Giải mã phân đoạn a hệ gen các chủng virus GUMBORO phân lập ở việt nam nhằm cung cấp nguồn gen cho nghiên cứu vacxin thế hệ mới

2010VN22372

bộ giáo dục và đào tạo

Trờng đại học nông nghiệp hà nội

Lê thị kim xuyến

giải mã phân đoạn a hệ gen các chủng virus gumboro
PHÂN LậP ở việt nam NHằM cung cấp nguồn gen cho
nghiên cứu vaccine thế hệ mới

Luận án tiến sĩ nông nghiệp

Chuyên ngành: Vi sinh vật học thú y
M số

: 62 62 50 10

Ngời hớng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Lê Thanh Hòa
2. TS. Nguyễn Bá Hiên

Hà Nội - 2010


LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu do chính tôi
thực hiện. Các số liệu và kết quả nêu trong luận án là số liệu ñầu
tiên, hoàn toàn trung thực, chưa ñược công bố trong bất kỳ công
trình hay tạp chí nào khác ở trong nước cũng như ở nước ngoài. Mọi

sự giúp ñỡ ñã ñược cảm ơn. Các thông tin, tài liệu trích trong luận
án ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2010

Nghiên cứu sinh

Lê Thị Kim Xuyến

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ……… 3


LỜI CẢM ƠN

Tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ñến PGS.TS. Lê Thanh Hòa Trưởng phòng Miễn dịch học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công
nghệ Việt Nam là thầy trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo tôi trong suốt quá trình
nghiên cứu, học tập và hoàn thành luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Bá Hiên - Trưởng Bộ môn Vi sinh vật
- Truyền nhiễm, Khoa Thú y, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, thầy ñồng hướng
dẫn, ñã tận tình giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.
Tôi xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí của Bộ Khoa học và Công nghệ cho ñề tài
cấp Nhà nước KC.04.29 (2004 - 2006).
Tôi xin chân thành cảm ơn:
- Tập thể các anh chị em Phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ Sinh học là nơi tôi công tác và cũng chính là nơi học tập nghiên cứu, ñã giúp tôi hoàn thành
công việc nghiên cứu của mình.
- Tập thể các thầy cô giáo Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Khoa Thú y,
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tạo mọi ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong

thời gian sinh hoạt học tập tại Bộ môn.
- TS. Nguyễn Bá Thành, PGS.TS. ðinh Thị Bích Lân và các ñồng nghiệp ñã
giúp ñỡ tôi trong quá trình thu thập mẫu bệnh phẩm.
- Viện ðào tạo Sau ñại học và các cán bộ phụ trách ñào tạo ñã tạo mọi ñiều
kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và học tập.
Cuối cùng tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ñến những người thân
trong gia ñình ñã luôn khuyến khích, ñộng viên cũng như chia sẻ những khó
khăn với tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành nghiên cứu của mình.
Xin chân thành cảm ơn.
Tác giả

Lê Thị Kim Xuyến

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ……… 4


MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa
Lời cam ñoan
Mục lục
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ, ñồ thị
MỞ ðẦU.............................................................................................................
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU..................................................................
1.1.

ðẠI CƯƠNG VỀ BỆNH GUMBORO.........................................................

1.1.1.
1.1.2.
1.1.3.
1.1.4.
1.1.5.
1.1.6.
1.1.7.
1.2.

SINH HỌC PHÂN TỬ VIRUS GUMBORO.........................................................

1.2.1.
1.2.2.
1.2.3.
1.2.4.
1.2.5.
1.2.6.
1.3.

1.3.2.
1.3.3.

1.5.

Hệ gen của virus Gumboro....................................................................
Protein của virus - cấu trúc và chức năng.......................................
Kháng nguyên của virus Gumboro.......................................................
Cơ chế phân tử quá trình nhân lên của IBDV…………………...
Cơ chế phân tử của quá trình “chết theo chương trình”
(apoptosis) và hậu quả do virus Gumboro gây ra……………….

Epitope và sự biến ñổi tính kháng nguyên và ñộc lực.....................

CÁC CHỈ THỊ DI TRUYỀN PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU VIRUS
GUMBORO....................................................................................................

1.3.1.

1.4.

Lịch sử và ñịa dư bệnh..................................................................
Nguyên nhân gây bệnh..................................................................
Cơ chế sinh bệnh...........................................................................
Triệu chứng lâm sàng....................................................................
Bệnh tích.......................................................................................
Chẩn ñoán bệnh.............................................................................
Phòng bệnh Gumboro...................................................................

Phản ứng RT-PCR thông dụng trong nghiên cứu phân tử virus
Gumboro..........................................................................................
Chỉ thị di truyền sử dụng vùng “siêu biến ñổi”............................
Chỉ thị di truyền sử dụng toàn bộ gen kháng nguyên VP2...........

TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SINH HỌC PHÂN TỬ VIRUS GUMBORO Ở
VIỆT NAM................................................................................................................................
TẦM QUAN TRỌNG CỦA VIỆC GIẢI MÃ HỆ GEN VIRUS
GUMBORO.......................................................................................................

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ……… 5

1

4
4
5
6
8
10
10
13
13
15
16
19
26
28
31
34
40
40
42
43
44
48


Chương 2. NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.....
2.1.

NỘI DUNG

2.1.1.

2.1.2.

2.1.3.

Giải trình tự chuỗi nucleotide gen kháng nguyên VP2 và phân
ñoạn A (VP2-4-3) của virus Gumboro phân lập tại Việt Nam
Phân tích so sánh thành phần gen, mối quan hệ nguồn gốc phả
hệ các chủng Gumboro của Việt Nam và thế giới dựa trên các
gen trong phân ñoạn A
Phân tích so sánh thành phần gen, mối quan hệ nguồn gốc phả
hệ các chủng Gumboro của Việt Nam và thế giới dựa trên toàn
bộ phân ñoạn A

2.2.

VẬT LIỆU......................................................................................................

2.3.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................................................................

2.3.1
2.3.2.
2.3.3.
2.3.4.

Phương pháp chọn và lấy mẫu
Phương pháp tách chiết RNA tổng số...........................................
Phương pháp RT-PCR..................................................................
Phương pháp kiểm tra sản phẩm RT-PCR bằng ñiện di trên thạch

agarose..............................................................................................
2.3.5. Phương pháp tinh sạch sản phẩm RT-PCR ..................................
2.3.6. Phương pháp tạo dòng..................................................................
2.3.7 Phương pháp thu nhận DNA ñích trong sản phẩm PCR/RT-PCR
nhiều ñoạn...............................................................................................
2.3.8. Phương pháp cắt-nối-ghép DNA...................................................
2.3.9. Phương pháp giải trình tự..............................................................
2.3.10 Phương pháp xử lý số liệu sử dụng các phần mềm tin-sinh học...
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................
3.1.

KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI NUCLEOTIDE GEN KHÁNG
NGUYÊN VP2 VÀ PHÂN ðOẠN A (VP2-4-3)...........................................

3.1.1. Kết quả xác ñịnh mẫu bệnh phẩm cung cấp nguồn RNA hệ gen virus
3.1.2. Kết quả giải trình tự gen kháng nguyên VP2................................
3.1.3. Kết quả giải trình tự phân ñoạn A................................................
3.1.3.1. Giải trình tự phân ñoạn A chủng BDG23 từ mẫu bệnh
phẩm thu nhận tại Bình Dương.............................................
3.1.3.2. Giải trình tự phân ñoạn A chủng GHUT-12 từ mẫu bệnh
phẩm thu nhận tại Thừa Thiên-Huế.......................................
3.1.3.3. Giải trình tự phân ñoạn A từ chủng cường ñộc cổ ñiển
G202 phân lập tại Hà Nội...........................................................
3.1.4. Danh sách ñăng ký Ngân hàng gen các chủng Gumboro..................

