Bai ging thc hanh vi sinh

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG CAO ĐẲNG CÔNG NGHIỆP TUY HÒA
KHOA CÔNG NGHỆ HÓA
  
\

BÀI GIẢNG
HỌC PHẦN: THỰC TẬP VI SINH VẬT KỸ THUẬT
MÔI TRƯỜNG
DÀNH CHO SINH VIÊN BẬC CAO ĐẲNG
NGÀNH CÔNG NGHỆ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG

TUY HÒA – 2010


Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường
CHƯƠNG 1
GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÁC TRANG THIẾT BỊ, DỤNG CỤ TRONG
PHÒNG THÍ NGHIỆM
1.1. Trang thiết bị cần thiết trong phòng thí nghiệm
1.1.1. Máy móc
a) Nồi hấp vô trùng ở áp suất cao ( autoclave): Dùng để khử trùng rất nhiều loại dụng
cụ, môi trường nuôi cấy và một số nguyên liệu khác. Nó đạt hiệu quả cao nhất trong
các thiết bị vô trùng vì nó sử dụng hơi nước bão hòa ở áp suất cao để đốt nóng môi
trường.
b) Tủ sấy: Thiết bị này được làm bằng kim loại chịu nhiệt. Phía bên trên tủ có nút điều
chỉnh nhiệt độ tùy theo yêu cầu sử dụng. Nó dùng để khử trùng và làm khô các loại
dụng cụ bằng sắt, bằng thủy tinh có khả năng chịu nhiệt cao.
c) Tủ cấy vô trùng: Đó là thiết bị có cấu trúc dạng hộp, bằng kính, có khả năng vô
trùng nhờ hệ thống đèn tử ngoại hoặc bộ phận thổi khí vô trùng.
d) Dụng cụ lọc vi khuẩn: Dùng để khử trùng các loại môi trường không chịu được

nhiệt độ và áp suất cao.
e) Tủ ấm: Thiết bị này có khả năng duy trì nhiệt độ thích hợp cho quá trình nuôi cấy để
nghiên cứu các đặc điểm sinh lý vi sinh vật.
g) Máy lắc: Thiết bị này dùng để nuôi cấy, nhân giống vi sinh vật bằng cách lắc các
bình nuôi theo các chiều khác nhau một cách đều đặn để tăng lượng ooxxi hòa tan
trong môi trường.
h) Máy li tâm: Máy này dùng để tách sinh khối tế bào trong môi trường nuôi cấy hoặc
tách các tiểu phần có độ lắng khác nhau trong thành phần của tế bào.
i) Máy đo pH: Dùng để xác định pH của môi trường nuôi cấy vi sinh vật
k) Cân phân tích: Dùng để định lượng các chất trong quá trình làm môi trường nghiên
cứu vi sinh vật.
1.1.2. Các dụng cụ và thiết bị trong phòng thí nghiệm
a) Phiến kính: Dùng làm tiêu bản trong nghiên cứu hình thái, sinh lý tế bào
b) Lá kính: Dùng để đậy lên vết bôi trên tiêu bản giúp cho việc quan sát, nghiên cứu vi
sinh vật dễ dàng hơn.

2


Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường
c) Phiến kính lõm: Phiến kính này giúp ta nghiên cứu khả năng di động, sự hình thành
bào tử và các đặc điểm về sinh sản của tế bào vi sinh vật.
d) Hộp lồng ( đĩa pêtri): Dùng để nghiên cứu các đặc điểm hình thái, đặc điểm nuôi
cấy và phân lập của tế bào vi sinh vật
e) Bình tam giác: Dùng để nuôi cấy, nhân giống, chứa các loại môi trường. Nó gồm
nhiều loại: 100 ml, 250ml, 500 ml… Trong đó loại 250 ml là được sử dụng nhiều nhất
g) Que gạt: Dụng cụ này để phân lập, tuyển chọn tế bào vi sinh vật
h) Que cấy: Gồm có 3 loại que cấy: que cấy đầu tròn, que cấy đầu nhọn, que cấy đầu
hình thước thợ. Công dụng chủ yếu của nó để lấy giống, cấy truyền và làm tiêu bản vi
sinh vật.

i) Các nguyên liệu và dụng cụ khác:
- Agar: Thường dùng ở dạng thạch dùng để nấu môi trường
- Các loại thuốc nhuộm
- Dầu bách hương: Dùng khi quan sát mẫu vật ở bội giác có độ phóng đại lớn của kính
hiển vi
- Axeton: Dùng để lau vật kính và các tiêu bản có dầu.
- Vải xô: Dùng để lọc tiêu bản và làm nút bông:
- Giấy lọc.
- Giấy báo cũ dùng để bao gói các dụng cụ.
- Bông thấm nước.
- Bông mỡ ( không thấm nước) để làm nút bông cho ống nghiệm và bình tam giác.
- Các loại dụng cụ để chế tạo môi trường nuôi cấy vi sinh vật: dao, thớt, xoong nhôm,
vá…
1.1.3: Kính hiển vi:
Là dụng cụ rất quan trọng trong nghiên cứu vi sinh vật. Nó cho phép ta quan sát,
nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý tế bào nhờ khả năng phóng đại từ hàng chục
đến hàng vạn lần hình ảnh của mẫu vật quan sát.
Tùy theo yêu cầu mà người nghiên cứu có thể lựa chọn và sử dụng các loại kính
hiển vi khác nhau
a) Kính hiển vi thông thường:Dùng ánh sáng thường từ dưới chiếu lên. Kính này cho
phép ta quan sát và nghiên cứu các đặc điểm hình thái, cấu tạo và sinh lý nói chung
của tế bào nên được sử dụng phổ biến trong giảng dạy và học tập.
3


Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường
b) Kính hiển vi nền đen: Cũng dùng ánh sáng thường nhưng nhờ cấu trúc đặc biệt của
kính tụ quang nên ánh sáng chiếu vào mẫu vật từ phía bên. Kính này cho phép ta nhìn
thấy các cấu trúc khó quan sát trên kính hiển vi thường, ở tiêu bản không nhuộm màu
và tiêu bản các tế bào sống.

