(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu và phân loại cây bảy lá một hoa (Paris) thu thập ở Lai Châu

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGÔ THÙY LINH

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, GIẢI PHẪU
VÀ PHÂN LOẠI CÂY BẢY LÁ MỘT HOA (PARIS)
THU THẬP Ở LAI CHÂU

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên, năm 2018


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGÔ THÙY LINH

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, GIẢI PHẪU
VÀ PHÂN LOẠI CÂY BẢY LÁ MỘT HOA (PARIS)
THU THẬP Ở LAI CHÂU

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 8 42 01 21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Vũ Thị Thu Thủy

Thái Nguyên, năm 2018

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự
hướng dẫn của PGS.TS Vũ Thị Thu Thủy. Các kết quả nghiên cứu là trung
thực và chưa được công bố ở bất cứ công trình nào khác.
Thái Ngun, tháng 11 năm 2018
Tác giả

Ngơ Thùy Linh

i


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS. Vũ Thị Thu Thủy,
khoa Sinh học trường Đại học sư phạm Thái Nguyên là người đã chỉ bảo,
hướng dẫn em suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô khoa Sinh
học, Trường Đại học Sư Phạm - ĐH Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn,
truyền dạy kiến thức cho em trong suốt khóa học.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy giáo, cô giáo trong Ban
giám hiệu trường Đại học Sư phạm - ĐH Thái Nguyên, thầy, cơ các phịng ban
chức năng đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong thời gian học tập tại trường.
Cuối cùng, xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới bạn bè và gia đình đã
ln quan tâm, động viên, ủng hộ và giúp đỡ em.
Luận văn là sản phẩm của đề tài cấp Bộ có mã số B2017-TNA-04-QG do
PGS.TS Vũ Thị Thu Thủy bộ môn Sinh học hiện đại và Giáo dục sinh học làm
chủ nhiệm.
Thái Nguyên, tháng 11 năm 2018

Tác giả

Ngô Thùy Linh

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................... ii
MỤC LỤC ..........................................................................................................iii
DANH MỤC NHỮNG TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT ............................................. iv
DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................. v
DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................. vi
MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1
1. Lý do chọn đề tài ............................................................................................. 1
2. Mục tiêu của đề tài........................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 2
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 4
1.1. Giới thiệu chung về cây Bảy lá một hoa ...................................................... 4
1.1.1. Đặc điểm, phân loại cây Bảy lá một hoa ................................................... 4
1.1.2. Phân bố, vai trò của cây Bảy lá một hoa ................................................... 5
1.2. Các phương pháp định danh thực vật ........................................................... 6
1.2.1. Phương pháp so sánh hình thái, giải phẫu ................................................. 7
1.2.2. Phương pháp sinh học phân tử .................................................................. 8
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 14
2.1. Vật liệu thực vật.......................................................................................... 14
2.2. Địa điểm nghiên cứu, hóa chất và thiết bị .................................................. 14
2.2.1. Địa điểm nghiên cứu................................................................................ 14
2.2.2. Hóa chất, dụng cụ .................................................................................... 14

2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 14
2.3.1. Phương pháp hình thái, giải phẫu ............................................................ 15
2.3.2. Phương pháp sinh học phân tử ................................................................ 15
2.3.3. Phương pháp phân tích trình tự nucleotide ............................................. 18

iii


Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .......................... 19
3.1. Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái và giải phẫu cây Bảy lá một hoa . 19
3.1.1. Đặc điểm hình thái của mẫu cây Bảy lá một hoa .................................... 19
3.1.2. Đặc điểm giải phẫu của mẫu cây Bảy lá một hoa ................................... 20
3.2. Kết quả nghiên cứu đặc điểm mã vạch DNA của mẫu cây Bảy lá một hoa .. 23
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số .............................................................. 23
3.2.2. Kết quả khuếch đại và phân tích trình tự nucleotide đoạn gen matK ..... 23
3.2.3. Kết quả khuếch đại và phân tích trình tự nucleotide vùng gen ITS ........ 29
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................. 34
1. Kết luận .......................................................................................................... 34
2. Đề nghị........................................................................................................... 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 35

iv


DANH MỤC NHỮNG TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT
CBOL

:

Consortium for the Barcode of Life

DNA

:

Deoxyribonucleic acid

ITS

:

Internal Transcribed Spacer

kb

:

Kilobase

matK

:

MaturaseK

NCBI

:

The National Center for Biotechnology Information

PCR

:

Polymerase Chain Reaction

rpoC

:

Retained products of conception

SH

:

Sìn Hồ

iv


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Mồi matK sử dụng trong kỹ thuật PCR ............................................ 17
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR ............................................................... 17
Bảng 2.3. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR....................................................... 17
Bảng 2.4. Mồi ITS sử dụng trong kỹ thuật PCR ................................................ 18
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR ............................................................... 18
Bảng 2.6. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR....................................................... 18
Bảng 3.1. Một số trình tự đoạn gen matK sử dụng để xác định độ tương

