nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa của lá cây ổi

MỤC LỤC


LỜI MỞ ĐẦU
Thuở tiền sơ khai, con người đã biết dùng những bài thuốc đầu tiên có nguồn gốc từ
thiên nhiên để chữa trị vết thương, trị bệnh, làm đẹp hay bồi bổ sức khỏe; những vị
thuốc có thể bắt nguồn từ những cây cỏ bình thường hay những loài động vật gần
gủi; nhưng để biết được cụ thể thành phần và hoạt tính chính xác của từng loài
chúng ta cần tiến hành các nghiên cứu khoa học.
Quyển luận văn này viết về cây ổi tại Việt Nam. Ổi là một loại cây khá phổ biến và
có sản lượng dồi dào, chúng không chỉ có ý nghĩa lớn về mặt kinh tế, mà còn được
biết đến là một loại dược liệu trị bệnh được lưu truyền trong nhân gian qua nhiều
thế hệ. Vì vậy, để khai thác hết các giá trị to lớn mà cây ổi mang lại, chúng ta cần
tiếp tục thực hiện những công trình nghiên cứu về chúng.
Mục tiêu của luận văn là nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa
của lá cây ổi.
Quyển luận văn bao gồm các nội dung chính và phụ lục:
Chương 1 : Tổng quan
Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp
Chương 3: Thực nghiệm
Chương 4: Kết quả
Chương 5: Bàn luận
Chương 6: Kết luận


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
Cây ổi thuộc họ Sim có khoảng 3000 loài, phân bổ trong 130 - 150 chi. Chúng phân
bổ rộng khắp ở vùng nhiệt đới và ôn đới ấm áp trên thế giới. Chi Ổi có nguồn gốc ở
Trung và Nam Mỹ với khoảng 100 loài cây bụi. Trong đó có nhiều loài cây có quả
ăn được và có giá trị kinh tế lớn.
Hiện nay cây ổi được trồng nhiều ở các nước thuộc Châu Phi, Nam Á, Đông Nam Á

, vùng Caribbean , cận nhiệt đới của Bắc Mỹ và Úc.
Ở Việt Nam, ổi là cây ăn quả quan trọng, được trồng hầu như khắp các địa phương,
cả vùng đồng bằng lẫn miền núi, trừ vùng cao hơn 1500m. Chỉ tính riêng quần thể
ổi đã có khoảng 7-10 giống khác nhau. Quần thể ổi mọc hoang dại thường chỉ thấy
ở vùng trung du và núi thấp; chúng mọc lẫn với nhiều loại cây bụi khác ở các vùng
đồi, đất sau nương rẫy, hay dọc theo các đường đi. [1]
Tên gọi khoa học
Psidium guajava
Phân giới thực vật [18]
Bậc (Domain): Eukaryota
Giới (Kingdom): Plantae
Ngành (Phylum): Spermatophyta
Lớp (Class): Dicotyledonae
Bộ (Order): Myrtales
Họ (Family): Myrtaceae
3
Chi (Genus): Psidium


Loài (Species): Psidium guajava

Đặc điểm thực vật [1]

Rễ :

Đâm sâu vào đất, rễ phân nhánh

4

Lá

:

Lá đơn, mọc đối, hình trái xoan hoặc
hình trứng; dài 9cm - 11cm, rộng 3cm
- 6cm, gốc tròn, đầu tù hơi nhọn, mặt
trên màu xanh sẫm, mặt dưới nhạt có
gân nổi rõ.

Thân cây :

Cây gỗ; cao từ 3m - 6m.

Hoa :

Hoa to, màu trắng, mộc đơn độc hoặc
tập trung 2 - 3 cái ở kẽ lá, cuống có
lông mịn; đài nhỏ có ống, 4 - 5 răng
không đều; tràng 5 cánh dày, có lông
mềm; nhị rất nhiều, xếp thành nhiều
dãy, chỉ nhị rời, bao phấn có trung đới
rộng; bầu hạ, dính vào ống đài.

