BÁO cáo THỰC HÀNH hóa SINH

1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG – THỰC PHẨM
Lớp 12DSH02

BÁO CÁO
THỰC HÀNH HÓA SINH

GVHD: Nguyễn Thị Hai
Sinh viên: Trương Thị Thảo

MSSV:1211100186

Ngô Lê Hồng Duyên

MSSV: 1211100062

Cao Thị Nhâm

MSSV:1211100142

Đoàn Ngọc Kiểng

MSSV:1211100293

Võ Nguyễn Anh Thư

MSSV:1211100192

Phan Thị Thúy Vy

MSSV: 1211100283


2

BÀI 1: GIỚI THIỆU PHÒNG THÍ HÓA SINH, CÁCH PHA
CHẾ CÁC DUNG DỊCH DÙNG TRONG PHÒNG THÍ
NGHIỆM HÓA SINH

Lý thuyết
Quy tắc làm việc trong phòng thí nghiệm hóa sinh

I.

a. An toàn khi làm việc với axit và kiềm
 An toàn khi làm việc với axit
-

Phải làm việc trong tủ hút bất cứ khi nào đun nóng axit hoặc thực hiện phản ứng

với các axit tự do
-

Khi pha loãng luôn phải cho axit vào nước .

 An toàn khi làm việc với kiềm
-

Kiềm có thể làm cháy da

-

Mang găng tay , khẩu trang khi làm việc với dung dịch kiềm

-

Thao tác trong tủ hút, mang mặc nạ chống độc để phòng ngừa bụi và hơi kiềm

b. Quy tắc làm việc với hóa chất thí nghiệm
 Hóa chất thí nghiệm:
-

Các hóa chất dùng để phân tích, làm tiêu bản, tiến hành phản ứng, trong phòng thí

nghiệm được gọi là hóa chất thí nghiệm.
 Nhãn hiệu hóa chất :
-

Hóa chất được bảo quản trong chai lọ, thủy tinh hoặc nhựa đóng kín có nhãn ghi

tên hóa chất, công thức hóa hoc, mức độ sạch, tạp chất, khối lượng tịnh, khối lượng phân
tử, nơi sản xuất , điều kiện bảo quản.
 Cách sử dụng và bảo quản hóa chất:
-

Khi làm việc với hóa chất , nhân viên phòng thí nghiệm cũng như sinh viên cần hết

sức cẩn thận tráng gậy những tai nạn đáng tiếc cho mình cũng như cho người khác.

3

-

Bao giờ cũng đổ axit hay bazơ vào nước khi pha loãng .

-

Không hút axit hay bazơ bằng miệng mà phải dùng các dụng cụ riệng như: ống bóp

cao su.

II.

Cách pha chế các dung dịch trong thí nghiệm hóa sinh:

 Dung dịch :
-

Dung dịch là hỗn hợp của hai hay nhiều chất tác động tương hổ với nhau về mặt

vật lí và hóa học. Trong dung dịch gồm có chất hòa tan và dung môi .
 Các đơn vị nồng độ dung dịch:
Nồng độ phần trăm, (% )


Nồng độ phần trăm – khối lượng, % (w/w): là số gam chất tan có trong 100g dung

dịch.



Nồng độ trăm khối lượng thể tích (w/v): là số g chất tan có trong 100ml dung dịch.



Nồng độ phần trăm thể tích – thể tích , % (v/v): là số ml dung chất có trong 100ml

dung dịch.


Nồng độ gam – lít, (g/L): là số g chất tan có trong 1 lít dung dịch.



Nồng độ phân tử g hay nồng độ mol, (mol/L): là số phân tử g ( hay số mol) chất tan

trong 1 lít dung dịch.


Nồng độ đương lượng (N); là số đương lượng gam (đlg) chất tan có trong 1 lít

dung dịch.
Số đương lương chất tan = số mol (n) x hệ số đương lượng (z)
-

Hệ số đương lượng (z) : phụ thuộc vào bản chất của chất đó và phản ứng mà chất

đó tham gia.
 Nồng độ dung dịch bão hòa: là nồng độ dung dịch khi tối đa chất hòa tan có

mặt trong dung dịch.
 Đơn vị nồng độ dùng trong các phép phân tích vi lượng :
-

Nồng độ mg/mL : số mg chất tan trong 1mL dung dịch


4

-

Miligam phần trăm , mg% : mg chất tan trong 100g dung dịch

-

Phần nghìn ,0/00 : số gam chất hòa tan trong 1000g dung dịch

-

Phần triệu , ppn : số mg chất hòa tan trong 1kg hay 1 lịt dung dịch

-

Phần tỷ , ppb : sồ µg chất hòa tan có trong 1kg hay 1 lít dung dịch

 Cách pha dung dịch có nồng độ xác định
a. Pha dung dịch có nồng độ theo khối lượng ,% (w/w)
- Chất tan là chất rắn khan
- Chất tan là chất rắn ngậm nước ( CuS04.5H2O..)
Khi pha dung dịch cần phải tính thêm lượng nước kết tinh có sẵn.