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ……… 6

51
51
51

51

52
52
54
55
55
56
57
58
58
63
64
64
66
71
71
71
74
77
78
81
84
86


3.2.

PHÂN TÍCH SO SÁNH THÀNH PHẦN GEN, MỐI QUAN HỆ NGUỒN

GỐC PHẢ HỆ CỦA CÁC CHỦNG GUMBORO VIỆT NAM VÀ THẾ GIỚI
DỰA TRÊN CÁC GEN TRONG PHÂN ðOẠN A...............................................
3.2.1. PHÂN TÍCH GEN VP2.........................................................................

89
91
91

3.2.1.1. Về thành phần nucleotide, amino acid ..................................
3.2.1.2. Phân tích ñồng nhất (về nucleotide) và tương ñồng (về
amino acid)............................................................................
96
3.2.1.3. Phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ.............................. 100
3.2.2. PHÂN TÍCH GEN VP5......................................................................... 103
3.2.2.1. Về thành phần nucleotide và amino acid............................... 103
3.2.2.2. Phân tích ñồng nhất (về nucleotide) và tương ñồng (về
amino acid)............................................................................ 106
3.2.2.3. Phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ sử dụng gen VP5 108
3.2.3. PHÂN TÍCH GEN VP4......................................................................... 109
3.2.3.1. Về thành phần nucleotide và amino acid .............................. 109
3.2.3.2. Phân tích ñồng nhất (về nucleotide) và tương ñồng (về
amino acid)............................................................................ 112
3.2.3.3. Phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ sử dụng gen VP4.. 113
3.2.4. PHÂN TÍCH GEN VP3......................................................................... 115
3.2.4.1. Về thành phần nucleotide và amino acid .............................. 115
3.2.4.2. Phân tích ñồng nhất (về nucleotide) và tương ñồng (về
amino acid) ........................................................................... 118
3.2.4.3. Phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ sử dụng gen VP3.. 119
3.3.

PHÂN TÍCH SO SÁNH THÀNH PHẦN GEN, MỐI QUAN HỆ NGUỒN
GỐC PHẢ HỆ CỦA CÁC CHỦNG GUMBORO VIỆT NAM VÀ THẾ GIỚI
DỰA TRÊN TOÀN BỘ PHÂN ðOẠN A.............................................................. 121

3.3.1.
3.3.2.
3.3.3.
3.3.4.
3.4.

Phân tích ñặc tính sử dụng nucleotide/amino acid ñể kiến tạo
phân ñoạn A (VP2-4-3) ở 3 chủng BDG23, GHUT-12, G202.....
Về thành phần nucleotide và amino acid......................................
Phân tích tỷ lệ ñồng nhất (về nucleotide) và tương ñồng (về
amino acid) ...................................................................................
Phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ......................................

THẢO LUẬN CHUNG

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.............................................................................
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ...................................................
TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................
PHỤ LỤC ...........................................................................................................

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ……… 7

121
124
128
130

132
140
142
143
161


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu

Tiếng Anh

Tiếng Việt

AGP

Agar Gel Precipitation

Phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch

bp

Base pair

Cặp bazơ

cDNA

complementary DNA

DNA bổ sung

CEF

Chicken Embryo fibroblast

Môi trường tế bào xơ phôi gà một lớp

CEK

Chicken Embryo Kidney cells

Môi trường tế bào thận thai gà

CPE

Cytopathic Effect

Bệnh tích tế bào

cv

classical virulent

Virus ñộc tính cổ ñiển

Da

dalton

DNA

Deoxyribonucleic acid

Axit Deoxyribonucleic

ELISA

Enzym Linked

Phản ứng hấp phụ miễn dịch liên kết với

Immunosorbent Assay

enzyme

gs

group-specific

Kháng nguyên ñặc hiệu theo nhóm

IBD

Infectious Bursal Disease

Bệnh viêm túi Fabricius truyền nhiễm

IBDV

Infectious Bursal Disease

Virus gây viêm túi Fabricius truyền

Virus

nhiễm

INF

Interferon

kDa

kilo dalton

m.o.i

multiplicity of infection

Tỷ lệ gây nhiễm

ORF

Open Reading Frame

Khung ñọc mở

RNA

Ribonucleic Acid

Axit ribonucleic

RT-PCR

Reverse transcriptase
polymerase chain reaction

SPF

Special Pathogen Free

Sạch mầm bệnh

ts

type-specific

Kháng nguyên ñặc hiệu theo týp

VN

Virus Neutralization

Phản ứng trung hòa

VP

Viral protein

Protein của virus

vvIBDV

Very virulent Infectious

Virus gây viêm túi Fabricius truyền

Bursal Disease Virus

nhiễm có ñộc lực cao

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ……… 8


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng

Nội dung

Trang

2.1

Danh sách các mẫu bệnh phẩm Gumboro sử dụng nghiên cứu..............

53

2.2

Thành phần phản ứng RT-PCR và chu trình nhiệt trong nghiên cứu
sinh học phân tử virus Gumboro............................................................

56

Các mồi sử dụng trong phản ứng RT-PCR và giải trình tự trong
nghiên cứu virus Gumboro.....................................................................

57

2.3
3.1

Danh sách bản quyền ñăng ký gen VP2 và phân ñoạn A (VP2-4-3)
trong Ngân hàng gen sử dụng trong nghiên cứu....................................

87

Danh sách các chủng Gumboro Việt Nam và thế giới sử dụng các gen
của phân ñoạn A trong phân tích so sánh thành phần gen và mối quan
hệ nguồn gốc phả hệ..................................................................................

88

Vị trí sai khác nucleotide (74/178) dẫn ñến sai khác amino acid của
gen kháng nguyên VP2 (1356 bp) giữa 28 chủng so sánh.....................

93

3.4

55 vị trí sai khác amino acid của protein VP2 giữa 28 chủng so sánh........

94

3.5

Sai khác về amino acid tại các vị trí quan trọng có vai trò quyết ñịnh về
tính kháng nguyên và ñộc lực của virus Gumboro ở các chủng của Việt
Nam và thế giới.............................................................................................

95

Tỷ lệ (%) ñồng nhất về nucleotide (trên ñường chéo) và tương ñồng
về amino acid (dưới ñường chéo) của gen kháng nguyên VP2 ở các
chủng Gumboro Việt Nam và thế giới...................................................

97

3.2

3.3

3.6

3.7

Tỷ lệ (%) tương ñồng về nucleotide (dưới ñường chéo) và amino acid
(trên ñường chéo) của 16 chủng Gumboro trong nghiên cứu này (gen

kháng nguyên VP2)………………………………………........................ 100

3.8

Các vị trí sai khác nucleotide dẫn ñên sai khác amino acid (21 trong số
28 sai khác) của gen mã hóa cho protein VP5 giữa 28 chủng so sánh..... 104

3.9

20 vị trí sai khác về amino acid của protein VP5 giữa 28 chủng so sánh

3.10

Tỷ lệ (%) ñồng nhất về nucleotide (trên ñường chéo) và tương ñồng

105

amino acid (dưới ñường chéo) gen VP5 của các chủng Gumboro Việt
Nam và thế giới...................................................................................... 107

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ……… 9


3.11

Vị trí sai khác về nucleotide (26 trong số 109) dẫn ñên sai khác amino
acid của gen VP4 giữa 15 chủng............................................................

