KHẢO sát THÀNH PHẦN HOÁ học PHÂN đoạn IV CAO ETHYL ACETATE cây LAN một lá (NERVILIA ARAGOANA)

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HOÁ HỌC PHÂN
ĐOẠN IV - CAO ETHYL ACETATE CÂY
LAN MỘT LÁ (NERVILIA ARAGOANA)

1
1


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
EtOH: Ethanol
DM: Dung môi
nH: Hexane
EA: Ethyl acetate
C: Chloroform
Me: Methanol
Aq: Nước
IC 50: Nồng độ ức chế 50% gốc tự do
SKC: Sắc kí cột
SKLM: Sắc kí lớp mỏng
UV: Tia cực tím
H2SO4: Sulfuric acid
DMSO: Dimethyl Sulfoxide
Me: Methanol
NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance)
1

H-NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (H1) (Hydro (1) Nuclear Magnetic Resonance
Spectroscopy)
13

C-NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon (C13) (Carbon (13) Nuclear Magnetic
Resonance Spectroscopy)
DEPT: Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer)
δ: Độ dịch chuyển hóa học
HSQC: Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết (Heteronuclear Single Quantum
Correlation)
HMBC: Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết (Heteronuclear Multiple Bond
Coherence)
%: phần trăm
2
2


g: gam
mg: miligam
mm: milimeter
mL: mililiter
PTLC: Sắc ký lớp mỏng điều chế
MS: Khối phổ (Mass Spectrometer)
ppm: Một phần triệu (Part per Million)
Hz: Hertz
MHz: Mega Hertz
µm: Micrometer
d: Mũi đôi (Doublet)
dd: Mũi đôi đôi (Doublet of Doublet)
m: Mũi đa (Multiplet)
s: Mũi đơn (Singlet)

3

3


TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] C.-L. L. H.-S. W. a. X.-S. Y. Guang-Xiong Zhoua, “An acetyl flavonol from Nervilia
fordii (Hance) Schltr,” 2009.
[2] E. D. Kumar, “Antidiabetic and regenerative effects of alcoholic corm extract of Nervilia
aragoana gaud. in streptozotocin-nicotinamide induced NIDDM rats,” 2013.
[3] G. J. E.K. Dilip Kumar, “Antidiabetic activity of alcoholic stem extract of Nervilia
plicata in streptozotocin-nicotinamide induced type 2 diabetic rats,” 2010.
[4] Y. P. Y.-J. Z. Y.-F. W. a. C.-R. Y. Li-Wen Tian, “7-O-Methylkaempferol and -quercetin
Glycosides from the Whole Plant of NerWilia fordii,” 2009.
[5] Z.-X. Z. C.-Z. L. C.-C. Z. L. G. Li Zhang, “Three new flavonol glycosides from Nervilia
fordii,” 2011.
[6] J.-M. C. W.-C. Y. X.-S. Y. &. G.-X. Z. Liu-Bin Wei, “Three new cycloartane glycosides
from Nervilia fordii,” 2012.
[7] L.-B. W. C.-L. L. &. G.-X. Z. Jin-Man Chen, “A flavonoid 8-C-glycoside and a
triterpenoid cinnamate from Nervilia fordii,” 2013.
[8] Y. J. J.-Z. X. G.-K. H. S.-L. Q. J.-H. M. &. X.-S. Y. Li Qiu, “Five new flavonoid
glycosides from Nervilia fordii,” 2014.
[9] Q. L. J. Y. X. J.-z. Z. L.-h. HUANG Gui-kun, “A new labdane diterpenoid glycoside
from Nervilia fordii,” 2014.
[10] Đ. H. Bích, “Cây Thuốc Và Động Vật Làm Thuốc Ở Việt Nam,” p. Tập 1 NXB Khoa
Học và Kỹ Thuật, 2004.
[11] P. S. a. O. R. K. Himakar Reddy, “A comparative in vitro study on antifungal and
antioxidant activities of Nervilia aragoana and Atlantia monophylla,” 2010.
[12] X. Y.-l. L. X.-p. L. L. X. Y.-j. L. J.-j. C. X.-p. HUANG Ming-qing, “Protection of Total
Flavonoid Fraction from Nervilia fordii on Lipopolysaccharide-induced Acute Lung
4