b. Pha dung dịch loãng từ một dung dịch đậm đặc hơn
c. Pha dung dịch bão hòa :
Lấy chất tan cần pha vào becher , thêm một ít nước cất và khuấy cho tan . Nếu sau
khi khuấy , chất tan không tan hết lắng xuống thì phần dung dịch phía trên là dung dịch
bão hòa. Nếu chất tan tan hết , thêm chất tan và tiếp tục khuấy , cứ như thế cho đến khi
chất tan không còn tan được nào.
d. Pha dung dịch có nồng độ % theo thể tích :
Chất tan là chất rắn khan

-

Cân lượng chất tan cần thiết , chuyển sang bình định mức , dùng nước cất hòa tan và
định
mức đến thể tích đúng.
-

Chất tan là chất rắn ngậm nước

Khi pha dung dịch ta cần phải tính lượng kết tinh có sẵn giống như phần a
-

Chất tan dạng lỏng : một số chất tan ở dạng lỏng như HCl, H2S04…
Ngày nay đa số các dung dịch thí nghiệm được pha chế theo nồng độ khới lượng- thể

tích (w/v).
i.
-

Pha dung dịch nồng độ phân tử gam:
Chất tan là chất rắn khan :

5

Muốn pha dung dịch nồng độ 1M của một chất nào đó , ta tính khối lượng phân tử chất
đó theo đơn vị gam. Cân chính xác lượng chất tan , qua phễu cho vào bình định mức có
dung tích 1 lít . Cho vào từng lượng nước cất nhỏ , lắc để hòa tan hoàn toàn và đưa nước
cất tới mức . Chuyển dunh dịch sang bình chứa, lác để trộn đều đồng nhất.
Khi phải đun dung dịch để hòa tan, hoặc quá trình hòa tan có tỏa nhiệt thì phải chờ
nhiệt độ trở lại bình thường (nhiệt độ không khí) rồi mới thêm nước tới vạch định mức.
-

Chất tan là chất rắn ngậm nước : khi tính lượng chất tan cần cân phải tính luôn cả

khối lượng các phân tử nước.
-

Chất tan dạng lỏng: nếu chất tan là dung dịch, ta phải tính toán dựa vào nồng độ

dung dịch đó.
 Hiệu chỉnh nồng độ dung dịch.
a. Dung dịch chuẩn.
Dung dịch chuẩn là các dung dịch được chuẩn bị sẵn, đảm bảo chính xác và được
dùng để định chuẩn các dung dịch tự pha chế khi làm thí nghiệm.
 Cách pha dung dịch từ ống chuẩn:
-

Dùng đinh thủy tinh chọc thủng ampun, hứng lên phểu vào bình định mức, dùng

bình tia rửa sạch chất tan có trong ampun vào bình định mức 1 lit, vừa thêm nước cất vừa

lắc và đưa nước cất tới vạch mức.
-

Đối với các hợp chất bền vững, có thành phần không thay đổi như NaCl, AgNO3,

acid oxalic,.. có thể pha dung dịch chuẩn trực tiếp bằng cách cân chính xác chất cần pha,
pha loãng và định mức tới thể tích đúng.
-

Đối với các chất như NaOH, HCl, Na2S2O3,..không thể pha ngay được dung dịch

chuẩn, do các chất này thường không bền vững và dễ thay đổi thành phần, vì vậy sau khi
pha phải hiệu chỉnh lại nồng độ.
b. Phương pháp hiệu chỉnh nồng độ dung dịch


6

Đối với các chất dễ thay đổi thành phần khi ở dạng rắn, nếu muốn pha dung dịch có
nồng độ chính xác, ta pha dung dịch có nồng độ gần đúng, sau đó hiệu chỉnh nồng độ của
dung dịch dựa vào phản ứng với một dung dịch chuẩn thích hợp.
Đối với các dung dịch dễ thay đổi trong quá trình bảo quản, mỗi lần sử dụng lại
phải xác định lại hệ số hiệu chỉnh nồng độ dung dịch
Xét một phản ứng trung hòa acid – base, 1 ion gam H+ sẽ phản ứng với 1 ion gam
OH-. Do đó:
C1V1 =C2V2
Nếu gọi Cp là nồng độ dung dịch định pha và Ct là nồng độ thực của dung dịch ta có
hệ số hiệu chỉnh K:
K = Cp/Ct = Vp/Vt

III.

Dung dịch đệm

a. Định nghĩa dung dịch đệm
Dung dịch đệm là dung dịch có pH không thay đổi nhiều lắm khi 1 lượng axit (H+ )
hoặc bazơ (OH-) . Vậy, dung dịch đệm gồm 1 cặp axit bazơ liên hợp ( axit yếu và muối
của axit yếu này hoặc bazơ yếu và muối của bazơ này) và tỉ lệ của chúng sẽ quyết định
pH dung dịch.
Trong cơ thể sống, dung dịch đệm đóng vai trò quan trọng ví dụ như ổn định pH
của máu bằng các hệ đệm cacbonat và phosphat.
b. Cách pha một số dung dịch đệm thường dùng
-