5


Quả :

Quả mọng hình cầu hoặc hình trứng,

khi chín màu vàng, ruột màu đỏ, trắng
hay vàng; hạt rất nhiều, hình bầu dục

Đặc điểm sinh học, sinh thái
Cây ưa sáng, sinh trưởng phát triển tốt trong vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt
đới. Giới hạn về nhiệt độ từ 150C - 450C, nhiệt độ tốt nhất cho cây sinh trưởng và
cho nhiều quả là từ 230C - 280C; lượng mưa 1000-2000mm/năm.
Ổi ra hoa quả nhiều năm. Cụm hoa thường xuất hiện trên những cành non mới ra
cùng năm. Thụ phấn nhờ gió hoặc côn trùng. Vòng đời có thể tồn tại
40 - 60 năm. Mùa hoa: tháng 3 - 4; mùa quả: tháng 8 - 9.
6


Thành phần hóa học trong lá ổi

Flavonoid

Quercetin;

[10], [13]

Avicularin;

Guaijaverin;

Quercitrin;

Hyperin;

Quercetin 3-O-β-Darabinopyranoside;

Isoquercetin; Quercetin 4’-glucuronoide;
Quercetin 3-O-gentiobioside.
Tannin

Amritoside;Guavin A; Guavin B; Guavin C; Guavin D;
Isostrictinin; Strictinin; Pedunculagin .

Monoterpen

Caryophyllene

oxide;

β-selinene;

1,8-cineole;

α-pinene,

myrcene; δ-elemene; d-limonene; caryophyllene; Linalool;
Eugenol; β-bisabolol; β-bisabolene; β-sesquiphellandrene;
Me 2-methylthiazolidine-4-(R)-carboxylate (cis and trans); Ethyl
2-methyl-thiazolidine-4-(R)-carboxylate (cis and trans);
Aromadendrene; α- and β-selinene; Caryophellene epoxide;
Cayophylladienol; (E)-nerolidol Selin-11-en-4-alpha-ol.

7


Terpenoid

Ursolic acid; Corosolic acid; Maslinic acid; Asiatic acid;
Guavenoic

acid;

Guavanoic

acid;

Guajavanoic

acid;

Jacoumaric acid; Isoneriucoumaric acid; Guavacoumaric acid;
Guajanoic acid; Guajavolide.

Một số nghiên cứu về hoạt tính sinh học trong lá cây ổi
Một vài nghiên cứu trong nước
Theo nghiên cứu của Đái Thị Xuân Trang (2012) và các cộng sự; cao ethanol lá ổi
được sử dụng liều 400 mg/kg trọng lượng cho chuột bệnh tiểu đường được gây bệnh
bằng alloxan monohydrate và chuột bình thường uống. Kết quả chứng minh rằng
cao ethanol lá ổi có khả năng hạ đường huyết một cách có ý nghĩa thống kê
(P<0,05) so với nhóm chuột bệnh tiểu đường không được uống cao chiết lá ổi và
tương đương với thuốc điều trị tiểu đường gliclazide. Kết quả thí nghiệm cũng
chứng minh cao ethanol lá ổi có thể cải thiện trọng lượng chuột bệnh tiểu đường
một cách có ý nghĩa thống kê (P<0,05) và cao chiết lá ổi cũng không gây độc tính
cấp cho chuột bình thường.[3]
Theo Nguyễn Xuân Duy, 2013. Cao chiết từ lá ổi cho thấy khả năng ức chế gốc tự
do DPPH, với giá trị IC50 là 1,18µg chất khô/ml. Ngoài ra, dịch chiết lá ổi thể hiện

hoạt tính ức chế emzyme polyphenoloxidase cao hơn so với dịch chiết từ lá trầu
không, lá trà xanh, lá lốt, lá nhàu, lá khoai lang. [4]
8