4


Injury in Rats,” 2012.
[13] K. P. P. NGUYỄN, “PHƯƠNG PHÁP CÔ LẬP HỢP CHẤT HỮU CƠ,” 2007.
[14] A. T. P. D. G. T. R. A. ELIZABETH THOMAS, “GC-MS ANALYSIS OF
PHYTOCHEMICAL COMPOUNDS PRESENT IN THE RHIZOMES OF Nervilia
aragoana GAUD,” 2013.
[15] A. M. C.-I. C. T. Y. Stephan W. Gale, “Inter-specific relationships and hierarchical
spatial genetic structuring in Nervilia nipponica, an endangered orchid in Japan,” 2009.
[16] A. T. P. D. G. T. ELIZABETH THOMAS, “NERVILIA ARAGOANA GAUD, A
TERRESTRIAL ORCHID,” 2013.
[17] M. M. Hossain, “Therapeutic orchids: traditional uses and recent advances — An
overview,” 2010.
[18] H.-E. Y. J.-M. C. Q.-Q. W. H. W. W.-C. Y. a. G.-X. Z. Liu-Bin Wei, “Five New
Cycloartane-Type Triterpenoid Saponins from Nervilia fordii,” 2013.
[19] V. V. Chi, “Tra Cứu Tên Cây Cỏ Việt Nam,” p. NXB Giáo Dục, 2007.

5
5


ĐẶT VẤN ĐỀ
MỞ ĐẦU
Đời sống xã hội ngày càng phát triển, mức sống được cải thiện rõ rệt qua từng năm. Tuy
nhiên, chúng ta không thể phủ nhận một thực tế đáng buồn đó chính là con người đang dần
tách rời khỏi thiên nhiên. Nhiều căn bệnh mới không ngừng xuất hiện mà chính nền khoa học
hiện đại hiện nay cũng không thể tìm ra nguyên nhân.
Từ xa xưa, con người trên khắp thế giới đã biết sử dụng cây thuốc để chữa bệnh. Các loại
thuốc có nguồn gốc từ thảo dược thiên nhiên có công dụng tốt, ít tác dụng phụ. Chính vì vậy

mà ngành nghiên cứu và khai thác hợp chất thiên nhiên ứng dụng vào thuốc chữa bệnh đang
trở thành xu hướng phát triển chung của ngành y học và cả nhân loại. Rất nhiều hợp chất có
tác dụng sinh học đã được tìm ra và ứng dụng rộng rãi trong thực phẩm, dược phẩm. Giá trị
của nhiều hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học không chỉ ở công dụng trực tiếp làm
thuốc chữa bệnh, mà có thể dùng làm các nguyên mẫu hoặc các cấu trúc dẫn đường cho sự
phát triển và phát hiện nhiều dược phẩm mới có chứa thuốc chữa cho tất cả các bệnh. Những
giá trị tiềm tàng trong cây thuốc vẫn còn chưa khám phá. Bằng cách xem xét giá trị của các
cây thuốc phải sử dụng nhiều thời gian và nguồn lực để phát triển các loại thuốc từ cây thuốc.
Nhận thức về các tác dụng phụ của phản ứng thuốc không mong muốn và yếu tố chi phí, vì
vậy y học cổ truyền đã được nâng cao. Y học cổ truyền bao gồm những kiến thức, kỹ năng và
thực hành dựa trên lý thuyết, niềm tin và kinh nghiệm dân gian được sử dụng để duy trì sức
khỏe, cũng như ngăn ngừa, chuẩn đoán, cải thiện hoặc điều trị bệnh lý về thể chất và tinh
thần.
MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU
Đề tài “Khảo sát thành phần hóa học phân đoạn IV - cao Ethyl acetate cây Lan một lá
(Nervilia aragoana)” nhằm khảo sát thành phần hóa học và tìm ra những hoạt tính sinh học
cũng như những tác dụng dược lý tiêu biểu của cây Lan một lá, giúp chúng ta có những hiểu
biết về khía cạnh hóa học các hợp chất thiên nhiên, góp phần cho những nghiên cứu sâu hơn
về khả năng sử dụng cây cỏ làm thuốc, từ đó hạn chế việc sử dụng kháng sinh trong chữa
bệnh.
NỘI DUNG VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Nội dung nghiên cứu:
Thực hiện quy trình chiết tách các hợp chất hóa học có trong phân đoạn IV cao Ethyl acetate
của cây Lan một lá.
Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được.


