(Luận văn thạc sĩ) Phân lập đoạn gen Cyp79D1 liên quan đến sự tổng hợp Hydrogen Cyanide của cây sắn (Manihot Esculenta)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
–––––––––––––––––––––

NGUYỄN THỊ THÙY

PHÂN LẬP ĐOẠN GEN CYP79D1 LIÊN QUAN ĐẾN
SỰ TỔNG HỢP HYDROGEN CYANIDE CỦA CÂY SẮN
(MANIHOT ESCULENTA)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2018


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
–––––––––––––––––––––

NGUYỄN THỊ THÙY

PHÂN LẬP ĐOẠN GEN CYP79D1 LIÊN QUAN ĐẾN
SỰ TỔNG HỢP HYDROGEN CYANIDE CỦA CÂY SẮN
(MANIHOT ESCULENTA)
Ngành: DI TRUYỀN HỌC
Mã số: 8 42 01 21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS. Hoàng Phú Hiệp

THÁI NGUYÊN - 2018


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan nội dung trình bày trong luận văn là kết quả nghiên cứu
của tôi dưới sự hướng dẫn trực tiếp của TS. Hoàng Phú Hiệp. Các số liệu, kết
quả sử dụng trong luận văn là trung thực và được sự đồng ý của cán bộ hướng
dẫn cùng nhóm nghiên cứu.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những kết quả nghiên cứu trong
luận văn này.

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Thùy

i


LỜI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Hoàng Phú Hiệp đã tận
tình hướng dẫn, giúp đỡ và chỉ bảo để em có thể hoàn thành luận văn này.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô, cán bộ Bộ môn Sinh học hiện đại &
Giáo dục Sinh học, khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã
tận tình giúp đỡ em trong quá trình làm luận văn.
Em xin bày tỏ lời cảm ơn sự động viên và giúp đỡ của gia đình và bạn bè trong
suốt thời gian học tập và thực hiện đề luận văn.
Trong quá trình nghiên cứu, do thời gian và khả năng có hạn, luận văn còn nhiều
hạn chế. Em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của thầy cô và các bạn.

Thái Nguyên, tháng 09 năm 2018

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Thùy

ii


MỤC LỤC
Trang

LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................... ii
MỤC LỤC .......................................................................................................... iii
BẢNG CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................... iv
DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................. v
DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................. vi
MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1
1. Lý do chọn đề tài ............................................................................................. 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................ 2
3. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 2
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................... 3
1.1. Cây sắn (Manihot esculenta Crantz)............................................................. 3
1.1.1. Phân loại, nguồn gốc và phân bố của cây sắn ........................................... 3
1.1.2. Đặc điểm cây sắn ....................................................................................... 4
1.1.3. Hướng sử dụng sản phẩm từ sắn ............................................................... 6
1.1.4. Tình hình sản xuất - tiêu thụ sắn tại Việt Nam.......................................... 8
1.2. Độc tố trong sắn .......................................................................................... 11
1.3. Họ gen CYP79 và tình hình nghiên cứu gen CYP79D1 và CYP79D2 ...... 14
1.3.1. Đặc điểm họ gen CYP79 ......................................................................... 14
1.3.2. Tình hình nghiên cứu gen CYP79D1 và CYP79D2 ................................ 16

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 18
2.1. Vật liệu và địa điểm nghiên cứu ................................................................. 18
2.1.1. Vật liệu thực vật....................................................................................... 18
2.1.2. Địa điểm nghiên cứu................................................................................ 18
2.2. Thiết bị và hóa chất .................................................................................... 18
2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 19

iii


2.3.1. Phương pháp tách chiết RNA tổng số ..................................................... 19
2.3.2. Phương pháp tạo cDNA........................................................................... 20
2.3.3. Phương pháp tách chiết DNA tổng số ..................................................... 20
2.3.4. Phương pháp PCR ................................................................................... 20
2.3.5. Phương pháp điện di sản phẩm PCR ....................................................... 22
2.3.6. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR .................................................... 22
2.3.7. Phương pháp đọc trình tự ........................................................................ 23
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 24
3.1. Kết quả tách chiết RNA, tạo cDNA và nhân đoạn gen CYP97D1 ............. 24
3.2. Kết quả tách chiết DNA và nhân đoạn gen CYP97D1 ............................... 25
3.3. Xác định và phân tích trình tự đoạn gen CYP79D1 của 2 giống sắn Xanh
Vĩnh Phú và KM94 ............................................................................................ 26
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................. 31
1. Kết luận .......................................................................................................... 32
2. Đề nghị........................................................................................................... 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 33

iv

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT
STT

VIẾT TẮT

VIẾT ĐẦY ĐỦ

1

BLAST

Basic Local Alignment Search Tool

2

cDNA

Complementary deoxyribonucleotide acid

3

CYP

Cytochrome P450

4

DNA

Deoxyribonucleotide acid

5

FAO

Food and Agriculture Organization of the United Nations

6

HCN

Hydro cyanua

7

IAA

β - Indole acetic acid

8

IAOx

Indole - 3 - acetaldoxime

9

PCR

Polymerase Chain Reaction

10

ppm

Parts per million

11

RNA

Ribonucleotide acid

iv


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của tinh bột sắn ............... 7
Bảng 1.2. Sản lượng sắn theo vùng của Việt Nam giai đoạn 2000-2015 ........... 9
Bảng 1.3. Nồng độ cyanide trong sản phẩm thức ăn từ sắn ............................. 12
Bảng 1.4. Họ gen CYP79 ở thực vật ................................................................ 14
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR ............................................................... 21
Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR ....................................................... 22

