(Khóa luận tốt nghiệp) Nghiên cứu nhân giống in vitro cây Đảng Sâm (Codonopsis javanica ( Blume) Hook.f. Thomson

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

TRẦN THỊ THU
Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN- VITRO CÂY ĐẢNG SÂM
(Codonopsis javanica ( Blume) Hook.f.& Thomson)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: ST & BTĐDSH

Khoa

: Lâm nghiệp

Khóa học

: 2014 – 2018

Thái Nguyên, năm 2018


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

TRẦN THỊ THU
Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN- VITRO CÂY ĐẢNG SÂM
(Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.& Thomson)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: ST & BTĐDSH

Lớp

: K46 – ST&BTĐDSH

Khoa

: Lâm nghiệp

Khóa học

: 2014 – 2018

Giảng viên hướng dẫn

: PGS.TS Trần Thị Thu Hà

Thái Nguyên, năm 2018


i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan Khóa luận tốt nghiệp tài “Nghiên cứu nhân giống invitro cây Đảng Sâm (Codonopsis javanica ( Blume) Hook.f.& Thomson.)”
là công trình nghiên cứu của bản thân tôi, công trình được thực hiện dưới sự
hướng dẫn của PGS.TS Trần Thị Thu Hà. Các số liệu và kết quả nghiên cứu
trình bày trong khóa luận là kết quả thí nghiệm thực tế của tôi, những phần sử
dụng tài liệu tham khảo trong khóa luận đã được nêu rõ trong phần tài liệu
tham khảo. Các số liệu và kết quả nghiên cứu trình bày trong khóa luận là quá
trình theo dõi hoàn toàn trung thực, nếu có sai sót gì tôi xin chịu hoàn toàn
trách nhiệm và chịu mọi hình thức kỷ luật của khoa và nhà trường đề ra.
Thái Nguyên,ngày tháng 5 năm 2018
XÁC NHẬN CỦA GVHD

PGS.TS Trần Thị Thu Hà

NGƯỜI VIẾT CAM ĐOAN

Trần Thị thu

XÁC NHẬN CỦA GV CHẤM PHẢN BIỆN
xác nhận đã sửa chữa sai sót sau khi Hội đồng đánh giá chấm

(Ký, họ và tên)


ii

LỜI CẢM ƠN
Được sự nhất trí của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm
khoa Lâm Nghiệp em đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu nhân giống in- vitro
cây Đảng Sâm (Codonopsis javanica ( Blume) Hook.f.& Thomson.)” Qua
thời gian thực tập đến nay em đã hoàn thành đề tài. Để đạt được kết quả như
ngày hôm nay em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ
nhiệm khoa Lâm Nghiệp cùng với các thầy cô trong khoa đã tạo điều kiện
giúp đỡ em trong suốt thời gian qua.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới giảng viên PGS.TS Trần Thị Thu
Hà đã tận tình hướng dẫn em trong thời gian thực hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn toàn thể cán bộ phòng Công nghệ Sinh học
Viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm nghiệp - trường Đại học Nông lâm Thái
Nguyên đã hết lòng tận tình và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp em trong quá trình
hoàn thành đề tài này.
Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã hết lòng động
viên và giúp đỡ tạo điều kiện về mặt vật chất và tinh thần cho em trong quá
trình học tập và nghiên cứu.
Mặc dù bản thân đã rất cố gắng nhưng đề tài của em không thể tránh
những thiếu sót. Em rất mong nhận được sự đóng góp của thầy cô và các bạn
để đề tài của em được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, ngày

tháng 5 năm 2018

Sinh viên
Trần Thị Thu


iii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 4.1. Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng NaClO 0,5%, HgCl2
0,1% đến hiệu quả vô trùng vật liệu nuôi cấy chồi Đảng sâm ................ 21
Bảng 4.2. Kết quả ảnh hưởng của môi trường MS, B5, WPM đến khả năng tái sinh
chồi Đảng sâm ..................................................................................................... 24
Bảng 4.3. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi Đảng
sâm ........................................................................................................................ 26
Bảng 4.4. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân
nhanh chồi Đảng sâm ......................................................................................... 29
Bảng 4.5. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của Đảng sâm... 31
Bảng 4.6. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ NAA kết hợp với IAA đến khả năng ra rễ
của Đảng sâm ...................................................................................................... 33


iv

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 01. Cây Đảng sâm ......................................................................................................5
Hình 02: Ảnh khử trùng bằng NaClO 0.5%, HgCl2 0,1% đến hiệu quả vô trùng vật
liệu nuôi cấy chồi Đảng sâm.......................................................................................22
Hình 03. Biểu đồ ảnh hưởng của môi trường MS, B5,WPM đến khả năng tái sinh
chồi Đảng sâm..............................................................................................................24