Xác định hoạt chất sinh học có trong cây Lan một lá.
Đối tượng nghiên cứu: Cây Lan một lá Nervilia aragoana.
Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN

Ý nghĩa khoa học: Cung cấp các thông tin khoa học về thành phần hóa học, cấu tạo của một
số hợp chất và hoạt tính sinh học có trong cây Lan một lá.
Ý nghĩa thực tiễn: Giải thích một cách khoa học các kinh nghiệm dân gian, thuận tiện cho
việc nghiên cứu, ứng dụng vào ngành công nghiệp dược phẩm và phát triển thuốc mới.


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY LAN MỘT LÁ
1.1.1 Phân loại khoa học và phân bố loài
Cây Nervilia đầu tiên được nhà khoa học Roptrostemom phát hiện vào năm 1828. Sở dĩ cây
này có tên là Nervilia do chữ Nerve nói về những đường gân trên lá. Dưới đây là những cây
thường thấy ở vùng Đông Nam Á.
1.1.1.1. Phân loại khoa học
Lớp: Monocotyledoneae
Bộ: Bộ măng tây (Asparagales)
Họ: Họ lan (Orchidaceae)
Giới: Gastrodieae
Chi: Nervilia
Loài: Nervilia aragoana
Tên khoa học: Nervilia aragoana Gaudich
Tên đồng nghĩa: Nervilia carinata
Tên nước ngoài: Tiếng Anh: Tall shield orchid; Malayalam: Orilathamara, Kalthamara,
Nilathamara ; Trung Quốc (Flora of China): yu-lan = Du-lan.
Tên Việt Nam: Trân châu xanh, Thanh thiên quỳ xanh, và trong dân gian có tên đơn giản hơn
là Lan một lá.
Việt Nam có 5 loài: Nervilia aragoana, Nervilia crispata, Nervilia fordii, Nervilia plicata và
Nervilia prainiana.
1.1.1.2. Phân bố loài
Năm 1829, nhà thực vật người Pháp Charles Gaudichaud Beaupre (1789-1854) đã đặt tên cây
là Nervilia aragoana. Nervilia aragoana được tìm thấy nhiều ở các vùng rừng Darrjeeling

Hymalaya với độ cao ở vào khoảng 400 – 1000 m, ở vùng núi Mcllwraith ở Queensland nước
Úc. Đặc biệt là các khu vực rừng nhiệt đới và đồi núi. Ở khu vực Đông Nam Á, các quốc gia
như Lào, Thái lan, Malaysia, Myanma, Indonesia,…đều tìm được loại cây này. Loài Nervilia
là loài cây mọc sát mặt đất, có vùng phân bố khá rộng, gần như các châu lục đều có thể tìm
được loại cây này.