Dung dịch đệm borat
Dung dịch đệm citrate (pH = 3,0 – 3,6)
Dung dịch đệm phosphate( pH = 5,7 – 8,0)
Dung dịch đệm Na2HPO4 – KH2PO4 (Ph = 5,0 – 8,0)
Dung dịch đệm glycine – HCl (pH = 2,2 – 3,6)
Dung dịch đệm Glycine – NaOH (pH = 8,6 – 10,6)
Dung dịch đệm axetat (pH = 3,6 – 5,6)
Dung dịch đệm vạn năng 0.1 M


7

CÂU HỎI ÔN TẬP
Câu 1:
Pha 1L dung dịch NaOH 40% (w/v): cân X=(40x1000)/100=400(g) NaOH khô.
Câu 2:

Nồng độ mol của H2SO4 đđ là:
CM = (10.d.C%)/M = (10x97x1.84)/98 = 18.2 (mol)
Thể tích H2SO4 cần sử dụng là:
VH2SO4 = (VH2SO4 2M. CMH2SO4)/CMH2SO4 đđ = (2x500)/18.2 = 54.91(ml)
Lượng nước cần bổ sung là: 500 – 54.91 = 445.09 (ml)
Câu 3:
Pha 250ml dung dịch CuSO4 1M, cân m = n.M = 0.25 x 250 = 62.5 (g)
CuSO4.5H2O
Câu 4:H2SO4 2M = H2SO4 4N
C1.V1 = C2.V2  V2 = (1000 x 0.1)/4 = 25 (ml)
Câu 5:
-

Lượng NaOH cần để pha dung dịch 10% là: X= ( 10x500)/100 = 50 (g)

-

Lượng dung dịch NaOH 40% cần dùng là: Y = (100x50)/40 = 125 (g)

-

Lượng nước cất thêm vào: 500 – 125 = 375 (g)

Câu 6:
-

Lượng HCl cần để pha dung dịch 2% là: X = (2x500)/100 =10 (g)

-

Lượng dung dịch HCl 37% cần dùng là: Y = (100 * 10)/37 = 27.03 (g)
=> 27.03 /1.19 = 22.71 (ml)

-

Lượng nước cất thêm vào : 500 – 22.71 = 477.29 (ml)


8

BÀI 2 : ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ BẰNG PHƯƠNG
PHÁP ACID DINITRO-SALICYLIC (DNS)
LÝ THUYẾT

 Nguyên tắc
Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử
acid dinitrosalicylic (DNS) .Cường độ màu của hỗn hợp phản tỉ lệ thuận với nồng độ
đường khử trong một phạm vi nhất định.

THỰC HÀNH
I.

Dụng cụ -Hóa chất:

1. Dụng cụ
-

Máy đo màu

-

Cuvette d = 1 cm, V = 4ml

-

Ống nghiệm có nắp và các dụng cụ thủy tinh khác

-

Bếp điện

2. Hóa chất
-

Mẫu rau quả chứa đường (dứa)

-

-Thuốc thử DNS

-

-Dung dịch glucose chuẩn 1mg/ml (bảo quản lạnh)

II.

Tiến hành

1. Chiết xuất đường trong thực vật
-

Chuẩn bị mẫu thơm 20g

-

Giã nhỏ

-

Vắt lấy nước cho vào bình định mức

-

Thêm nước cất đủ 100ml

-

Pha loãng mẫu hệ số n (20,50,100,200 lần)


9

2. Dựng đường chuẩn và xác định hàm lượng đường
Hóa chất

ống1

ống2

ống3

ống ống5

ống6

ống7

4
Glucose 1mg/ml

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0

Nước cất(ml)

1

0.8

0.6

0.4

0.2

0

0

Mẫu pha loãng(ml)

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

?

DNS (mol)

3

3

3

3

3

3

3

OD540nm

0

0.333

0.712

1.233

1.469

1.623 0.179

-

Đo ở bước sóng 540nm

-

CHÚ Ý : tiến hành các mẫu dựng đường chuẩn và thí nghiệm đồng thời

Đường chuẩn nồng độ đường khử (mg/ml)
với mật độ quang OD540nm
2
1,8

1,6

OD540nm

1,4
1,2
1
y = 1,7206x + 0,0347
R² = 0,9756

0,8
0,6
0,4
0,2
0
0

0,2

0,4

0,6
C

0,8

1

1,2


10

 Tính kết quả:
Từ phương trình đồ thị đường cong chuẩn tính được mg/ml đường khử trong dung dịch
đường pha loãng.
Nhân với hệ số pha loãng n để được lượng đường trong 1 ml dung dịch gốc
Chọn hệ số pha loãng n sao cho OD nằm trong giới hạn đường chuẩn
Dựa vào phương trình đường tuyến tính giữa nồng độ đường khử (mg/ml) với mật độ
quang OD540 ở trên ta tính được hàm lượng đường khử P ở trong mẫu phân tích X.

y = 1,7206x + 0,0347 ⟹ x =

𝑦−0,0347
1,7206

=

0,179−0,0347
1,7206

= 0.084

Tính hàm lượng đường trong nguyên liệu (mg/g) = X * n * V/m = 0.084 * 25 * 100/20 = 10.5


