Nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu và phân loại cây bảy lá một hoa (Paris) thu thập ở Lai Châu (Luận văn thạc sĩ)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGÔ THÙY LINH

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, GIẢI PHẪU
VÀ PHÂN LOẠI CÂY BẢY LÁ MỘT HOA (PARIS)
THU THẬP Ở LAI CHÂU

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên, năm 2018


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGÔ THÙY LINH

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, GIẢI PHẪU
VÀ PHÂN LOẠI CÂY BẢY LÁ MỘT HOA (PARIS)
THU THẬP Ở LAI CHÂU

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 8 42 01 21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Vũ Thị Thu Thủy

Thái Nguyên, năm 2018

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự
hướng dẫn của PGS.TS Vũ Thị Thu Thủy. Các kết quả nghiên cứu là trung
thực và chưa được công bố ở bất cứ công trình nào khác.
Thái Nguyên, tháng 11 năm 2018
Tác giả

Ngô Thùy Linh

i


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS. Vũ Thị Thu Thủy,
khoa Sinh học trường Đại học sư phạm Thái Nguyên là người đã chỉ bảo,
hướng dẫn em suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô khoa Sinh
học, Trường Đại học Sư Phạm - ĐH Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn,
truyền dạy kiến thức cho em trong suốt khóa học.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy giáo, cô giáo trong Ban
giám hiệu trường Đại học Sư phạm - ĐH Thái Nguyên, thầy, cô các phòng ban
chức năng đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong thời gian học tập tại trường.
Cuối cùng, xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới bạn bè và gia đình đã
luôn quan tâm, động viên, ủng hộ và giúp đỡ em.
Luận văn là sản phẩm của đề tài cấp Bộ có mã số B2017-TNA-04-QG do
PGS.TS Vũ Thị Thu Thủy bộ môn Sinh học hiện đại và Giáo dục sinh học làm
chủ nhiệm.
Thái Nguyên, tháng 11 năm 2018

Tác giả

Ngô Thùy Linh

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................... ii
MỤC LỤC ..........................................................................................................iii
DANH MỤC NHỮNG TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT ............................................. iv
DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................. v
DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................. vi
MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1
1. Lý do chọn đề tài ............................................................................................. 1
2. Mục tiêu của đề tài........................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 2
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 4
1.1. Giới thiệu chung về cây Bảy lá một hoa ...................................................... 4
1.1.1. Đặc điểm, phân loại cây Bảy lá một hoa ................................................... 4
1.1.2. Phân bố, vai trò của cây Bảy lá một hoa ................................................... 5
1.2. Các phương pháp định danh thực vật ........................................................... 6
1.2.1. Phương pháp so sánh hình thái, giải phẫu ................................................. 7
1.2.2. Phương pháp sinh học phân tử .................................................................. 8
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 14
2.1. Vật liệu thực vật.......................................................................................... 14
2.2. Địa điểm nghiên cứu, hóa chất và thiết bị .................................................. 14
2.2.1. Địa điểm nghiên cứu................................................................................ 14
2.2.2. Hóa chất, dụng cụ .................................................................................... 14

2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 14
2.3.1. Phương pháp hình thái, giải phẫu ............................................................ 15
2.3.2. Phương pháp sinh học phân tử ................................................................ 15
2.3.3. Phương pháp phân tích trình tự nucleotide ............................................. 18

iii


Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .......................... 19
3.1. Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái và giải phẫu cây Bảy lá một hoa . 19
3.1.1. Đặc điểm hình thái của mẫu cây Bảy lá một hoa .................................... 19
3.1.2. Đặc điểm giải phẫu của mẫu cây Bảy lá một hoa ................................... 20
3.2. Kết quả nghiên cứu đặc điểm mã vạch DNA của mẫu cây Bảy lá một hoa .. 23
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số .............................................................. 23
3.2.2. Kết quả khuếch đại và phân tích trình tự nucleotide đoạn gen matK ..... 23
3.2.3. Kết quả khuếch đại và phân tích trình tự nucleotide vùng gen ITS ........ 29
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................. 34
1. Kết luận .......................................................................................................... 34
2. Đề nghị........................................................................................................... 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 35

iv


DANH MỤC NHỮNG TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT
CBOL

:

Consortium for the Barcode of Life

DNA

:

Deoxyribonucleic acid

ITS

:

Internal Transcribed Spacer

kb

:

Kilobase

matK

:

MaturaseK

NCBI

:

The National Center for Biotechnology Information

PCR

:

Polymerase Chain Reaction

rpoC

:

Retained products of conception

SH

:

Sìn Hồ

iv


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Mồi matK sử dụng trong kỹ thuật PCR ............................................ 17
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR ............................................................... 17
Bảng 2.3. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR....................................................... 17
Bảng 2.4. Mồi ITS sử dụng trong kỹ thuật PCR ................................................ 18
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR ............................................................... 18
Bảng 2.6. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR....................................................... 18
Bảng 3.1. Một số trình tự đoạn gen matK sử dụng để xác định độ tương

đồng và sai khác với mẫu SH .............................................................. 27
Bảng 3.2. Độ tương đồng và phân ly dựa trên trình tự gen matK ..................... 27
Bảng 3.3. Một số trình tự vùng gen ITS sử dụng để xác định độ tương đồng
và sai khác với mẫu SH ....................................................................... 32
Bảng 3.4. Độ tương đồng và phân ly dựa trên trình tự vùng gen ITS ............... 32

v


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1: Mô hình thí nghiệm tổng quát ........................................................... 15
Hình 3.1. Hình thái cơ quan sinh dưỡng của mẫu cây Bảy lá một hoa thu
thập ở huyện Sìn Hồ, tỉnh Lai Châu .................................................... 19
Hình 3.2. Cấu tạo giải phẫu cuống lá ................................................................ 20
Hình 3.3. Cấu tạo giải phẫu thân ....................................................................... 21
Hình 3.4. Cấu tạo giải phẫu rễ ........................................................................... 22
Hình 3.5. Kết quả tách chiết DNA tổng số của cây Bảy lá một hoa ................. 23
Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại gen matK bằng kỹ thuật PCR .... 24
Hình 3.7. Kết quả Blast trình tự gen matK ........................................................ 25
Hình 3.8. Trình tự nucleotide của đoạn gen matK phân lập từ mẫu cây Bảy
lá một hoa thu thập ở Sìn Hồ, Lai Châu .............................................. 26
Hình 3.9. Sơ đồ mô tả mối quan hệ di truyền giữa các loài Bảy lá một hoa
trong chi Paris dựa trên trình tự nucleotide của đoạn gen matK. ....... 28
Hình 3.10. Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại vùng gen ITS bằng kỹ
thuật PCR............................................................................................. 29
Hình 3.11. Kết quả Blast trình tự vùng gen ITS ................................................ 30
Hình 3.12. Trình tự nucleotide của vùng gen ITS phân lập từ mẫu cây Bảy
lá một hoa thu thập ở Sìn Hồ, Lai Châu .............................................. 31
Hình 3.13. Sơ đồ mô tả mối quan hệ di truyền giữa các mẫu cây Bảy lá một
hoa trong chi Paris dựa trên trình tự nucleotide của vùng ITS ........... 33

vi


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Bảy lá một hoa là tên gọi chung của các mẫu cây thuộc chi Paris. Cây
Bảy lá một hoa còn gọi là Thất diệp nhất chi mai, Độc cước liên, Thiết đăng đài,
Chi hoa đầu, Tảo hưu, Thảo hà xa, Trọng lâu, Thất tử liên, Đăng đài thất, Cúa dô
(H’Mông)…. Hiện nay, chi Paris được công bố có 24 loài, mỗi loài gồm nhiều
giống khác nhau. Chỉ riêng loài Paris polyphylla kết quả thống kê cho thấy đã có
8 giống. Nhiều giống được mô tả chi tiết về mặt hình thái, đó là căn cứ ban đầu
để nhận dạng và phát hiện sự có mặt của các cây quý hiếm này [30].
Ở Việt Nam, cây Bảy lá một hoa được tạm gọi tên khoa học là Paris
polyphylla Sm. [12], [30]. Đây là những loài thảo mộc có giá trị trong chữa một
số bệnh như cầm ho, giảm cơn hen, cầm máu, ức chế trực khuẩn lị, thương
hàn… Đặc biệt, chữa cả một số bệnh nan y như ung thư, rắn cắn... chính vì có
nhiều giá trị mà hiện tại cây Bảy lá một hoa đang bị khai thác bừa bãi, có nguy
cơ tuyệt chủng. Từ năm 1999, Phạm Hoàng Hộ mô tả đặc điểm hình thái của 5
loài [5]. Đến năm 2016, Nguyễn Quỳnh Nga và cộng sự lập khóa phân loại chi
tiết cho 8 loài và 2 giống [20]. Tuy nhiên, tiềm năng của cây Bảy lá một hoa ở
Việt Nam còn khá phong phú và cần thiết được khai thác thêm.
Có nhiều phương pháp có thể định danh thực vật làm thuốc đảm bảo độ
chính xác và hiệu quả. Các phương pháp thường dùng như nghiên cứu và so
sánh các đặc điểm về hình thái, giải phẫu, sinh lý, hóa sinh... hướng nghiên cứu
này đã thành công trên một số đối tượng cây trồng như cây Ngô đồng đỏ, Rong
câu chỉ, Ráng thư dực [2], [3], [4]… Tuy nhiên, khi cây không còn nguyên vẹn,
hay đã được chế biến thì phương pháp nhận diện này sẽ kém hiệu quả.
Sự phát triển của công nghệ sinh học hiện đại trong những năm gần đây
có bổ sung vào hệ thống phân loại sinh vật phương pháp phân loại học phân tử.