Ở Việt Nam ta, các tỉnh có phân bố loài cây này chủ yếu là các vùng núi các tỉnh Tây Bắc và
vùng Tây Nguyên như Cao Bằng, Lào Cai hay Lâm Đông, Kon Tum,…..
1.1.2 Mô tả đặc điểm thực vật tổng quát
Lan một lá là loài cây địa lan nhỏ, cây địa sinh, sồng nhiều năm, cao 10 – 20 cm bao gồm cả
phát hoa, mọc thành từng cụm. Chỉ có một lá duy nhất, thân rất ngắn. Rễ tròn, to, dạng củ,
đường kính 1.5 – 3.5 cm. Lá mọc thẳng, cuống lá dài khoảng 15 – 20 cm. Phiến lá to và
mỏng, hình tam giác, rộng khoảng 4 – 8cm, lõm như hình chảo, màu lục nhạt. Gân lá nổi, toả
đều ra từ cuống, cuống lá dài 10 – 20 cm, mép lượn sóng. Hoa thường xuất hiện trước khi
mọc lá. Hoa màu trắng, đốm tím hồng, phiến hoa hình dầm, dài 1 cm, môi tam giác, thuỳ
nhọn tròn, có lông dày, cột cao 5 – 7 mm.
Phát hoa ở cuối cành, dài 200 – 350 mm, màu xanh lục. Cuống hoa dài 8 – 10 mm. Hoa 2 – 6
cái, lộn ngược, vươn ra, hình sao, kích thứơc 35 – 40 mm x 30 – 35 mm, màu xanh lục nhạt,
cánh môi hơi vàng hay xanh lá cây. Đài hoa và cánh hoa có đầu nhọn, dẹp, dàn rộng. Phần
lưng của đài hoa thẳng đứng, kích thuước 17 – 24 mm x 2 – 2.5 mm. Cánh hoa xoè rộng 14 –
22 mm x 2 mm. Cánh môi 17 – 22 mm x 9 – 12 mm với các sợi lông tím mảnh hoặc gân
xanh, có 3 thuỳ. Thuỳ bên uốn cong vào, thuỳ giữa có mép không đều gợn sóng và có 3 chóp
rậm lông. Quả nang, hình thon dài có cuống, rủ xuống, tự nứt ra khi già.

Hình 1.1 Nervilia aragoana


Hình 1.2 Nervilia fordii

Hình 1.3 Nervilia plicata


Hình 1.4 Nervilia crispapta

Hình 1.5 Nervilia prainiana


1.1.3 Đặc điểm sinh học
Như hầu hết các loài thực vật khác, cây Lan một lá đều rụng lá vào mùa đông để tránh lạnh,
chỉ còn củ nằm lại dưới đất. Do đó, để không làm hỏng củ Lan một lá, vào mùa đông không
nên tưới nước cho cây.
Khi trời bắt đầu ấm áp trở lại và bắt dầu có mưa thì củ dưới đất sẽ nảy mầm trở lại và bắt đầu
ra thân để chuẩn bị nở hoa.
Đến khi hoa nở hết chu kì, củ mới bắt đầu hình thành. Ở điều kiện khí hậu cũng như chăm sóc
thích hợp, cây sẽ phát triển gấp nhiều lần thông thường.
Hầu hết loài Lan một lá ở Việt Nam nói riêng và vùng Đông Nam Á nói chung có thời gian
nở hoa là vào khoảng tháng 2 đến tháng 4 hàng năm.
1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC
1.2.1 Các công trình nghiên cứu trong nước
Hiện nay chưa có bất kì công bố nào về các công trình nghiên cứu cây Lan một lá tại Việt
Nam.
1.2.2 Các công trình nghiên cứu trên thế giới
Tính đến hiện tại, hầu như tất cả các công trình nghiên cứu được công bố trên thế giới chủ
yếu là ở loài Nervilia fordii. Dưới đây là các nghiên cứu về thành phần hoá học của loài
Nervilia fordii đã được công bố qua các năm tính đến năm 2014:
Năm 2009, Guang - Xiong Zhou, Chuan - Li Lu, Heng - Shan Wang và Xin - Sheng Yao đã
thu được từ Nervilia fordii 1 acetyl flavonol là 3-O-acetyl-7-O-methyl kaempferol (1) cùng
với 5 chất được biết là rhamnocitrin (kaempferol 7-O-methyl ether) (2), rhamnocitrin-3-O-βD glucoside (3), rhamnocitrin-4′-β-D-glucosid (4), rhamnazin (5), và p-hydroxyl benzoic acid
(6). [1]