đồng và sai khác với mẫu SH .............................................................. 27
Bảng 3.2. Độ tương đồng và phân ly dựa trên trình tự gen matK ..................... 27
Bảng 3.3. Một số trình tự vùng gen ITS sử dụng để xác định độ tương đồng
và sai khác với mẫu SH ....................................................................... 32
Bảng 3.4. Độ tương đồng và phân ly dựa trên trình tự vùng gen ITS ............... 32

v


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1: Mơ hình thí nghiệm tổng quát ........................................................... 15
Hình 3.1. Hình thái cơ quan sinh dưỡng của mẫu cây Bảy lá một hoa thu
thập ở huyện Sìn Hồ, tỉnh Lai Châu .................................................... 19
Hình 3.2. Cấu tạo giải phẫu cuống lá ................................................................ 20
Hình 3.3. Cấu tạo giải phẫu thân ....................................................................... 21
Hình 3.4. Cấu tạo giải phẫu rễ ........................................................................... 22
Hình 3.5. Kết quả tách chiết DNA tổng số của cây Bảy lá một hoa ................. 23
Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại gen matK bằng kỹ thuật PCR .... 24
Hình 3.7. Kết quả Blast trình tự gen matK ........................................................ 25
Hình 3.8. Trình tự nucleotide của đoạn gen matK phân lập từ mẫu cây Bảy
lá một hoa thu thập ở Sìn Hồ, Lai Châu .............................................. 26
Hình 3.9. Sơ đồ mô tả mối quan hệ di truyền giữa các loài Bảy lá một hoa
trong chi Paris dựa trên trình tự nucleotide của đoạn gen matK. ....... 28
Hình 3.10. Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại vùng gen ITS bằng kỹ
thuật PCR............................................................................................. 29
Hình 3.11. Kết quả Blast trình tự vùng gen ITS ................................................ 30
Hình 3.12. Trình tự nucleotide của vùng gen ITS phân lập từ mẫu cây Bảy
lá một hoa thu thập ở Sìn Hồ, Lai Châu .............................................. 31
Hình 3.13. Sơ đồ mơ tả mối quan hệ di truyền giữa các mẫu cây Bảy lá một
hoa trong chi Paris dựa trên trình tự nucleotide của vùng ITS ........... 33

vi


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Bảy lá một hoa là tên gọi chung của các mẫu cây thuộc chi Paris. Cây
Bảy lá một hoa còn gọi là Thất diệp nhất chi mai, Độc cước liên, Thiết đăng đài,
Chi hoa đầu, Tảo hưu, Thảo hà xa, Trọng lâu, Thất tử liên, Đăng đài thất, Cúa dô
(H’Mông)…. Hiện nay, chi Paris được cơng bố có 24 lồi, mỗi lồi gồm nhiều
giống khác nhau. Chỉ riêng loài Paris polyphylla kết quả thống kê cho thấy đã có
8 giống. Nhiều giống được mơ tả chi tiết về mặt hình thái, đó là căn cứ ban đầu
để nhận dạng và phát hiện sự có mặt của các cây quý hiếm này [30].
Ở Việt Nam, cây Bảy lá một hoa được tạm gọi tên khoa học là Paris
polyphylla Sm. [12], [30]. Đây là những loài thảo mộc có giá trị trong chữa một
số bệnh như cầm ho, giảm cơn hen, cầm máu, ức chế trực khuẩn lị, thương
hàn… Đặc biệt, chữa cả một số bệnh nan y như ung thư, rắn cắn... chính vì có
nhiều giá trị mà hiện tại cây Bảy lá một hoa đang bị khai thác bừa bãi, có nguy
cơ tuyệt chủng. Từ năm 1999, Phạm Hồng Hộ mơ tả đặc điểm hình thái của 5
lồi [5]. Đến năm 2016, Nguyễn Quỳnh Nga và cộng sự lập khóa phân loại chi
tiết cho 8 loài và 2 giống [20]. Tuy nhiên, tiềm năng của cây Bảy lá một hoa ở
Việt Nam còn khá phong phú và cần thiết được khai thác thêm.
Có nhiều phương pháp có thể định danh thực vật làm thuốc đảm bảo độ
chính xác và hiệu quả. Các phương pháp thường dùng như nghiên cứu và so
sánh các đặc điểm về hình thái, giải phẫu, sinh lý, hóa sinh... hướng nghiên cứu
này đã thành công trên một số đối tượng cây trồng như cây Ngô đồng đỏ, Rong
câu chỉ, Ráng thư dực [2], [3], [4]… Tuy nhiên, khi cây không cịn ngun vẹn,
hay đã được chế biến thì phương pháp nhận diện này sẽ kém hiệu quả.
Sự phát triển của công nghệ sinh học hiện đại trong những năm gần đây
có bổ sung vào hệ thống phân loại sinh vật phương pháp phân loại học phân tử.

Đây là phương pháp có độ chính xác cao, đặc biệt rất cần đối với thực vật dùng
làm thuốc muốn xác định ở cấp độ loài, ngay cả khi đã được chế biến. Việc xác

1


định chính xác tên lồi là một bước quan trọng để có thể đảm bảo về chất lượng
sản phẩm. Bên cạnh đó, kết quả nhận diện có vai trị quan trọng trong việc bảo
tồn các lồi có nguy cơ tuyệt chủng.
Mã vạch DNA là một phương tiện nhận biết mới của sinh học phân tử.
Một số mã vạch DNA được nghiên cứu và ứng dụng có hiệu quả trong phân
loại các cây dược liệu như matK, rpoC1, trnH-psbA, ITS, rbcL… Theo đó gen
matK nằm trong lục lạp mã hóa cho enzyme mature K. Nhiều nghiên cứu đã sử
dụng gen matK trong việc định loại cây trồng và cũng mang lại những thành
tựu nhất định [11], [24],… Vùng gen ITS bao gồm trình tự ITS1-5.8S-ITS2
cũng là đối tượng được nghiên cứu nhiều. Hiện nay, số lượng các trình tự
nucleotide của vùng ITS đã được công bố trong ngân hàng gen thế giới khá
phong phú, thuận lợi cho việc phân tích so sánh. Các nghiên cứu phát sinh loài
thực vật dựa trên vùng gen ITS ở cây Đẳng sâm, cây Dâu, Nấm và nhiều thực
vật khác là minh chứng cho vai trò của vùng gen ITS trong nhận diện cây trồng
[13], [25], [33].
Tỉnh Lai Châu là một tỉnh miền núi phía bắc Việt Nam được phát hiện có
sự có mặt của cây Bảy lá một hoa [20]. Mẫu cây thu được có những đặc điểm gì
và thuộc lồi nào là câu hỏi được đặt ra trong nghiên cứu này. Xuất phát từ
những lý do trên, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm hình thái,
giải phẫu và phân loại mẫu cây Bảy lá một hoa (Paris) thu thập ở Lai Châu”.
2. Mục tiêu của đề tài
Xây dựng được dữ liệu về đặc điểm hình thái, giải phẫu và đặc điểm của
đoạn gen matK, vùng gen ITS dùng trong phân loại thực vật phục vụ nhận dạng
cây Bảy lá một hoa.