Khả năng tái sinh chồi Đảng sâm phát triển trong các môi trường được thể hiện qua
hình 04: .........................................................................................................................25
Hình 04: Ảnh chồi Đảng sâm tái sinh trên các môi trường MS, B5, WPM ................25
Hình 05: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi Đảng
sâm (sau 20 ngày nuôi cấy).........................................................................................27
Hình 06: Ảnh nhân nhanh chồi Đảng sâm với các nồng độ BA khác nhau ................28
Hình 07: Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin đến khả
năng nhân nhanh chồi Đảng sâm (sau 20 ngày nuôi cấy) .......................................29
Hình 09: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của Đảng sâm ..31
Hình 10: Ảnh Chồi Đảng sâm ra rễ khi sử dụng NAA nồng độ khác nhau ................32
Hình 11. Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ NAA kết hợp với IAA đến khả năng ra rễ
của Đảng sâm ...............................................................................................................33
Hình 12: Ảnh Chồi Đảng sâm ra rễ khi phối hợp IAA nồng độ khác nhau ................35


v

DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

AND

: Acid deoxyribonucleic

B1

: Thiamin

B3

: Nicotinic acid

B5

: Gamborg’s

B6

: Pyridoxine

BA

: 6-Benzylaminopurine

CV

: Coefficient of Variation

Đ/C

: Đối chứng

IAA

: Indol axetic acid

Kinetin

: 6-Furfurylaminopurine

LSD

: Least Significant Difference Test

MS

: Murashige and Skoog’s

MT

: Môi trường

NAA

:  - Naphlene axetic acid

TN

: Thí nghiệm

WPM

: Woody Plant Medium


vi

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN.................................................................................................................ii
DANH MỤC CÁC BẢNG .........................................................................................iii
DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................................iv

DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT..................................................................... v
MỤC LỤC .....................................................................................................................vi
PHẦN 1. MỞ ĐẦU....................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề................................................................................................... 1
1.2. Mục đích nghiên cứu .................................................................................. 2
1.3. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................... 2
1.4. Ý nghĩa của đề tài ....................................................................................... 2
1.4.1.Ý nghĩa trong học tập và nghiên cứu khoa học ....................................... 2
1.4.2.Ý nghĩa thực tiễn ...................................................................................... 3
PHẦN 2. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU ................................................................. 4
2.1. Tổng quan về cây Đảng sâm ...................................................................... 4
2.1.1. Đặc điểm hình thái .................................................................................. 4
2.1.2. Giá trị của Đảng sâm ............................................................................... 6
2.2. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật .................................................. 7
2.2.1. Khái niệm ................................................................................................ 7
2.2.2. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật.................................... 7
2.2.3. Các giai đoạn của nhân giống vô tính in vitro ........................................ 9
2.3. Một số chất điều hòa sinh trưởng nuôi cấy mô tế bào thực vật ............... 10
2.3.1. Auxin ..................................................................................................... 10
2.3.2. Cytokinin ............................................................................................... 11
2.4. Tình hình nghiên cứu nhân giống cây Đảng sâm . .................................. 12
PHẦN 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....13


vii

3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ............................................................ 13
3.2. Địa điểm, thời gian nghiên cứu ................................................................ 13
3.3. Hóa chất và thiết bị .................................................................................. 13
3.4. Nội dung và phương pháp nghiên cứu ..................................................... 13

3.4.1. Nội dung nghiên cứu ............................................................................. 13
3.4.2. Phương pháp nghiên cứu....................................................................... 14
PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN....................................21
4.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng NaClO 0,5%, HgCl2 0,1% đến
hiệu quả vô trùng vật liệu nuôi cấy chồi Đảng sâm. .................................. 21
4.2. Ảnh hưởng của môi trường MS, B5, WPM đến khả năng tái sinh chồi
Đảng sâm .................................................................................................... 23
4.3. Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh
chồi Đảng sâm ............................................................................................ 26
4.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi Đảng sâm .. 26
4.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân
nhanh chồi
4.4.1. Ănh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của Đảng sâm ............... 31
4.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ NAA kết hợp với IAA đến khả năng ra rễ của
Đảng sâm .................................................................................................... 33
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................36
5.1. Kết luận .................................................................................................... 36
5.2. Kiến nghị .................................................................................................. 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................37
PHỤ LỤC