Đây là phương pháp có độ chính xác cao, đặc biệt rất cần đối với thực vật dùng
làm thuốc muốn xác định ở cấp độ loài, ngay cả khi đã được chế biến. Việc xác

1


định chính xác tên loài là một bước quan trọng để có thể đảm bảo về chất lượng
sản phẩm. Bên cạnh đó, kết quả nhận diện có vai trò quan trọng trong việc bảo
tồn các loài có nguy cơ tuyệt chủng.
Mã vạch DNA là một phương tiện nhận biết mới của sinh học phân tử.
Một số mã vạch DNA được nghiên cứu và ứng dụng có hiệu quả trong phân
loại các cây dược liệu như matK, rpoC1, trnH-psbA, ITS, rbcL… Theo đó gen
matK nằm trong lục lạp mã hóa cho enzyme mature K. Nhiều nghiên cứu đã sử
dụng gen matK trong việc định loại cây trồng và cũng mang lại những thành
tựu nhất định [11], [24],… Vùng gen ITS bao gồm trình tự ITS1-5.8S-ITS2
cũng là đối tượng được nghiên cứu nhiều. Hiện nay, số lượng các trình tự
nucleotide của vùng ITS đã được công bố trong ngân hàng gen thế giới khá
phong phú, thuận lợi cho việc phân tích so sánh. Các nghiên cứu phát sinh loài
thực vật dựa trên vùng gen ITS ở cây Đẳng sâm, cây Dâu, Nấm và nhiều thực
vật khác là minh chứng cho vai trò của vùng gen ITS trong nhận diện cây trồng
[13], [25], [33].
Tỉnh Lai Châu là một tỉnh miền núi phía bắc Việt Nam được phát hiện có
sự có mặt của cây Bảy lá một hoa [20]. Mẫu cây thu được có những đặc điểm gì
và thuộc loài nào là câu hỏi được đặt ra trong nghiên cứu này. Xuất phát từ
những lý do trên, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm hình thái,
giải phẫu và phân loại mẫu cây Bảy lá một hoa (Paris) thu thập ở Lai Châu”.
2. Mục tiêu của đề tài
Xây dựng được dữ liệu về đặc điểm hình thái, giải phẫu và đặc điểm của
đoạn gen matK, vùng gen ITS dùng trong phân loại thực vật phục vụ nhận dạng
cây Bảy lá một hoa.

3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu đặc điểm hình thái và giải phẫu cơ quan sinh dưỡng cây
Bảy lá một hoa thu thập tại huyện Sìn Hồ, tỉnh Lai Châu.
- Nghiên cứu xác định trình tự nucleotide của đoạn gen matK.

2


- Nghiên cứu xác định trình tự nucleotide của vùng gen ITS.
- Nghiên cứu xác định mối quan hệ của mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập
được dựa trên phân tích trình tự nucleotid của đoạn gen matK và vùng gen ITS
nghiên cứu.

3


Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về cây Bảy lá một hoa
1.1.1. Đặc điểm, phân loại cây Bảy lá một hoa
Cây Bảy lá một hoa là thực vật thuộc ngành Magnoliophyta (Mộc lan,
Hạt kín), lớp Liliopsida (Hành), bộ Dioscoreales (Củ nâu), họ Trilliaceae
(Trọng lâu), chi Paris (Bảy lá một hoa).
Chi Paris hiện tại được công bố có 22 loài, trong đó gồm nhiều giống
khác nhau [16]. Chỉ riêng loài Paris polyphylla kết quả thống kê cho thấy đã
gồm 8 giống. Các giống khác nhau về số lượng, hình dạng lá và sự phân bố
[32]. 8 giống thuộc loài Paris polyphylla gồm:
Giống

