tác giả Skowen và cộng sự [111] đã định lượng
mesna trong dịch sinh học, sử dụng N, N-dimethyl-p-phenylendiamin trong môi
trường acid với sự có mặt của chất oxy hóa Fe3+, đo quang ở bước sóng 490 nm [111].
Mesna trong chế phẩm hoặc nguyên liệu đã được oxy hóa bằng các tác nhân thích
hợp sau đó sử dụng các chất tạo phức như Fe3+ và kali rhodanat (λ = 480 nm) [127],
natri hipoclorit và methyl da cam (λ = 505 nm) hoặc đỏ công-gô (λ = 605 nm) [14],
4-cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (λ = 414 nm), 2,4-dinitrofluorobenzen (λ =
332nm), 1,10-phenanthrolin, bạc và eosin ( λ = 547 nm), 1,10-phenanthrolin, bạc và
đỏ bromopyrogallol (λ = 635 nm) [42] hay oxy hóa trực tiếp bởi ceri [95].

7