3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu đặc điểm hình thái và giải phẫu cơ quan sinh dưỡng cây
Bảy lá một hoa thu thập tại huyện Sìn Hồ, tỉnh Lai Châu.
- Nghiên cứu xác định trình tự nucleotide của đoạn gen matK.

2


- Nghiên cứu xác định trình tự nucleotide của vùng gen ITS.
- Nghiên cứu xác định mối quan hệ của mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập
được dựa trên phân tích trình tự nucleotid của đoạn gen matK và vùng gen ITS
nghiên cứu.

3


Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về cây Bảy lá một hoa
1.1.1. Đặc điểm, phân loại cây Bảy lá một hoa
Cây Bảy lá một hoa là thực vật thuộc ngành Magnoliophyta (Mộc lan,
Hạt kín), lớp Liliopsida (Hành), bộ Dioscoreales (Củ nâu), họ Trilliaceae
(Trọng lâu), chi Paris (Bảy lá một hoa).
Chi Paris hiện tại được cơng bố có 22 lồi, trong đó gồm nhiều giống
khác nhau [16]. Chỉ riêng loài Paris polyphylla kết quả thống kê cho thấy đã
gồm 8 giống. Các giống khác nhau về số lượng, hình dạng lá và sự phân bố
[32]. 8 giống thuộc loài Paris polyphylla gồm:
Giống

Phân bố

Paris polyphylla var. Alba

Quý Châu, Hồ Bắc, Vân Nam

Paris polyphylla var. chinensis

An Huy, Phúc Kiến, Quảng Đông, Quảng
Tây, Quý Châu, Hồ Bắc, Hồ Nam , Giang
Tô, Giang Tây, Tứ Xuyên, Đài Loan, Vân
Nam, Lào, Myanmar, Thái Lan, Việt Nam

Paris polyphylla var. latifolia

An Huy, Hà Nam, Hồ Bắc, Giang Tây,
Thiểm Tây, Sơn Tây

Paris polyphylla var. nana

Tứ Xuyên

Paris polyphylla var. panxiensis

Tứ Xuyên

Paris polyphylla var. polyphylla

Trung Quốc , Himalayas, phía bắc Đông
Dương

Parispolyphylla var. stenophyla

Trung Quốc, Bhutan, Assam, Nepal,
Myanmar, Sikkim

Paris polyphylla var.yunnanensi

- Quý Châu, Tứ Xuyên, Tây Tạng, Vân
Nam, Assam, Myanmar

4


Tên khoa học là Paris polyphylla Sm. Tên đồng nghĩa Daiswa polyphylla
(Smith) Raf. Tên khác như Thất diệp nhất chi mai, Độc cước liên, Thiết đăng
đài, Chi hoa đầu, Tảo hưu, Thảo hà xa, Trọng lâu, Thất tử liên, Đăng đài thất,
Cúa dô (H’Mông)… cũng được sử dụng để gọi về cây Bảy lá một hoa [12], [30].
Ở Việt Nam, từ năm 1999, Phạm Hồng Hộ đã mơ tả đặc điểm hình thái
của 5 lồi. Các lồi đó là Paris delavayi, Paris polyphylla, Paris fargesii, Paris
yunanensis, Paris hainanensis [5]. Đến năm 2016, Nguyễn Quỳnh Nga và cộng
sự đã lập khóa phân loại chi tiết cho 8 loài và 2 giống [20]. Các nghiên cứu về
cây Bảy lá một hoa đều khẳng định tiềm năng của cây Bảy lá một hoa ở Việt
Nam còn khá phong phú và cần thiết được khai thác thêm.
Bảy lá một hoa là loại cây một lá mầm, thân thảo, sống lâu năm. Từ củ
nổi lên mặt đất một thân mọc thẳng, cao chừng 0,3-0,8 m, thân thon dài, trơn
nhẵn, khơng có cành, phía gốc có 1 số lá thối hóa thành vảy bao lấy thân cây.
Thân mềm, mọng nước. Phần thân trên mặt đất của cây lụi hàng năm vào cuối
mùa thu. Củ có ngấn, phình to, cứ mỗi năm có thêm 1 đốt hiện ra rõ ràng, màu
xám đen. Rễ mềm, mọc dày theo củ. Giữa thân có 1 tầng lá mọc vịng, thường
từ 4 đến 9 lá. Cuống lá dài 2-3 cm, màu tím. Phiến lá hình mác, hình trứng, bầu