1

PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Sâm dây hay còn gọi là Đảng sâm (Codonopsis javanica ( Blume)
Hook.f.& Thomson.) là loại cây dược liệu có giá trị kinh tế. Đây là cây thuốc
quý, có tác dụng bổ ngũ tạng, nâng cao thể lực, tăng sức dẻo dai, tăng cường

khả năng miễn dịch cho cơ thể, có tác dụng ích huyết, sinh tân dịch, chống
mệt mỏi, giảm stress. Bộ phận dùng làm thuốc duy nhất của Đảng sâm là rễ.
Rễ cây Đảng sâm chứa saponins, triterpenes và steroid. Các hoạt chất có trong
Đảng sâm giúp cho các hoạt động trao đổi chất của cơ thể tốt hơn.
Ở Việt Nam Đảng sâm mọc rải rác ở các tỉnh miền núi phía Bắc. Trước đây
có nhiều ở một số tỉnh Lai Châu, Lào Cai, Hà Giang, Sơn La, Yên Bái, Tuyên
Quang, Cao Bằng, Lạng Sơn. Các tỉnh phía Nam chỉ thấy tập trung ở cao nguyên
Langbian (tỉnh Lâm Đồng) và xung quanh chân núi Ngọc Linh (Đắc Glây, Tu Mơ
Rông, tỉnh Kon Tum và Quảng Nam - Đà Nẵng). Tại Kon Tum, Sâm dây phân bố
chủ yếu ở vùng Ngọc Linh thuộc huyện Tu Mơ Rông và Đăkglei [3].
Đảng sâm đã được ghi trong Sách Đỏ Việt Nam (1996) với cấp đánh
giá "sẽ nguy cấp" (Bậc V) và Danh mục Thực vật rừng, Động vật rừng nguy
cấp, quý hiếm (nhóm 2) của Nghị định số 32/2006/NĐ - CP ngày 30/3/2006
của Chính phủ để hạn chế khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại.
Do là loại cây dược liệu có giá trị kinh tế nên hiện nay người dân đang
khai thác theo cách tận thu, dẫn đến ngày càng khan hiếm trong tự nhiên.
Trong tương lai không xa, nguồn cây dược liệu mang tính đặt trưng của vùng
sẽ có nguy cơ cạn kiệt. Vì vậy, chủ động tạo nguồn giống phục vụ cho sản
xuất là vấn đề cấp thiết.
Theo phương pháp nhân giống cổ truyền, Đảng sâm được nhân giống
bằng cách gieo hạt, nhưng phương pháp này có nhiều nhược điểm, như việc


2

nhân giống mang tính thời vụ, khó tạo ra số lượng lớn theo yêu cầu của sản
xuất.. Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật việc ứng dụng
nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân giống đã trở nên phổ biến. Nuôi cấy
mô tế bào tạo ra những cây trồng sạch bệnh, chất lượng tốt, độ đồng đều cao,
hệ số nhân lớn và giữ được đặc tính di truyền của cây mẹ Nhận thức được vấn

đề bảo tồn và phát triển loài dược liệu quý tôi tiến hành đề tài : “Nghiên cứu
nhân giống in- vitro cây Đảng sâm (Codonopsis javanica ( Blume)
Hook.f.& Thomson.)”
1.2. Mục đích nghiên cứu
Nhân nhanh được cây Đảng Sâm (Codonopsis javanica ( Blume)
Hook.f.& Thomson) bằng phương pháp in vitro.
1.3. Mục tiêu nghiên cứu
- Xác định được thời gian khử trùng bằng hóa chất khử trùng mang lại
hiệu quả cao nhất trong vô trùng vật liệu nuôi cấy chồi cây Đảng sâm.
- Xác định được môi trường nuôi cấy cơ bản đạt hiệu quả tái sinh chồi
cây Đảng sâm cao nhất.
- Xác định được nồng độ chất kích thích sinh trưởng đạt tỉ lệ nhân
nhanh chồi Đảng sâm cao nhất.
- Xác định được nồng độ chất kích sinh trưởng đạt tỉ lệ ra rễ của Đảng
sâm cao nhất.
1.4. Ý nghĩa của đề tài
1.4.1.Ý nghĩa trong học tập và nghiên cứu khoa học
- Kết quả nghiên cứu của đề tài đưa ra các bước nhân nhanh chồi Đảng
sâm bằng phương pháp in vitro phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
- Biết được phương pháp nghiên cứu một vấn đề khoa học, xử lý, phân
tích số liệu, trình bày một bài báo cáo khoa học.


3

1.4.2.Ý nghĩa thực tiễn
- Đề xuất được quy trình nhân giống Đảng sâm bằng phương pháp nuôi
cấy in vitro, để đảm bảo cung cấp số lượng lớn cây giống có chất lượng cao,
đồng đều cho sản xuất.
- Bảo tồn được loại dược liệu quý đang có nguy cơ tuyệt chủng.