v


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Phân bố và sản lượng sắn ở các nước trên thế giới (2013) ................. 4
Hình 1.2. Sản lượng sắn cả nước giai đoạn 1995-2016....................................... 8
Hình 1.3. Quá trình chuyển hóa HCN từ lá sắn xuống củ ................................. 15
Hình 3.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số ........................................................ 24
Hình 3.2. Kết quả PCR nhân đoạn gen CYP79D1 từ RNA tổng số ................. 24
Hình 3.3. Kết quả điện di DNA tổng số ......................................................................25
Hình 3.4. Kết quả PCR nhân đoạn gen CYP79D1
Hình 3.5. So sánh bằng đồ họa về trình tự đoạn gen CYP79D1 ....................... 27
Hình 3.6. Vị trí phân bố của một số gen CYP trên hệ gen sắn ............................ 31

vi


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Nhóm chất cyanide gồm rất nhiều hợp chất với cấu tạo hóa học phức tạp.
Những chất này có trong hơn 2.650 loài thực vật khác nhau thuộc khoảng 550
chi và hơn 130 họ, bao gồm dương xỉ, thực vật hạt kín, cây hạt trần [20]. Nhiều
cây ăn được chứa cyanogenic glycosides với nồng độ khác nhau, sự khác biệt
chủ yếu do yếu tố di truyền, môi trường, vị trí, mùa và loại đất [6].
Ở Việt Nam, cây sắn đóng góp phần không nhỏ trong công cuộc xóa đói
giảm nghèo cho nông dân các vùng thiểu số, vùng sâu vùng xa. Sản phẩm từ sắn
được ứng dụng trong nhiều ngành sản xuất: chế biến bột ngọt, bánh kẹo, mì ăn
liền, bao bì, phụ gia, màng phủ thực phẩm hay thành phần của ethanol.
Cyanide có mặt trong sắn ở hai dạng cyanogenic glycoside: linamarin và
lotaustralin. Trong đó, linamarin chiếm hơn 80% và có mặt trong tất cả các bộ
phận của cây sắn, đặc biệt là rễ và lá. HCN tạo ra và tích tụ nhiều ở vỏ, đầu và
phần lõi ruột của sắn [24]. Căn cứ vào hàm lượng HCN (hydro cyanua) trong
sắn, người ta chia các giống sắn thành 2 nhóm: nhóm sắn ngọt và nhóm sắn đắng.
Trong quá trình chế biến sắn, nếu không loại được HCN thì chất này có thể gây

ngộ độc cho người và động vật. Khả năng chống chịu hàm lượng HCN của động
vật phụ thuộc vào giống, độ tuổi [7]. Để làm giảm hàm lượng HCN trong sản
phẩm sắn thường phải thông qua các phương pháp như làm khô; ủ chua để lên
men, ngâm nước củ, thân và lá non.
Độc tố trong sắn được phát hiện lần đầu vào năm 1885 bởi Peckolt, có tên
gọi là manihotoxin. Quá trình sinh tổng hợp độc tố ở sắn có sự tham gia của
enzyme hydrolytic, enzyme này phân giải các dạng cyanogenic glycoside thành
dạng cyanide tự do [8]. Như vậy, hàm lượng độc tố trong sắn có thể được giảm
bằng cách sử dụng các kĩ thuật knock-out gen hoặc RNAi tác động vào chu trình
chuyển hóa đó.
1


Nhằm mục đích nghiên cứu vật liệu cơ sở cho việc ứng dụng kĩ thuật trên
trên đối tượng cây sắn, chúng tôi tiến hành đề tài: Phân lập đoạn gen CYP79D1
liên quan đến sự tổng hợp Hydrogen cyanide của cây sắn (Manihot
esculenta).
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Phân lập đoạn gen mã hóa cytochrome P450 của cây sắn.
3. Nội dung nghiên cứu
- Tách chiết RNA tổng số và tạo cDNA từ lá cây sắn.
- Nhân bản đoạn gen CYP79D1 bằng kỹ thuật PCR.
- Xác định trình tự đoạn gen CYP79D1.

2


Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Cây sắn (Manihot esculenta Crantz)