dục,… dài 20-23 cm, rộng 6-7 cm. Đầu phiến lá nhọn, mặt trên màu xanh đậm,
mặt dưới màu nhạt hơn. Hoa mọc trên đỉnh cây, cuống hoa dài 14 cm. Lá đài
bằng số cánh tràng. Nhụy màu tím đỏ, bầu có 3 ngăn. Nhị mảnh, có bao phấn
màu vàng nâu, xếp thành 2 vịng, xen kẽ nhau, mỗi vịng có 5 nhị [5], [20].
1.1.2. Phân bố, vai trò của cây Bảy lá một hoa
Bảy lá một hoa là cây đặc biệt ưa ẩm và ưa bóng, thường mọc rải rác
dưới tán rừng kín thường xanh, dọc theo các bờ khe suối, trên đất ẩm nhiều
mùn. Paris là một chi nhỏ, hiện chỉ có một số loài phân bố ở vùng cận nhiệt đới
hoặc ôn đới ẩm Bắc bán cầu: Trung Quốc, Ấn Độ, Nê Pan và Myanma. Ở Việt
Nam, cây Bảy lá một hoa hầu như chỉ thấy ở các tỉnh miền núi phía bắc như
Ninh Bình, SaPa (Lào Cai), Quản Bạ (Hà Giang), Sìn Hồ (Lai Châu),… [12],
[20], [32].

5


Theo dân gian, cây Bảy lá một hoa có rất nhiều công dụng để trị một số
bệnh như: bệnh gan, ung thư phổi và thanh quản, ung thư biểu mô,… Thân rễ
Bảy lá một hoa có vị đắng, hơi cay, tính hơi lạnh, hơi độc, vào kinh can, có tác
dụng xổ hạ, lợi tiểu, tiêu đờm, thanh nhiệt, giải độc. Thân rễ của cây còn chữa
sốt, sốt rét cơn, kinh giản, giải độc [12]. Kết quả nghiên cứu dược lý hiện đại
còn cho thấy các thành phần trong cây Bảy lá một hoa có tác dụng: cầm ho,
giảm cơn hen. Chiết xuất hóa học trong thân và rễ cịn có tác dụng cầm máu, ức
chế với mức độ khác nhau đối với trực khuẩn lị, thương hàn, tụ cầu vàng, liên
cầu khuẩn đồng thời có tác dụng ức chế Leptospira và virut cúm. Ngoài ra chiết
xuất ở cây Bảy lá một hoa có tác dụng ức chế tế bào ung thư cổ tử cung [35].
Tại vùng Quảng Tây (Trung Quốc) có câu “Ốc hữu thất diệp nhất chi hoa / Độc
xà bất tiến gia” nghĩa là trong nhà có cây Bảy lá một hoa thì rắn độc khơng vào
nhà được. Ngồi cơng dụng chữa sốt và rắn độc cắn, vị tảo hưu (thân rễ của cây
Bảy lá một hoa) còn dùng chữa mụn nhọt, viêm tuyến vú, ho lao, dùng ngồi da

thì giã nát đắp lên nơi sưng đau. Ở Châu Âu người ta dùng thân, rễ và quả của
loài Paris quadrifolia làm thuốc tẩy nhưng có chất độc. Dùng với liều vừa phải,
thân, rễ và quả có tác dụng chống co thắt [30], [35].
1.2. Các phương pháp định danh thực vật
Có rất nhiều phương pháp để định danh thực vật. Các phương pháp đều
dựa trên nguyên tắc những thực vật có chung nguồn gốc thì có những tính chất
giống nhau. Thực vật càng gần nhau thì mức độ giống nhau càng nhiều. Sự
giống nhau có thể về đặc điểm hình thái, giải phẫu, sinh lý sinh hố, phơi sinh
học, ... nhưng chủ yếu dựa vào việc quan sát, so sánh và trên cơ sở mẫu vật đã
thu thập được để phân tích, tổng hợp đi đến suy diễn giả thiết. Việc quan sát, so
sánh cấu tạo của cây thường được tiến hành trong điều kiện tự nhiên và môi
trường thực nghiệm. Kỹ thuật PCR thường dùng để xác định mối quan hệ phát
sinh giữa các loài và là kỹ thuật được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu sinh
học. Việc kết hợp 2 phương pháp này sẽ có hiệu quả trong nhận diện và bảo tồn
các loài thực vật.

6


1.2.1. Phương pháp so sánh hình thái, giải phẫu
Hầu hết cấu trúc của các cơ quan đều nghiên cứu ở mức độ hiển vi, vì
vậy mà các mẫu khi sử dụng phương pháp giải phẫu đều được cắt thật mỏng,
sau đó để giữ được cấu trúc bên trong tế bào, thuận lợi cho việc quan sát người
ta thường dùng phương pháp nhuộm màu. Việc nhuộm màu này giúp chúng ta
phân biệt được các thành phần cấu tạo của các cơ quan, vì mỗi một thành phần
thì bắt một màu nhất định. Nguyên tắc của phương pháp nghiên cứu hình thái
và giải phẫu chủ yếu là dựa vào việc quan sát, so sánh và trên cơ sở mẫu vật đã
thu thập được để phân tích, tổng hợp đi đến suy diễn giả thiết. Phương pháp so
sánh hình thái, giải phẫu đã cung cấp nhiều thơng tin có giá trị trong định loại
thực vật [2], [3], [4], [6], [8].