4

PHẦN 2
TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

2.1. Tổng quan về cây Đảng sâm
Theo hệ thống thực vật [6] Đảng sâm được phân loại như sau:
Giới (regnum)

: Plantae

Lớp (Class)

: Magnoliopsida

Bộ (ordo)

: Campanulales

Họ (Family)

: Campanulaceae

Chi (genus)

: Codonopsis

Loài (species)

: Codonopsis javanica ( Blume)

Ở Việt Nam Đảng sâm mọc rải rác ở các tỉnh miền núi phía Bắc. Trước
đây có nhiều ở một số tỉnh Lai Châu, Lào Cai, Hà Giang, Sơn La, Yên Bái,
Tuyên Quang, Cao Bằng, Lạng Sơn. Các tỉnh phía Nam chỉ thấy tập trung ở
cao nguyên Langbian (tỉnh Lâm Đồng) và xung quanh chân núi Ngọc Linh
(Đắc Glây, Tu Mơ Rông, tỉnh Kon Tum và Quảng Nam - Đà Nẵng). Tại Kon
Tum, Sâm dây phân bố chủ yếu ở vùng Ngọc Linh thuộc huyện Tu Mơ Rông
và Đăkglei [3].
2.1.1. Đặc điểm hình thái
Đảng sâm là loài cây cỏ, sống lâu năm, leo bằng thân quấn. Rễ hình
tru dài, đường kính có thể đạt 1,5-2cm, phân nhánh, đầu rễ phình to có
nhiều vết sẹo lồi của thân củ, thường chỉ có một rễ trụ mà không có rễ
nhánh, càng nhỏ về phía đuôi, lúc tươi màu trắng, sau khô thì rễ có màu
vàng, có nếp nhăn. Thân mọc thành từng cụm vào mùa xuân, bò trên mặt
đất hay leo vào cây khác, thân màu tím sẫm, có lông thưa, phần ngọn
không lông. Lá mọc cách hình trứng hay hình trứng tròn, đuôi lá nhọn,
phần gần cuống hình tim, màu xanh hơi pha vàng, mặt trên có lông nhung,


5

mặt dưới mầu trắng xám nhẵn hoặc có lông rải rác, dài 3-8cm, rộng 2-4cm.
Hoa màu xanh nhạt, mọc riêng lẻ ở kẽ nách lá, có cuống dài 2-6cm, đài
tràng hình chuông, gồm 5 phiến hẹp, 5 cánh có vân màu tím ở họng, lúc
sắp rụng trở thành màu vàng nhạt, chia làm 5 thùy, nhụy 5, chỉ nghụy hơi
dẹt, bao phấn đính gốc. Quả bổ đôi, hình chùy tròn, 3 tâm bì, đầu hơi bằng,
có đài ngắn, lúc chín thì nứt ra. Có nhiều hạt màu nâu nhẵn bóng.
Rễ hình trụ tròn hơi uốn cong, dài 10 – 35 cm, đường kính 0,4 – 2 cm.

Bề ngoài có màu vàng nhạt đến vàng xám nâu, phía trên của rễ có vết thân
lõm xuống hình tròn, đoạn dưới có nhiều nếp vân ngang. Toàn rễ có nhiều
nếp nhăn dọc và rải rác có bì khổng. Rễ dẻo, mặt cắt ít bằng phẳng, phần vỏ
có màu vàng nhạt, phần lõi màu trắng ngà. Mùi thơm dịu, vị ngọt [7].

Hình 01. Cây Đảng sâm


6

2.1.2. Giá trị của Đảng sâm
Đảng sâm là một loại thuốc bổ khí thông dụng, là đầu vị của hầu hết
các bài thuốc bổ khí huyết, bổ tỳ vị, chữa bệnh mạn tính, suy nhược cơ thể,
thích nghi với mọi lứa tuổi, giới tính. Ðảng sâm với liều cao có thể dùng thay
thế nhân sâm, nên người ta thường ví đảng sâm là “nhân sâm của người
nghèo”. Theo kinh nghiệm sử dụng trong nhiều năm qua, dược liệu đảng sâm
của ta hoàn toàn có khả năng thay thế được đảng sâm Trung Quốc, vừa hiệu
quả, vừa an toàn hơn rất nhiều [3].
Có thể dùng Đảng sâm như Nhân sâm, để thay Nhân sâm khi thiếu,
hoặc có Nhân sâm nhưng vẫn dùng Đảng sâm trong trường hợp tỳ hư, ăn
kém, mệt mỏi, phế hư do phiền khát hoặc thiếu máu, vàng da, phù chân, tiểu
đục. Dùng riêng hoặc dùng rộng rãi phối hợp với các vị thuốc khác trong các
bài: Tứ Quân Tử Thang, Thập Toàn Đại Bổ Thang, Bát Vị Địa Hoàng
Hoàn...” (Trung Dược Học).
Cây đảng sâm, ngoài nhu cầu về số lượng rất lớn, giá trị kinh tế cao,
còn có nhiều ưu thế như địa bàn phân bố rộng , thời gian có thể thu hoạch chỉ
18-20 tháng, rất thích hợp với đồng bào miền núi có thể trồng đại trà hoặc xen
canh với các loài cây khác như (như cây ngô) trên các nương rẫy để góp phần
tăng thu nhập, xóa đói giảm nghèo…
Hiện nay, nhu cầu về đảng sâm trên thị trường dược liệu trong nước rất

lớn, theo ước tính có thể trên 1.000 tấn mỗi năm (khoảng 2% tổng lượng dược
liệu tiêu thụ). Hầu hết (trên 95%) đảng sâm chúng ta đang sử dụng đều nhập
từ Trung Quốc theo đường buôn bán tiểu ngạch nên rất khó quản lý về giá cả
và chất lượng (các loại đảng sâm Trung Quốc trôi nổi có độ ẩm rất cao nhưng
để lâu không mốc mọt có khả năng tẩm chất bảo quản không kiểm soát được).
Chỉ trong vòng 2-3 năm gần đây, giá đảng sâm Trung Quốc trên thị trường
tăng chóng mặt gấp 4-5 lần, nên có nhiều bệnh viện không mua được để cung
ứng cho bệnh nhân.