1.1.1. Phân loại, nguồn gốc và phân bố của cây sắn
Cây sắn (Manihot esculenta Crantz) thuộc họ Thầu dầu Euphorbiaceae,
còn có tên gọi khác là cây khoai mì, củ mì. Cây sắn có nguồn gốc từ vùng nhiệt
đới của châu Mỹ La tinh và được trồng cách đây khoảng 5000 năm. Nơi xuất
hiện cây sắn đầu tiên được giả thiết tại vùng đông bắc Brasil. Ngoài ra, nhiều
bằng chứng chứng minh cây sắn có nguồn gốc tại Mexico, Trung Mỹ và ven biển
phía Bắc của Nam Mỹ. Tại những di tích khảo cổ, củ sắn được tìm thấy có niên
đại 2.700 năm trước Công nguyên (Venezuela,); niên đại khoảng 2.000 năm
trước công nguyên (ở vùng ven biển Peru). Những lò nướng bánh sắn ở phía bắc
Colombia niên đại khoảng 1200 năm trước công nguyên, những hạt tinh bột sắn
ở trong phần hóa thạch được phát hiện tại Mexico có tuổi khoảng 900 năm đến
200 năm trước công nguyên.
Ở châu Á, sắn được du nhập vào Ấn Độ khoảng thế kỷ XVII, sau đó, được
trồng ở Trung Quốc, Myanmar và các nước châu Á khác ở cuối thế kỷ XVIII đầu thế kỷ XIX.
Cây sắn vào Việt Nam khoảng giữa thế kỷ XVIII và được trồng trên khắp
lãnh thổ do khả năng thích ứng tốt với điều kiện khí hậu thổ nhưỡng, tập trung
nhiều ở các vùng sinh thái nông nghiệp như Đồng bằng sông Hồng, Trung du và
miền núi phía Bắc, Bắc Trung Bộ và Duyên hải miền Trung, Trung du, Đông
Nam Bộ, Đồng bằng sông Cửu Long [25].
Ngày nay, cây sắn được trồng từ 30˚B - 30˚N, ở 89 nước nhiệt đới thuộc
châu Mỹ (14%), châu Phi (60%) và châu Á - Thái Bình Dương (20%), trên những
vùng đất nghèo dinh dưỡng với kĩ thuật canh tác truyền thống để làm lượng thực
- thực phẩm, thức ăn gia súc. Sự phân bố vùng trồng sắn trên thế giới được thể
hiện ở hình 1.1.

3


Hình 1.1. Phân bố và sản lượng sắn ở các nước trên thế giới (2013) [2]
Từ năm 1961 đến nay, diện tích trồng sắn trên thế giới có xu hướng gia

tăng. Cây sắn đang được nhanh chóng chuyển đổi thành cây công nghiệp triển
vọng, làm nguyên liệu cho các ngành công nghiệp chế biến tinh bột, cây nhiên
liệu sinh học…
1.1.2. Đặc điểm cây sắn
Đặc điểm hình thái là một trong những chỉ tiêu đánh giá và phân loại giống.
Đặc điểm này do yếu tố di truyền của giống sắn quyết định. Lá sắn là lá đơn mọc
xen kẽ trên thân. Phiến lá xẻ thùy, có 5 - 7 thùy, mặt trên xanh thẫm, mặt dưới
xanh nhạt có gân nổi rõ, cuống lá dài, có giống dài tới 30 - 40 cm, màu sắc cuống
thay đổi: xanh, vàng, đỏ, thể hiện đặc trưng riêng của giống [3].
Chùm hoa có cuống dài, thường mọc ở phía ngọn thân, số lượng hoa cái ít
hơn hoa đực và thường nở trước hoa đực nên cây thường thụ phấn chéo nhờ gió
và côn trùng. Quả sắn thuộc loại quả nang tự khai, màu nâu nhạt đến đỏ tía, hình
lục giác, chia thành ba ngăn, mỗi ngăn có một hạt. Hạt sắn hình trứng, có vân
hoặc những vết nâu đỏ trên nền màu kem hoặc xám nhạt [5].
Sắn thường có một thân đơn, mọc thẳng, thuộc loại thân gỗ cao trung bình
từ 2 - 3 m, đường kính thân trung bình 2 - 6 cm, giữa thân có lõi trắng và xốp.
Chiều cao cây của các giống sắn chịu ảnh hưởng bởi đặc điểm di truyền và điều
kiện ngoại cảnh. Mỗi giai đoạn sinh trưởng khác nhau chiều cao cây khác nhau

4


và chiều cao tăng dần theo thời gian sinh trưởng. Tốc độ gia tăng kích thước thân
ở mỗi giai đoạn sinh trưởng khác nhau không giống nhau. Tốc độ tăng trưởng
chiều cao cây tăng lên từ giai đoạn 40 - 140 ngày sau trồng và tăng mạnh nhất
vào giai đoạn 80 - 120 ngày sau trồng. Sau đó tốc độ này giảm dần và đạt tối đa
vào thời kỳ thu hoạch. Những giống sắn có chiều cao trung bình khoảng 200 250 cm. Giống sắn có chiều cao cây cao dễ bị đổ ngã, khó thu hoạch. Giống sắn
có chiều cao cây quá thấp ảnh hưởng tới năng suất của giống cũng như đến nguồn
cây giống cho vụ sau. Sự phân cành và chiều cao phân cành được đánh giá là yếu
tố quan trọng trong chọn tạo giống sắn. Sự phân cành ảnh hưởng tới bộ tán lá,

giống phân cành càng thấp thì độ rộng tán lá thường lớn, chiếm diện tích không
gian lớn, điều này ảnh hưởng tới việc quang hợp của cây, từ đó hạn chế việc tăng
mật độ trồng trên một đơn vị diện tích. Do cây sắn sử dụng hom để trồng, sau
khi thu hoạch thân cây được thu lại làm giống cho vụ sau, nếu chiều cao phân
cành thấp làm phần thân thu được ít, gây hạn chế nguồn giống. Màu sắc thân tùy
thuộc vào giống và từng giai đoạn phát triển của cây. Thân non có màu xanh
hoặc màu đỏ tía. Thân già màu sắc thay đổi thành màu vàng, vàng tro, xám, trắng
bạc hay xám lục. Thân có nhiều mắt sắp xếp xen kẽ nhau theo vị trí của lá, khúc
khuỷu, xù xì [5].
Rễ con là rễ ở mô phân sinh, mọc dài theo hướng ngang sau đó phát triển
theo hướng xuyên xuống sâu. Rễ cái đối với cây mọc từ hạt mọc theo hướng
thẳng đứng và từ rễ cái mọc ra nhiều rễ con. Rễ con chủ yếu làm nhiệm vụ hút
nước và dinh dưỡng để nuôi cây, khi gặp điều kiện không thuận lợi sẽ mọc đâm
sâu để hút nước và dinh dưỡng. Rễ mọc từ mắt và mô sẹo của hom, phình to ra,
tập trung được nhiều dinh dưỡng và tích lũy bột thành củ. Khi gặp điều kiện
thuận lợi tượng tầng sẽ phát triển mạnh tạo thành củ.
Củ thường phát triển theo hướng nằm ngang hoặc xiên, xuyên sâu vào đất.
Củ sắn hai đầu nhọn, chiều dài từ 25 - 200 cm, trung bình khoảng 40 - 50 cm.
Đường kính củ thay đổi trung bình từ 5 - 7 cm. Kích thước cũng như trọng lượng
củ thay đổi theo giống, điều kiện canh tác và độ màu mỡ của đất [5].
5