Các công trình nghiên cứu nước ngoài về lá cây ổi


Thành phần quercetin trong lá ổi có khả năng chống tiêu chảy, ngoài ra các dẫn
xuất của quercetin cũng có tác dụng kháng vi khuẩn; tác dụng kháng viêm và chống
lại tác nhân gây mụn trứng cá Propionibacterium acnes; kháng ký sinh trình gây
bệnh sốt rét, ức chế trùng kiết lị (Entamoeba histolytica) gây bệnh viêm niêm mạc
ruột; giảm ho, bảo vệ gan (Hepatoprotective effects); các chiết xuất từ lá ổi và tinh
dầu ổi có khả năng ức chế tế bào ung thư; khả năng kháng vi nấm thuộc chủng
Arthrinium sacchari M001 và Chaetomium funicola M002. [13]
Lá ổi khô thu từ khuôn viên trường Đại học Bayero, được chiết với dung môi nước,
ethanol và chlorofom bằng phương pháp thẩm thấu. Chiết xuất từ lá ổi được phân
tích hóa học để phát hiện sự hiện diện của các chất chuyển hóa thứ cấp; kết quả
sàng lọc hóa học cho thấy sự hiện diện của tannin, flavonoid, steroid, terpenoid và
phenol. Ngoài ra, chiết xuất từ lá ổi cũng cho thấy khả năng kháng khuẩn với các
chủng Salmonella Typhi; Salmonella Paratyphi A và Salmonella Paratyphi B. [14]
Tổng hợp các nghiên cứu về các dẫn xuất có khả năng kháng oxy hóa của ổi. Kết
quả cho thấy các dẫn xuất có khả năng kháng oxy hóa như: flavonoids, terpenoids,
tannins, saponins, steroids, amino acids, vitamin C. [12]
Tinh dầu được tìm thấy trong lá ổi bằng phương pháp chưng cất, có hoạt tính kháng
khuẩn với các chủng Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus và
Streptococcus aureus và ba Gram(-) Escherichia coli; Haemophilusenzae và
Pseudomonas aerugosa. Bằng phương pháp GC-MS phát hiện được các chất có mặt
trong tinh dầu như: iso - caryophyllene (33,53%); veridiflorene (13,00%);
farnesene (11,65%); D,L-limonene (9,84%); cadinene (2,80%); α - humulene
(3,74%); aromadendene (1,70%) và cadinol (0,08%). [17]

Nghiên cứu của Ghosh P. (2010) và các cộng sự đã phân lập được hai triterpenoid
betulinic acid và lupeol từ chiết xuất lá của ổi và khảo sát khả năng kháng khuẩn
của hai triterpenoid, kết quả cho thấy tiềm9 năng kháng khuẩn của chúng khá cao. [9]


Tại Việt Nam, ổi là một loại cây khá phổ biến và có sản lượng dồi dào, vì vậy để
khai thác hết các giá trị to lớn mà cây ổi mang lại, chúng ta cần tiếp tục thực hiện
những công trình nghiên cứu về chúng.
Mục tiêu của luận văn là nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa
của lá cây ổi.

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1 Cây nguyên liệu
2.2 Hóa chất - Dụng cụ - Thiết bị
Hóa chất: methanol; ethanol; ethylacetate; chloroform; nước; formic acid; sulfuric
acid; silica gel 60 F254 ; 1,1 - diphenyl 10- 2 - picrylhydrazyl (DPPH); vitamin C;
dimethyl sulfoxide (DMSO).


Dụng cụ: ống đong; bình giải ly dung môi; becher; pipette pasteur; màn lọc; xylanh;
ống nghiệm; bình cầu.
Thiết bị: máy HPLC-MS; máy MPLC; hệ thống HPLC điều chế; máy cô quay; máy
thổi Nitơ; máy ly tâm; máy siêu âm.
2.3 Quy trình
2.3.1 Quy trình chiết

2.3.2 Quy trình phân lập

11

2.4 Phương pháp
2.4.1 Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatograph, TLC) [2]
Sắc ký lớp mỏng còn gọi là sắc ký phẳng, dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thu trong
đó pha động là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua một
pha tĩnh là một chất hấp thu trơ như: silica gel hoặc alumin oxide. Pha tĩnh này
được tráng bằng một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như một tấm kiếng,
tấm nhôm hoặc tấm plastic.(Nguyễn Kim Phi Phụng,2007).
Giá trị Rf
Một hợp chất tinh khiết có một vết với sắc ký lớp mỏng sẽ có giá trị Rf không đổi,
trong một hệ dung môi giải ly xác định và bởi bản sắc ký của một ô sản xuất nhất
định.
Muốn đo Rf: sử dụng thước để đo khoảng đường di chuyển của hợp chất và của
dung môi. Thực hiện bài toán chia, kết quả
R là con số không đơn vị, luôn luôn nhỏ
12 f
hơn một (Rf <1). Quy ước viết Rf với hai con số lẻ sau dấu phẩy.