7

Vì vậy, ngành dược liệu cần thiết quy hoạch vùng trồng, xây dựng các
quy trình nhân giống, kỹ thuật nuôi trồng, sơ chế dược liệu, phối hợp cùng
các địa phương vận động nhân dân, doanh nghiệp đẩy mạnh việc mở rộng sản
xuất dược liệu Đảng sâm, phát triển thành cây hàng hóa của địa phương; góp
phần chuyển đổi cơ cấu cây trồng, tăng thu nhập cho người dân [11].
2.2. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.2.1. Khái niệm
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là khái niệm chung cho tất cả các quá trình
nuôi cấy từ nguyên liệu thực vật trên môi trường nhân tạo trong điều kiện vô
trùng
Nhân giống in vitro hay còn gọi là vi nhân giống thường sử dụng cho
việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, sử dụng các
bộ phận khác nhau của thực vật với kích thước nhỏ .
Trong thực tế, các nhà vi nhân giống thường dùng thuật ngữ nuôi cấy
mô và nhân giống in vitro hay nuôi cấy in vitro thay thế cho nhau để chỉ các
phương thức nhân giống thực vật trong điều kiện vô trùng với các mục đích
khác nhau .
2.2.2. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nguyên lí cơ bản của nhân giống nuôi cấy mô tế bào là tính toàn năng
của tế bào thực vật. Mỗi tế bào bất kì của cơ thể thực vật đều mang toàn bộ
lượng thông tin di truyền của toàn bộ cơ thể. Trong điều kiện thích hợp mỗi tế
bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Tính toàn năng của tế
bào là cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. Hiện
nay, người ta đã thực hiện được khả năng tạo ra một cơ thể hoàn chỉnh từ một
tế bào riêng rẽ [4].
Cơ thể thực vật hình thành là một chính thể thống nhất bao gồm nhiều cơ
quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau. Tuy
nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp
tử). Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào
phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa). Sau đó, từ các tế bào


8

phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu
cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau [4].
Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô
chuyên hóa, đảm bảo các chức năng khác nhau. Quá trình phân hóa tế bào có thể
biểu thị:
Tế bào phôi sinh → Tế bào dãn → Tế bào phân hoá có chức năng riêng biệt
Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên, chúng
không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình. Trong trường hợp cần thiết, ở điều
kiện thích hợp, chúng có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ, quá
trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngược lại với sự phân hóa tế bào.
phân hóa tế bào
tế bào phôi sinh

tế bào dãn

tế bào chuyên hóa

phản phân hóa tế bào
Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt
hóa, ức chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có
một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ta tính trạng mới,
còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một chương
trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử ADN của mỗi tế bào khiến cho
quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hòa. Mặt khác,
khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung
quanh. Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối mô sẽ tạo điều
kiện cho sự hoạt hóa các gen của tế bào [4].


9

2.2.3. Các giai đoạn của nhân giống vô tính in vitro
Trong nuôi cấy mô, tế bào gồm 5 giai đoạn:
Giai đoạn 1: Chuẩn bị vật liệu
Đây là giai đoạn quan trọng quyết định toàn bộ quy trình nhân giống in
vitro. Mục đích là phải tạo được nguyên liệu vô trùng để đưa vào nuôi cấy. Có thể
vô trùng mẫu nuôi cấy bằng một số chất có tác dụng diệt khuẩn như: CaOCl2,
NaOCl, HgCl2,...
Mẫu đưa từ bên ngoài vào phải đảm bảo: Tỷ lệ nhiễm thấp; tỷ lệ sống cao;
tốc độ sinh trưởng nhanh. Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc vào cách lấy mẫu,
nồng độ và thời gian xử lý diệt khuẩn. Vật liệu thường được chọn và đưa vào nuôi
cấy là: Đỉnh sinh trưởng, chồi nách, đoạn thân…
Giai đoạn 2:Tái sinh mẫu nuôi cấy
Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần

đảm bảo các yêu cầu: tỉ lệ nhiễm thấp, tỉ lệ sống cao, mô tồn tại sinh trưởng tốt.
Mục đích của giai đoạn này là tái sinh một cách định hướng sự phát triển của mô
nuôi cấy. Quá trình này được điều khiển chủ yếu bằng các chất điều hòa sinh
trưởng (tỷ lệ auxin/cytokinin) đưa vào môi trường nuôi cấy.
Giai đoạn 3:Giai đoạn nhân nhanh chồi
Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng số
lượng thông qua các con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi
vô tính. Mục đích của giai đoạn này là tạo hệ số cao nhất. Chính vì thế giai đoạn
này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình nuôi cấy. Để tăng hệ số người ta
thường đưa vào môi trường nuôi cấy các chất điều hòa sinh trưởng (auxin,
cytokinin,…), các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết nấm mem,…, kết
hợp với các yếu tố ánh sáng, nhiệt độ thích hợp. Chế độ nuôi cấy thường là 2327ºC, có 16 giờ chiếu sáng/ngày, cường độ ánh sáng 2000 - 4000 lux. Tuỳ thuộc
vào đối tượng nuôi cấy, người ta có thể nhân nhanh bằng cách kích thích sự hình


10

thành các cụm chồi (nhân cụm chồi), hay kích thích sự phát triển của các chồi
nách hoặc thông qua việc tạo thành cây từ phôi vô tính.
Giai đoạn 4:Giai đoạn ra rễ cho mẫu.
Khi đạt được kích thước nhất định các chồi được chuyển sang môi trường
ra rễ. Thường sau 2 - 3 tuần, các chồi riêng lẻ này sẽ ra rễ và trở thành cây hoàn
chỉnh. Ở giai đoại này người ta bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất điều hoà
sinh trưởng thuộc nhóm auxin, nhóm hormon thực vật quan trọng có chức năng
tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy. Trong nhóm này các chất IAA, IBA, NAA, 2.4-D được
nghiên cứu và sử dụng nhiều nhất để tạo rễ cho chồi.
Giai đoạn 5:Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên
Đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình và nó quyết định khả năng ứng
dụng của quá trình nhân giống in vitro trong thực tiễn sản xuất. Là giai đoạn
chuyển cây từ môi trường dị dưỡng sang môi trường tự dưỡng hoàn toàn. Do đó

phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh thích hợp để cây có thể đạt tỷ lệ sống cao
trong vườn ươm cũng như trong ruộng sản xuất.
2.3. Một số chất điều hòa sinh trưởng nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.3.1. Auxin
Chất auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật là indol axetic acid
(IAA). IAA có tác dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào và điều khiển sự
hình thành rễ. Ngoài IAA, còn có các dẫn xuất của nó là naphthalene axetic
acid (NAA) và 2,4 - Diclophenoxy acid (2,4 D). Các chất này cũng đóng vai trò
quan trọng trong sự phân chia của mô và trong quá trình hình thành rễ. NAA có
tác dụng tăng hô hấp của tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tính enzym và ảnh
hưởng mạnh đến trao đổi chất của nitơ, tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng
đường trong môi trường. NAA là auxin nhân tạo, có hoạt tính mạnh hơn auxin tự
nhiên IAA, NAA có vai trò quan trọng đối với phân chia tế bào và tạo rễ [2], [13].


11

Trong cây auxin được tổng hợp ở các mô non đặc biệt là lá đang phát
triển và vùng đỉnh chồi. Từ những vùng này auxin được chuyển xuống các
phần phía dưới của cây [2].
2.3.2. Cytokinin
Cytokinin là chất điều hoà sinh trưởng có tác dụng làm tăng sự phân
chia tế bào. Các cytokinin thường gặp là kinetin, 6 - Benzyl aminopurin (BA).
Kinetin được Skoog phát hiện ngẫu nhiên trong chiết xuất acid nucleic.
Kinetin thực chất là một dẫn xuất của bazơ nitơ adenine. BA là cytokinin tổng
hợp nhân tạo nhưng có hoạt tính mạnh hơn nhiều kinetin. Kinetin và BA cùng
có tác dụng kích thích phân chia tế bào kéo dài thời gian hoạt động của tế bào
phân sinh và làm hạn chế sự già hoá của tế bào. Ngoài ra các chất này có tác
dụng lên quá trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp ADN, tổng hợp protein và
làm tăng cường hoạt tính của một số enzyme. Cơ chế tác dụng của auxin ở