Phân bố

Paris polyphylla var. Alba

Quý Châu, Hồ Bắc, Vân Nam

Paris polyphylla var. chinensis

An Huy, Phúc Kiến, Quảng Đông, Quảng
Tây, Quý Châu, Hồ Bắc, Hồ Nam , Giang
Tô, Giang Tây, Tứ Xuyên, Đài Loan, Vân
Nam, Lào, Myanmar, Thái Lan, Việt Nam

Paris polyphylla var. latifolia

An Huy, Hà Nam, Hồ Bắc, Giang Tây,
Thiểm Tây, Sơn Tây

Paris polyphylla var. nana

Tứ Xuyên

Paris polyphylla var. panxiensis

Tứ Xuyên

Paris polyphylla var. polyphylla

Trung Quốc , Himalayas, phía bắc Đông
Dương

Parispolyphylla var. stenophyla

Trung Quốc, Bhutan, Assam, Nepal,
Myanmar, Sikkim

Paris polyphylla var.yunnanensi

- Quý Châu, Tứ Xuyên, Tây Tạng, Vân
Nam, Assam, Myanmar

4


Tên khoa học là Paris polyphylla Sm. Tên đồng nghĩa Daiswa polyphylla
(Smith) Raf. Tên khác như Thất diệp nhất chi mai, Độc cước liên, Thiết đăng
đài, Chi hoa đầu, Tảo hưu, Thảo hà xa, Trọng lâu, Thất tử liên, Đăng đài thất,
Cúa dô (H’Mông)… cũng được sử dụng để gọi về cây Bảy lá một hoa [12], [30].
Ở Việt Nam, từ năm 1999, Phạm Hoàng Hộ đã mô tả đặc điểm hình thái
của 5 loài. Các loài đó là Paris delavayi, Paris polyphylla, Paris fargesii, Paris
yunanensis, Paris hainanensis [5]. Đến năm 2016, Nguyễn Quỳnh Nga và cộng
sự đã lập khóa phân loại chi tiết cho 8 loài và 2 giống [20]. Các nghiên cứu về
cây Bảy lá một hoa đều khẳng định tiềm năng của cây Bảy lá một hoa ở Việt
Nam còn khá phong phú và cần thiết được khai thác thêm.
Bảy lá một hoa là loại cây một lá mầm, thân thảo, sống lâu năm. Từ củ
nổi lên mặt đất một thân mọc thẳng, cao chừng 0,3-0,8 m, thân thon dài, trơn
nhẵn, không có cành, phía gốc có 1 số lá thoái hóa thành vảy bao lấy thân cây.
Thân mềm, mọng nước. Phần thân trên mặt đất của cây lụi hàng năm vào cuối
mùa thu. Củ có ngấn, phình to, cứ mỗi năm có thêm 1 đốt hiện ra rõ ràng, màu
xám đen. Rễ mềm, mọc dày theo củ. Giữa thân có 1 tầng lá mọc vòng, thường
từ 4 đến 9 lá. Cuống lá dài 2-3 cm, màu tím. Phiến lá hình mác, hình trứng, bầu

dục,… dài 20-23 cm, rộng 6-7 cm. Đầu phiến lá nhọn, mặt trên màu xanh đậm,
mặt dưới màu nhạt hơn. Hoa mọc trên đỉnh cây, cuống hoa dài 14 cm. Lá đài
bằng số cánh tràng. Nhụy màu tím đỏ, bầu có 3 ngăn. Nhị mảnh, có bao phấn
màu vàng nâu, xếp thành 2 vòng, xen kẽ nhau, mỗi vòng có 5 nhị [5], [20].
1.1.2. Phân bố, vai trò của cây Bảy lá một hoa
Bảy lá một hoa là cây đặc biệt ưa ẩm và ưa bóng, thường mọc rải rác
dưới tán rừng kín thường xanh, dọc theo các bờ khe suối, trên đất ẩm nhiều
mùn. Paris là một chi nhỏ, hiện chỉ có một số loài phân bố ở vùng cận nhiệt đới
hoặc ôn đới ẩm Bắc bán cầu: Trung Quốc, Ấn Độ, Nê Pan và Myanma. Ở Việt
Nam, cây Bảy lá một hoa hầu như chỉ thấy ở các tỉnh miền núi phía bắc như
Ninh Bình, SaPa (Lào Cai), Quản Bạ (Hà Giang), Sìn Hồ (Lai Châu),… [12],
[20], [32].