110

3.12

22 vị trí sai khác amino acid của protein enzyme VP4 giữa 15 chủng.......... 110

3.13

Vị trí sai khác nucleotide và amino acid ở VP4 giữa các chủng Âu - Mỹ
và Châu Á...................................................................................................... 111

3.14

Tỷ lệ (%) ñồng nhất về nucleotide (trên ñường chéo) và tương ñồng
về amino acid (dưới ñường chéo) của gen VP4 giữa 15 chủng so sánh. 112

3.15

Vị trí sai khác nucleotide (36 trong số 95) dẫn ñến sai khác amino acid
của gen VP3 giữa 15 chủng so sánh............................................................. 117

3.16

25 vị trí sai khác amino acid của protein VP3 giữa 15 chủng so sánh.......... 117

3.17

Tỷ lệ (%) ñồng nhất về nucleotide (trên ñường chéo) và tương ñồng về
amino acid (dưới ñường chéo) của gen VP3 ở các chủng Gumboro Việt
Nam và thế giới.......................................................................................... 118

3.18

Thành phần nucleotide sử dụng trong VP2-4-3 (3039 nucleotide) ở
phân ñoạn A của 3 chủng BDG23, GHUT-12 và G202........................... 122

3.19

Thành phần amino acid sử dụng trong polypeptide chung do VP2-4-3
mã hóa của 3 chủng BDG23, GHUT-12 và G202.................................... 123

3.20

Các vị trí có sai khác về nucleotide trong phân ñoạn A có ñộ dài 3039
bp giữa 3 chủng Gumboro của Việt Nam, lần lượt theo trật tự các gen
VP2-VPx-VP4-VP3................................................................................... 126

3.21

Các vị trí sai khác amino acid của protein chung trong phân ñoạn A
giữa các chủng Gumboro của Việt Nam và thế giới, lần lượt theo trật
tự phân bố VP2-VPx-VP4-VP3........................................ ..................... 127

3.22

Tỷ lệ (%) ñồng nhất về nucleotide (trên ñường chéo) và tương ñồng
về amino acid (dưới ñường chéo) của VP2-4-3 ở các chủng Gumboro
Việt Nam và thế giới (Âu-Mỹ và Châu Á)............................................

129

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ……… 10

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình

Nội dung

1.1

Vùng Gumboro, ñịa hạt Sussex bang Delaware của Mỹ, nơi ñầu tiên
phát hiện bệnh Gumboro.........................................................................

6

1.2

Cấu trúc của hạt IBDV dưới kính hiển vi ñiện tử...................................

6

1.3

Virus Gumboro thường tập hợp thành từng cụm nằm trong tế bào
lympho B bị nhiễm .................................................................................

7

1.4

Bệnh tích túi Fabricius và hệ cơ..............................................................

11

1.5

Ảnh vi thể của các tế bào ñại thực bào trong túi Fabricius bị virus
Gumboro tấn công...................................................................................

12

1.6

Các hạt virus nhìn dưới kính hiển vi ñiện tử.................................................

15

1.7

Hệ gen của virus Gumboro bao gồm 2 phân ñoạn A và B nhìn dưới
kính hiện vi ñiện tử.................................................................................

17

1.8

Sơ ñồ hệ gen và một số vùng quan trọng của IBDV serotype I và II

18

1.9

Các phân ñoạn A và B của hệ gen virus Gumboro qua ñiện di DNA và
các thành phần protein qua ñiện di protein.............................................

20

Sơ ñồ minh hoạ hệ gen của virus Gumboro và quá trình tổng hợp protein
cấu trúc...........................................................................................................

24

Quy luật biến ñổi epitope: cường ñộc -> ñộc lực yếu -> nhược ñộc và
ngược lại.............................................................................................................

36

1.12

Sơ ñồ minh họa các bước của một chu kỳ phản ứng PCR......................

42

2.1

Sơ ñồ nghiên cứu tổng quát ñể thu nhận các chuỗi gen………..............

55

1.10
1.11

Trang

®

2.2

Cấu trúc của vector pCR 2.1TOPO (Invitrogen)…………………….....

59

2.3

Quy trình tách chiết plasmid tái tổ hợp…………………………….......

61

3.1

Sơ ñồ minh họa vùng “siêu biến ñổi” hệ gen IBDV và vị trí bám của
cặp mồi GF-GR…………………………………………………….......

72

Kết quả ñiện di kiểm tra RNA tổng số, và sản phẩm RT-PCR sử dụng
cặp mồi GF-GR………………………………………………...............

72

Kết quả ñiện di kiểm tra sản phẩm DNA plasmid tái tổ hợp bằng

enzyme EcoRI……………………………………………………….....

73

Giản ñồ (chromatogram) một phần trình tự vùng “siêu biến ñổi” gen
kháng nguyên VP2 của chủng BDG…………………………………...

74

3.2
3.3
3.4

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ……… 11


3.5
3.6

3.7
3.8
3.9
3.10

3.11
3.12
3.13
3.14
3.15

3.16
3.17
3.18
3.19

Sơ ñồ minh họa gen VP2-4-3 trong hệ gen virus Gumboro và vị trí
bám của cặp mồi GVF(Kz2) - GV2R trên gen VP2…………………...
Kết quả ñiện di sản phẩm RT-PCR nhân gen kháng nguyên VP2 và
kiểm tra kết quả cắt DNA plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn
EcoRI………………………………………...........................................
Sơ ñồ minh họa phân ñoạn A hệ gen và vị trí các cặp mồi bám ñể thu
nhận các ñoạn gen phân ñoạn A bằng RT-PCR………………………..
Kết quả ñiện di sản phẩm RT-PCR phân ñoạn A hệ gen virus
Gumboro mẫu BDG23…………………………………………………
Phân tích diễn giải thành phần nucleotide và amino acid của phân ñoạn A
ở chủng BDG23…………………………………………………………..
Kết quả ñiện di sản phẩm RT-PCR phân ñoạn A hệ gen virus
Gumboro mẫu GHUT-12 và DNA plasmid tái tổ hợp cắt kiểm tra
bằng enzyme EcoRI……………………………………………………
Phân tích diễn giải thành phần nucleotide và amino acid của phân ñoạn A
ở chủng GHUT-12………………………………………………………..
Kết quả ñiện di sản phẩm RT-PCR phân ñoạn A hệ gen virus
Gumboro mẫu G202……………………………………………………
Phân tích diễn giải thành phần nucleotide và amino acid của phân ñoạn A
ở chủng G202…………………………………………………………….
Sơ ñồ minh hoạ vị trí các gen trong phân ñoạn A……………………...
Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ giữa các chủng IBDV Việt Nam và thế
giới trên cơ sở gen kháng nguyên VP2 về thành phần nucleotide và
amino acid……………………………………………………………...
Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ giữa các chủng IBDV Việt Nam và thế

giới trên cơ sở gen VP5 về thành phần nucleotide và amino acid..........
Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ giữa các chủng IBDV Việt Nam và
thế giới trên cơ sở gen VP4 về thành phần nucleotide và amino acid....
Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ giữa các chủng IBDV Việt Nam và
thế giới trên cơ sở gen VP3 về thành phần nucleotide và amino acid....
Mối quan hệ phả hệ giữa các chủng IBDV của Việt Nam và các chủng
của thế giới trên cơ sở phân tích toàn bộ phân ñoạn A (VP2-4-3) về
thành phần nucleotide và amino acid………..........................................