mức độ phân tử trong tế bào thể hiện bằng tác dụng tương hỗ của cytokinin
với các nucleoprotein làm yếu mối liên kết của histone với ADN, tạo điều
kiện cho sự tổng hợp ADN [2], [13].
Nghiên cứu của Miller và Skoog (1963) đã cho thấy không phải các
chất kích thích sinh trưởng ngoại sinh tác dụng độc lập với hoocmon sinh
trưởng nội sinh. Phân chia tế bào, phân hoá và biệt hoá được điều khiển bằng
sự tác động tương hỗ giữa các hoocmon ngoại sinh và nội sinh. Tác động phối
hợp của auxin và cytokinin có tác dụng quyết định đến sự phát triển và phát
sinh hình thái của tế bào và mô. Những nghiên cứu của Skoog cho thấy tỷ lệ
auxin/cytokinin cao thì thích hợp cho sự hình thành rễ, và thấp thì thích hợp
cho quá trình phát sinh chồi. Nếu tỷ lệ này ở mức độ cân bằng thì thuận lợi
cho phát triển mô sẹo (callus). Das (1958) và Nitsch (1968) khẳng định rằng
chỉ khi tác dụng đồng thời của auxin và cytokinin thì mới kích thích mạnh mẽ
sự tổng hợp ADN, cảm ứng cho sự phân chia tế bào. Theo Dmitrieva (1972)
giai đoạn đầu của quá trình phân bào được cảm ứng bởi auxin còn giai đoạn


12

tiếp theo thì cần tác động tổng hợp của cả hai chất kích thích. Skoog và Miller
(1957) đã khẳng định vai trò của cytokinin trong quá trình phân chia tế bào cụ
thể là cytokinin điều khiển quá trình chuyển pha trong mitos và giữ cho quá
trình này diễn ra một cách bình thường. Cytokinin được tổng hợp bởi rễ và
hạt đang phát triển [2], [13].
2.4. Tình hình nghiên cứu nhân giống cây Đảng sâm .
Đoàn Trọng Đức và CS (2015) đã nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cây
giống, phương thức trồng đến sinh trưởng, phát triển và năng suất của cây đảng
sâm ở Việt Nam tại Kon Tum, Kết quả nghiên cứu cho thấy có thể mở rộng
vùng nguyên liệu đảng sâm bằng sử dụng cây nhân giống bằng nuôi cấy mô và
bằng củ đạt hiệu quả cao hơn cây từ hạt và cây nhân giống từ mầm củ [5].

Nguyễn Thùy Dương và CS (2014) đã nghiên cứu các yếu tố ảnh
hưởng tới nhân giống invitro cây Đảng sâm như ảnh hưởng của chất khử
trùng NaClO 15%, và HgCl 2 0,1% đến tỷ lệ sống của mẫu chồi Đảng
sâm, nghiên cứu nhân nhanh Đảng sâm từ chồi đỉnh, nhân nhanh Đảng sâm
từ chồi nách.
Trần Thị Lệ và CS (2013) đã nghiên cứu tạo rễ tơ ở cây Đảng sâm
thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes[8].
Nguyễn Kiều Uyên Vi và CS đã nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều
hòa sinh trưởng thực vật lên sự tạo saponin cây Đảng sâm Việt Nam
(codonopsis javanica (blume)) nuôi cấy In- Vitro. Định tính, định lượng
saponin bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng và phương pháp cân để xác định
được ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên sự tạo saponin [14].
Bùi Văn Thắng, Cao Thị Việt Nga, Vùi Văn Kiên, Nguyễn Văn Việt
(2016), nghiên cứu nhân giống cây Đảng sâm (codonopsis javanica ( Blume)
Hook. f. et Thomson) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô [9].
Huỳnh Thị Kim, Nguyễn Thị Điệp, Vương Thị Hồng Loan, Kha Nữ Tú
Uyên, Trần Thị An, Nghiên cứu quy trình nhân giống in- vitro cây Đảng Sâm
(Codonopsis javanica (Blume).


13

PHẦN 3
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: Giống Đảng sâm thu thập từ huyện Nam Trà My, tỉnh
Quảng Nam
Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu phương pháp tạo vật liệu vô trùng, khả
năng tái sinh nhân nhanh và ra rễ Đảng sâm bằng phương pháp nuôi cấy mô
thực vật.

3.2. Địa điểm, thời gian nghiên cứu
Địa điểm tại phòng Công Nghệ Sinh Học - Viện Nghiên cứu và Phát
triển Lâm nghiệp - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
Thời gian nghiên cứu từ tháng 1/2018 đến tháng 5/2018.
3.3. Hóa chất và thiết bị
Hóa chất: Hóa chất khử trùng (cồn, NaClO, HgCl2), môi trường MS cơ bản,
WPM, B5, saccharose, agar, các chất kích thích sinh trưởng: BA, Kinetine, αNAA, IAA.
Thiết bị: Máy đo pH, máy khuấy từ, cân phân tích 10-4, cân kỹ thuật 10-2,
bếp ga, lò vi song, tủ sấy, nồi hấp vô trùng, box cấy vô trùng.
3.4. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng NaClO
1%, HgCl2 0,1% đến hiệu quả vô trùng vật liệu nuôi cấy chồi Đảng sâm.
Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường MS, B5, WPM đến
khả năng tái sinh chồi Đảng sâm.
Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng
(BA, Kinetin) đến khả năng nhân nhanh chồi Đảng sâm.