1.1.3. Hướng sử dụng sản phẩm từ sắn
Củ sắn tươi có tỉ lệ chất khô 30-40%, tinh bột 16-32%, chất protein, béo,
xơ trong 100g tương ứng là 0,8-2,5g; 0,2-0,3g; 1,1-1,7g; 0,6-0,9g; giàu vitamin
C, canxi, vitamin B và các khoáng chất, nghèo chất béo và nghèo đạm. Khoáng
chất và vitamin trong 100g củ sắn là 18,8-22,5mg Ca; 22,5-25,4mg P; 0,02mg B1;
0.02mg B2; 0,05mg PP. Trong củ sắn, hàm lượng các amino acid không được cân
đối, thừa arginin nhưng lại thiếu amino acid chứa lưu huỳnh. Thành phần dinh

dưỡng khác nhau tuỳ giống, vụ trồng, số tháng thu hoạch sau khi trồng.
Lá sắn có hàm lượng đạm khá cao, nhiều chất bột, chất khoáng và vitamin.
Lá sắn trong nguyên liệu khô 100% chứa đựng 24,2% đường và tinh bột, 24%
protein, 6% chất béo, 11% xơ, 6,7% chất khoáng, xanhthophylles 350ppm. Chất
đạm của lá sắn có khá đầy đủ các amino acid cần thiết, giàu lysin nhưng thiếu
methionin [1].
Sắn lát khô thường có hai loại: sắn lát khô có vỏ và sắn lát khô không vỏ.
Sắn lát khô có vỏ bao gồm: vỏ thịt, thịt sắn, lõi sắn và có thể là một phần vỏ gỗ.
Sắn lát khô không vỏ chỉ bao gồm thịt sắn và lõi sắn. Số liệu hàm lượng các chất
trong sắn lát khô không vỏ của Việt Nam bình quân đạt: 90,01% khối lượng khô,
2,48% đạm thô, 1,40% béo thô, 3,72% xơ thô, 2,04% khoáng tổng số, 78,59%
dẫn xuất không đạm, 0,15% Ca, 0,25% P. Sắn lát khô có vỏ có 90,57% khối
lượng khô, 4,56% đạm thô, 1,43% béo thô, 3,52% xơ thô, 2,22% khoáng tổng
số, 78,66% dẫn xuất không đạm, 0,27% Ca, 0,50% P [24].
Bột sắn nghiền thủ công có khoảng 87,56% vật chất khô, 3,52% đạm thô,
1,03% béo thô, 1,37% xơ thô, 1,38% khoáng tổng số, 83,89% dẫn xuất không
đạm, 0,11% Ca, 0,11% P. Tinh bột sắn có màu rất trắng. Hạt tinh bột sắn quan sát
trên kính hiển vi điện tử quét (SEM - Scanning Electron Microscope) có kích thước
5 - 40 nm, nhiều hình dạng, chủ yếu là hình tròn, bề mặt nhẵn, một bên mặt có chỗ
lõm hình nón và một núm nhỏ ở giữa. Tinh bột sắn có hàm lượng amylopectin và
phân tử lượng trung bình cao hơn amylose của tinh bột bắp, lúa mì, khoai tây. Gel

6


tinh bột có độ nhớt, độ kết dính cao và khả năng gel bị thoái hóa thấp. Thành
phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của tinh bột sắn thể hiện ở bảng 1.1 [24].
Bảng 1.1. Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của tinh bột sắn
Thành phần

Giá trị dinh dưỡng

Tỷ lệ chất khô (%)

30-40

Hàm lượng tinh bột (%)

27-36

Đường tổng số (% FW)

0,5-2,5

Đạm tổng số (%FW)

0,5-2,0

Chất xơ (%FW)

1,0

Chất béo (%FW)

0,5

Chất khoáng (%FW)

0,5-1,5

Vitamin A (mg/100gFW)

17

Vitamin C (mg/100gFW)

50

Năng lượng (KJ/100g)

607

Yếu tố hạn chế dinh dưỡng

Cyanogenes

Amylose (%)

15-29

Độ dính tối đa (BU)

700-1100

Nhiệt độ hồ hóa (OC)