76

77
78
79
81

82
83
84
86
90

101
108
114
120

131

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ……… 12

MỞ ðẦU
Bệnh Gumboro hay còn gọi là bệnh viêm túi Fabricius truyền nhiễm, là một
bệnh truyền nhiễm cấp tính lây lan nhanh ở gia cầm non, chủ yếu ở gà và gà tây, do
một loại virus gây ra, có tên gọi là virus gây viêm túi Fabricius truyền nhiễm, hay còn
gọi là virus Gumboro. Bệnh gây thiệt hại rất lớn về mặt kinh tế cho người chăn nuôi.
Ngày nay, bệnh Gumboro xảy ra ở hầu hết các vùng chăn nuôi tập trung trên thế
giới và virus Gumboro gây bệnh có nhiều biến chủng khác nhau nhưng ñều thuộc
về serotype I và II, trong ñó serotype I có mức ñộ ñộc lực và tính gây bệnh cao, còn
serotyp II hầu như không có tính gây bệnh.
Tại Việt Nam, bệnh Gumboro ñược chính thức phát hiện từ những năm 1980
dựa vào triệu chứng lâm sàng, bệnh tích, dịch tễ học (Bitay và cs, 1984) [3]. Từ ñó
ñến nay, sau gần 30 năm phát hiện, mặc dù ñã có nhiều chương trình phòng chống
và sử dụng nhiều loại vaccine, Gumboro vẫn là bệnh khó xử lý, xảy ra ngày càng
trầm trọng và lan rộng trên toàn quốc, gây thiệt hại lớn.
Virus Gumboro là loại virus có hệ gen là RNA (ribonucleic acid) gồm hai
sợi dương (ds RNA) cuộn tròn ñược phân làm hai ñoạn riêng biệt nên virus
Gumboro thuộc họ Birnaviridae (Dobos và cs, 1979) [55]. Hai phân ñoạn trong hệ
gen RNA của virus Gumboro có tên gọi là phân ñoạn A và phân ñoạn B, ñều mang
thông tin di truyền và có nhiệm vụ sinh tổng hợp 5 loại protein từ VP1 ñến VP5
(VP = viral protein) của virus, ñó là VP1, VP2, VP3, VP4, VP5 (Kibenge và cs,
1988) [92]. Phân ñoạn B có ñộ dài khoảng 2800 nucleotide có chứa bộ phận gen mã
hóa cho protein VP1. Protein VP1 tham gia vào quá trình tái tạo virus Gumboro với
chức năng enzyme xúc tác RNA-polymerase (Tacken và cs, 2002) [183]. Phân ñoạn
A có ñộ dài khoảng 3200 nucleotide, mã hóa cho protein chung gồm VP2, 4, 3 và
một protein khác khung ñọc là VP5, trong ñó VP2 là một protein kháng nguyên của
virus Gumboro. VP2 có ñộ bảo tồn cao về thành phần nucleotide ở hai ñầu 5’ và 3’,
nhưng lại có một vùng khoảng 500 nucleotide ở giữa của gen rất thay ñổi ở các
chủng khác nhau, gọi là vùng “siêu biến ñổi” (hypervariable region) (Yuwen và cs,

2008) [211]. Thực chất tất cả quần thể virus Gumboro ñều thuộc họ Birnaviridae,
nhưng VP2 của các chủng khác nhau có vùng “siêu biến ñổi” có thành phần amino

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ……… 1


acid không ñồng nhất. Vùng này bao gồm 120 - 150 amino acid mà ở ñó có một số
amino acid quan trọng, chúng là các amino acid khung cấu tạo nên epitope kháng
nguyên và ñộc lực. Sự thay ñổi của một, hai hay vài amino acid ñược gọi là epitope
trong vùng này có tính chất quyết ñịnh ñến sự kết hợp kháng thể do chúng hoặc do
các chủng ñồng kháng nguyên khác kích thích sinh ra. Nếu không ñồng nhất về thành
phần khung epitope, kháng nguyên vaccine sử dụng có thể kích thích sinh kháng thể
với hàm lượng cao nhưng kháng thể này không thể hoặc không hoàn toàn trung hòa
ñược chủng virus gây bệnh khác vì không có vị trí kết hợp kháng nguyên - kháng thể
tương ứng, do sai lệch về epitope của vaccine với chủng cường ñộc gây bệnh, và như
vậy mặc dù ñàn gà ñược tiêm vaccine nhưng bệnh vẫn nổ ra (Letzel và cs, 2007)
[113]. ðứng trước tình hình này, việc nghiên cứu một loại vaccine ña chủng, mà ñặc
biệt là vaccine thế hệ mới ñể phòng bệnh Gumboro cho ñàn gia cầm là hết sức cần
thiết và trên thế giới hiện nay, nghiên cứu cơ bản và phát triển vaccine vẫn không
ngừng ñược ñẩy mạnh, nhằm tiến tới có ñược những phương thức và loại hình
vaccine tốt nhất phòng chống bệnh Gumboro (Müller và cs, 2003) [133].
Vaccine thế hệ mới hay còn gọi là vaccine công nghệ gen là sản phẩm kết
quả của quá trình thao tác và can thiệp của kỹ thuật gen ñối với gen kháng nguyên
của một hay nhiều loại vi sinh vật cần phòng chống, trong ñó có virus Gumboro
ñang ngày càng ñược quan tâm. Nguồn nguyên liệu về gen và hệ gen của virus gây
bệnh phải ñược phân lập, tách dòng, giải trình tự và phân tích ñặc tính sinh học
phân tử của chúng, ñồng thời một khi nguồn gen ñó ñã ñược gài vào plasmid thì
việc thu thập, lưu giữ làm nguyên liệu khung tạo nên thư viện gen ñể tiến hành các
công ñoạn tiếp theo là kết sức thuận lợi.
ðể có nguồn gen của một số chủng virus Gumboro có tại Việt Nam, từ ñó

làm cơ sở dữ liệu cho nghiên cứu về gen và hệ gen của virus Gumboro, cũng như
tạo nguồn nguyên liệu gen ñể có thể sử dụng cho các chế phẩm thế hệ mới (chế
phẩm chẩn ñoán, vaccine thế hệ mới...), chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài:
“Giải mã phân ñoạn A hệ gen các chủng virus Gumboro phân lập ở Việt Nam
nhằm cung cấp nguồn gen cho nghiên cứu vaccine thế hệ mới”.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ……… 2


Mục tiêu của ñề tài là: giải mã phân ñoạn A và gen VP2 của một số chủng
Gumboro tại Việt Nam, lưu giữ gen kháng nguyên VP2 và phân ñoạn A trong
plasmid, phân tích ñặc ñiểm sinh học phân tử của chúng nhằm có ñược dữ liệu và
nguyên liệu cho nghiên cứu vaccine thê hệ mới.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài
Gumboro có thể ñược coi là một bệnh cổ ñiển của ngành chăn nuôi gà công
nghiệp. Có nhiều công trình nghiên cứu về bệnh, virus gây bệnh và vaccin phòng
bệnh song bệnh vẫn bùng phát.
Ở Việt Nam, virus Gumboro cũng rất ña dạng và phức tạp do chúng ta nhập
khẩu con giống từ nhiều nước khác nhau trên thế giới, khi có bệnh xảy ra chúng ta
không biết ñược virus Gumboro ñang mắc thuộc chủng nào và vì thế việc phòng
bệnh chưa ñạt hiệu quả như mong muốn.
Việc nghiên cứu trình tự nucleotide toàn bộ hệ gen của virus ñã ñược thế giới
công bố. Tại Việt Nam, cho ñến thời ñiểm chúng tôi nghiên cứu công trình này,
chưa có một nghiên cứu nào về vấn ñề giải mã toàn bộ phân ñoạn A và hệ gen của
virus Gumboro phân lập nội ñịa.
Bằng việc thu thập các chủng virus Gumboro ñương nhiễm ở Việt Nam, xem
xét sự biến ñổi về thành phần gen, tính kháng nguyên và ñộc lực, nguồn gốc và mối
quan hệ phả hệ của các chủng virus này, sẽ giúp chúng ta có hướng tạo ra các chế
phẩm ñể phòng bệnh này một cách hiệu quả.
ðề tài ñược tiến hành tại Viện Công nghệ sinh học - Viện Khoa học và Công