Năm 2009, Li - Wen Tian, Ying Pei, Ying - Jun Zhang, Yi - Fei Wang và Chong - Ren Yang đã
thu được 5 chất 7-O-methylkaempferol và – quercetin glycoside, nervilifordin A-E là
rhamnocitrin [2] [3]-3-O-β-D-xylopyranosyl-(1-4)-β-D-glucopyranoside (nervilifordin A) (7),
rhamnocitrin-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1-4)-β-D-glucopyranoside (nervilifordin B) (8),
rhamnetin-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1-4)-β-D-glucopyranoside (nervilifordin C) (9), 4′-O-βD-glucopyranosylrhamnocitrin-3-O-β-D-glucopyranosyl
(4-1)-β-D-glucopyranoside
(nervilifordin D) (10) và4′-O-β-D-glucopyranosylrhamnetin- 3-O-β-D-glucopyranosyl-(4-1)β-D-glucopyranoside (nervilifordin E) (11) từ Nervilia fordii. [4]
Năm 2011, Li Zhang, Zhong-Xiang Zhao, Chao-Zhan Lin, Chen-Chen Zhu và Li Gao đã thu
được 3 hợp chất flavonol glycoside nervilifordizin A-C từ Nervilia fordii là rhamnazin 3-O-β-


D-xylopyranosyl-(1-4)-β-D-glucopyranoside (nervilifordizin A) (12), rhamnazin 3-O-β-Dglucopyranosyl-(1-4)-β-D-glucopyranoside (nervilifordizin B) (13) và rhamnazin 3-O-β-Dxylopyranosyl-(1-4)-β-D-glucopyranoside-4′-O-β-D- glucopyranoside (nervilifordizin C)
(14). [5]
Năm 2012, Liu-Bin Wei, Jin-Man Chen, Wen-Cai Ye, Xin-Sheng Yao và Guang-Xiong Zhou
đã thu được 3 chất cycloartane glycoside là 3-β-O-β-D- glucopyranosyl-1α,24ξ,25,31tetrahydroxyl cycloartan-28-oic acid (nerviside A) (15), 3-β-O-β-D-glucopyranosyl-1α,25,31trihydroxyl cycloartan-28-oic acid (nerviside B) (16) và 3-β-O-β-D-xylopyranosyl-24-Oacetoxy-1α,25-dihydroxyl cycloartan-28-oic acid (nerviside C) (17) từ Nervilia fordii. [6]
Năm 2013, Jin-Man Chen, Liu-Bin Wei, Chuan-Li Lu và Guang-Xiong Zhou đã cô lập được
một
hợp
chất
flavonoid
glycoside
7-O-β-D-glucopyranosylapigenin-8-C-β-Dglucopyranosyl-(1-2)-β-D-glucopyranoside (18) và 1 triterpenoid cinnamate 24(S/β)dihydrocycloeucalenol-3-(Z)-p-hydroxycinnamate (19) từ Nervilia fordii. [7]
Năm 2013, Li Qiu, Yang Jiao, Ji-Zhao Xie, Gui-Kun Huang, Shao-Ling Qiu, Jian-Hua Miao
và Xin-Sheng Yao đã cô lập được 5 chất flavonoid glycoside, nervilifordin F-J là rhamnazin3-O-β-6′′-acetyl-glucopyranosyl-4′-O-β-glucoside (nervilifordin F) (20), rhamnazin-3-O-βglucopyranosyl-4′-O-β-6′′′-acetyl-glucoside