11

CÂU HỎI ÔN TẬP
Câu 1: Đường khử là các đường chứa nhóm aldehyde (-CHO) hoặc ketone (-CO) như
glucose , fructose ,arabinose , maltose , lactose (saccharose , trehalose không phải đường
khử.
Câu 2: Áp dụng phương pháp đo đường khử trong trường hợp phân tích nồng độ
đường khử trong dung dịch.
Câu 3 : Sai số hệ thống do những lý do:
- Hóa chất chuẩn bị cho thí nghiệm không được chuẩn.
- Do vận chuyển mẫu không đúng cách
- Thao tác đo không chính xác
- Ghi không chính xác chỉ số
- Ở dụng cụ cuvete khi đo OD
- Hút hóa chất không chính xác
Câu 4 : Khi đo OD máy báo over là do mẫu quá đậm đặc cần phải pha loãng lại.
Gía trị OD nằm trong khoảng từ 1 đến 5 .Vì nếu cao quá hoặc thấp quá đường chuẩn sẽ
bị lệch.
Câu 5: Trong bài thực hành chọn đường glucose để dựng đường chuẩn .điều này
không luôn đúng .vì đường khử có nhiều loại như fructose, maltose…..


12

BÀI 3: ĐỊNH LƯỢNG NITƠ TỔNG SỐ BẰNG PHƯƠNG

PHÁP KJELDAHL
1. Định nghĩa:
- Tất cả các dạng nitơ có trong cơ thể hay trong các mô được gọi là nitơ tổng số.
Nitơ có trong các thành phần amino acid của protein là nitơ protein. Nitơ không có trong
thành phần protein như của các muối NH4+, các amino acid tự do, các peptide, urea và
các dẫn xuất của urea, các alkaloid, các base purin và pyrimidine,….. là nitơ phi protein
Nitơ tổng số = Nitơ protein + Nitơ phi protein
- Đạm tổng số hay protein tổng số là nitơ tổng số nhân với hệ số chuyển đổi. Hệ số
này phụ thuộc vào hàm lượng nito trong protein. Thông thường nito chiếm 16% protein
nên hệ số chuyển đổi thường sử dụng là 100/16 = 6.25
- Đạm tổng số = Nito tổng số X hệ số chuyển đổi
- Bảng dưới đây biểu diễn hệ số chuyển đổi cụ thể cho nhiều đối tượng mẫu khác
nhau.
MẪU
Nguồn gốc động vật
Hạt bông
Đậu phộng
Đậu nành
Hạt hướng dương
Cơm dừa
Hạt mè
Bắp
Gạo
Lúa mì

HỆ SỐ CHUYỂN ĐỔI
6.25
5.30
5.46
5.71

5.3
5.3
5.3
6.25
5.95
5.83

2. Nguyên tắc:
a) Vô cơ hóa mẫu.
- Trước tiên mẫu được vô cơ hóa bằng H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao và có chất xúc tác.
Các phản ứng của quá trình vô cơ hóa xảy ra như sau:
2H2SO4  2H20 + 2SO2 + O2


13

- Oxi tạo thành trong phản ứng lại oxi hóa các nguyên tố khác. Các phân tử chứa
nito dưới tác dụng của H2SO4 tạo thành NH3. Ví dụ các protein bị thủy phân thành amini
acid, cacbon và hidro của acid amine tạo thành CO2 và H2O, còn nito được giải phóng
dưới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 dư tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch.
2NH3 + H2SO4  (NH4)2SO4
- Các nguyên tố P, K, Ca, Mg,……chuyển thành dạng oxide: P2O5, K2O, CaO,
MgO,……
b) Chưng cất đạm:
- Đuổi NH3 ra khỏi dung dịch bằng NaOH
(NH4)2SO4 + 2NaOH  Na2SO4 + H2O + 2NH3
- NH3 bay ra được làm lạnh biến đổi thành NH4OH rơi vào bình hứng, bình hứng
chứa H2SO4 0.1N
2NH4OH + H2SO4  (NH4)2SO4 + 2H2O + H2SO4 (dư)
c) Chuẩn độ H2SO4 dư

Chuẩn độ H2SO4 dư bằng NaOH 0.1N
H2SO4 (dư) + NaOH  Na2SO4 + H2O
d) Tính kết quả
 Hàm lượng % nito tổng số được tính theo công thức:
N(%) = {1.42/1000*(V1 – V2)*100/m}*n
Trong đó:
-

V1: số ml H2SO4 cho vào trong bình
V2: số ml NaOH 0.1N đã chuẩn độ
m: số gam mẫu hay ml mẫu sau khi chuẩn độ lại
n: hệ số pha loãng mẫu khi vô cơ hóa mẫu để đưa vào chưng cất

1.42: hệ số nito, cứ 1ml H2SO4 dùng để trung hòa NH4OH thì tương đương với
1.42mg nito
Bài tập: pha loãng 50 lần sữa tươi nguyên chất Vinamilk bằng bình định mức
100ml, sau đó chưng cất đạm với lượng H2SO4 cho vào bình là 20ml và chuẩn độ bằng
NaOH 0.1N. Tính hàm lượng N tổng số trong mẫu, tính ra protein tổng số.
 Vô cơ hóa mẫu