nghệ Việt Nam.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ……… 3


CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 ðẠI CƯƠNG VỀ BỆNH GUMBORO
Bệnh Gumboro hay còn gọi là bệnh viêm túi Fabricius truyền nhiễm
(Infectious Bursal Disease - IBD) là bệnh truyền nhiễm lây lan cấp tính ở gà con (26 tuần tuổi). Nguyên nhân gây ra bệnh Gumboro là một loại virus RNA có tên là
virus gây viêm túi truyền nhiễm (Infectious Bursal Disease Virus - IBDV) hay còn
gọi là virus Gumboro. Sự nhiễm IBDV có thể làm gia tăng trầm trọng mức ñộ
nhiễm bệnh với những tác nhân gây bệnh khác và làm giảm khả năng ñáp ứng miễn
dịch của gia cầm.
Các tế bào lympho trong túi Fabricius là những tế bào ñích của virus Gumboro.
Gà ở ñộ tuổi 3 - 6 tuần có tính nhạy cảm cao với virus, khi túi Fabricius phát triển
lớn nhất. Hậu quả của IBDV gây nhiễm ở gia cầm là làm teo nhỏ các mô lympho
và cuối cùng là phá hủy cấu trúc túi Fabricius làm cho cơ quan có thẩm quyền
miễn dịch này mất hoàn toàn hoặc một phần chức năng ñáp ứng miễn dịch dẫn ñến
suy giảm miễn dịch (immunosuppression) (Sharma và cs, 2000) [167]; (Müller và
cs, 2003) [133].
Virus ở các dạng ñộc lực cổ ñiển, nguyên nhân gây ra nhiều vụ dịch xảy ra
trước ñây, thường gây ra tỷ lệ chết khoảng từ 1 - 50% số gà nhiễm trong ñàn
(Müller và cs, 2003) [133]. Ở những ñàn gà thịt thương phẩm bị nhiễm, tỉ lệ này
có thể lên ñến 50%, tuy nhiên ở các ñàn gà trong ñộ tuổi 3-6 tuần tỉ lệ chết ít khi
vượt quá 3%. Người ta thấy rằng, khi thay thế các ñàn gà mái tơ Leghorn (thay
ñàn) ở trong ñộ tuổi nhạy cảm với bệnh có thể làm gia tăng tỉ lệ chết của số gà
nhiễm bệnh trong ñàn lên ñến 20% (Müller và cs, 2003) [133]. Trong các ñàn
ñang ở thời kì ñẻ trứng, có sự giảm sút sản lượng trứng và cả chất lượng trứng.
Bên cạnh khả năng gây chết, IBDV còn gây suy giảm miễn dịch ở gà bị nhiễm

bệnh. Ở các ñàn gà thịt thương phẩm, sự suy giảm khả năng miễn dịch ñược biểu
hiện rõ rệt bởi tỉ lệ xâm nhiễm cao của các virus ñường hô hấp và làm gia tăng tỉ lệ
chết do sự nhiễm trùng máu của vi khuẩn E. coli (trực khuẩn ruột già) trong suốt

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ……… 4


một phần ba cuối của chu kỳ phát triển 6-8 tuần. Vaccine sống nhược ñộc có thể
không phát huy tác dụng ở cả các ñàn gà thịt và ñàn gà mái tơ sau tiêm chủng nhằm
chống lại với các bệnh ñường hô hấp như là bệnh viêm phế quản và bệnh Newcastle.
Từ năm 1986 ñến nay, các chủng IBDV ñộc lực cao ñã gây ra nhiều vụ dịch lớn ở
Châu Âu, bao gồm nhiều chủng có thể gây chết tới 70% số gà nhiễm bệnh trong các
ñàn gà mái ñẻ (Van Den Berg, 1991; 2000) [192, 193]; (Zorman-Rojs và cs, 2003)
[217]. Các chủng virus này có sự tương ñồng kháng nguyên với chủng virus “cổ ñiển”
gây bệnh dịch Gumboro trong nhiều thập kỷ và có thể gây ra các tổn thương bệnh tích
ñặc trưng (Eterradossi và cs, 1992) [60]. ðặc biệt, các chủng IBDV có ñộc lực cao
(very virulent IBDV = vvIBDV) có khả năng “lẩn tránh” ñược ñáp ứng miễn dịch dịch
thể sinh ra sau kích thích bằng chủng virus cổ ñiển (không bị trung hòa bởi các kháng
thể này), khi xâm nhiễm và gây bệnh ở gà mẫn cảm.
ðược phát hiện lần ñầu tiên cách ñây hơn 50 năm, cho ñến nay bệnh Gumboro
vẫn ñang là mối ñe dọa nguy hiểm với ngành chăn nuôi gà công nghiệp ở khía
cạnh suy giảm miễn dịch do virus gây ra. Sự thay ñổi tính kháng nguyên cũng như
sự xuất hiện các chủng virus có tính gây bệnh cao trong nhiều ñàn gia cầm ñược
tiêm vaccine (Dolz và cs, 2005) [58]; (Yuwen và cs, 2008) [211], ñã kích thích nỗ
lực quan tâm nghiên cứu các chủng Gumboro mới xuất hiện cả về bệnh và nguyên
nhân gây bệnh.
1.1.1 Lịch sử và ñịa dư bệnh
IBDV là loại virus thuộc họ Birnaviridae, nhóm Birnavirus, ñược phát hiện
ñầu tiên vào năm 1957 tại vùng Gumboro, ñịa hạt Sussex thuộc bang Delaware của
Mỹ (Hình 1.1), nhưng mãi ñến năm 1962 mới ñược Cosgrove miêu tả cặn kẽ

(Cosgrove, 1962) [50]. Năm 1970, Hitchner ñề nghị chính thức coi bệnh do
Cosgrove phát hiện là bệnh viêm túi Fabricius truyền nhiễm (IBD) hay còn gọi là
bệnh Gumboro ñể ghi nhớ ñịa danh phát hiện bệnh ñầu tiên (Hitchner, 1970) [73].

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ……… 5


Hình 1.1: Vùng Gumboro, ñịa hạt Sussex bang Delaware của Mỹ,
nơi ñầu tiên phát hiện bệnh Gumboro

Từ khi ñược phát hiện ñến nay, bệnh ñã lan truyền nhanh chóng và rộng rãi trên
nhiều nước có nền chăn nuôi gà công nghiệp phát triển. Ở Việt Nam bệnh ñược phát hiện
năm 1984 (Bitay và cs, 1984) [3].
1.1.2 Nguyên nhân gây bệnh
1.1.2.1 Hình thái, cấu trúc và phân loại virus gây bệnh Gumboro
IBDV là một virus hoàn toàn mới, thành viên của nhóm Avibirnavirus thuộc
họ Birnaviridae (Brown, 1986) [41], là một virus có kích thước không lớn, khoảng 58
- 60 nm, dạng hình khối ña diện cấu trúc ñối xứng 20 mặt (Dobos và cs, 1979) [55],
(Hình 1.2).