5


Theo dân gian, cây Bảy lá một hoa có rất nhiều công dụng để trị một số
bệnh như: bệnh gan, ung thư phổi và thanh quản, ung thư biểu mô,… Thân rễ
Bảy lá một hoa có vị đắng, hơi cay, tính hơi lạnh, hơi độc, vào kinh can, có tác
dụng xổ hạ, lợi tiểu, tiêu đờm, thanh nhiệt, giải độc. Thân rễ của cây còn chữa
sốt, sốt rét cơn, kinh giản, giải độc [12]. Kết quả nghiên cứu dược lý hiện đại
còn cho thấy các thành phần trong cây Bảy lá một hoa có tác dụng: cầm ho,
giảm cơn hen. Chiết xuất hóa học trong thân và rễ còn có tác dụng cầm máu, ức
chế với mức độ khác nhau đối với trực khuẩn lị, thương hàn, tụ cầu vàng, liên
cầu khuẩn đồng thời có tác dụng ức chế Leptospira và virut cúm. Ngoài ra chiết
xuất ở cây Bảy lá một hoa có tác dụng ức chế tế bào ung thư cổ tử cung [35].
Tại vùng Quảng Tây (Trung Quốc) có câu “Ốc hữu thất diệp nhất chi hoa / Độc
xà bất tiến gia” nghĩa là trong nhà có cây Bảy lá một hoa thì rắn độc không vào
nhà được. Ngoài công dụng chữa sốt và rắn độc cắn, vị tảo hưu (thân rễ của cây
Bảy lá một hoa) còn dùng chữa mụn nhọt, viêm tuyến vú, ho lao, dùng ngoài da

thì giã nát đắp lên nơi sưng đau. Ở Châu Âu người ta dùng thân, rễ và quả của
loài Paris quadrifolia làm thuốc tẩy nhưng có chất độc. Dùng với liều vừa phải,
thân, rễ và quả có tác dụng chống co thắt [30], [35].
1.2. Các phương pháp định danh thực vật
Có rất nhiều phương pháp để định danh thực vật. Các phương pháp đều
dựa trên nguyên tắc những thực vật có chung nguồn gốc thì có những tính chất
giống nhau. Thực vật càng gần nhau thì mức độ giống nhau càng nhiều. Sự
giống nhau có thể về đặc điểm hình thái, giải phẫu, sinh lý sinh hoá, phôi sinh
học, ... nhưng chủ yếu dựa vào việc quan sát, so sánh và trên cơ sở mẫu vật đã
thu thập được để phân tích, tổng hợp đi đến suy diễn giả thiết. Việc quan sát, so
sánh cấu tạo của cây thường được tiến hành trong điều kiện tự nhiên và môi
trường thực nghiệm. Kỹ thuật PCR thường dùng để xác định mối quan hệ phát
sinh giữa các loài và là kỹ thuật được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu sinh
học. Việc kết hợp 2 phương pháp này sẽ có hiệu quả trong nhận diện và bảo tồn
các loài thực vật.

6


1.2.1. Phương pháp so sánh hình thái, giải phẫu
Hầu hết cấu trúc của các cơ quan đều nghiên cứu ở mức độ hiển vi, vì
vậy mà các mẫu khi sử dụng phương pháp giải phẫu đều được cắt thật mỏng,
sau đó để giữ được cấu trúc bên trong tế bào, thuận lợi cho việc quan sát người
ta thường dùng phương pháp nhuộm màu. Việc nhuộm màu này giúp chúng ta
phân biệt được các thành phần cấu tạo của các cơ quan, vì mỗi một thành phần
thì bắt một màu nhất định. Nguyên tắc của phương pháp nghiên cứu hình thái
và giải phẫu chủ yếu là dựa vào việc quan sát, so sánh và trên cơ sở mẫu vật đã
thu thập được để phân tích, tổng hợp đi đến suy diễn giả thiết. Phương pháp so
sánh hình thái, giải phẫu đã cung cấp nhiều thông tin có giá trị trong định loại
thực vật [2], [3], [4], [6], [8].