c) Kính hiển vi đổi pha: Cũng dùng ánh sáng thường nhưng nhờ cấu trúc đặc biệt của
kính tụ quang, vật kính, thị kính làm đổi pha dao động của ánh sáng. Kính này cho
phép ta nhìn thấy rõ các cấu trúc nhỏ, rõ nét hơn như tiên mao, các lớp màng, không
bào, ti thể…
d) Kính hiển vi huỳnh quang: Dùng chùm tia tử ngoại chiếu vào tiêu bản đã nhuộm
màu bởi các chất huỳnh quang. Trong tế bào, các cấu trúc khác sẽ phát quang với màu
sắc khác nhau cho phép ta phân biệt rõ chúng.
e) Kính hiển vi điện tử: Dùng chùm tia điện tử với độ phân giải cao thay cho ánh sáng
thường cho phép nhìn thấy ảnh của mẫu vật được phóng đại từ 30- 50 vạn lần.
Có 2 loại:
- Kính hiển vi điện tử truyền suốt: Dùng để nghiên cứu các đại phân tử sinh học.
- Kính hiển vi điện tử quét: Dùng để nghiên cứu các cấu trúc có kích thước lớn hơn
các đại phân tử sinh học. Tuy nhiên kính hiển vi điện tử thường được trang bị tạ các
phòng thí nghiệm có quy mô lớn với các cán bộ chuyên môn có đủ trình độ và kinh
nghiệm mới sử dụng được.
1.2. Quan sát vi sinh vật trên kính hiển vi
1.2.1. Phương pháp làm tiêu bản vi sinh vật
1.2.1.1 Phương pháp làm tiêu bản tạm thời:
- Cách làm tiêu bản giọt ép:
+ Dùng que cấy hoặc ống hút lấy giống vi sinh vật để làm vết bôi.
+ Đặt lá kính lên giọt canh trường thật nhẹ nhàng tránh không để tạo thành bọt
khí.Muốn vậy để một mép lá kính tiếp xúc với phiến kính rồi từ từ hạ lá kính xuống.
+ Đưa tiêu bản lên quan sát trên kính hiển vi.
- Cách làm tiêu bản giọt treo:
Dùng để theo dõi sự sinh sản, sự hình thành bào tử, khả năng di động và phản
ứng của tế bào vi sinh vật với các loại kích thích
+ Dùng phiến kính đặc biệt có lõm hình tròn ở giữa.
+ Bôi vazolin quanh phần lõm của phiến kính.
4

Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường
+ Cho một giọt canh trường lên giữa lá kính.
+ Thận trọng xoay ngược lá kính cho giọt canh trường xuống phía đươi rồi đặt lên
phần lõm của phiến kính.
- Cách làm tiêu bản tạm thời có nhuộm màu:
a. Nguyên tắc:
Phương pháp này sử dụng thuốc nhuộm không hoặc ít độc với vi sinh vật và được pha
loãng ở nồng độ đảm bảo cho tế bào vi sinh vật vẫn sống và hoạt động sau khi nhuộm.
b. Cách nhuộm:
+ Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm xanh meetylen 0,001% lên phiến kính.
+ Nhỏ 1 giọt canh trường vi sinh vật với thuốc nhuộm.
+ Đậy lá kính lên giọt dịch
+ Quan sát tiêu bản ở vật kính (x10) rồi (x40)
1.2.1.2 Phương pháp làm tiêu bản cố định:
- Các bước tiến hành làm tiêu bản cố định:
1. Làm vết bôi:
2. Cố định vết bôi:
Các cách cố định :
+ Cố định bằng nhiệt:
+ Cố định bằng hóa chất:
* Phương pháp này tuy phức tạp nhưng không gây biến dạng tế bào, không gây biến
đổi cấu trúc tế bào và không làm đứt các tiên mao.
* Người ta thường dùng các hóa chất là rượu và axeton để cố định vết bôi.
* Cách cố định: Có thể thực hiện một trong những cách sau:
Nhúng vết bôi vào rượu. Với rượu 95 0 ngâm vết booit ừ 5-15 phút. Với rượu
CH3OH ngâm khoảng 2-5 phút.
Ngâm vết bôi vào dung dịch axeton trong 5 phút
Nhỏ vài giọt rượu 90-950 lên vết bôi. Đốt cháy và dập tắt ngay. Làm như vậy vài
lần rồi để khô.

1.2.2. Phương pháp nhuộm vi sinh vật
1.2.2.1 Nhuộm màu tiêu bản cố định
a. Nguyên tắc:

5


Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường
- Sử dụng thuốc nhuộm có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào và kết hợp với thành
phần khác nhau của tế bào thành các hợp chất màu đặc trưng bền vững.
- Tùy theo mục đích nghiên cứu và khả năng bắt màu khác nhau của các thành phần tế
bào mà chọn thuốc nhuộm và cách nhuộm cho phù hợp.
- Có 2 cách nhuộm chính:
+ Nhuộm đơn: Chỉ dùng một loại thuốc nhuộm trên 1 tiêu bản
+ Nhuộm kép: Dùng đồng thời 2 hay nhiều thuốc nhuộm trên một tiêu bản.
b) Cách nhuộm đơn:
- Đặt tiêu bản lên cầu thủy tinh ( đặt nằm ngang miệng một khay nhân, hoặc thủy tinh).
- Nhỏ vào vết bôi vài giọt Fuchsin Ziel, để yên từ 1 -2 phút.
- Rửa vết bôi bằng cách nghiên phiến kính, dùng bình xịt cho dòng nước chảy nhẹ qua
vết bôi đến khi nước chảy ra không còn màu nữa.
- Dùng giấy thấm khô tiêu bản hoặc hơ nhẹ tiêu bản trên đèn cồn
-Quan sát tiêu bản ở vật kính (x40) rồi chuyển sang vật kính (x100) dùng dầu soi.
c) Nhuộm kép: Việc sử dùng đồng thời các loại thuốc nhuộm trên cùng một tiêu bản
cho phép ta có thể quan sát và phân biệt cấu trúc dễ dàng hơn.
- Phương pháp nhuộm Gram :
+ Nguyên tắc:Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc
nhuộm tím kết tinh và iot mà hình thành nên 2 loại phức chât khác nhau.
 Loại phức chất thứ nhất vẫn giữ nguyên màu của thuốc nhuộm nên không bị rửa
trôi khi xử lý bằng cồn. Vi sinh vật có phức chất này thuộc loại Gram dương.
 Loại phức chất thứ hai không giữ được màu của thuốc nhuộm nên mất màu khi

xử lý bằng cồn và bắt màu của thuốc nhuộm bổ sung. Vi sinh vật có phức chất
này thuộc loại Gram âm.\
+ Cách tiến hành:
 Làm tiêu bản:
* Dùng que cấy lấy nước vô trùng để làm 3 vết bôi trên phiến kính ( hai đầu và
giữa phiến kính).
* Dùng que cấy lấy một chút khuẩn lạc của chúng làm vết bôi theo thứ tự sau:Bên
trái phiến kính là Bac. Subtilis bên phải phiến kính là E. Coli, ở giữa phiến kính là
Bac. Subtilis trộn lẫn với E. Coli.
* Để khô vết bôi trong không khí hoặc cố định nhẹ trên ngọn đèn cồn.
6


Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường
 Nhuộm tiêu bản:
* Đặt 3 miếng giấy lọc lên ba vết bôi.
* Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm tím kết tinh qua giấy lọc trong một phút
* Nhuộm lugol trong một phút
* Rửa nước
* Tẩy bằng cồn trong 30 giây, để nghiêng tiêu bản, nhỏ từ từ từng giọt cồn cho đến
khi tan hết màu.
* Rửa nước
* Nhuộm bổ sung Fuchsin hay saframin từ 10-30 giây
* Rửa nước
* Làm khô và soi tiêu bản với vật kính dầu.
 Kết quả:
* Vết bôi của Bac. Subtilis màu tím – gram dương
* Vết bôi trộn Bac. Subtilis với E. Coli có màu hồng lẫn màu tím
* Vết bôi của E. Coli có màu hồng – gram âm.

7


Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường

CHƯƠNG 2
NUÔI CẤY VI SINH VẬT
2.1. Chuẩn bị dụng cụ và nuôi cấy vi sinh vật
2.1.1. Chuẩn bị dụng cụ
Qúa trình chuẩn bị dụng cụ nuôi cấy bao gồm các bước sau:
- Xử lý dụng cụ
- Bao gói dụng cụ
- Khử trùng dụng cụ
2.1.1.1 Xử lý dụng cụ
1. Nguyên tắc chung
Các loại dụng cụ dùng để nuôi cấy vi sinh vật phải đạt độ trung tính, thật sạch và
trong, không bị nứt mẻ.
2. Phương pháp xử lý
Phương pháp xử lý gồm 2 giai đoạn: trung tính dụng cụ và rửa dụng cụ
a) Phương pháp trung tính dụng cụ:
- Đổ vào bên trong dụng cụ nước có pH = 7
- Hấp khử trùng dụng cụ ở 1200C trong 30 phút bằng nồi hấp.
- Lấy dụng cụ ra để nguội rồi kiểm tra pH của nước trong dụng cụ.
- Nếu nước có pH > 7 thì tiếp tục ngâm dụng cụ vào dung dịch HCl 2% cho đến khi
kiểm tra pH = 7 thì thôi.
- Rửa kĩ bằng nước nhiều lần là dùng được.
b) Phương pháp rửa dụng cụ:
* Phiến kính:
- Với phiến kính cũ( đã dùng làm tiêu bản)
+ Chùi sạch mỡ hoặc vazolin trên phiến kính bằng miếng vải tẩm xilen hoặc ngâm tiêu

bản vào dung dịch sunphôbicromat trong 48h.
+ Ngâm tiêu bản vào nước xà phòng và đun sôi trong 1h.
+ Rửa nước, để ráo.
+ Ngâm tiêu bản vào cồn 900 trong 12h.
+ Lau khô chúng bằng vải mịn rồi sấy khô.
- Với phiến kính mới cần kiểm tra độ pH và xử lý để đạt độ trung tính
* Ống nghiệm:
8


Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường
- Với các ống nghiệm cũ đã bị nhiễm khuẩn :
+ Hấp trùng ở 1200C trong 30 phút.
+ Lấy ra và đổ các vật phẩm trong ống nghiệm đi.
+ Ngâm ống nghiệm vào nước ấm .
+ Rửa ống nghiệm bằng cách:
Dùng chổi chấm xà bông hay tro bếp cọ xát vào thành ống đều khắp nhiều lần.
Rửa nước 2- 3 lần.
Úp ống nghiệm cho thật ráo nước và khô.
Sấy khô ở 700C.
- Với các ống nghiệm không nhiễm khuẩn hay chứa các vi khuẩn không gây bệnh thì
không phải hấp khử trùng và tiến hành rửa như trên.
* Đĩa pêtri:
- Đặt ngữa đĩa petri trong lòng bàn tay trái.
- Tay phải dùng dẻ có chấm tro hoặc xà bông xát vào 2 mặt của đĩa, các khe ở chân đĩa
và thành đĩa.
- Rửa nước 2 -3 lần.
- Úp nghiêng các đĩa trong giỏ nhựa cho thật khô.
* Các dụng cụ thủy tinh khác: phễu, chai lọ, bình cầu, bình tam giác.
- Dùng giẻ với nước xà bông cọ rửa phần ngoại dụng cụ.

- Dùng nước xà bông đặc lắc kĩ để rửa phần trong dụng cụ.
- Rửa nước nhiều lần cho sạch và để ráo.
* Nút ống cao su:
- Phân loại các dụng cụ này theo kích thước to, nhỏ, tốt, xấu, sạch hay bẩn.
- Ngâm từng loại riêng vào nước ấm ( 50 – 800C) trong 3- 4 h.
- Cọ rửa kĩ trong nước xà bông.
- Rửa nước lã nhiều lần.
- Phơi nắng 2 -3h rồi cất đi dùng dần.
2.1.1.2 Bao gói dụng cụ
1. Nguyên tắc
- Dụng cụ được bao gói phải đảm bảo sạch và khô.
- Việc bao gói phải thật kín và cẩn thận để dụng cụ sau khi khử trùng vẫn đảm bảo sự
vô trùng trong lớp giấy gói và lấy ra sử dụng dễ dàng.
9


Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường
2. Phương pháp bao gói dụng cụ
Việc bao gói dụng cụ gồm 2 khâu:
- Làm nút bông : cho các ống nghiệm, bình tam giác, pipet, que gạt.
- Bao gói: cho hầu hết các dụng cụ thủy tinh.
2.1.1.3. Khử trùng dụng cụ
1. Nguyên tắc
- Sau khi khử trùng cần đảm bảo:
+ Sự vô trùng tuyệt đối cho các vật phẩm và các dụng cụ.
+ Không làm thay đổi chất lượng mẫu vật.
2. Các phương pháp khử trùng
Khi khử trùng bằng nhiệt, các tế bào sinh dưỡng của vi sinh vật có thể bị tiêu diệt dễ
dàng trong các bào tử vẫn còn tồn tại ở ngay nhiệt độ đó.
Khả năng chịu nhiệt của vi sinh vật phụ thuộc vào:

- Tính chất môi trường
- Số lượng tế bào
- Độ pH của vật định khử trùng.
Do vậy, để khử trùng bằng nhiệt có hiệu quả cần xác định ngưỡng nhiệt độ thấp nhất
và khoảng thời gian ngắn nhất cần thiết để tiêu diệt toàn bộ vi sinh vật và các bào tử
của chúng có trong dụng cụ khử trùng.
2.1.2 Chuẩn bị môi trường để nuôi cấy vi sinh vật
2.1.2.1 Môi trường dinh dưỡng
1. Khái niệm
- Các chất dinh dưỡng là những hợp chất tham gia vào quá trình trao đổi chất nội bào.
- Môi trường dinh dưỡng là hỗn hợp gồm các chất dinh dưỡng và các chất có nhiệm vụ
duy trì thế oxy hóa khử, áp suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định độ pH của môi
trường.
2. Các yêu cầu cơ bản của môi trường dinh dưỡng
- Có đủ các chất dinh dưỡng cần thiết.
- Có độ pH thích hợp.
- Có độ nhớt nhất định.
- Không chứa các yếu tố độc hại.
- Hoàn toàn vô trùng.
10


Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường
3. Phân loại môi trường dinh dưỡng
Người ta dựa trên cơ sở khác nhau để phân loại môi trường.
a) Căn cứ theo thành phần và nguồn gốc: Có 3 loại môi trường là:
- Môi trường tự nhiên: Có thành phần môi trường là các sản phẩm tự nhiên như sữa,
trứng, khoai tây, dịch chiết nấm men, đường, cám. Thành phần hóa học của loại môi
trường này không được xác định chính xác do tính chất không ổn định của sản phẩm
tự nhiên.

- Môi trường tổng hợp: Là môi trường gồm các chất hóa học mà thành phần của chúng
được xác định và định lượng một cách cụ thể và chính xác.
- Môi trường bán tổng hợp:Là môi trường mà thành phần gồm cả hóa chất lẫn các chất
hữu cơ tự nhiên.
b) Căn cứ vào tính chất lý học: Có thể chia môi trường thành 3 loại.
- Môi trường lỏng ( dịch thể):
Thành phần môi trường này không chứa thạch và thường được dùng để nghiên cứu
quá trình vi tổng hợp của vi sinh vật.
- Môi trường đặc:
Trong thành phần môi trường này chứa 1,5 -2% agar hoặc 10 -20% gelatin và dùng để
nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lí của vi sinh vật.
- Môi trường bán lỏng:
Môi trường này chứa 0,35 – 0,7% agar.
c) Căn cứ vào công dụng : Có thể gồm các loại môi trường sau:
- Môi trường cơ bản: Thích hợp cho nhiều vi sinh vật khác nhau:
- Môi trường chọn lọc: Là môi trường đảm bảo cho sự phát triển ưu thế của 1 loài hay
một nhóm vi sinh vật xác định nào đó.
- Môi trường kiểm định: Là môi trường cho phép phân biệt được một số đặc điểm của
một số loại vi khuẩn cần xác định. Thông thường người ta dùng chất chỉ thị màu hay
một số hóa chất để tạo ra những phản ứng màu đặc trưng.
Ví dụ: Môi trường kiểm định kháng sinh, môi trường lên men các loại đường.
4. Phương pháp làm môi trường
Làm môi trường để thực hiện được việc phân lập, nhân giống, giữ giống vi sinh vật,
đồng thời để nuôi cấy và nghiên cứu các đặc điểm sinh học của chúng.
a) Nguyên tắc của việc chế tạo môi trường:
11


Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường
- Dựa trên cơ sở nhu cầu về các chất dinh dưỡng và khả năng đồng hóa các chất dinh

dưỡng của từng loại vi sinh vật.
- Để đảm bảo sự cân bằng về áp suất thẩm thấu giữa môi trường và tế bào vi sinh vật
nên cần điều chỉnh tỉ lệ và nồng độ các chát trong thành phần môi trường.
- Đảm bảo các điều kiện hóa lí cần thiết cho các hoạt động trao đổi chất của vi sinh
vật.
b) Các bước chế tạo môi trường dinh dưỡng:
- Pha chế:
Cân, đong thật chính xác từng thành phần môi trường và pha chế theo đúng trình tự
+ Môi trường lỏng: Cân, đong các chất rồi hòa tan vào nước .
+ Môi trường đặc:
 Cân agar rồi ngâm vào nước.
 Cân hóa chất rồi hòa tan trong nước.
 Vớt agar ra, vắt khô, bỏ vào xoong môi trường để đun.
- Làm trong môi trường:
Việc làm trong môi trường sẽ giúp dễ dàng quan sát sự phát triển của vi sinh vật, bao
gồm các bước sau:
+ Cách 1 : Lọc bằng bông, vải thưa hay giấy lọc
+ Cách 2: Lọc bằng lòng trắng trứng gà.
Cứ 1 lít môi trường dùng lòng trắng trứng gà.Lấy lòng trắng trứng + lượng nước
bằng lượng lòng trắng đánh tan cho sủi bọt. Đỗ hỗn hợp dịch trứng và nước trên vào
môi trường.Trộn đều, đun sôi 10- 15 phút.Để lắng rồi mới lọc.
- Điều chỉnh độ pH của môi trường:
+ Người ta dùng HCl 10% hay NaCl 10%. Ngoài ra có thể dùng một số hóa chất khác
như H3PO4, H2SO4, KOH, NaHCO3, Na2CO3….
+ Sử dụng máy đo pH, và giấy quỳ để kiểm tra độ pH.
- Phân phối môi trường vào dụng cụ:
Người ta thường phân phối môi trường vào ống nghiệm, đĩa petri, bình tam giác. Trình
tự phân bố như sau:
+ Môi trường cần được đun cho hóa lỏng rồi đổ qua phễu thủy tinh vào các dụng cụ.
+ Tay trái giữ dụng cụ chứa môi trường.