Hình 1.2: Cấu trúc của hạt IBDV dưới kính hiển vi ñiện tử
(Nguồn: vir.sgmjournals.org/.../vol86/issue8/cover.shtml)

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ……… 6


Trong nguyên sinh chất của tế bào bị nhiễm, dưới kính hiển vi ñiện tử, có
thể quan sát thấy tập hợp virus Gumboro, xếp ñều ñặn cạnh nhau (Hình 1.3). Mỗi
một nguyên sinh chất có thể chứa một vài tập hợp virus nói trên.

Hình 1.3: Virus Gumboro thường tập hợp thành từng cụm nằm trong tế bào lympho
B bị nhiễm (Nguồn: 210.36.18.48/gxujingpin/dwwswx/ev/16.htm)

IBDV không có vỏ bọc ngoài cùng (envelop), mà chỉ là virus dạng trần, hay
còn gọi là nucleocapsid, bao gồm nhân chứa ribonucleic acid (RNA) và bao quanh hệ
gen là lớp vỏ protein hay còn gọi là capsid. Vỏ capsid của virus bao gồm 32 ñơn vị
hình thái, mà mỗi một ñơn vị hình thái còn ñược gọi là capsomer ñan chéo nhau tạo
thành (Hirai và cs, 1979) [72]. Mỗi capsomer ñược tạo thành bởi 4 loại protein khác
nhau (Dobos, 1979) [54]. Các nucleotide trong ribonucleic acid (RNA) của virus
Gumboro ñược xếp thành ñôi cuộn tròn và phân làm hai ñoạn riêng biệt (Becht và cs,
1988) [35]; (Müller và cs, 1979) [128]; (Müller và Lange, 1985) [130], ñây là một
ñặc ñiểm hết sức ñặc trưng của loại virus này do vậy, theo sự phân loại mới nhất hiện
nay, IBDV ñược xếp vào nhóm virus có chứa RNA và là thành viên ñại diện ñầu tiên
của nhóm Avibirnavirus (Leong và cs, 2000) [112].
1.1.2.2 Phân type huyết thanh học
Cho ñến nay người ta coi tất cả các loại IBDV thuộc 2 serotype: I và II. Hai
serotype của IBDV có thể ñược phân biệt bằng phản ứng trung hòa virus (McFerran
và cs, 1980) [123].

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ……… 7


Serotype I bao gồm các chủng virus cường ñộc Gumboro gây bệnh cho gà,
mà tùy thuộc vào mức ñộ ñộc lực, người ta phân ra làm 4 nhóm chính: nhóm cường
ñộc cao (very virulent group), nhóm cổ ñiển (classical group), nhóm biến ñổi (variant
group) và nhóm nhược ñộc (attenuated group) (Wu và cs, 2007) [202]. Giữa các
chủng trong cùng serotype I có thể có mức ñộ cộng ñồng kháng nguyên không ñều
nhau, nhiều trường hợp chủng này chỉ cho 30% miễn dịch chéo với chủng khác.
Serotype II bao gồm tất cả các chủng IBDV gây nhiễm và ñược phân lập ở
gà tây. Chúng không gây bệnh ở gà nhưng có thể gây nhiễm, cũng tương tự các

chủng ở type I không gây bệnh cho gà tây nhưng có thể tồn tại ở gà tây ñể lan
truyền trở lại bệnh cho gà.
1.1.2.3 Tính gây bệnh của IBDV
Trong tự nhiên: gà nhà và gà tây là hai loại mẫn cảm với virus Gumboro,
trong ñó type I gây bệnh cho gà nhà và type II gây bệnh cho gà tây. Người ta cũng ñã
phát hiện thấy IBDV ở gà Nhật và chim bồ câu sống hoang dã ở Châu Phi (Kasanga và
cs, 2007; 2008) [90, 91]. Một số loài chim hoang dã như vịt trời, ngỗng trời, chim ác là,
cũng có thể bị nhiễm virus Gumboro, bị bệnh và chết. Virus Gumboro phân lập từ
những loài chim hoang dã này có thể gây bệnh trở lại cho gà mẫn cảm, gây chết tới
60% và làm teo túi Fabricius (Jeon và cs, 2008) [87].
Trong phòng thí nghiệm: khác với một số virus gây bệnh ở ñộng vật khác
là có thể gây bệnh dễ dàng trên chính ñộng vật mẫn cảm hoặc trên một số ñộng vật
cảm thụ phòng thí nghiệm như chuột lang, chuột bạch, thỏ và một số ñộng vật khác.
Với virus Gumboro, ngoài gia cầm mẫn cảm (gà 2 - 6 tuần tuổi), virus chỉ có khả
năng gây bệnh trên phôi gà hoặc môi trường tế bào xơ phôi gà mà không có khả
năng gây bệnh trên các ñộng vật cảm thụ phòng thí nghiệm.
1.1.3 Cơ chế sinh bệnh
Khác với nhiều loại virus gây bệnh ở gia cầm mà cơ quan thích ứng cho sự
nhân lên và gây bệnh thuộc về các cơ quan nội tạng hay da, niêm mạc, virus gây bệnh
Gumboro lại chọn túi Fabricius - cơ quan có thẩm quyền miễn dịch chủ yếu ở gia
cầm làm cơ quan thích ứng cho sự nhân lên và gây bệnh của mình, cụ thể là các tế

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ……… 8


bào lympho B mang thụ thể kháng thể IgG bề mặt và ñại thực bào (Nakai và Hirai,
1981) [142]; (Terasaki và cs, 2008) [187].
Qua con ñường tiêu hóa, do thức ăn, nước uống virus xâm nhập vào hệ tiêu hóa.
Tại ñây, chúng ñược các tế bào ñại thực bào tiếp nhận, ñồng thời tiếp xúc với tế bào
lympho B còn non là loại mẫn cảm với virus, bắt ñầu thực hiện quá trình nhân lên, quá

trình này là sự nhân lên cục bộ, hay sự nhân lên sơ cấp. Chỉ sau 6-8 giờ, một số lượng
virus Gumboro ñáng kể ñược giải phóng và xâm nhập vào hệ tuần hoàn. ðây là lần thứ
nhất virus xuất hiện trong máu, nhưng người ta không gọi là sự nhiễm trùng máu vì số
lượng virus không nhiều. Hệ tuần hoàn chỉ làm nhiệm vụ vận chuyển virus ñi khắp cơ
thể mà trước hết là ñến lách, túi Fabricius và một số cơ quan khác. Thông thường 9-11
giờ sau khi vào hệ tiêu hóa, một số lượng lớn virus Gumboro ñã có mặt trong túi
Fabricius và bắt ñầu tấn công các loại hình tế bào lympho B, ñây là quá trình nhân lên
toàn phần hay sự nhân lên thứ cấp. Số lượng lớn virus Gumboro ñược giải phóng ñã
xâm nhập vào hệ tuần hoàn lần thứ hai, lúc này người ta coi sự có mặt của virus
Gumboro trong máu là sự nhiễm trùng máu (viremia).
Theo Skeeles và cs (1980) [173], virus Gumboro tác ñộng gây nên hiện tượng
bệnh lý ñông máu, do vậy trong hệ tuần hoàn xuất hiện các cục huyết khối, làm
nghẽn mạch mao quản, chủ yếu là vùng niêm mạc túi Fabricius và ở một số nơi
khác, dẫn ñến hiện tượng xung huyết. Khi không chịu nổi áp suất gia tăng của máu,
mao mạch bị ñứt gây nên hiện tượng xuất huyết. Sự xuất huyết thường gặp ở các
vùng cơ ñùi, cơ lườn thành tia, thành mảng, thành vệt dài và có màu tím, màu hồng,
ñồng thời ở túi Fabricius, lách, gan cũng có thể xảy ra trường hợp tương tự.
Cứ như vậy, sự xung huyết, xuất huyết từ quy mô nhỏ (từng ñiểm li ti) ñến
quy mô lớn (vệt, mảng) và có màu sắc ña dạng từ hồng ñến tím hoặc nâu ñen.
Một số biến ñổi bệnh lý trong một số cơ quan có thể dần dần mất ñi và dần
phục hồi chức năng vốn có, nhưng ñối với túi Fabricius sự phục hồi không xảy ra.
Do virus Gumboro phá hủy túi một cách trầm trọng, virus nhân lên trong tế bào
lympho B, phá hủy chúng làm giảm ñáng kể số lượng tế bào này. Số lượng tế bào lympho
mất ñi không ñược bù ñắp nên chức năng miễn dịch của túi bị mất một phần hoặc hoàn