14

2NH3 + H2SO4 + (2g xúc tác) + to  (NH4)2SO4
2ml mẫu


5ml

dd trong suốt

Chưng cất đạm

(NH4)2SO4 + 2NaOH  Na2SO4 + H2O + 2NH3
100ml

35ml

NH3 + H2O  NH4OH
2NH4OH + H2SO4  (NH4)2SO4 + 2H2O + H2SO4 (dư)
20ml


Chuẩn độ H2SO4 dư

H2SO4 (dư) + NaOH + 3 giọt Tashiro  Na2SO4(xanh lá mạ) + H2O
14,25ml
 Chuẩn độ cho thấy lượng NaOH 0.1N phản ứng là V2= 14.25ml
 Ta có: V1 = 20ml, m = 100ml, n = 50 lần
 Áp dụng công thức ta tính được:
N(%) = {1.42/1000*(V1 – V2)*100/m}*n = {1.42/1000*(20 – 14.25}*100/100}*50
= 0.40825%
Nito (tổng số) = Nito tổng số X hệ số chuyển đổi = 0.40825 x 6.25 = 2.5515625

Dd trước chuẩn độ

Dd sau chuẩn độ


15

CÂU HỎI ÔN TẬP
Câu 1) Giải thích ý nghĩa các bước trong thí nghiệm
a) Vô cơ hóa mẫu.
- Oxi tạo thành trong phản ứng lại oxi hóa các nguyên tố khác. Các phân tử chứa
nito dưới tác dụng của H2SO4 tạo thành NH3.NH3 kết hợp với H2SO4 dư tạo thành
(NH4)2SO4 tan trong dung dịch.
2NH3 + H2SO4  (NH4)2SO4
b) Chưng cất đạm:
- Đuổi NH3 ra khỏi dung dịch bằng NaOH
- (NH4)2SO4 + 2NaOH  Na2SO4 + H2O + 2NH3
- NH3 bay ra được làm lạnh biến đổi thành NH4OH rơi vào bình hứng, bình hứng
chứa H2SO4 0.1N
- 2NH4OH + H2SO4  (NH4)2SO4 + 2H2O + H2SO4 (dư)
c) Chuẩn độ H2SO4 dư
- Chuẩn độ H2SO4 dư bằng NaOH 0.1N
- H2SO4 (dư) + NaOH  Na2SO4 + H2O
Câu 2. Thảo luận các yếu tố dẫn đến sai số.
 Hút không chính xác mẫu
 Chuẩn độ không chính xác
 Sai số của máy chưng cất
Câu 3. Vì sao phải bảo đảm NaOH trong bình chưng cất đạm dư?
Vì NaOH dư thì sẽ chuyển tất cả (NH4)2SO4 thành NH3
Câu 4. Nếu thay H2SO4 trong bình hứng bằng acid boric (H3BO3) thì kết quả có thay
đổi gì không?
Ta có: 0.1N H2SO4 = 0.05M H2SO4
Ta chuyển qua phương trình và 1.42 là hệ số nito, cứ 1ml H2SO4 dùng để trung hòa
NH4OH thì tương đương với 1.42mg nito. Vì lấy 1ml nên nhân thêm cho 10-3


2NH4OH
0.1*10-3

+

H2SO4
0.05*10-3

 mN=0.1*10-3 * 14.2

 (NH4)2SO4 + 2H2O + H2SO4 (dư)


16

3NH4OH

+ H3BO3  (NH4)3BO3 + 3H2O + H3BO3 Dư

0.15*10-3*14.2

0.05*10-3

 mN=0.15*10-3 * 14.2= 2.13*10-3
Vì vậy nếu thay thành acid boric thì hệ số sẽ là 2.13
Câu 5. Nếu chuẩn độ bằng NaOH 0.05N thì kết quả N tổng số thay đổi thế nào?
Áp dụng công thức: C1V1 = C2V2
V1, C1 cố định và V2 phải chuẩn độ
Mà C2 giảm 1 nữa thì V2 tăng thể tích gấp đôi  Công thức thay đổi

BÀI 4. ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP
BRADFORD

Lý thuyết
1. Nguyên tắc
Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm
Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức hợp với protein. Trong dung dịch mang tính acid,
khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm có bước sóng hấp thu cực đại 465 nm; khi
kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thu cực đại ở bước sóng 595 nm. Độ hấp thụ ở
bước sóng 595 nm có liên hệ một cách trực tiếp tới nồng độ protein.
Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn với dung
dịch protein chuẩn đã biết trước nồng độ. Dung dịch protein chuẩn thường là bovine
serum albumin (BSA) . Sau khi cho dung dịch protein vào dung dịch thuốc nhuộm, màu
sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1 giờ. Tiến hành đo dung dịch bằng máy quang phổ kế
ta được ODx, độ hấp thụ sẽ tỷ lệ với lượng trong mẫu. Thực hiện một đối chứng với nước
cất (OD0). Lấy giá trị OD = ODx - OD0. Lượng protein mẫu trong dung dịch đo được xác
định bằng cách chấm trên đường chuẩn theo OD, lấy giá trị của điểm đó trên trục hoành.
Đó chính là lượng protein mẫu trong dung dịch đo.