Nghiên cứu đặc điểm hình thái cây Ngơ đồng đỏ ở Cù Lao Chàm, nhóm
tác giả Vũ Văn Dũng và Đinh Thị Phương Anh (2016) chỉ ra rằng ở Việt Nam
có 2 lồi Ngơ đồng đỏ cùng thuộc chi Firmiana khác nhau về nơi sống có sự
khác biệt về nhiều đặc điểm hình thái như thân, lá, cụm hoa, hoa, quả. Những
sự khác biệt thu được là tài liệu cung cấp cho việc nhận diện mẫu cây Ngô
đồng đỏ và làm căn cứ để sử dụng bền vững và phát triển lồi cây ngơ đồng đỏ
ở Cù Lao Chàm [2].
Năm 2006, Lê Ngọc Hân và cộng sự đã sử dụng phương pháp phân tích
đặc điểm hình thái và so sánh các đại diện họ Ban – Hypericaceae juss ở Việt
Nam, nhóm nghiên cứu đã xác định được tông và chi thuộc họ Ban. Kết quả
nghiên cứu được sử dụng làm khóa phân loại ở mức độ chi [3].
Nghiên cứu của Lê Như Hậu (2009), khi phân tích hình thái các mẫu tiêu
bản của 7 loài Rong câu chỉ ở Việt Nam phát hiện thấy có sự thay đổi lớn về
mặt hình thái. Tuy nhiên, giữa chúng vẫn có những đặc điểm chung về cấu tạo
thân, kiểu phân nhánh, hình dạng quả. Các đặc điểm hình thái ngồi cho thấy,
tuy có sự phân bố rộng khắp và được nuôi trồng dọc theo biển Việt Nam nhưng
chúng vẫn xuất phát từ cùng một loài [4].

7


Ráng thư dực (Thelypteridaceae Ching ex Pic. Serm) là một họ lớn với
khoảng 50 chi và hơn 1000 loài được phân bố ở các vùng nhiệt đới. Tại Việt
Nam, nhóm nghiên cứu của Dỗn Hồng Sơn cùng cộng sự (2017) đã sử dụng
phương pháp so sánh hình thái để mơ tả một số đặc điểm cơ bản của các chi
trong họ Ráng thư dực. Kết quả nghiên cứu đã cung cấp dữ liệu của 17 chi có ở
Việt Nam về đặc điểm hình thái, sinh thái, khu phân bố, kèm theo thơng tin về
số lượng lồi của các chi đó ở Việt Nam [8].
Chi Mua tuy là chi nhỏ nhưng những đại diện thuộc chi Mua lại có vai
trị quan trọng trong các hệ sinh thái rừng thứ sinh. Một số lồi thì làm thuốc,

lồi thì làm thực phẩm, làm cảnh. Năm 2017, Khuất Văn Quyết cùng Đỗ Thị
Xuyến đã tiến hành mơ tả đặc điểm hình thái chi Mua ở Việt Nam thơng qua
mơ tả dạng sống, hình thái lá, hình thái hoa, cụm hoa, quả, hạt của 13 lồi. Trên
cơ sở phân tích các đặc điểm hình thái đã lựa chọn được 51 đặc điểm làm cơ sở
xây dựng khóa phân loại các lồi trong chi Mua ở Việt Nam [6].
1.2.2. Phương pháp sinh học phân tử
Các phương pháp phân loại dựa trên đặc điểm hình thái đã thành cơng
trên nhiều lồi [2], [3], [4], [6], [8]. Tuy nhiên, cùng với sự phát triển của khoa
học kỹ thuật các phương pháp phân loại có độ chính xác cao hơn cũng được
chú trọng trong nghiên cứu. Phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử là
một trong những lựa chọn của nhiều nhà nghiên cứu. Theo đó, phân loại dựa
vào sinh học phân tử có nghĩa là sử dụng các phân tử lớn như DNA, RNA,
protein để làm dấu hiệu nhận biết và phân loại sinh vật.
DNA barcode là một đoạn trình tự nucleotide ngắn, từ một phần của hệ
gen và được dùng giống như cách một máy quét nhận diện các loài sinh vật.
Trọng tâm nghiên cứu barcode ở thực vật chủ yếu là về đánh giá hiệu quả
tương đối của các đoạn gen chỉ thị đã được sử dụng trong nghiên cứu phát sinh
loài. Đối với thực vật, quá trình tìm kiếm một chỉ thị DNA chung cho các lồi
thực vật gặp nhiều khó khăn. Hệ gen ty thể ở thực vật thường quá bảo thủ nên

8


khơng được dùng cho chỉ thị DNA, trong khi đó hệ gen lục lạp lại mang nhiều
đặc điểm mong muốn. Hebert P.D, nhà nghiên cứu tại Đại học Guelph ở
Ontario, Canada từ năm 2003 đã đề xuất mã vạch DNA (DNA barcode, chỉ thị
DNA) giống như một cách để xác định loài [18].
Để đảm bảo là một mã vạch DNA điển hình cần 3 yếu tố. Thứ nhất phải
có hiệu suất nhân bản cao và trình tự có tính đặc hiệu. Thứ hai phải có tính phổ
biến. Thứ ba có khả năng phân biệt được nhiều loài một cách đồng thời [28].