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ……… 9


toàn dẫn ñến sự suy giảm miễn dịch (immunosuppression). Mức ñộ suy giảm miễn dịch
phụ thuộc vào ñộc lực của virus, thời gian và ñiểm xâm nhập vào cơ thể gà (Hirai và cs,

1979) [72]; (Sharma và cs, 2000) [167].
1.1.4 Triệu chứng lâm sàng
ðối với ñàn gà mẫn cảm, thời gian nung bệnh xảy ra ngắn, khoảng 2-3 ngày: gà
ngoẹo ñầu, rúc mỏ vào cánh, có khi gục sang một bên, thích nằm, mắt lim dim mỏi mệt và
thường dồn về một góc chuồng, gà kém ăn hoặc bỏ ăn, uống nhiều nước, mất ñịnh hướng,
ỉa phân trắng, loãng hoặc toàn nước có khi lẫn máu, lúc ñầu nhiệt ñộ tăng, sau giảm và nếu
không qua khỏi thì gà chết trong vòng vài ngày.
Do ñặc tính truyền ngang rất mạnh, virus Gumboro gây nên tỷ lệ nhiễm trong ñàn có
khi ñạt 100%. Thông thường từ ngày thứ 3 sau triệu chứng lâm sàng ñầu tiên, trong ñàn
bắt ñầu có cá thể chết và chết ồ ạt trong vòng 5-7 ngày, sau ñó giảm chết rất nhanh, thường
10-12 ngày có thể dứt bệnh, gà dần hồi phục, tuy nhiên các cá thể bị bệnh qua khỏi thông
thường bị tổn thương khá nặng, ñặc biệt là hệ miễn dịch dẫn ñến suy giảm miễn dịch.
1.1.5 Bệnh tích
1.1.5.1 Bệnh tích ñại thể
Túi Fabricius: sau 72 giờ bị nhiễm, virus Gumboro có ñộc lực mạnh ñã có thể gây
bệnh với bệnh tích ñại thể ñiển hình: túi Fabricius thường sưng rất to, có kích thước và
trọng lượng gấp 2-3 lần bình thường. Xung quanh túi có thủy thũng keo nhầy vàng, có khi
có bọc dịch thẩm xuất bọc quanh túi Fabricius. Nếu chích hết nước, túi lộ rõ ra, căng tròn,
sưng phù. Túi chuyển màu sắc từ vàng sáng sang màu trắng ñục. Túi dễ cấu, dễ bục, các
nếp gấp múi khế sưng không rõ nét. Niêm mạc sưng dầy lên làm cho dung tích khoang túi
trở nên hẹp lại. ðây là giai ñoạn viêm sưng (Hình 1.4A).
Có nhiều cá thể bị bệnh Gumboro, hiện tượng viêm sưng ñi kèm với hiện tượng
xuất huyết và thẩm xuất dịch vào trong lòng túi Fabricius, niêm mạc túi có ñiểm xuất
huyết, ñôi khi thành vệt, niêm mạc túi chuyển từ màu trắng sang màu thâm tím, nâu ñen
(Hình 1.4B).

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ……… 10


Theo Cheville (1967) [49], túi Fabricius bắt ñầu tăng về kích thước và trọng

lượng trong khoảng 48-72 giờ sau khi nhiễm do thủy thũng và xuất huyết. Kích
thước túi có thể tăng gấp 2-3 lần so với bình thường. Vào ngày thứ 4 sau nhiễm,
kích thước túi vẫn còn to gấp ñôi, sau ñó mới nhỏ dần lại. Ngày thứ 5 sau nhiễm
trọng lượng túi bằng trọng lượng ban ñầu và sau ñó bắt ñầu teo ñi. ðến ngày thứ 8
trọng lượng túi chỉ bằng 1/3 trọng lượng ban ñầu.

C
B
Hình 1.4: Bệnh tích túi Fabricius và hệ cơ
A: Hình ảnh túi Fabricius sưng to, xung quanh có thủy thũng keo nhầy (Nguồn:
www.vemedim.vn/benhvadieutri), B: Hình ảnh xuất huyết bên trong túi (Nguồn:
www.medvet.umontreal.ca/.../OrigiInfect/), C: Hình ảnh cơ ñùi, cơ lườn bị xuất huyết
ñiểm hoặc thành từng vệt, từng mảng có màu ñỏ hay màu nâu thẫm (Nguồn:
/>A

Hệ cơ: gà bệnh bị mất nước nên cơ khô rất nhanh, chỉ vài phút sau khi lột da, cơ
ngực của gà ñã khô nhăn lại, có mầu thẫm, ñặc biệt có xuất huyết những ñám lấm chấm
hoặc thành từng vệt, có khi các vệt xuất huyết hợp lại tạo thành mảng lớn (Hình 1.4C).
Ngoài ra, lách có thể bị sưng nhẹ. Gan sưng, bề mặt có những vệt loang lổ
mầu vàng, có thể có hoại tử rìa gan, ñôi khi ñiểm hoại tử hợp thành từng vệt nhỏ,
mầu vàng sáng ăn sâu vào nội mô của gan. Thận có thể bị sưng, trên bề mặt có
những ñiểm xuất huyết, hoại tử. Tuyến ức bị xuất huyết ñiểm, vệt hoặc từng mảng,
có khi xuất huyết ăn sâu vào các thùy của tuyến.
1.1.5.2 Bệnh tích vi thể
Bệnh tích vi thể xuất hiện sớm ở các cơ quan có cấu trúc từ tổ chức lympho
và các cơ quan tạo miễn dịch như túi Fabricius, tuyến ức (thymus), lách, hạch, các
mô lympho ở ruột, chỉ trong vòng vài giờ ñến vài chục giờ sau khi virus cường ñộc
Gumboro xâm nhập vào cơ thể.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ……… 11

Theo Müller và Lange (1985) [130], có sự tập trung của ñại thực bào và các
tế bào lympho trong vòng 4-5 giờ sau khi gây nhiễm qua ñường tiêu hóa và sau 11
giờ xuất hiện những tế bào lympho bị nhiễm virus, nếu gây nhiễm trực tiếp vào túi
Fabricius chỉ sau 6 giờ ñã xuất hiện những tế bào lympho bị nhiễm virus.
Theo Helmboldt và Garner (1964) [70], 24 giờ sau khi nhiễm các tế bào
lympho trong túi Fabricius ñã bị thoái hóa, các tế bào lympho ở vùng tủy của nang ñã
bắt ñầu quá trình hoại tử. Virus tấn công và phá hủy các tế bào lympho B non và
lympho B trưởng thành, nên chỉ trong thời gian rất ngắn lượng tế bào lympho B ñã
giảm ñáng kể (Kim và cs, 2000) [99]. Trung tâm bị hoại tử ngày càng tăng, các vách
nang giảm dần, nang bị thu hẹp lại, có các hình tròn, chữ nhật, ô van khác nhau. Các
trung tâm hoại tử xuất hiện không bào (vacuole), không còn tế bào lympho hoặc chỉ
còn rất ít tập trung ở vùng ngoại vi nang. Thay vào các vị trí của các tế bào lympho là
các tế bào heterophil, các mảnh tế bào bị phân hủy một phần, các tế bào hệ lưới nội
mô. Toàn bộ các nang lympho bị hủy hoại và có thể quan sát thấy các mức ñộ khác
nhau (Kulkarui và cs, 1982) [105] (Hình 1.5).