Giới hạn dung môi

Rf = a/b, (Rf <1)

Mức xuất phát

2.4.2 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid
chromatograph, HPLC) [13],[5]
Năm 1967, Horvath C. là người đầu tiên chế tạo máy HPLC để nghiên cứu về
nucleotic. Ngày nay, HPLC là một kỹ thuật dùng trong hóa phân tích để tách, định
tính và định lượng từng thành phần trong hỗn hợp; HPLC được ứng dụng trong rất

nhiều lĩnh vực nghiên cứu như: dược phẩm, các dung dịch sinh lý, polymer thiên
nhiên và tổng hợp, các dư lượng trong môi trường, các nguyên tố hiện diện trong
mẫu phân tích ở dạng vết.
Máy HPLC hoạt động trong điều kiện: áp suất cao, nhiệt độ phòng, mẫu chất trong
dòng chảy của pha động với lượng lớn thể tích, chất khảo sát ở thể lỏng, vận tốc
dòng chảy lớn (vài mL/phút).
13


2.4.3 Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy, MS) [2]
Phương pháp khối phổ (MS) là một kỹ thuật phân tích hóa học giúp xác định khối
lượng của các ion, mảnh phân tử.
Nguyên lý máy khối phổ: chuyển chất nghiên cứu thành thể khí (bay hơi mẫu ở
nhiệt độ và áp suất thích hợp); tạo các ion từ các phân tử khí; phân tách các ion, ghi
tín hiệu theo khối lượng ion (m/z)
Máy MS hoạt động trong điều kiện: áp suất thấp, nhiệt độ cao, lượng mẫu phân tích
rất nhỏ, chất khảo sát phải ở thể khí, vận tốc dòng chảy nhỏ.
2.4.4 HPLC điều chế [2]
Là phương pháp dùng để cô lập một lượng lớn mẫu chất dùng cho nhiều mục tiêu
khác nhau như để phân tích phổ NMR, thử hoạt tính của chất cần tách…Thực hiện
bằng cách mỗi lần tiêm vào máy một lượng mẫu nhất định; dùng cột loại phân tích
có đường kính phù hợp lượng mẫu tiêm vào máy; lặp lại nhiều lần đến khi thu được
lượng mẫu mong muốn.
2.4.5 Phương pháp chạy sắc ký cột áp suất trung bình (MPLC)
Phương pháp dùng để tách một hỗn hợp gồm nhiều chất thành từng loại đơn chất
riêng biệt, dựa vào độ phân cực khác nhau của các chất đối với hệ thống pha tĩnh
(chất và silica gel) và pha động (một hoặc hệ nhiều dung môi). Dung môi được đẩy
qua cột nhờ áp lực của bơm trung áp.
Cột sắc ký
Sử dụng sắc ký cột pha thường và sắc ký cột pha đảo

Sắc ký cột pha thường: cột được nhồi Silica gel pha thường; khi chạy chất phân cực
14

mạnh được giữ lại trong cột, chạy dung môi từ hệ phân cực thấp đến phân cực cao.


Sắc ký cột pha đảo: chất nhồi cột pha đảo thông thường silica gel C18; khi chạy
chất phân cực yếu sẽ được giữ lại trong cột, chạy dung môi từ phân cực mạnh đến
phân cực yếu.
2.4.6 Phương pháp DPPH kiểm tra hoạt tính chống oxy hóa
Khả năng chống oxy hóa của mẫu phân tích dựa vào nguyên tắc dập tắc gốc tự do
và là đổi màu dung dịch DPPH.