49-73

Sắn là cây trồng có nhiều công dụng trong chế biến công nghiệp, thức ăn
gia súc và lương thực thực phẩm. Mỗi bộ phận của cây đều đem lại những giá trị

sử dụng nhất định. Từ việc đóng vai trò làm cây lương thực, sắn đang được mở
rộng sang các hướng cây nhiên liệu sinh học (sản xuất cồn sinh học, màng phủ
sinh học), tinh bột biến tính. Củ sắn được dùng để chế biến tinh bột, sắn lát khô,
các sản phẩm công nghiệp như bột ngọt, mì ăn liền, glucose, siro, bánh kẹo, mạch
nha, kỹ nghệ chất dính (hồ vải, dán gỗ), bún, miến, mì ống, mì sợi, bột khoai,
bánh tráng, hạt trân châu (tapioca), phụ gia thực phẩm, phụ gia dược phẩm hoặc
dùng để ăn tươi. Củ sắn cũng là nguồn nguyên liệu chính để làm thức ăn gia súc.
Thân sắn dùng để làm giống, nguyên liệu cho công nghiệp cellulose, làm nấm,
làm củi đun. Lá sắn non làm rau xanh giàu đạm, dùng trực tiếp để nuôi tằm, nuôi

7


cá. Bột lá sắn hoặc lá sắn ủ chua dùng để nuôi lợn, gà, trâu bò, dê… Hiện tại, sản
phẩm sắn ngày càng thông dụng trong buôn bán, trao đổi thương mại quốc tế [4].
1.1.4. Tình hình sản xuất - tiêu thụ sắn tại Việt Nam
Hiện nay, sắn được trồng tại trên dưới 100 quốc gia trên toàn thế giới với
các quy mô canh tác rất khác nhau. Sắn là cây trồng tiềm năng, được coi là cây
lương thực quan trọng với diện tích trồng ngày càng mở rộng nhanh chóng. Tổng
diện tích sắn toàn thế giới năm 2014 là 24,15 triệu ha, năng suất bình quân 11,30
tấn/ha, sản lượng 272,94 triệu tấn, đứng hàng thứ năm về sản lượng các cây
lương thực chính, xếp sau ngô (1.037,79 triệu tấn); lúa nước (741,48 triệu tấn);
lúa mì (729,01 triệu tấn) và khoai tây (381,68 triệu tấn).
Là cây công nghiệp xuất khẩu triển vọng, Việt Nam hiện mỗi năm thu
hoạch trên 0,5 triệu ha sắn, sản lượng khoảng 10 triệu tấn. Sắn được Bộ Công
thương đưa vào nhóm 10 mặt hàng nông sản xuất khẩu chủ lực của Việt Nam
những năm gần đây, giá trị xuất khẩu sắn mỗi năm đạt từ 1,0 tỷ đến 1,5 tỷ USD.
Năng suất sắn năm 2015 đã tăng lên gấp đôi và sản lượng sắn tăng lên gấp 5 lần
so với năng suất và sản lượng sắn năm 2000 (hình 1.2) [26].

Hình 1.2. Sản lượng sắn cả nước giai đoạn 1995-2016 (Đơn vị: nghìn tấn)
Tại Việt Nam, sắn được canh tác phổ biến, tập trung nhiều tại các vùng
sinh thái nông nghiệp. Đây là một trong số những nguồn thu nhập quan trọng của

8


nông dân do dễ trồng, vốn đầu tư ít, khả năng thích nghi với sinh thái cao và phù
hợp với kinh tế nông hộ.
Vùng Bắc Trung bộ và Duyên hải miền Trung có sản lượng năm 2015 là
3.144.200 tấn sắn củ tươi chiếm 29,46% tổng sản lượng sắn cả nước. Những tỉnh
trồng nhiều sắn của vùng này là Bình Thuận, Phú Yên, Quảng Ngãi và Thanh
Hóa.
Vùng Đông Nam bộ: sản lượng năm 2015 là 2.982.600 tấn sắn củ tươi,
chiếm 27,94% tổng sản lượng sắn cả nước. Những tỉnh trồng nhiều sắn của
vùng này là Tây Ninh, Bình Phước, Đồng Nai, Bà Rịa - Vũng Tàu và Bình
Dương.
Vùng Tây Nguyên: sản lượng năm 2015 là 2.728.300 tấn sắn củ tươi,
chiếm 25,56% tổng sản lượng sắn cả nước. Những tỉnh trồng nhiều sắn của vùng
này là Gia Lai (nhiều nhất cả nước), Kon Tum, Đăk Lăk và Đăk Nông.
Vùng núi và trung du phía Bắc: sản lượng năm 2015 là 1.500.600 tấn sắn
củ tươi, chiếm 14,06% tổng sản lượng sắn cả nước. Những tỉnh trồng nhiều sắn
của vùng này là Sơn La, Yên Bái và Hòa Bình [26].
Bảng 1.2. Sản lượng sắn theo vùng của Việt Nam giai đoạn 2000-2015
(Đơn vị: nghìn tấn)

Hiện nay, Việt Nam hiện có 105 nhà máy sản xuất tinh bột sắn quy mô
công nghiệp và 7 nhà máy chế biến cồn với hàng trăm doanh nghiệp thương mại