A

B

Hình 1.5: Ảnh vi thể của các tế bào ñại thực bào
trong túi Fabricius bị virus Gumboro tấn công
Ghi chú: A: sự hủy hoại của tế bào ñại thực bào; B: tập hợp virus ñang nhân lên trong tế bào
ñại thực bào (Nguồn: ss.niah.affrc.go.jp/disease/EM/em_en/virus0.html)

Vào ngày thứ 3 hoặc 4, sự thủy thũng, xung huyết và tập trung của các tế
bào của túi làm cho túi Fabricius sưng to. Sự khám phá vai trò của các tế bào T
trong miễn dịch bệnh lý ñược gây ra bởi IBDV và sự phục hồi của những mô bị

nhiễm ñã cho thấy có sự xâm nhiễm của cả tế bào lympho T (CD4+) và tế bào

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ……… 12


lympho T (CD8+) làm cho số lượng lympho T tăng tối ña vào ngày thứ 7 sau khi
nhiễm (Kim và cs, 2000) [99]. Các tế bào T ở trong túi Fabricius ngăn cản sự nhân
lên của virus trong túi trong giai ñoạn ñầu của bệnh, nhưng cũng thúc ñẩy quá trình
phá hủy mô túi và làm chậm quá trình hồi phục của mô thông qua việc giải phóng ra
các cytokine gây ñộc tế bào (Rautenschlein và cs, 2002) [154]. Khi phản ứng viêm
mất dần, túi Fabricius teo ñi, các nang rỗng phát triển ở vùng tủy nang túi. Có sự
hoại tử và thực bào của các tế bào heterophil và tương bào (plasmocyte), có sự xơ
hóa của các tế bào phân cách các nang. Sự tăng sinh tế bào nền biểu mô có những
ñám dịch nhầy mucin trên bề mặt.
1.1.6 Chẩn ñoán bệnh
Có nhiều phương pháp ñể chẩn ñoán bệnh Gumboro ñó là chẩn ñoán bằng phương
pháp phân lập virus, chẩn ñoán bằng phương pháp huyết thanh học và hiện nay,
chẩn ñoán bằng phương pháp sinh học phân tử sử dụng phản ứng RT-PCR (reverse
transcriptase polymerase chain reaction) và Real time PCR (Moody và cs, 2000)
[126]. RT-PCR là phương pháp hiện ñại và chính xác, xác ñịnh sự có mặt của một
ñoạn gen trong hệ gen virus Gumboro có trong bệnh phẩm; real-time PCR xác ñịnh
hàm lượng RNA thông tin của virus Gumboro vừa ñịnh tính vừa ñịnh lượng
(Moody và cs, 2000) [126]. Phương pháp chẩn ñoán nhanh bằng miễn dịch học sắc
ký (immunochromatographic test, ICT) cũng ñã ñược phát triển và ứng dụng hiện
nay (Zhang và cs, 2009) [212].
1.1.7 Phòng bệnh Gumboro
Do ñặc ñiểm cấu tạo ñặc biệt, IBDV có sức ñề kháng rất cao trong tự nhiên,
khả năng tồn tại và lan truyền bệnh rất lớn, tính chất dịch tễ bệnh rất phức tạp. Các
biện pháp vệ sinh thú y, chăm sóc nuôi dưỡng, kiểm dịch là các biện pháp ñóng góp
tích cực trong phòng dịch, song chưa hoàn toàn ngăn ñược bệnh xảy ra. Biện pháp

cơ bản ñể khống chế bệnh là tạo miễn dịch cho gà. Do bệnh thường xảy ra ở gà con
nên việc tạo miễn dịch cho gà con là vô cùng quan trọng.
Có nhiều loại vaccine như vaccine nhược ñộc cho gà con, vaccine vô hoạt nhũ
dầu cho gà mẹ. Một loại vaccine “phức hợp miễn dịch - immune complex” ñã ñược

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ……… 13


phát triển, trong ñó các virus vaccine ñược pha trộn với một số lượng các kháng thể
tối ưu (Whitfill và cs, 1995) [201] và ñược sử dụng ñể tiêm chủng trong phôi trứng
gà (noãn). Tuy nhiên, cơ chế hoạt ñộng chính xác của vaccine “phức hợp miễn
dịch” vẫn chưa ñược làm sáng tỏ, người ta cho rằng “phức hợp miễn dịch” làm gia
tăng các tế bào tua và ñại thực bào trong nang túi Fabricius, nơi virus tồn tại cho
ñến khi giảm lượng kháng thể nhận ñược từ mẹ (Jeurissen và cs, 1998) [88].
Một số loại vaccine vector tái tổ hợp thế hệ mới sử dụng các virus dẫn truyền
gen kháng nguyên VP2 hoặc toàn bộ phân ñoạn A của virus Gumboro ñã ñược thử
nghiệm ñó là các loại vaccine có vector dẫn truyền chứa gen kháng nguyên virus
Gumboro, cụ thể là vector virus ñậu gà (Shaw và Davison 2000) [169], vector virus
herpes của gà tây (Tarpey và cs, 2007) [186], vector adenovirus ở gà (Francois và cs,
2001) [66]; (Perozo và cs, 2008) [149], vector virus gây bệnh Marek (Tsukamoto và
cs, 2002) [191] và vector virus Forest Semliki (Phenix và cs, 2001) [151], hay sử
dụng bacteriophage T4 (Cao và cs, 2005) [45]. Protein VP2 ñược biểu hiện trong hệ
thống baculovirus riêng biệt (Dybing và Jackwood, 1998) [59]; (Yehuda và cs, 2000)
[209] hoặc cùng với cytokine IL-6 (Liu và cs, 2005) [115]; các tiểu phần cấu tạo
(giống hạt virus) tương tự virus ñược biểu hiện trong tế bào côn trùng (VLP = viruslike particle) của IBDV (Hu và cs, 1999) [75]; (Kibenge và cs, 1999) [98], tất cả các
loại hình này cũng ñược coi là các vaccine mới cung cấp kháng nguyên miễn dịch
trong ñịnh hướng phát triển vaccine phòng chống Gumboro.
Một loại hình vaccine thế hệ mới khác là vaccine DNA cũng ñược sử dụng cho
việc phòng chống ñối với IBDV, ñó là plasmid ñược thiết kế chứa gen kháng nguyên
của virus Gumboro (Kim và cs, 2004) [101]; (Mahmood và cs, 2007) [121]; (Sun và

cs, 2005) [180], công nghệ ứng dụng vaccine dạng này ở Việt Nam cũng ñã ñược
tiến hành nghiên cứu (Lê Thanh Hòa, 2006a) [18], cũng như vaccine tái tổ hợp gen
kháng nguyên VP2 ñã ñược sản xuất và sử dụng trên quy mô lớn (Pitcovski và cs,
2003) [152]; (Rong và cs, 2005; 2007) [159, 160]. Một phương thức mới dựa trên
công nghệ cao ñã ñược thử nghiệm ñó là liệu pháp phá bỏ gen RNA thông tin VP2
của virus Gumboro thông qua cơ chế can thiệp RNA (RNA interference, RNAi) nhờ

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ……… 14