(nervilifordin

G)

(21),

apigenin-6-C-α-

arabinosyl-8-C-[2′′′-O-(E)-feruloyl]-β- galactoside (nervilifordin H) (22), apigenin-6-C-αarabinosyl-8-C-(2′′′-O-sinapoyl)-β- galactoside (nerilifordin I) (23), apigenin 8-C-galactosyl6′′-O-β-glucopyranoside (nerilifordin J) (24) từ Nervilia fordii. [8]
Năm 2014, Huang Gui-kun, Qiu Li, Jiao Yang, Xie Ji-zhao và Zou Lu-Hui đã thu được một
hợp chất labdane diterpenoid glycoside từ Nervilia fordii là 12,17-Epoxy-3-hydroxy- 17methoxy-labdan-13-en-16,15-olide-3-O-α-rhamnopyranosyl-(1-2)-O-β- glucopyranoside (25).
[9]


3-O-acetyl-7-O-methyl kaempferol (1)

Rhamnocitrin (kaempferol 7-O-methyl ether) (2)


Rhamnocitrin-3-O-β-D-glucoside (3)

Rhamnocitrin-4′-β-D-glucoside (4)


Rhamnazin (5)

p-Hydroxyl benzoic acid (6)


Rhamnocitrin-3-O-β-D-xylopyranosyl-(1-4)-β-D-glucopyranoside (nervilifordin A) (7)

Rhamnocitrin-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1-4)-β-D-glucopyranoside (nervilifordin B) (8)


Rhamnetin-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1-4)-β-D-glucopyranoside (nervilifordin C) (9)

4′-O-β-D-Glucopyranosylrhamnocitrin-3-O-β-D-glucopyranosyl-(4-1)-β-D-glucopyranoside
(nervilifordin D) (10)


4′-O-β-D-Glucopyranosylrhamnetin-3-O-β-D-glucopyranosyl-(4-1)-β-D-glucopyranoside
(nervilifordin E) (11)

Rhamnazin 3-O-β-D-xylopyranosyl-(1-4)-β-D-glucopyranoside (nervilifordizin A) (12)


Rhamnazin 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1-4)-β-D-glucopyranoside (nervilifordizin B) (13)

Rhamnazin
3-O-β-D-xylopyranosyl-(1-4)-β-D-glucopyranoside-4′-O-β-D-glucopyranoside
(nervilifordizin C) (14)


3-β-O-β-D-Glucopyranosyl-1α,24ξ,25,31-tetrahydroxyl cycloartan-28-oic acid (nerviside A)
(15)

3-β-O-β-D-Glucopyranosyl-1α,25,31-trihydroxyl cycloartan-28-oic acid (nerviside B) (16)


3-β-O-β-D-Xylopyranosyl-24-O-acetoxy-1α,25-dihydroxyl cycloartan-28-oic acid (nerviside
C) (17)

7-O-β-D-Glucopyranosylapigenin-8-C-β-D- glucopyranosyl-(1-2)-β-D-glucopyranoside (18)

24(S/β)-Dihydrocycloeucalenol-3-(Z)-p-hydroxycinnamate (19)

Rhamnazin-3-O-β-6′′-acetyl-glucopyranosyl-4′-O-β-glucoside (nervilifordin F) (20)


Rhamnazin-3-O-β-glucopyranosyl-4′-O-β-6′′′-acetyl-glucoside (nervilifordin G) (21)

R=Feruloyl

Apigenin-6-C-α-arabinosyl-8-C-[2′′′-O-(E)-feruloyl]-β-galactoside (nervilifordin H) (22)


R=sinapoyl

Apigenin-6-C-α-arabinosyl-8-C-(2′′′-O- sinapoyl)-β-galactoside (nerilifordin I) (23)

Apigenin-8-C-galactosyl-6′′-O-β- glucopyranoside (nerilifordin J) (24)