9

sắn. Năm 2016, sắn và các sản phẩm từ sắn là đứng vị trí thứ 8 trong các mặt
hàng sản phẩm xuất khẩu chủ lực của Việt Nam. Sản xuất tinh bột sắn với sản
lượng mỗi năm trên 2,0 triệu tấn, trong đó 70% xuất khẩu và 30% tiêu thụ trong
nước. Kim ngạch xuất khẩu sắn và các sản phẩm từ sắn đứng thứ 2 sau Thái Lan.
Giá trị xuất khẩu sản phẩm sắn từ 2012 đến 2016 đạt từ 1,0 tỷ USD đến 1,5 tỷ
USD/năm. Năm 2015 sản lượng xuất khẩu sắn và các sản phẩm từ sắn đạt 4,11
triệu tấn, trong đó 1,86 triệu tấn sắn lát; 2,25 triệu tấn tinh bột sắn và các sản
phẩm khác từ sắn. Tổng giá trị kim ngạch xuất khẩu: 1,32 tỷ USD. Sản lượng
xuất khẩu và kim ngạch xuất khẩu năm 2015 tăng so với năm 2014 (3,368 triệu
tấn) và (1,136 tỷ USD). Trong năm 2016, Việt Nam xuất khẩu khoảng 3,7 triệu
tấn sản phẩm sắn, trị giá 998.698 nghìn USD, trong đó 88,22% khối lượng được
xuất khẩu sang Trung Quốc, trị giá 868.395 nghìn USD; tiếp sau đó là các thị
trường Hàn Quốc, Nhật Bản, Philippin, Malaysia và Đài Loan [26]. Sắn là cây
đứng thứ 4 trong các cây trồng có kim ngạch xuất khẩu chủ lực của Việt Nam
trên 1 tỷ USD. Tinh bột sắn Việt Nam đã đến được với trên 20 quốc gia trên thế
giới. Năng suất sắn của Việt Nam 18,8 tấn/ha hiện đang đứng ở xung quanh số
10 trong số các nước có năng suất cao.
Sắn Việt Nam trong thời gian qua mặc dù đã đạt được những thành tựu
trong sản xuất, chế biến, kinh doanh và xuất khẩu nhưng vẫn gặp nhiều thách
thức. Giá mua bán sắn không ổn định và lệ thuộc nhiều vào thị trường Trung
Quốc. Năng suất sắn Việt Nam thấp hơn nhiều so với tiềm năng năng suất sắn
và nhiều rủi ro trong sản xuất tiêu thụ. Năng suất sắn Việt Nam hiện tại (18,8
tấn/ha) thấp hơn Ấn Độ (35,7 tấn/ha), Campuchia (25,2 tấn/ha), Indonesia (23,4
tấn/ha), Thái Lan (22,3 tấn/ha) của vùng sắn Châu Á. Nhiều địa phương trồng
một giống sắn liên tục nhiều năm, ít phục tráng, nhân giống mới, sử dụng hom
giống kém chất lượng, trồng sắn không chọn đúng lịch thời vụ và thời điểm thu
hoạch tối ưu, bón ít phân và không cân đối. Sắn trồng trên đất dốc, đất bị xói mòn

10


nghèo dinh dưỡng, không chú trọng đúng mức các biện pháp thâm canh sắn. Khi
bùng phát nhiều dịch hại nguy hiểm có thể làm giảm năng suất cây trồng.
1.2. Độc tố trong sắn
Nhóm chất cyanide gồm nhiều hợp chất có cấu tạo hóa học khác nhau và
rất phức tạp. Nhiều dạng cyanide được ứng dụng trong sản xuất công nghiệp.
Hydrogen cyanide là chất lỏng màu xanh nhạt hoặc không màu, được sử dụng
chủ yếu trong sản xuất các chất chẳng hạn adiponitrile, methyl methacrylate,
cyanuric chloride, methionine. Các cyanide khác, chẳng hạn như natri và kali
cyanide, là muối hút ẩm hoặc tinh thể được sử dụng rộng rãi trong quá trình chiết
xuất quặng để thu hồi vàng…Tuy nhiên, anion CN- trong các hợp chất cyanide
là một trong số các tác nhân gây ô nhiễm cho môi trường [9]. Cyanogenic
glycosides có trong hơn 2.650 loài thực vật khác nhau thuộc khoảng 550 chi và
hơn 130 họ, bao gồm dương xỉ, thực vật hạt kín, cây hạt trần [20]. Có khoảng 25
loại cyanogenic glycosides được biết đến, khi phân giải chúng thu được sản phẩm
chứa cyanide.
Cyanogenic glycosides trong sắn được phân giải nhờ enzyme tiêu hóa hoặc
clohdric acid trong dịch vị dạ dày, tạo thành cyan hydric acid có khả năng gây
ngộ độc cho con người và động vật. Độc tính của sắn chủ yếu là do cyan hydric
acid tạo ra, tương tự như chất say của một số loại họ Đậu và tích tụ nhiều ở vỏ
sắn, đầu sắn, phần lõi ruột [24].
Độc tố trong sắn được phát hiện lần đầu vào năm 1885 bởi Peckolt, ở dạng
glycoside, tên gọi là manihotoxin. Cyanide có mặt trong sắn ở hai dạng
cyanogenic glycoside: linamarin và lotaustralin. Trong đó, linamarin chiếm hơn
80%, có mặt trong tất cả các bộ phận của cây sắn, đặc biệt là rễ và lá [16].
Quá trình sinh tổng hợp dạng cyanide tự do có sự tham gia của enzyme
hydrolytic, phân giải các dạng cyanogenic glycosides tạo thành dạng cyanide tự
do [8]. Chúng bị thuỷ phân trong nước thành acid cyanhydric, aceton và glucose.