Hóa chất: 1,1 - diphenyl - 2 - picrylhydrazyl; ethanol
Thiết bị: quang phổ UV - Vis

15


CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM
3.1 Chuẩn bị cao chiết
Cho 400 (g) nguyên liệu lá ổi ngâm trong 5 (lít) dung môi ethanol ở nhiệt độ phòng
trong khoảng 24 (h). Hỗn hợp sau khi ngâm được lọc qua giấy lọc, ta thu phần dịch;
phần bã tiếp tục được ngâm với ethanol cho đến khi màu của dịch ngâm nhạt hoàn
toàn. Phần dịch sẽ được cho vào bình cầu cô quay để loại bỏ dung môi, sau khi cô
quay ta thu được phần rắn (gọi là cao tổng) có khối lượng 4,7 (g).
4,7 g cao tổng sẽ được chiết tiếp với dung môi n-Hexane (thu được cao n-Hexane)
và Ehtyl acetate (thu được cao ethyl acetate); khối lượng cao n-Hexane thu được là
m (g) và cao ethyl acetate là m (g). Phương pháp chiết: cho phần cao tổng vào lắc
lần lượt với các dung môi có độ phân cực từ thấp đến cao; khi màu dịch chiết nhạt

dần thì dừng, cho dịch chiết vào cô quay và thu cao.
3.2 Cô lập và tinh sạch hợp chất trong cao

16


17


3.3 Thử hoạt tính kháng oxy hóa
Pha mẫu với dung môi DMSO thành các nồng độ 5, 25, 50, 75, 100 (ppm)
Pha DPPH với dung môi ethanol tuyệt đối cho nồng độ 250μM
Tiến hành lót mẫu với mỗi giếng gồm: 50μl mẫu + 150μl DPPH
Ủ tối khoảng 30 phút, sau đó tiến hành đo độ hấp thu ở bước sóng 520 nm

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ
4.1 Phân lập
4.2 Xác định cấu trúc
4.2.1 Hợp chất 1 (PG1)
Dạng bột, màu vàng; tiến hành chấm sắc ký lớp mỏng (TLC) với hệ dung môi
CHCl3 - MeOH (90:10), quan sát dưới đèn UV có bước sóng 254nm. Phun đều với
dung dịch thuốc thử H2SO410%/ EtOH, 18sau đó nướng dưới nhiệt độ 105 0C; màu
vàng sẽ xuất hiện trên TLC và có giá trị Rf = 0,55.


Định tính bằng HPLC - MS

19

Kết quả
Một peak đơn cường độ mạnh có thời gian lưu tại phút thứ 10,097 và độ tinh khiết
đạt 97,94%; đầu dò MS cho tín hiệu peak ion có m/z [M-H] - = 301,11 và m/z
[M+H]+ = 303,28

Hình 4.1 PG1 sau khi phân lập

Hình 4.2 TLC PG3, hệ CHCl3 - MeOH (90:10)


4.2.2 Hợp chất 2 (PG2)
Dạng bột, màu vàng; tiến hành chấm sắc ký lớp mỏng (TLC) với hệ dung môi
CHCl3 - MeOH (75:25), quan sát dưới đèn UV có bước sóng 254nm. Phun đều với
dung dịch thuốc thử H2SO410%/ EtOH, sau đó nướng dưới nhiệt độ 105 0C; màu
vàng sẽ xuất hiện trên TLC và có giá trị Rf = 0,24.
NMR
HRLC-MS



Hình 4.3 PG2 sau khi phân lập

Hình 4.4 TLC PG2; hệ dung môi CHCl3 - MeOH (75:25)

4.2.3 Hợp chất 3 (PG3)
Dạng bột hơi dầu, màu vàng; tiến hành chấm sắc ký lớp mỏng (TLC) với hệ dung
môi CHCl3 - MeOH - HCOOH (75:25:2); quan sát dưới đèn UV có bước sóng
254nm. Phun đều với dung dịch thuốc thử H 2SO410%/ EtOH, sau đó nướng dưới
nhiệt độ 1050C; màu vàng sẽ xuất hiện trên TLC và có giá trị Rf = 0,39.

Hình 4.5: Kết PG3 sau khi chạy HPLC điều chế


Hình 4.6: PG3 sau khi phân lập

Hình 4.7: TLC PG3; hệ dung môi CHCl3 - MeOH - HCOOH (75:25:2)