17

Công thức phân tử của Coomasie Brilliant Blue G-250

THỰC HÀNH
1. Dụng cụ - hóa chất
1. Dụng cụ
- Máy đo quang phổ
- Ống nghiệm (14)
- Pipette 5ml, 1ml (có thể thay bằng pipetteman)

- Đồng hồ bấm giây
- Giấy thấm
- Giá để ống nghiệm
- Bình tia đựng cồn
2. Hóa chất
- Cồn 900
- Dung dịch protein chuẩn: cân 10 mg albumin bằng cân phân tích, pha trong 1 ml
nước cất, lắc đều cho tan. Giữ ở -200C. Khi dùng pha loãng ra 100 lần, được dung dịch có
nồng độ 0,1 mg/ml.
- Dung dịch thuốc thử Bradford: dd thuốc thử có thành phần trong 100ml như sau:
Coomassie Brilliant Blue: 0,005g


18

Methanol: 4,7g
Phosphoric acid 85%: 8,5g
Phẩm màu Coomasie Brilliant Blue được làm tan trong ethanol trong một chai
đựng màu tối có nắp. Bổ sung phosphoric acid và chỉnh tới 100ml bằng nước cất. Lắc
đều, giữ ở 40C
- Dung dịch cần xác định hàm lượng protein (phòng thí nghiệm cung cấp)
2. Tiến hành
- Thu dịch trích ly protein như trong bài enzyme (5 g malt trích ly bằng nước thu
được V = 100 ml). Pha loãng mẫu với hệ số pha loãng n lần để được mẫu phân tích (mẫu
X).
- Lập một loạt 6 ống theo số thứ tự 0, 1, 2, 3, 4, 5 và 1 ống nghiệm chứa mẫu cần
phân tích X

- Dùng đồng hồ bấm giây, canh thời gian 0 phút cho 5ml thuốc thử vào ống nghiệm
0, lắc đều để yên. Ở thời điểm 1 phút cho 5ml thuốc thử vào ống nghiệm 1, lắc đều để

yên,... cứ tiếp tục cho đến hết.


19

Ống nghiệm

0

1

2

3

4

5

X

Nước cất (ml)

1

0.9

0.9

0.7

0.6

0.5

-

Albumin chuẩn (0,1mg/ml)

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

-

TT Bradford

5

5

5

5

5

5

5

Nồng độ Albumin (µg /ml)

0

10

20

30

40

50

4.14

OD595nm

0

0.076 0.210 0.376 0.439 0.485 0.045

- Tính thời gian ống 0 được 20 phút, tiến hành đo độ hấp thu của dung dịch ở bước
sóng 595 nm. Ta có giá trị OD0, ở thời điểm 21 phút đo ống 1 (OD1),... tương tự cứ
cách một phút đo cho hết các ống. Ghi lại giá trị OD.
3. Tính kết quả:
- Vẽ đường tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) với mật độ quang OD595nm
ĐƯỜNG CHUẨN BSC PHƯƠNG PHÁP BRADFORD
0,6

0,5

OD 595nm

0,4

0,3

y = 10,514x + 0,0015
R² = 0,9675

0,2

0,1

0
0

10

20

30

40

50

C (µg /ml)
60

- Dựa vào phương trình đường tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) với mật độ
quang OD595 ở trên ta tính được hàm lượng protein P ở trong mẫu phân tích X.


20

𝑦 = 10,514𝑥 + 0.0015  𝑥 =

𝑦 − 0,0015 0,045 − 0,0015
=
= 4,14 . 10−3
10,514
10,514

𝑃 = 𝑥 . 𝑛 = 4,14 . 10−3 . 25 = 0,1035
Để tính tóan hàm lượng protein trong 1g mẫu cân:
Protein (µg/g) = 𝑃 ∗

𝑉
𝑚

= 0,1035 ∗

100
10

= 1.035

CÂU HỎI ÔN TẬP:
1. Giải thích ý nghĩa các bước trong thí nghiệm.
- Pha loãng mẫu với hệ số pha loãng n lần để được mẫu phân tích
 Phải giảm bớt nồng độ protein trong mẫu, để khi đo nồng độ quang không bị vượt
quá giới hạn cho phép.
- Lập một loạt 6 ống theo số thứ tự 0, 1, 2, 3, 4, 5 và 1 ống nghiệm chứa mẫu
cần phân tích X.
 Phải pha các nồng độ khác nhau để lập đường chuẩn. Để xác định protein trong
mẫu.
- Dùng đồng hồ bấm giây, canh thời gian 0 phút cho 5ml thuốc thử vào ống
nghiệm 0, lắc đều để yên. Ở thời điểm 1 phút cho 5ml thuốc thử vào ống
nghiệm 1, lắc đều để yên,... cứ tiếp tục cho đến hết.
 Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm
Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức hợp với protein.
- Tính thời gian ống 0 được 20 phút, tiến hành đo độ hấp thu của dung dịch ở
bước sóng 595 nm. Ta có giá trị OD0, ở thời điểm 21 phút đo ống 1 (OD1),...
tương tự cứ cách một phút đo cho hết các ống. Ghi lại giá trị OD
 Trong 20 phút thuốc nhuộm kết hợp với protein khi đó thuốc nhuộm hấp thu cực
đại ở bước sóng 595 nm.