+ Tay phải kẹp nút bông và kéo ra.
12


Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường
+ Nhanh tay rót môi trường vào dụng cụ và đậy nút bông lại.
+ Chú ý:
 Đối với ống nghiệm: Nếu dùng môi trường làm thạch nghiêng thì lượng môi
trường phân phối chiếm ¼ thể tích của ống nghiệm. Nếu làm thạch đứng thì
lượng môi trường cần được phân phối từ ½ - 1/3 thể tích ống nghiệm.
 Đối với bình cầu hay bình tam giác, lượng môi trường được phân phối chiếm ½ 2/3 thể tích của bình.
 Các thao tác phân phối phải nhanh, gọn, khéo léo để môi trường không dính lên
miệng dụng cụ hoặc các nút bông và việc phân phối cần thực hiện xong trước
khi môi trường bị đông đặc.
- Khử trùng môi trường:
Tùy theo tính chất và điều kiện cụ thể của từng loại môi trường mà có chế độ và
phương pháp khử trùng khác nhau.
Các phương pháp khử trùng thường sử dụng là: phương pháp Pasteur, phương pháp
Tyndal, phương pháp lọc bằng dụng cụ lọc vi khuẩn và phương pháp hấp hơi nước bão
hòa ở áp suất cao.
 Đối với các dụng cụ chịu nhiệt ( sứ, vải, thủy tinh) khử trùng ở 1,5 atm / 20 phút
-30 phút.
 Đối với dụng cụ chứa 1l môi trường trở lên thì hấp ở 1atm/30 phút.
 Với các loại môi trường chứa đường dễ bị biến chất ở nhiệt độ cao thì hấp khử
trùng ở 0,5 – 0,6 atm/15 phút.
- Làm thạch nghiêng, thách đứng, đổ thạch vào đĩa Pêtri:
+ Làm thạch nghiêng: Cần tiến hành ngay sau khi khử trùng môi trường vừa kết
thúc và môi trường chưa đông đặc.
 Đặt ống nghiệm có môi trường lên giá đặt nghiêng, nhưng không được để môi
trường chạm vào nút bông.

 Để yên cho đến khi mặt thạch đông đặc, yêu cầu mặt thạch phải thẳng, nhẵn liên
tục.
+ Làm thạch đứng: Đặt các ống nghiệm đã có môi trường làm thạch đứng vào giá,
để yên cho đến khi môi trường nguội và đông đặc.
+ Đổ thạch vào đĩa pêtri:
13


Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường
Toàn bộ quy trình đỗ thạch vào đĩa pêtri đều thực hiện trong tủ cấy vô trùng và
gồm các thao tác sau:
 Mở bao giấy gói các đĩa pêtri.
 Tay phải cầm dụng cụ (bình tam giác) chứa môi trường.
 Tay trái lấy nút bông ra và hơ miệng bình trên ngọn đèn cồn.
 Nghiêng bình và rót nhẹ một chút môi trường vào đĩa pêtri sau khi tay trái mở hé
nắp trên của đĩa.
 Đậy nắp trên lại, xoay tròn đĩa pêtri để môi trường được phân phối đều trên mặt
đĩa.
 Để yên cho môi trường nguội và đông đặc
 Lật ngược cho đáy dưới của đĩa pêtri lên trên để hơi nước bốc ra và khô dần đi.
+ Chú ý:
 Thao tác đổ thạch phải hết sức khẩn trương và khéo léo để hạn chế sự nhiễm bẩn.
 Mặt thạch phải thẳng, nhẵn có độ dày khoảng 2mm. Thông thường cứ ¼ lit môi
trường có thể phân phối được 22 – 25 đĩa pêtri.
 Sau khi đổ môi trường vào đĩa pêtri, 1 - 2 ngày sau khi kiểm tra lại xem môi
trường có bị nhiễm khuẩn không rồi mới sử dụng để cấy hay phân lập.
 Nhớ viết vào nhãn: Tên môi trường …
Khử trùng: ngày … tháng … năm
 Để vào nơi cất giữ môi trường để tiện cho việc theo dõi, sử dụng và bảo quản.
- Bảo quản và kiểm tra môi trường:

+ Môi trường chưa dùng cần được bảo quản ở chỗ mát, hạn chế tác dụng của ánh
sáng, nhiệt độ từ 0 – 5oC và không để môi trường bị khô.
+ Trước khi sử dụng, để kiểm tra độ vô khuẩn của môi trường, người ta thường đặt
chúng vào tủ ẩm 37oC, trong 48 – 72 giờ. Sau đó lấy ra quan sát, loại bỏ các ống có
vi sinh vật phát triển và chỉ sử dụng những ống nghiệm, những đĩa pêtri có môi
trường đạt yêu cầu.
2.1.2.2. Công thức và cách chế tạo một số môi trường thông dụng
1. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn
a) Môi trường nước thịt – pepton
- Công thức:
14


Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường
Nước chiết thịt :
Pepton

10g

NaCl

5g

1000ml

- Cách chế tạo nước thịt:
+ Thịt bò tươi lọc sạch gân, mỡ, đem xay hoặc thái nhỏ. Cứ 500g thịt thêm 1000 ml
nước.
+ Đun nóng từ từ giữ ở 50oC trong vòng 1 giờ, sau đó đun sôi 30 phút.
+ Để nguội và lắng trong dung dịch.

+ Lọc bằng vải hay giấy lọc.
+ Phân phối môi trường vào các dụng cụ để khử trùng.
b) Môi trường nước mắm – peptôn:
- Công thức :
Nước mắm 350 đạm 30 ml
Pepton

10 g

Nước cất bổ sung đến 1000ml
pH = 7, khử trùng 1 atm/ 30 phút.
- Cách chế tạo hỗn dịch ( thạch + nước thịt + peptôn)
+ Cho 10 g peptôn vào nước thịt.
+ Thạch cân xong, ngâm nước, rữa kĩ, để ráo.
+ Cho thạch vào dung dịch nước thịt – peptôn.
+ Đun sôi cho tan và để nguội 450C.
+ Điều chỉnh độ pH rồi mới lọc.
2. Môi trường nuôi cấy nấm men.
a) Môi trường khoai tây – đường cám:
Khoai tây

300g

Cám

100g

Đường kính
Nước

50 g
1000ml

- Cách chế tạo:
+ Khoai tây gọt vỏ, rửa, cân 300g, thái nhỏ hạt lựu. Thêm 500 ml nước rồi đun sôi
30 phút.
+ Lọc lấy nước trong.
15


Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường
+ Cân 100g cám đun sôi với 500 ml nước trong 30 phút rồi lọc trong.
+ Trộn 2 dịch lọc trên với nhau và thêm 50 g đường.
+ Bổ sung nước cho đủ 1000ml.
+ Nếu làm môi trường đặc thêm 20 g cám.
Chú ý: cũng có thể không dùng cám.
b) Môi trường giá đậu - đường:
Cân 100 g giá đậu: Thêm 100 ml nước. Đun sôi 30 phút. Lọc lấy dịch trong. Bổ
sung nước cho đủ 1000ml và thêm 50 g đường. Nếu làm môi trường đặc thì thêm
20 g thạch. Phân phối môi trường rồi khử trùng.
3. Môi trường nuôi cấy nấm mốc
a) Môi trường peptôn – glucoza:
Có thể dùng môi trường này để kiểm tra số lượng tế bào nấm mốc ở trong đất.
Glucôza

10g

Peptôn

5g

K2HPO4

1g

MgSO4. 7H2O 0,5 g
Nước cất

1000 ml

Thạch ( agar)

20 g

pH = 4, sau khi khử trùng.
b) Môi trường cơm rượu:
Cơm

10g

Axit lactic (1%) 40 ml
Nước cất

15 ml

Rượu (500)

12,5 ml.

- Cách chế tạo:

+ Cho cơm, axit lactic, nước cất vào bình tam giác.
+ Khử trùng ở 1 atm /15 phút.
+ Lấy ra để nguội mới cho rượu vào.
2.2 Nuôi cấy vi sinh vật
2.2.1 Phương pháp phân lập vi sinh vật
1. Nguyên tắc:
- Tách rời các tế bào vi sinh vật.
16


Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường
- Nuôi cấy các tế bào trên trong môi truờng dinh dưỡng đặc trưng để cho khuẩn lạc
riêng rẽ, cách biệt nhau.
2. Qúa trình phân lập vi sinh vật ở dạng thuần khiết
Với hầu hết các mẫu nghiên cứu, quá trình phân lập vi sinh vật ở dạng thuần khiết
bao gồm các bước sau:
- Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật ban đầu.
- Phân lập vi sinh vật thuần khiết.
- Kiểm tra độ tinh khiết của các khuẩn lạc.
a) Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẻ trên các môi trường phân lập:
- Nếu mẫu ban đầu ở dạng đặc phải đưa về dạng lỏng bằng cách
+ Nghiền mẫu
+ Hòa tan mẫu trong nước cất vô trùng.
Sau thực hiện như dạng mẫu lỏng.
+ Tiếp tục pha loãng ở nồng độ cần thiết.
+ Cấy mẫu trên môi trường đặc trưng của nó.
- Chú ý: Nếu không có môi trường đặc trưng có thể sử dụng môi trường mà vi sinh vật
cần phân lập phát triển bình thưòng ( có thể bổ sung các chất ức chế các loại vi sinh
vật khác).
b) Phân lập các vi sinh vật trên môi trường đặc ở đĩa petri

- Đối với vi sinh vật hiếu khí.
+ Hút 0,1 ml dịch mẫu đã pha loãng cho vào đĩa pêtri có môi trường thích hợp .
+ Dùng que gạt thủy tinh phân phối dịch mẫu trải đều khắp mặt thạch.
+ Tiếp tục sử dụng que gạt này gạt mẫu cho đều khắp mặt thạch đĩa pêtri thứ 2 rồi dĩa
thứ 3.
+ Đặt các đĩa pêtri 1, 2,3 trên vào các tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp, sau một thời gian
nhất định tùy vào giống vi sinh vật ta sẽ có được các khuẩn lạc riêng rẽ từ các đĩa thứ
2 và 3
- Đối với vi sinh vật kị khí.
+ Dùng môi trường đặc trong ống nghiệm đem chưng cách thủy để loại bỏ không khí
trong môi trường.
+ Để nguội môi trường còn 450 – 500C.

17


Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường
+ Hút 0,1 ml dịch nghiên cứu cho vào ống môi trường, đậy nút lại , lắc tròn quanh trục
ống nghiệm.
+ Rót nhanh môi trường ở ống nghiệm vào nắp dưới của đĩa pêtri và đậy thật nhanh
nắp trên lại, sao cho giữa mặt nắp và môi trường không còn không khí.
+ Dùng parafin hàn kín phần tiếp xúc giữa 2 nắp của đĩa pêtri và ủ ở nhiệt độ thích
hợp.
+ Sau khi vi sinh vật phát triển, chọn các khuẩn lạc riêng rẽ trong khối môi trường,
dùng que cấy cắt cả khối môi trường rồi cấy vào môi trường lỏng thích hợp.
c) Kiểm tra độ tinh khiết của giống mới phân lập:
Có nhiều cách kiểm tra:
- Kiểm tra vết cấy:
Quan sát sự sinh trưởng của vi sinh vật qua vết cấy trên môi trườg đặc.
+ Nếu vết cấy có bề mặt và màu sắc đồng đều, thuần nhất chứng tỏ giống mới phân lập

tinh khiết thì giữ lại.
+ Nếu vết cấy không thuần nhất thì loại bỏ.
- Kiểm tra lại độ thuầm khiết của các khuẩn lạc:
+ Chọn các khuẩn lạc riêng rẽ trên môi trường thạch nghiêng.
+ Tách các khuẩn lạc này ra và hòa tan, pha loãng ở nồng độ cần thiết trong nước cất
vô trùng.
+ Nhỏ một giọt dịch trên vào đĩa pêtri có môi trường.
+ Dùng 1 que gạt phân phối giọt dịch đều khắp mặt thạch đĩa pêtri thứ nhất, rồi đĩa thứ
2, thứ 3.
+ Đặt các đĩa pêtri trên vào tủ ấm với nhiệt độ và thời gian thích hợp tùy loại vi sinh
vật.
+ Sau lấy ra quan sát các khuẩn lạc riêng rẽ. Sự thuần khiết của khuẩn lạc là biểu hiện
thuần khiết của giống.
3) Phân lập một số giống vi sinh vật trong thực tế
a) Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis:
- Cỏ khô cắt nhỏ, cho vào 1 bình tam giác
- Bổ sung thêm : + Một chút phân
+ Nước sạch đổ ngập cỏ.
- Đun sôi 15 phút để diệt các tế bào sinh dưỡng và các tế bào kháng sinh bào tử.
18


Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường
- Đậy nút bông, để tủ ấm ở nhiệt độ 25- 260C trong 48- 72 h.
- Kết quả:
Xuất hiện các lớp váng xám có nhiều vi khuẩn Bacillus subtilis vì cỏ khô bao giờ cũng
có bào tử của vi khuẩn này.
+ Trên kính hiển vi: Tế bào Bacillus subtilis có hình que, dài, bào tử hình ôvan nằm ở
xa tâm hay gần tâm khuẩn lạc. Tế bào có kích thước ( 3 -5 x0,6) m.

b) Phân lập nấm mốc Aspergillus oryzae, Aspergillus niger và Mucor
- Có thể phân lập nấm mốc này trên cơm nguội, xôi làm mốc tương, bánh mì để khô ít
ngày.
19


Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường
- Thông qua màu sắc của mốc để nhận diện.
+ Mốc có màu trắng: Có thể là Mucor hay Rhizopus.
+ Mốc có màu đen là Aspergillus niger
+ Mốc có màu xanh lục là Penicilium italicum
Loại mốc này thường có trên vỏ cam, chanh để lâu ngày
- Dùng que cấy đầu hình thước thợ lấy 1 ít sợi nấm cấy vào môi trường thạch nghiêng
thích hợp (Czapek)
c) Thu nhận nấm men :
- Có thể phân lập nấm men dễ dàng từ các môi trường như :
+ Bề mặt trái cây và dịch ép một số trái cây như táo, lê, nho, dâu, mơ, dứa…
+ Trong rượu nếp, trong các bánh men rượu, trong bia, trong nước mía để vài hôm,
trong hạt kiphia.
- Nấm men này khi quan sát trên kính hiển vi thường có dạng hình cầu hay hình trứng.
Tế bào có kích thước lớn, có khả năng nảy chồi, khuẩn lạc có màu trắng sữa
- Chọn các khuẩn lạc nấm men riêng rẽ và cấy vào môi trường thích hợp ( môi trường
khoai tây - đường cám )

Mốc Aspergillus niger
2.2.2 Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật
1. Khái niệm
Qúa trình nuôi cấy bao gồm 2 công đoạn nuôi và cấy
- Nuôi là quá trình đảm bảo và duy trì những điều kiện thuận lợi nhất cho sự hoạt động
và phát triển của vi sinh vật.

20


Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường
- Cấy : là những thao tác chuyển vi sinh vật từ môi trường đang sống sang môi trường
thuận lợi hơn cho sự phát triển của chúng.
Hai khâu này luôn gắn bó với nhau, không thể tách rời nhau trong quá trình nghên cứu
và ứng dụng vi sinh vật.
2. Mục đích của việc nuôi cấy
- Phát hiện sự có mặt của vi sinh vật trong các nguyên liệu, vật phẩm cần nghiên cưú.
- Tiến hành nhân giống vi sinh vật một cách nhanh chóng
- Bảo tồn các giống thuần khiết.
- Nghiên cứu các đặc tính sinh học và hệ thống sinh trưởng của chúng.
3. Nguyên tắc
- Mọi thao tác nuôi cấy đều phải thực hiện trong điều kiện vô trùng để tránh tạp nhiễm.
- Môi trường và dụng cụ nuôi cấy phải được khử trùng triệt để.
- Duy trì tốt các điều kiện nuôi cấy để vi sinh vật phát triển.
4. Các phương pháp nuôi cấy
a) Phương pháp chung của việc cấy chuyền ( lấy việc cấy truyền từ ống nghiệm chứa
giống sang ống nghiệm chứa môi trường làm ví dụ) : gồm các thao tác chính sau :
- Dán nhãn ghi :Tên giống vi sinh vật, ngày cấy) vào thành ống nghiệm, dưới nút
bông một chút.
- Tay trái cầm 2 ống nghiệm : 1 ống giống và 1 ống môi trường
- Tay phải cầm que cấy và khử trùng trên ngọn đèn cồn cho đến khi nóng đỏ dây cấy
- Dùng ngón út và ngón áp út kẹp nút bông vào lòng bàn tay xoay nhẹ, kéo nút ống
giống ra
- Hơ nóng để khử trùng không khí ở miệng 2 ống nghiệm
- Đợi khi que cấy vừa nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với khuẩn lạc trong ống
giống.
- Rút que cấy ra, không để que cấy chạm vào thành ống nghiệm và đưa vào ống môi

trưòng để thực hiện các thao tác cấy truyền.
- Khử trùng lại phần không khí nơi miệng 2 ống nghiệm rồi đậy nút bông
- Khử trùng lại que cấy sau khi đã sử dụng xong.
- Chú ý :
+ Nêú ống giống là canh trường lỏng có vi sinh vật thì dùng pipet hút canh trường thay
que cấy.
21


Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường
+Thao tác khử trùng ống hút bắt đầu thực hiện ở đầu nhỏ ống hút sau khi tháo giấy bao
gói.
+ Sử dụng xong cắm ống hút vào dung dịch cromic để khử trùng.
b) Phương pháp nuôi cấy trên thạch nghiêng :
Phương pháp này dùng để cấy truyền các vi sinh vật hiếu khí.
- Sử dụng que cấy đầu tròn tiến hành các thao tác theo đúng trình tự nói trên
- Thực hiện việc cấy giống vào ống thạch nghiêng bằng các thao tác tiếp theo :
+ Hòa giống ở đầu que cấy vào giọt nước ở đáy ống nghiệm
+ Nhẹ nhàng lướt que cấy trên mặt thạch theo các kiểu
 Hình chữ chi
 Hình vòng xoắn
 Hình vạch song song
c) Phương pháp cấy trên thạch đứng : Phương pháp này dùng để cấy các vi sinh vật kị
khí.
- Sử dụng que cấy hình kim
- Sau khi lấy giống vi sinh vật, dùng que cấy này đâm sâu vào phần khối thạch hình trụ
- Đâm sát đáy ống nghiệm và đâm thành 3 đường : 1 đường chính giữa, 2 đường sát
thành ống tùy theo yêu cầu.
- Đường cấy phải thẳng, nhẹ nhàng để không gãy nứt, vỡ môi trường.
d) Phương pháp cấy trên đĩa pêtri :