Sử dụng phương pháp sinh học phân tử có thể giám định được ngay cả
khi các mẫu khơng cịn nguyên vẹn. Việc kết hợp giữa chỉ thị phân tử DNA và
chỉ thị hình thái sẽ nhanh chóng xác định được sự khác biệt giữa sinh vật này
với sinh vật khác một cách chính xác [23].
Hiện nay, nhiều loại thảo dược được sử dụng rộng rãi trong việc điều trị
các bệnh, góp phần phát triển ngành cơng nghiệp dược liệu. Những cây dược
liệu luôn phải xác định ở cấp độ lồi, vì vậy cần phải định danh chính xác để
đảm bảo được sản phẩm chất lượng và có ý nghĩa quan trọng trong việc nghiên
cứu các đặc tính đa dạng di truyền và bảo vệ các loài quý hiếm. Bên cạnh đó,
dược liệu cịn bị pha trộn nhiều làm giảm đi hiệu quả của thuốc, hay dược liệu
bị thay thế bởi các thành phần chứa độc tính, nên một số trường hợp có thể thể
gây nguy hiểm đến tính mạng. Vì vậy, xác định chính xác nguồn gốc của các
loại dược liệu là điều cần thiết. Nhiều nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu
xác định nguyên liệu thảo dược bằng mã vạch DNA. He J. và cộng sự (2010)
cũng sử dụng mã vạch DNA để nghiên cứu xác định một số mẫu cây dược liệu
trong chi Aconitum [18]... Chỉ thị DNA thường dùng trong phân loại cây thuốc
là matK, rpoC1, trnH-psbA, ITS, rbcL …
Gen rpoC1 mã hóa 1 trong 4 tiểu đơn vị của RNA polymerase lục lạp.
Gần đây, nhiều nghiên cứu cũng đã chỉ ra hiệu quả của việc sử dụng gen rpoC1
vào việc định danh thực vật. Nghiên cứu của Vũ Thị Thu Thủy và cộng sự
(2016) đã sử dụng đoạn gen rpoC1 có kích thước 558 bp của mẫu thu thập tại

9


huyện Bình Gia, tỉnh Lạng Sơn đã xác định được mối quan hệ của mẫu với các
loài trong chi Paris ở mức 96-99 % [10].
Nghiên cứu của Liu và đồng tác giả (2010) đã chỉ ra rpoC1 là một chỉ thị
rất hữu ích khi được sử dụng để phân biệt các loài Bryophytes. Tuy nhiên,
CBOL đã thử nghiệm 7 locus và thấy rằng khả năng phân biệt loài của đoạn

gen rpoC1 là thấp nhất (43%). Do vậy cần có các nghiên cứu tiếp theo để
chứng minh sự phù hợp khi sử dụng rpoC1 làm chỉ thị barcode trong các
nghiên cứu giám định lồi [24], [28].
Gen matK mã hóa cho enzyme maturase K liên quan đến quá trình loại
bỏ các intron loại 2 trong quá trình phiên mã RNA. Trong số các gen lục lạp,
matK có kích thước khoảng 1550 bp và có mặt hầu hết trong thực vật nên đã
được sử dụng như một chỉ thị trong nghiên cứu mối quan hệ giữa các loài và
phát sinh loài ở thực vật. Trình tự gen matK trong các gen lạp thể cũng có khả
năng phân biệt lồi cao. CBOL đã thử nghiệm gen matK trên gần 550 loài thực
vật và thấy rằng 90% mẫu thực vật hạt kín dễ dàng khuếch đại trình tự bằng
cách sử dụng một cặp mồi đơn và đề nghị sử dụng gen matK là một trong
những mã vạch chuẩn cho thực vật [23], [28].
Năm 2008, dựa vào những mẫu thu được từ Costa Rica, tiến sĩ Vincent
Savolainen và đồng sự sử dụng gen matK để nhận dạng 1600 lồi lan. Trong
nghiên cứu, nhóm tác giả phát hiện một loài trước đây được cho là lan thực ra
lại là hai loài tách biệt. Loài này sống trên những dốc khác nhau trên núi và có
hoa hình dạng khác nhau để thích nghi với những lồi cơn trùng thụ phấn khác
nhau [31].
Nghiên cứu của Huang và cộng sự (2017) xác định trình tự của gen lục
lạp lồi Paris vietnamensis có 158224 bp. Trong đó gen matK gồm 1547
nucleotide, nằm từ vị trí 1677 đến 3224, quy định tổng hợp maturase K có 515
axit amin (KX784050) [34]. Hay như khi phân tích hệ gen lục lạp của lồi
Daiswa chinensis, nhóm tác giả này cũng thu được 157847 bp. Gen matK nằm
ở vị trí từ 1651 đến 3198 quy định tổng hợp maturase K (KX784048) [34].

10


Khi sử dụng gen matK để so sánh mối quan hệ của lồi có nguồn gốc từ
Rheum palmatum L (Polygonaceae), R. tanguticum (Maxim. ex Regel) Maxim.