14

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh
chồi Đảng sâm.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin đến khả
năng nhân nhanh chồi Đảng sâm.
Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng
(NAA, IAA) đến khả năng ra rễ của Đảng sâm.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của Đảng sâm.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA kết hợp với nồng độ IAA đến
khả năng ra rễ của Đảng sâm.

3.4.2. Phương pháp nghiên cứu
3.4.2.1. Phương pháp nghiên cứu nội dung 1
- Phương pháp tạo vật liệu vô trùng:
- Mẫu cấy là các đoạn thân, sau khi lấy mẫu về đem vào rửa sạch bằng
xà phòng, tráng sạch bọt, tiếp tục tráng lại 3-4 lần bằng nước cất.
- Khử trùng mẫu: Mẫu sau khi được làm sạch bụi bẩn, cắt bỏ phần thừa
tiến hành khử trùng sơ bộ bằng cồn 700 và tráng lại bằng nước cất nhiều lần
cho sạch cồn và bụi bẩn trong box cấy. Tiến hành khử trùng bằng NaClO
0,5%, HgCl2 0,1%.
- Sử dụng đoạn thân Đảng sâm đã khử trùng cấy vào môi trường đã được
chuẩn bị sẵn.
- Sau khi cấy xong đưa vào phòng nuôi với điều kiện nuôi cấy nhiệt độ
phòng từ 22 – 250C, cường độ chiếu sáng 2000 – 2500 lux, ẩm độ: 60 – 65%
quang chu kì 16h sáng/8h tối. Tiến hành theo dõi mẫu (quan sát bằng mắt
thường).
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng
NaClO 0.5%, HgCl2 0,1% đến hiệu quả vô trùng vật liệu nuôi cấy chồi Đảng
sâm (sau 10 ngày nuôi cấy)


15

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn.
Với mỗi loại hóa chất được bố trí 4 công thức, mỗi công thức thí nghiệm nhắc
lại 3 lần.
Thí nghiệm được bố trí như sau:
Hóa chất
Không sử dụng hóa chất

Công thức

CT1 (Đ/C)

0

CT2

5

CT3

10

CT4

12

CT5(Đ/C)

0

CT6

5

CT7

10

CT8

12

NaClO (0.5%)
Không sử dụng hóa chất

Thời gian (phút)

HgCl2 (0.1%)

Chỉ tiêu theo dõi: Tiến hành theo dõi sau 10 ngày các chỉ tiêu tỷ lệ mẫu
sống không nhiễm, tỷ lệ mẫu sống nhiễm, tỷ lệ mẫu chết.
3.4.2.2. Phương pháp nghiên cứu nội dung 2
- Phương pháp tái sinh in vitro:
+ Sử dụng môi trường MS (Murashinge & Skoog, 1962), B5 (Gamborg’s),
WPM có bổ sung Inositol 100mg/l + đường 30g/l + agar 6g/l, pH: 5,6-5,8.
+ Chồi được cấy trên bề mặt môi trường với mật độ đồng đều, sau khi
cấy xong đưa vào phòng nuôi cấy với điều kiện nhiệt độ phòng từ 22-250C,
cường độ chiếu sáng 2000-2500 lux, ẩm độ 60-65% quang chu kì 16h sáng/8h
tối. Tiến hành theo dõi số chồi, chất lượng chồi (quan sát bằng mắt thường).
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường MS, B5, WPM
đến khả năng tái sinh chồi Đảng sâm (sau 20 ngày nuôi cấy)
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn.
Với 3 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình,


16

mỗi bình cấy 5 chồi. Mỗi công thức bổ sung thêm: Inositol 100mg/l + đường
30g/l + agar 6g/l, pH: 5,6-5,8.
Thí nghiệm được bố trí như sau:

Công thức

Môi trường

1

MS

2

B5

3

WPM

Chỉ tiêu theo dõi sau 20 ngày: Tỷ lệ tái sinh, chất lượng chồi.
3.4.2.3. Phương pháp nghiên cứu nội dung 3
- Phương pháp nhân nhanh in vitro:
+ Sử dụng dao (lưỡi dao số 11 đã được khử trùng) tách chồi đã tái sinh
từ đoạn thân.
+ Sử dụng chồi sạch bệnh, sinh trưởng tốt có chiều dài từ 0,5-1cm,
dùng pank đã được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, chờ nguội rồi gắp chồi
đưa vào môi trường đã được chuẩn bị trước.
+ Cấy chồi trên bề mặt môi trường với mật độ đồng đều, sau khi cấy
xong đưa vào phòng nuôi. Sau đó tiến hành theo dõi số chồi và chất lượng
chồi (quan sát bằng mắt thường).
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng
nhân nhanh chồi Đảng sâm (sau 20 ngày nuôi cấy)
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn.

Với 5 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình,
mỗi bình cấy 5 chồi.