Có thể cấy trên đĩa pêtri theo một trong hai cách sau :
* Dùng que cấy đầu tròn và thực hiện theo trình tự sau :
- Để đĩa pêtri lên bàn.
- Dùng que cấy lấy canh trường vi sinh vật theo thứ tự và yêu cầu ở phương pháp
chung
- Tay trái hé mở nắp đĩa pêtri vừa đủ để cho que cấy vào.
- Nhẹ nhàng và nhanh chóng lướt que cấy lên mặt thạch theo một trong các kiểu sau :
+ Theo hình chữ chi trên toàn bộ mặt thạch
+ Theo những đường song song
+ Theo 4 hình chữ chi 4 góc.
* Dùng pipet : Thường áp dụng để định lượng vi sinh vật và cấy lượng khá nhiều
giống. Có 2 cách ;
22


Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường
- Cách 1 :
+ Trộn dịch cấy vào thạch bằng cách hút 0,1 ml dịch nghiên cứu cho vào ống nghiệm
có môi trường thạch ở nhiệt độ 500C.
+ Đậy nút bông lại, lắc nhẹ cho vi sinh vật phân phối đều trong môi trường.
+ Đổ thạch này vào đĩa pêtri đã khử trùng.
+ Xoay tròn đĩa pêtri cho thạch dàn đều ở đáy hộp.
+ Để yên cho thạch đông đặc lại và đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp.
- Cách 2 :
+ Hút 0,1 ml dịch cấy, nhỏ vào đĩa pêtri có môi trường đặc.
+ Dùng que gạt phân phối giọt dịch đều khắp mặt thạch đĩa.
+ Cất vào tủ ấm với nhiệt độ và thời gian thích hợp tùy loài vi sinh vật.
e) Các điều kiện nuôi của vi sinh vật :
Để bảo đảm sự phát triển của vi sinh vật, sau khi cấy xong phải quan tâm đến các điều
kiện nuôi dưỡng chúng . Các điều kiện đó bao gồm

* Nhiệt độ : Tùy loại vi sinh vật khác nhau, chọn nhiệt độ tối thích cho sự phát triển
của chúng và duy trì sự ổn định nhiệt độ đó.
* Độ ẩm : Để duy trì độ ẩm trong quá trình nuôi cần :
- Đảm bảo đủ lượng nước khi làm môi trường.
- Trong điều kiện cần thiết có thể phun nước vô khuẩn vào phòng nuôi hoặc để nước
bốc hơi trong tủ ấm.
* Ôxi :
- Đối với vi sinh vật hiếu khí :
+ Cung cấp thường xuyên và đầy đủ O2
+ Lớp môi trường nuôi cấy có độ dày vừa phải.
+ Các bình chứa môi trường được lắc thường xuyên trong quá trình nuôi để cung cấp
thêm ôxi cho vi sinh vật.
+ Nếu nuôi cấy trong môi trường có khối lượng lớn vừa phải tiến hành sục khí thường
xuyên hay định kỳ.
- Đối với vi sinh vật kị khí :
+ Hạn chế sự tiếp xúc với ôxi bằng cách :
Đổ lên bề mặt môi trường parafin, dầu vazơlin
Cấy trích sâu vào môi trường đặc.
23


Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường
Nuôi cấy trong bình hút chân không.
Nuôi cấy trong môi trường ống nghiệm đặc biệt sau khi rút hết không khí và hàn
kín lại
Đun sôi môi trường một thời gian để loại hết O 2. Để nguội 450C. Dùng ống hút
cấy vi sinh vật vào đáy ống nghiệm. Làm nguội thật nhanh rồi đổ vazơlin lên
bề mặt để hạn chế sự tiếp xúc với O2.
g) Kết quả của việc nuôi cấy :
Sau khi nuôi ở thời gian và nhiệt độ thích hợp cho mỗi loại vi sinh vật ta thấy :

- Trong môi trường lỏng : Vi khuẩn phát triển sẽ làm đục môi trường.
_ Trong môi trường đặc ở thạch nghiêng :
+ Nấm men, vi khuẩn phát triển sẽ tạo nên vệt nổi trên mặt thạch trong hay trắng đục.
+ Nấm mốc sẽ tạo nên những sợi mảnh từ vết cấy.
- Trong môi trường thạch đứng : Các vi khuẩn kị khí phát triển đáy của cột môi trường.

24


Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường

CHƯƠNG 3
LẤY MẪU VÀ PHÂN TÍCH VI SINH VẬT
3.1 Phương pháp lấy mẫu để phân tích vi sinh vật
3.1.1. Xác định số lượng mẫu và dụng cụ để lấy mẫu
+ Xác định số lượng mẫu cần lấy:
- Phụ thuộc vào mục tiêu, nội dung nghiên cứu mà định ra yêu cầu số lượng và vị trí
lấy mẫu phải đại diện.
- Phụ thuộc vào điều kiện cụ thể ngoài thực địa, hay khu vực cần lấy mẫu phân tích
Điều quan trọng nhất người lấy mẫu phải thực hiện là lấy mẫu sao cho đồng nhất và
phải đại diện được khu vực, khoanh đất hay cơ chất cho khu đó, vùng đó.
Ví dụ : số lượng tương ứng các mẫu cơ chất trong các đống phế thải, rác thải…. được
lấy từ khu vực đã điều tra và được trộn lẫn để tạo thành một mẫu đại diện.
+ Các vật liệu cần chuẩn bị để lấy mẫu
- Dụng cụ lấy mẫu ( dao, kéo, lõi trụ, mai thuồng…)
- Cồn, bông vô trùng
- Xô đựng
- Túi đựng mẫu
- Thùng làm lạnh
+ Mẫu đại diện

Các mẫu ngẫu nhiên có thể chỉ để trộn đều nếu chúng được lấy từ một khu vực đồng
nhất và đại diện.
Ví dụ : Nếu lấy mẫu đất để phân tích VSV đất ( cần dựa vào yêu cầu của mục tiêu
nghiên cứu, độ chính xác đến đâu, lấy bao nhiêu mẫu, diện tích rộng hẹp của từng
khoanh đất…)
- Diện tích
- Địa hình
- Độ sâu theo tầng phẫu diện đất
- Loại hình sử dụng đất
- Cây trồng
- Điều kiện độ ẩm

25