21

2. Thảo luận các yếu tố dẫn đến sai số.
 Do sai thao tác trong tiến hành thí nghiệm.
 Mẫu protein chuẩn bị không được chuẩn.
 Hóa chất chuẩn bị cho thí nghiệm không được chuẩn.
 Do vận chuyển mẫu không đúng cách
 Lấy mẫu không đúng theo thể tích yêu cầu
 Ghi không chính xác chỉ số.
 Thao tác đo không chính xác
 Máy đo OD không chuẩn.
3. Áp dụng phương pháp bradford cho trường hợp nào
 Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc
nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức hợp với protein.Hình thành hợp
chất màu có khả năng hấp thu ánh sáng ở bước sóng 595nm, cường độ màu tỷ lệ
với nồng độ protein trong dung dịch.
 Tiết kiệm thời gian và dễ thực hiện.
 Cường độ màu tỉ lệ nồng độ protein trong dung dịch nồng độ càng cao thì màu
xanh càng đậm không phụ thuộc nồng độ acid amin của dung dịch.
 Phương pháp có độ nhạy cao cho phép phát phát hiện tới vài protein 5-200 µg/
ml Nhạy hơn phường pháp Lowry gấp 4 lần.
 Ít bị ảnh hưởng bởi các chất thường gặp trong tế bào gặp chẳng hạn như muối.
4. Trường hợp mẫu ở thể rắn cần phải xử lý mẫu như thế nào?
Cân m = 5-10g mẫu rắn đã nghiền nhỏ, cho vào bình nón dung tích 250ml, bổ sung 50ml
nước cất và 10ml dung dich đệm phosphat pH = 4,9. Giữ hỗn hợp ở nhiệt độ 30oC trong
thời gian 1 giờ có khuấy đảo định kỳ. Lọc, rửa thu hồi dung dịch sao cho V = 100ml. Bảo
quản dung dịch gốc ở 2 – 4oC trong thời gian một ngày.


22

BÀI 5: PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME

LÝ THUYẾT:
I.

Enzyme và đơn vị đo hoạt tính của enzyme.

a. Định nghĩa
Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein và có tính đặc hiệu cao. Mỗi
enzyme có khả năng xúc tác cho một hoặc một số phản ứng nhất định. Hoạt động hay
hoạt tính của enzyme càng mạnh thì lượng cơ chất được chuyển hóa hoặc lượng sản
phẩm tạo thành trên một đơn vị thời gian càng lớn. Vì vậy có thể đánh giá hoạt tính xúc
tác của enzyme bằng cách xác định tốc độ chuyển hóa cơ chất hoặc tốc độ tích lũy sản
phẩm phản ứng.



Về nguyên tắc có thể hai nhóm phương pháp chính sau:
Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong một thời

gian nhất định ứng với một nồng độ enzyme xác định.
Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay
sản phẩm tương ứng với một nồng độ enzyme xác định.
Để thực hiện được mục đích trên, nhiều phương pháp phân tích khác nhau được sử
dụng: phương pháp đo quang phổ, đo độ phân cực, áp suất, độ nhớt, phương pháp sắc ký
và phương pháp hóa học.
Mục đích xác định hoạt tính enzyme là xác định số đơn vị hoạt tính. Một đơn vị họat
tính enzyme được định nghĩa theo nhiều phương pháp.
b. Đơn vị hoạt tính của enzyme:
Đơn vị đơn vị quốc tế (Enzyme Unit, viết tắt U)

Do Hiệp hội Hóa sinh Quốc tế (International Union of Biochemistry – IUB) định
nghĩa:
Một đơn vị chuẩn của enzyme (1 U) là lượng enzyme xúc tác chuyển hóa được
 1 𝜇mol cơ chất sau 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn.


23

 1 U = 1 𝜇mol sản phẩm = 1 𝜇mol cơ chất (10-6 mol)/phút
Katal:
Năm 1979, Hội đồng Danh pháp của IUB khuyến cáo nên sử dụng Katal làm đơn vị
cơ bản của hoạt tính enzyme.
Một Katal là lượng enzyme xúc tác chuyển hóa được 1 mol cơ chất sau 1 giây ở điều
kiện tiêu chuẩn.
1 Kat = 1 mol cơ chất/ giây = 60 mol/ phút = 60 x 106 𝜇mol/ phút = 6 x 107 U
1 U = 1/60 x 10-6 Kat = 16,67 nKat (nanokatal)
Đơn vị Katal được khuyến cáo vì nằm trong hệ đơn vị đo lường Quốc tế (SI).
Đơn vị tự đặt: đơn vị hoạt tính dựa vào sự thay đổi đặc tính hỗn hợp phản ứng, ví
dụ sự thay đổi độ đục, độ nhớt ...trong một đơn vị thời gian. Trường hợp cơ chất và sản
phẩm là một hỗn hợp phức tạp thì áp dụng đơn vị hoạt tính này.

II.

Hoạt tính riêng của enzyme.

Hoạt tính riêng của một chế phẩm enzyme đăc trưng cho độ tinh sạch của chế phẩm
enzyme. Hoạt tính riêng được biểu thị bằng số đơn vị enzyme/mg protein ( U/mg
protein) hoặc (Kat/kg protein), trong đó hàm lượng protein được xác dịnh bởi phương
pháp Lowry hoặc Bradford.