Nghiên cứu đặc điểm hình thái cây Ngô đồng đỏ ở Cù Lao Chàm, nhóm
tác giả Vũ Văn Dũng và Đinh Thị Phương Anh (2016) chỉ ra rằng ở Việt Nam
có 2 loài Ngô đồng đỏ cùng thuộc chi Firmiana khác nhau về nơi sống có sự
khác biệt về nhiều đặc điểm hình thái như thân, lá, cụm hoa, hoa, quả. Những
sự khác biệt thu được là tài liệu cung cấp cho việc nhận diện mẫu cây Ngô
đồng đỏ và làm căn cứ để sử dụng bền vững và phát triển loài cây ngô đồng đỏ
ở Cù Lao Chàm [2].
Năm 2006, Lê Ngọc Hân và cộng sự đã sử dụng phương pháp phân tích
đặc điểm hình thái và so sánh các đại diện họ Ban – Hypericaceae juss ở Việt
Nam, nhóm nghiên cứu đã xác định được tông và chi thuộc họ Ban. Kết quả
nghiên cứu được sử dụng làm khóa phân loại ở mức độ chi [3].
Nghiên cứu của Lê Như Hậu (2009), khi phân tích hình thái các mẫu tiêu
bản của 7 loài Rong câu chỉ ở Việt Nam phát hiện thấy có sự thay đChâu thuộc loài Paris
fargesii [5].
3.1.2. Đặc điểm giải phẫu của mẫu cây Bảy lá một hoa
Sử dụng phương pháp nhuộm kép tiêu bản tế bào, chúng tôi tiến hành
làm tiêu bản với các phần thân, rễ, cuống lá. Kết quả nghiên cứu trình bày trên
hình 3.2, 3.3, 3.4.
Mạch gỗ

Biểu bì

Mô mềm

Libe

Hình 3.2. Cấu tạo giải phẫu cuống lá

20

Theo hình 3.2, lát cắt giải phẫu cuống lá cây Bảy lá một hoa có các mô
sau: biểu bì, mô mềm, bó mạch gỗ, bó libe. Biểu bì là lớp tế bào mỏng ở ngoài
cùng. Các tế bào biểu bì xếp sít nhau. Sau lớp biểu bì là mô mềm. Các tế bào
mô mềm có hình hơi tròn hoặc đa giác tròn ở góc, các tế bào mô mềm chiếm
diện tích trong tế bào. Trong cùng là mạch dẫn bao gồm mạch gỗ và libe. Khi
nhuộm màu hệ mạch gỗ bắt màu xám, hệ mạch libe bắt màu hồng.
Kết quả nghiên cứu phù hợp với công bố của Hoàng Thị Sản (2003) về
giải phẫu cuống lá cây một lá mầm [7].

Mô mềm

Libe
Biểu bì

Mạch gỗ
Hình 3.3. Cấu tạo giải phẫu thân

Hình 3.3 mô tả lát cắt ngang của thân cây Bảy lá một hoa. Hình ảnh tiêu
bản cho phép quan sát thấy có các phần: biểu bì, mô mềm và các bó dẫn (mạch
gỗ và libe). Biểu bì là lớp tế bào mỏng ở ngoài cùng có chức năng bảo vệ các
mô bên trong. Mô mềm là những tế bào hình đa giác tròn đầu, các tế bào mô
mềm ở lớp ngoài có kích thước lớn hơn những tế bào nằm phía trong. Các bó
dẫn nằm rải rác trong lớp mô mềm. Các bó dẫn vòng ngoài nhỏ hơn các bó dẫn
vòng trong.
Trong mỗi bó dẫn gồm hệ mạch gỗ là các tế bào lớn, bắt màu xám xếp
thành hình lưỡi liềm và hệ mạch libe, gồm những tế bào nhỏ hơn, bắt màu hồng
bao quanh mạch gỗ. Thân cây Bảy lá một hoa không có cấu tạo thứ cấp.

21

Biểu bì

Mô mềm ruột

Trung trụ

Vỏ trụ

Libe
Nội bì

Mạch gỗ

Hình 3.4. Cấu tạo giải phẫu rễ
Hình 3.4 mô tả lát cắt ngang của rễ cây Bảy lá một hoa. Theo đó, rễ cây
Bảy lá một hoa có cấu tạo sơ cấp gồm 4 phần chính: biểu bì, ngoại bì, nội bì và
trung trụ.
Biểu bì là lớp tế bào bao bọc ngoài cùng xếp sít nhau. Các tế bào biểu bì
được gắn chặt với nhau nên dễ bị bóc tách.
Dưới lớp biểu bì có nhiều lớp tế bào dày gọi là ngoại bì. Các tế bào ngoại
bì có hình chữ U.
Nội bì (mô mềm vỏ) gồm các tế bào hình đa giác tròn đầu xếp sít nhau, ở
các góc có khoảng gian bào. Lớp này nằm sau lớp ngoại bì.
Phần trung trụ nằm ở trung tâm của rễ gồm 4 phần là vỏ trụ, mạch gỗ,
mạch libe, mô mềm ruột. Lớp vỏ trụ, nằm sát nội bì là các lớp tế bào hình chữ
nhật xếp sít nhau thành vòng bao quanh hệ mạch. Tiếp đến là libe gồm các tế
bào hình trứng cạnh nhau bắt màu hồng, xếp xen kẽ các bó gỗ với các tế bào
xếp liền nhau bắt màu xám sát vỏ trụ. Cuối cùng là mô mềm ruột nằm ở trong

cùng của trụ giữa, gồm những tế bào hình bầu dục xếp sít nhau, không có
khoảng gian bào.
Kết quả phân tích giải phẫu mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập ở huyện
Sìn Hồ, tỉnh Lai Châu theo Hoàng Thị Sản và cộng sự [1990] là mẫu điển hình
của cây một lá mầm ưa bóng.
22