Liên kết β trong phân tử linamarin chỉ bị phá vỡ dưới tác động của nhiệt độ cao,

11


áp suất cao và sự có mặt của các acid khoáng, khi đó, enzyme linamarase nội
sinh sẽ dễ dàng cắt liên kết β. Điều kiện tối ưu để enzyme hoạt động là 25°C với
pH 5,5 - 6 [16].
Cyanide có trong nhiều loại thực vật. Nhiều cây ăn được chứa cyanogenic
glycosides, nồng độ có thể khác nhau do yếu tố di truyền, môi trường, vị trí, mùa
và loại đất [6]. Nồng độ chất này trong sản phẩm từ sắn được trình bày trong
bảng 1.3.
Bảng 1.3. Nồng độ cyanide trong sản phẩm thức ăn từ sắn [18]
Nồng độ Cyanide

Loại sản phẩm

(mg/kg hoặc mg/l)

Sắn (đắng) / vỏ rễ khô

2360

Sắn (đắng) / lá

300

Sắn (đắng) / củ

380

Sắn (ngọt) / lá

451

Sắn (ngọt) / củ

445

Căn cứ vào hàm lượng HCN trong củ sắn, người ta chia các giống sắn
thành 2 nhóm: nhóm sắn ngọt và nhóm sắn đắng. Các loại sắn khác nhau ở hàm
lượng cyanogen, thường từ 15 đến 400mg HCN/ 1kg củ tươi. Nhóm sắn ngọt
bao gồm các giống sắn có hàm lượng HCN trong củ nhỏ hơn 80 ppm trong 100
g chất tươi; theo sự phân loại khác thì sắn ngọt có hàm lượng HCN nhỏ hơn
0,01% trong chất tươi. Nhóm sắn đắng là các giống sắn có hàm lượng HCN ≥ 80
ppm trong 100 gam củ sắn tươi và theo sự phân loại khác là có hàm lượng HCN
≥ 0,01% trong củ tươi. Lá sắn có chứa hàm lượng cao độc tố HCN, trong 1kg lá
tươi các giống sắn ngọt có 80 - 100mg HCN, các giống sắn đắng có chứa 160 240mg HCN.

12


Các loài động vật khác nhau, các giống khác nhau, cá thể và độ tuổi khác
nhau có khả năng chống chịu nồng độ HCN khác nhau. Đối với con người, liều
lượng HCN 20mg/1kg thể trọng sẽ gây độc và từ 50 - 100mg gây tử vong [7].
Ở người, các dấu hiệu lâm sàng của nhiễm độc cyanua cấp tính bao gồm
hô hấp nhanh, giảm huyết áp, nhịp tim nhanh, chóng mặt, nhức đầu, đau dạ dày,
nôn, tiêu chảy, rối loạn tâm thần, co giật. Tử vong do ngộ độc cyanua có thể xảy
ra khi mức độ cyanua vượt quá giới hạn giải độc của cơ thể. Liều gây tử vong
cấp tính của hydrogen cyanide ở người được báo cáo là từ 0,5 đến 3,5 mg/kg

trọng lượng cơ thể. Trẻ em có nguy cơ cao hơn vì kích thước, trọng lượng cơ thể
nhỏ. Những người thường xuyên sử dụng sắn làm thực phẩm chính có thể nhiễm
độc cyanua mãn tính và dẫn đến một số bệnh như rối loạn chức năng tuyến giáp
và rối loạn thần kinh [10]. Tuy nhiên, cyanua trong cơ thể có thể kết hợp với
hydroxycobalamin (vitamin B12a) hình thành nên cyanocobalamin (vitamin
B12). Cyanua cũng có thể được đào thải khỏi cơ thể thông qua hô hấp khi biến
đổi thành carbon dioxide (CO2) [9].
Sự có mặt của hai glycosides cyanogenic trong sắn là một yếu tố chính của
việc hạn chế sử dụng sắn làm thực phẩm. Các kỹ thuật chế biến truyền thống
được thực hiện trong sản xuất sắn nhằm loại bỏ cyanide trong sản phẩm củ, lá
như làm khô (phơi - sấy lát khô, ép viên loại nước, làm tinh bột); ủ chua để lên
men, ngâm nước củ, thân và lá non. Trong đó, sấy khô là phương pháp chế biến
phổ biến nhất ở nhiều nước nhiệt đới. Phơi nắng loại bỏ cyanua nhiều hơn so với
sấy lò do thời gian tiếp xúc giữa linamarase và glycoside dài hơn. Ngâm nước
rồi đun sôi cũng là một phương pháp phổ biến và hiệu quả để loại bỏ cyanide.
Các sản phẩm thực phẩm truyền thống của châu Phi như gari và fufu được thực
hiện theo các bước khử nước, lên men và rang. Trong quy trình sản xuất gari,
hàm lượng cyanua giảm tới 80% - 95% [19]. Phương pháp ủ chua có thể loại bỏ
70% - 90% độc tố HCN trong củ và lá sắn, đây là phương pháp dễ thực hiện,
không phụ thuộc vào thời tiết. Các phương pháp này dựa trên ba nguyên lý cơ
bản là: loại bỏ trực tiếp cyanogen glycoside bằng cách hòa tan trong nước; làm
13


phân giải cyanogenic glycoside thành xeton và HCN, sau đó dùng nhiệt làm bốc
hơi HCN hoặc dùng nước rửa trôi HCN; làm phá hủy hoặc ức chế enzyme
linamariase và glucosidase, các men này không hoạt động thì cyanogenic
glycoside không thể phân giải thành xeton và HCN [23].
1.3. Họ gen CYP79 và tình hình nghiên cứu gen CYP79D1 và CYP79D2
1.3.1. Đặc điểm họ gen CYP79