ex Balf, R. officinale Baill., và loài gần gũi Rheum palmatum L.. Kết quả
nghiên cứu cho thấy mức độ biến đổi nội bộ loài và giữa các loài khác nhau là
khá cao [11].
Trên cây Bảy lá một hoa, việc sử dụng gen matK trong việc định danh
cũng đã được thực hiện bởi một số các tác giả. Nghiên cứu của Vũ Thị Thu
Thủy và cộng sự (2017) phân lập đoạn gen matK từ các mẫu khác nhau về địa
điểm thu thập và số lượng lá. Theo đó mẫu thu được ở tỉnh Hà Giang có 6 lá và
mẫu thu ở tỉnh Lào Cai có 7 lá. Kết quả cho thấy trình tự nucleotide của đoạn
gen matK mẫu cây 6 lá (Hà Giang) có 808 nucleotide, trình tự nucleotide của
đoạn gen matK mẫu cây 7 lá (Lào Cai) có 806 nucleotide. Tuy nhiên kết quả so
sánh sự khác biệt và tương đồng cho thấy cả 2 mẫu cùng thuộc lồi Paris
polyphylla var. yunnanensis [11].
Trình tự vùng gen ITS (internal transcribed spacer) là một vùng gồm các
đoạn ITS1-5,8S-ITS2. Vùng ITS nằm trong nhân tế bào được phiên mã trong quá
trình tổng hợp rRNA. Tuy nhiên, trong quá trình trưởng thành của rRNA, phần
ITS bị cắt và nhanh chóng phân hủy. Một lợi thế của vùng ITS là nó bao gồm 2
locut riêng biệt (ITS1 và ITS2) được nối với nhau qua locut 5.8S. Vùng ITS có
nhiều ưu thế trong nghiên cứu phát sinh và đánh giá sự đa dạng di truyền của các
lồi như trình tự nucleotide vùng gen ITS mang các đặc tính di truyền của cả bố và
mẹ, số lượng trình tự DNA lặp lại thích hợp cho việc khuếch đại và xác định trình
tự DNA ribosome. Trình tự nucleotide vùng gen ITS đã được nghiên cứu và công
bố trong ngân hàng gen thế giới khá phong phú và đa dạng, thuận lợi cho việc
phân tích so sánh. Các nghiên cứu phát sinh lồi thực vật dựa trên vùng gen ITS đã
được tiến hành bởi nhiều nhà nghiên cứu [14], [21], [22].
Trước đây nấm thường được phân loại dựa trên các đặc điểm về hình thái,
cơ chế trao đổi chất, cấu trúc vách tế bào và thành phần protein nên kết quả

11

phân loại thường có độ chính xác khơng cao. Berbee và cộng sự (1995) đã
chứng

minh

Penicillium,

Aspergillus,

và

Paecilomyces

thuộc

lớp

Trichocomaceae khi sử dụng vùng gen ITS để định loại [13].
Sử dụng trình tự vùng gen ITS và trình tự trnL-F, Zhao Weiguo và cộng
sự (2005) đã làm rõ được mối quan hệ giữa loài dâu thuộc chi Morus. Kết quả
cho thấy trong chi Morus trình tự ITS có sự đa dạng hơn nhiều so với trình tự
trnL-F [25].
Muthumeenakshi và cộng sự (1994) đã chứng minh có sự đa hình xảy ra
khi nghiên cứu những thay đổi trong vùng gen ITS của các dòng Trichoderma
harzianum dựa trên trình tự rRNA 18S, 5.8S và vùng gen ITS [19].
Đánh giá đa dạng di truyền trong chi Ephedra các nhà khoa học đã tiến
hành phân tích trình tự vùng ITS. Kết quả nghiên cứu xác định được nguồn gốc
lai giữa các loài và phân loại 8 được loài Ephedra [27].
Những năm gần đây, ngoài ý nghĩa phân loại, vùng ITS rất được quan
tâm ở cấp độ phân tử. Nguyễn Thị Thanh Nga và cộng sự (2012) đã tiến hành

nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền một số loài cây dược liệu Việt Nam
thuộc chi Đẳng Sâm (Codonopsis sp), kết quả nghiên cứu đã khuếch đại thành
công vùng gen ITS và phân tích được sự đa hình trên mỗi vùng gen [33].
Quả của các loài thuộc chi Zanthoxylum trong y học Trung Quốc có cơng
dụng lớn trong việc chữa đau vùng thượng vị. Người ta đã phát hiện ra trong
chi Zanthoxylum có đến 200 lồi khác nhau. Sun Yan-Lin và cộng sự đã tìm ra
trình tự vùng gen ITS của loài Zanthoxylum piperitum đồng thời phân biệt loài
Zanthoxylum piperitum với lồi Zanthoxylum schinifolium trong chi
Zanthoxylum cũng nhờ trình tự vùng gen ITS [29].
Vùng gen ITS được sử dụng như một điểm đánh dấu hiệu quả và mạnh
mẽ, đây cũng là một mã vạch tiềm năng để phân biệt các lồi khác nhau trong
họ Fabaceae [17].
Trình tự nucleotide của 22 loài thuộc chi Paris trên GenBank được sử
dụng để làm trình tự tham chiếu khi so sánh với 3 mẫu cây Bảy lá một hoa khác
12


nhau kí hiệu lần lượt là PR1, PR2, PR3. Sử dụng phần mềm Bioedit Nguyễn
Tiến Dũng cùng cộng sự (2017) cho thấy kết quả so sánh có sự tương đồng rất
cao giữa 3 mẫu nghiên cứu với nhau và với trình tự lồi Paris vietnamensis trên
GenBank. Trong đó vùng gen ITS khả năng phân biệt loài tốt hơn, với độ biến
thiên trình tự giữa các lồi cao hơn so với vùng gen psbA-trnH [5].
Vũ Thị Thu Thủy cùng cộng sự (2017) đã khuếch đại thành công vùng
gen ITS của mẫu Bảy lá một hoa thu được ở Lào Cai. Từ trình tự vùng gen thu
được có kích thước 676 bp với hệ số tương đồng là 99% so với loài Paris
vietnamensis, mẫu cây Bảy lá một hoa thu được ở huyện SaPa, tỉnh Lào Cai đã
được định danh thuộc loài Paris vietnamensis [9].
Có thể thấy việc nghiên cứu ứng dụng mã vạch DNA trong phân tích
đa dạng di truyền các loài đã khẳng định vùng gen ITS và gen matK có thể
giúp nhận diện lồi, đồng thời có thể được dùng cho các nghiên cứu tiếp

theo về tiến hóa học phân tử và nghiên cứu bảo tồn nguồn gen của loài dược
liệu quý [11], [12].