Để có các thông tin về đặc điểm phân tử của cây Bảy lá một hoa thu
được chúng tôi tiếp tục nghiên cứu trình tự đoạn gen matK, vùng gen ITS.
3.2. Kết quả nghiên cứu đặc điểm mã vạch DNA của mẫu cây Bảy lá một hoa
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số
Lá non của cây Bảy lá một hoa thu thập tại huyện Sìn Hồ, tỉnh Lai Châu
được sử dụng làm vật liệu tách chiết DNA tổng số, mẫu được kí hiệu là SH. Để
đánh giá mức độ tinh sạch, nguyên vẹn của phân tử DNA sau khi tách chiết
chúng tôi sử dụng phương pháp điện di. Kết quả thí nghiệm được kiểm tra bằng
điện di trên gel agarose 1 % và thể hiện ở hình 3.5.

Hình 3.5. Kết quả tách chiết DNA tổng số của cây Bảy lá một hoa
Nghiên cứu trên hình 3.5 thu được đoạn băng DNA là một băng sáng, rõ
và gọn.
3.2.2. Kết quả khuếch đại và phân tích trình tự nucleotide đoạn gen matK
Sau khi tách chiết và tinh sạch DNA tổng số, tiến hành nhân gen matK
bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi được ký hiệu matK-F và matK-R. Sản phẩm
PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% được thể hiện ở hình 3.6

23


M

SH

1000 bp
800 bp
750 bp

Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại gen matK bằng kỹ thuật PCR
M: maker 1 kb; SH: sản phẩm PCR của gen matK mẫu Sìn Hồ
Kết quả khuếch đại đoạn gen matK cho thấy, trên hình ảnh điện di chỉ
xuất hiện một băng sản phẩm với kích thước khoảng 800 bp phù hợp với tính
toán lý thuyết về kích thước đoạn gen matK nhân bản bằng kỹ thuật PCR. Sau
khi tinh sạch sản phẩm PCR, mẫu được đem đi giải trình tự trên máy giải trình
tự tự động tại Viện Công nghệ Sinh học.
Gen matK được tinh sạch và đọc trực tiếp trên máy xác định trình tự trên
máy đọc trình tự tự động và blast trên NCBI, kết quả Blast được trình bày ở
hình 3.7

24


Hình 3.7. Kết quả Blast trình tự gen matK
Theo hình 3.7 đoạn gen matK của cây Bảy lá một hoa thu ở Sìn Hồ được so
sánh với 9 trình tự trên GenBank với độ tương đồng đều là 98%. Kết quả nghiên
cứu như vậy khẳng định trình tự mẫu nghiên cứu là trình tự đoạn matK thuộc chi
Paris. Kết quả phân tích đoạn trình tự nucleotide bằng phần mềm Bioedit thì thu
được đoạn có chiều dài 836 nucleotide, được trình bày ở hình 3.8.

25

Hình 3.8. Trình tự nucleotide của đoạn gen matK phân lập từ mẫu cây Bảy lá
một hoa thu thập ở Sìn Hồ, Lai Châu
Sử dụng trình tự đoạn gen matK của 8 loài thuộc chi Paris, với 14 giống
khác nhau để so sánh sự tương đồng và khác biệt về đoạn gen matK. Các trình
tự gen matK sử dụng được trình bày trong bảng 3.1.

26


Bảng 3.1. Một số trình tự đoạn gen matK sử dụng để xác định độ
tương đồng và sai khác với mẫu SH
STT Mã số gen

Tên loài/ giống

Năm công bố

1

GU178944 P. fargesii var. fargesii voucher

2010

2

KM242781 P. forrestii

2015

3

HG475403 P. mairei

2014

4

GU178946 P. marmorata voucher

2011

5

KM242788 P. polyphylla var. yunnanensis

2015

6

KM242785 P. polyphylla var. chinensis

2015

7

GU178949 P. polyphylla var. pseudothibetica voucher

2016

8

GU178947 P. polyphylla var. stenophylla voucher

2011

9

GU178952 P. polyphylla var. yunnanensis voucher

2010

10

GU178945 P. polyphylla var. pseudothibetica voucher

2011

11

JN417377

2012

12

KM242789 P. rugosa

2015

13

GU178948 P. vietnamensis voucher

2011

14

KM242792 P. vietnamensis

2011

15

SH (mẫu thu thập ở huyện Sìn Hồ, tỉnh Lai Châu)