Việc chuyển đổi các amino acid thành aldoximes là một bước quan
trọng trong quá trình sinh tổng hợp glycoside, được xúc tác bởi enzyme P450
cytochrome.
Cytochrome P450 oxidase (thường viết tắt là CYP) là một thuật ngữ chung
chỉ một nhóm enzyme oxy hóa khử quan trọng trong sinh lý động thực vật. Họ gen
CYP ở thực vật có rất nhiều (từ CYP71 đến CYP750). Trong đó, CYP79 có các họ
phụ từ CYP79A1 đến CYP79F2. Hệ gen của cây họ Cải Arabidopsis có chứa 7
gen thuộc họ CYP79: CYP79A2, CYP79B2, CYP79B3, CYP79C1, CYP79C2,
CYP79F1, CYP79F2 [22]. CYP79A1 ở cây cao lương chuyển hóa tyrosine thành
p-hydroxylphenyl-acetaldoxime trong quá trình sinh tổng hợp glucosinolate.
Glucosinolates là các sản phẩm tự nhiên có nguồn gốc từ amino acid, khi thủy
phân, thường giải phóng isothiocyanates với một loạt các hoạt động sinh
học. Glucosinolates có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ thực vật khỏi các
động vật ăn và mầm bệnh.
Bảng 1.4. Họ gen CYP79 ở thực vật [27]
Kí hiệu

Tên đầy đủ

Số hiệu

K13027

CYP79A1

tyrosine N-monooxygenase

EC:1.14.14.36

K12153

CYP79A2

phenylalanine N-monooxygenase

EC:1.14.14.40

K11812

CYP79B1_2

tryptophan N-monooxygenase

EC:1.14.13.125

K11813

CYP79B3

tryptophan N-monooxygenase

EC:1.14.13.125

K13401

CYP79D1_2

valine N-monooxygenase

EC:1.14.14.38

K14984

CYP79D3_4

isoleucine N-monooxygenase

EC:1.14.14.39

K20785

CYP79E1_2

tyrosine N-monooxygenase

EC:1.14.14.36

K12154

CYP79F1

homomethionine N-monooxygenase

EC:1.14.14.42

K12155

CYP79F2

homomethionine N-monooxygenase

EC:1.14.14.42

14


CYP79A2 chuyển hóa phenylalanine thành phenylacetaldoxime, tiền thân
của benzyl glucosinolate. Cả CYP79B2 và CYP79B3 chuyển hóa tryptophan thành
IAOx, tiền thân của indole glucosinolate hoặc IAA. Ở E.coli, CYP79F1 được biểu
hiện và chuyển hóa chuỗi methionine thành aldoxime tương ứng [22].
CYP79 có liên quan đến sinh tổng hợp glycosides cyanogenic - hợp chất thứ
cấp phổ biến ở các loài thực vật có mạch. Sự sinh tổng hợp bắt đầu bằng việc chuyển
đổi các amino acid thơm hoặc béo thành các aldoxime tương ứng, được xúc tác bởi
N-hydroxylating cytochrome P450 monooxygenases (CYP) của họ CYP79. Quá
trình thủy phân glycosides cyanogenic được thực hiện bởi các enzyme βglucosidase tạo thành hydrogen cyanide, chất này được giải phóng sau các tổn
thương mô [21]. Giai đoạn đầu tiên trong sinh tổng hợp glycosides được xúc tác
bởi hai cytochromes P450 (CYP79D1 và CYP79D2). Glycosides được tổng hợp
ở đỉnh chồi và vận chuyển đến gốc. CYP79D1 và CYP79D2 được ưu tiên biểu
hiện trong tế bào thịt lá và các tế bào nằm bên cạnh lớp biểu bì [11].

Hình 1.3. Quá trình chuyển hóa HCN từ lá sắn xuống củ [13]

15


1.3.2. Tình hình nghiên cứu gen CYP79D1 và CYP79D2
Trong số các gen thuộc họ CYP79, cả CYP79D1 và CYP79D2 đều có trong
hệ gen của cây sắn và chịu trách nhiệm sản xuất glycosides cyanogenic. Quá
trình tổng hợp độc tố trong sắn được quy định bởi nhiều gen, bước đầu là hai gen
CYP79D1 và CYP79D2, chúng được phát hiện trong lá mầm, cánh hoa ở đầu

chồi cây sắn 2 tháng tuổi và hầu hết các mô, nhưng chủ yếu ở lớp vỏ ngoài, các
lớp tế bào trụ bì (pericycle), các mô mạch (xylem, phloem) trong cuống [11], [14].
Quá trình chuyển hóa được thể hiện bằng sơ đồ:

Do đó, có thể dùng các cấu trúc antisense ngăn chặn hoặc làm giảm quá
trình tổng hợp glycoside cyanogenic trong cây sắn [15].
Cytochrome P450s là các hemoprotein liên quan đến quá trình oxy hóa các
hợp chất khác nhau. P450 ở sinh vật nhân sơ chủ yếu là protein hòa tan. Ở sinh
vật nhân thực, P450 chủ yếu được tìm thấy trong mạng lưới nội chất
(microsome). Cytochrome P450 có trong thành phần của cây sắn, xúc tác cho
sinh tổng hợp hai dạng cyanogenic glycoside thông qua chuyển đổi L - valin và

16