III.

Phương pháp xác định hoạt tính enzyme.

Chú ý:
-

Cần trách những yếu tố có thể biến tính protein enzyme.

-

Các thông số nhiệt độ , pH, nồng độ ion và thành phần dung dịch đệm ảnh hưởng

lên hoạt tính enzyme. Thử hoạt tính enzyme phải được tiến hành trong điều kiện thích
hợp như điều kiện sinh lý, đk tồn trữ thực phẩm hoặc đk mà hoạt lực có thể đạt tối ưu.
-

Với những enzyme cần có chất hoạt hóa hoặc chất ổn định thì phải cho các chất

này vào enzyme trước khi cho cơ chất vào hỗn hợp phản ứng.
-

Nồng độ cơ chất ở giới hạn thích hợp, đủ thừa để bão hòa enzyme, không quá cao

để kìm hãm enzyme, cơ chất được chuyển hóa 20%-30%.


24

-

Thởi gian xác định hoạt tính thường 5-30 phút.

-

Khi xác định hoạt tính phải làm mẫu đối chứng( enzyme bị bất hoạt trước khi tiếp

xúc với cơ chất) song song với thí nghiệm.

Enzyme amylase và phương pháp xác định hoạt tính.

IV.

a. Khái quá về enzyme amylase.
b. Các phương pháp đo hoạt tính enzyme amylase.
-

Nguyên tắc chung dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi enzyme trong dd enzyme

nghiên cứu thành các dextrin có phân tử lượng khác nhau. Đo cường độ màu tạo thành
giữa tinh bột và các sản phẩm thủy phân của nó với iod bằng máy so màu sẽ tính được
hoạt tính của enzyme.
-

Đơn vị amylase (theo Smith và Roe) là lượn enzyme cần thiết để thủy phân hoàn

toàn 10 mg tinh bột sau thời gian phản ứng 30 phút trong điều kiện thí nghiệm.

THỰC HÀNH:
1. Dụng cụ - hóa chất:

a. Dụng cụ.
-

Máy lắc.

-

Máy đo quang phổ, cuvette dày 1cm.

-

Bể điều khiển.

-

Bình định mức.

-

Ống nghiệm.

-

Pipette 5ml, 1ml.

-

Đồng hồ bấm giây.

-

Giấy thấm.

-

Giá để ống nghiệm.

-

Bình tia đựng cồn.

b. Hóa chất:


25

 Dung dịch đệm.
-

Dung dịch đệm

-

Dung dịch đệm acetate pH= 4,7 (xác định hoạt tính enzyme nấm mốc): trộn 1 thể

tích CH 3COOH 1N với 1 thể tích CH 3COONa 1N. Kiểm tra pH.
-

Dung dịch đệm phosphate pH= 4,9 (xác định hoạt tính enzyme của malt): trộn 10

ml dung dịch Na 2HPO 4 1/15 M với 990 ml dung dịch KH 2PO 4 1/15 M nhận được 1 l
dung dịch đệm phosphate pH = 4,94. Kiểm tra pH.
-

Dung dịch đệm glycine – NaOH 0,1 M pH = 10 (dùng đ ể xác định hoạt tính

𝛼 −amylase kiềm.
-

Dung dịch HCl 0,1N .

-

Dung dịch iod: hòa tan 30 mg KI và 3 mg I2 v ới một lượng nhỏ nước cất. Lắc nhẹ

hỗn hợp để hòa tan hoàn toàn, sau đó chuyển dung dịch sang b ình định mức 1000 ml, bổ
sung nước cất đến vạch mức. Bảo quản dung dịch trong b ình màu nâu để chỗ tối.
-

Dung dịch tinh bột 1%: h òa tan 1 g tinh b ột (theo chất khô tuyệt đối) với 50 ml

nước cất trong bình định mức 100 ml, lắc đều. Đặt v ào bếp cách thủy đang sôi, lắc li ên
tục cho đến khi tinh bột tan ho àn toàn. Sau đó làm ngu ội và bổ sung 10 ml đệm acetate
pH = 4,7 (hoặc 10 ml dung dịch đệm phosphate pH = 4,9) bổ sung n ước cất đến vạch
mức, lắc đều. Dung dịch đ ược chuẩn bị trong ngày sử dụng.
-

Dung dịch enzyme gốc.

 Trích ly enzyme:

Enzyme được trích ly từ chế phẩm hay tế bào, mô động thực vật bằng dd đệm có pH
thích hợp như
-

Trích ly enzyme từ vi khuẩn: Cân m= 0,1g chế phẩm  dùng đũa thủy tinh chà

nhẹ chế phẩm trong cốc dt 50ml  cho vào bình định mức 100ml + H2O cất  lọc và
trích ly enzyme bảo quản 2-4°𝐶 / 1 ngày.
-

Trích ly enzyme nấm mốc: Cân m=5g chế phẩm  dùng đũa thủy tinh chà nhẹ

chế phẩm trong cốc dt 50ml  cho vào bình định mức 100ml + H2O cất +dd đệm