P. pubescens voucher

Dựa trên trình tự nucleotide của gen matK, bằng phần mềm DNAstar
chúng tôi thiết lập bảng độ tương đồng và phân ly ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Độ tương đồng và phân ly dựa trên trình tự gen matK
P. fargesii var. fargesii voucher
P. forrestii
P. mairei
P. marmorata voucher
P. polyphylla var. yunnanensis
P. polyphylla var. chinensis
P. polyphylla var. pseudothibetica voucher
P. polyphylla var. stenophylla voucher
P. polyphylla var. yunnanensis voucher

P. polyphylla var. pseudothibetica voucher
P. pubescens voucher
P. rugosa
P. vietnamensis voucher
P. vietnamensis
SH

27


Theo kết quả bảng 3.2, trình tự nucleotide của gen matK của mẫu SH (thu
thập tại huyện Sìn Hồ, tỉnh Lai Châu) có độ tương đồng dao động từ 97,4 % đến
99,9 %. Có 7 trình tự độ tương đồng cùng đạt 99,7 % với mẫu SH, là P. fargesii
voucher, P. forrestii, P. mairei, P. polyphylla var. chinensis, P. Polyphylla var.
pseudothibetica voucher, P. vietnamensis. voucher, P. vietnamensis.

Loài P.

marmorata voucher có độ tương đồng đạt 99,8 %. Có 2 loài có độ tương đồng 99,6
% là P. rugosa, P. pubescens. voucher. Trình tự P. polyphylla var. yunnanensis có
độ tương đồng 99,0 %, P. polyphylla var. yunnanensis voucher 99,5 %. Trình tự P.
polyphylla var.stenophylla độ tương đồng thấp nhất, đạt 97,4 %.
Mối quan hệ di truyền về trình tự nucleotide của gen matK thể hiện trên
sơ đồ hình cây 3.10. Kết quả biểu diễn trên hình 3.10 cho thấy sự phân bố của
các loài trong chi Paris, cũng như các giống trong các loài có sự phân tán, sự
phân bố tạo thành 2 nhánh chính. Đoạn gen matK của mẫu SH nằm trong
nhánh chính thứ nhất có tới 14 mẫu. Như vậy, dựa vào trình tự đoạn gen matK
thì mẫu SH có quan hệ gần với tất cả các loài đã so sánh. Khoảng cách xa nhất
về đoạn gen matK của mẫu SH đó là với một giống của loài Paris polyphylla
nằm độc lập ở nhánh 2

Paris polyphylla var. chinensis
Paris pubescens voucher
Paris polyphylla var. yunanensis
Paris polyphylla var. yunnanensis voucher

Paris mairei
Paris vietnamensis
Paris forrestii
Paris rugosa
Paris fargesii var. Fargesii
SH
Paris marmorata
Paris polyphylla var. pseudothibetica
Paris vietnamensis voucher
Paris polyphyla. stenophylla
Paris polyphylla

Hình 3.9. Sơ đồ mô tả mối quan hệ di truyền giữa các loài Bảy lá một hoa
trong chi Paris dựa trên trình tự nucleotide của đoạn gen matK.

28


3.2.3. Kết quả khuếch đại và phân tích trình tự nucleotide vùng gen ITS
Sau khi tách chiết và tinh sạch DNA tổng số, tiến hành nhân vùng gen
ITS bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi được ký hiệu ITS-F và ITS-R (bảng 2.4).
Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1 % được thể hiện ở hình
3.10. Kết quả khuếch đại vùng gen ITS cho thấy, trên hình ảnh điện di chỉ xuất
hiện một băng sản phẩm với kích thước khoảng 800 bp. Sau khi tinh sạch sản

phẩm PCR, mẫu được đem đi giải trình tự trên máy giải trình tự tự động tại
Viện Công nghệ Sinh học.
M

1000 bp
750 bp

SH

800 bp

800 bp

Hình 3.10. Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại vùng gen ITS
bằng kỹ thuật PCR
M: maker 1 kb; SH: sản phẩm PCR của vùng gen ITS mẫu Sìn Hồ
Vùng gen ITS được đọc trực tiếp trên máy đọc trình tự tự động và Blast
trên NCBI, kết quả Blast được trình bày ở hình 3.11

29