13


Chương 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu thực vật
Mẫu của cây Bảy lá một hoa thu thập được tại huyện Sìn Hồ, tỉnh Lai Châu
là sản phẩm của đề tài cấp Bộ có mã số B2017-TNA-04-QG do bộ môn Sinh học
hiện đại và Giáo dục sinh học chủ nhiệm sử dụng làm vật liệu nghiên cứu.
2.2. Địa điểm nghiên cứu, hóa chất và thiết bị
2.2.1. Địa điểm nghiên cứu
Các thí nghiệm phân tích hình thái, giải phẫu được thực hiện tại Khoa
Sinh học trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên.
Phân lập đoạn gen matK, vùng gen ITS được thực hiện tại Viện Công
nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam.
Luận văn được hoàn thành tại trường Đại học Sư phạm – ĐHTN.
2.2.2. Hóa chất, dụng cụ
Đề tài sử dụng hóa chất của các hãng có uy tín và đảm bảo độ tin cậy
như Merck, Bioneer, Sigma, ... Một số hóa chất chính có sử dụng trong đề tài
như: xanh methylene, phèn chua, carmin, chloroform, isoamy alcohol, ...
Cặp mồi nhân gen được thiết kế dùng chung cho phân loại thực vật do
phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học cung cấp.
Các thiết bị dùng trong sinh học phân tử như máy ly tâm (Nhật Bản),
máy điện di (Mỹ), pipet (Eppendorf – Đức), máy đo quang phổ (Đức), máy
PCR, ... cùng các trang thiết bị khác thuộc Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện
Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam.
2.3. Phương pháp nghiên cứu

Đề tài được thực hiện theo mơ hình thí nghiệm tổng qt trình bày ở
hình 2.1.

14


Thu thập mẫu cây Bảy lá một hoa

Nghiên cứu đặc điểm thực vật
Mơ tả hình thái
Làm tiêu bản tế bào
Chụp ảnh, quan sát, phân
tích

Nghiên cứu đặc điểm mã vạch DNA
- Phân tích đặc điểm đoạn gen matK
Phân tích đặc điểm vùng gen ITS

Dữ liệu phục vụ nhận dạng cây Bảy lá một hoa
Hình 2.1: Mơ hình thí nghiệm tổng qt
2.3.1. Phương pháp hình thái, giải phẫu
Phân tích mẫu và xác định tên lồi theo phương pháp so sánh hình thái
dựa trên tài liệu “Cây cỏ Việt Nam” của Phạm Hoàng Hộ năm 1999 [5].
Phân tích giải phẫu hình thái rễ, thân, lá theo tài liệu của Hoàng Thị Sản
và cộng sự năm 2003 [7].
Các bước làm tiêu bản gồm:
- Cắt nhỏ mẫu vật, tẩy sạch bằng nước Javen, rồi rửa thật sạch bằng
nước thường.
- Nhuộm màu: nhỏ dung dịch xanh methylen lên đĩa đồng hồ có chưa
mẫu vật để trong vịng 30 phút sau đó rửa lại thật sạch bằng nước thường. Tiếp

đó dùng dung dịch carmin nhỏ vào mẫu vật vừa nhuộm, để trong vòng 30-45
phút rồi rửa lại thật sạch bằng nước thường.
- Lên kính: nhỏ 1 giọt nước lên lam kính, cho mẫu vật vào rồi đậy lamen.
- Chụp ảnh, quan sát và phân tích kết quả thu được.
2.3.2. Phương pháp sinh học phân tử
2.3.2.1. Phương pháp tách DNA tổng số
Tách chiết DNA tổng số theo phương pháp của Doyle và cộng sự, năm
1987 [15].

15


Quy trình tách chiết DNA của cây Bảy lá một hoa được thực hiện theo
các bước sau:
1. Nghiền 0,2 g lá non bằng cối chày sứ trong nitơ lỏng thành bột mịn,
sau đó chuyển sang ống eppendorf 2 ml, giữ trong đá.
2. Bổ sung 1 ml đệm rửa, lắc mạnh trong 40 giây, ly tâm (12000
vòng/phút, 4ºC, 7 phút), loại dịch nổi (lặp lại bước này 2 lần).
3. Bổ sung 800 µl đệm chiết, lắc đều và giữ ở 65ºC trong thời gian 60
phút, giữ mẫu ở nhiệt độ phòng trong thời gian 10 phút.
4. Bổ sung 800 µl dung dịch chloroform/isoamyl alcohol (24:1) vào mẫu,
lắc đều trong thời gian 10 phút. Ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút trong thời
gian 15 phút ở 4ºC.
Dùng pipet chuyển dịch nổi sang ống eppendorf 1,5 ml.
5. Bổ sung một thể tích tương đương isopropanol, đảo nhẹ, giữ mẫu
trong đá 30 phút.
Ly tâm 12000 vòng/phút trong thời gian 15 phút ở 4º C.
6. Loại dịch nổi, rửa DNA bằng cách thêm 500 µl cồn 80%, ly tâm
12000/phút trong thời gian 4 phút ở 4º C (thực hiện 2 lần), loại bỏ cồn.
7. Làm khơ DNA, sau đó hịa tan trong 100 µl nước cất, bổ sung 3 µl

RNase (10mg/ml), giữ ở 37º C trong 1 giờ.
8. Điện di DNA tổng số trên gel argarose 1 %.
2.3.2.2. Phương pháp nhân gen
Sau khi tách chiết và tinh sạch DNA tổng số, tiến hành nhân trình tự
đoạn matK bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi có kí hiệu matK-F và matK-R do
phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Cơng nghệ sinh học cung cấp được
trình bày ở bảng 2.1.

16