(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện môi trường nuôi cấy đến năng suất, chất lượng của nấm đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
----------------------------------

VŨ HOÀI NAM

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC
ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐẾN
NĂNG SUẤT, CHẤT LƯỢNG CỦA NẤM
ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (Cordyceps militaris)

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN – 2018


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
----------------------------------

VŨ HOÀI NAM

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC
ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐẾN
NĂNG SUẤT, CHẤT LƯỢNG CỦA NẤM
ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (Cordyceps militaris)
Ngành Công nghệ sinh học
Mã số: 8 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Ngươi hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Dương Văn Cường

THÁI NGUYÊN – 2018


i
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp, em đã nhận được
sự giúp đỡ về nhiều mặt của các cấp lãnh đạo, các tập thể và các cá nhân.
Trước tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến PGS.TS.Dương
Văn Cường đã luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực
hiện và hoàn thành luận văn này.
Em xin bày tỏ lời cảm ơn đến ThS. Ma Thị Trang cùng các cán bộ Viện
Khoa học sự sống trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo điều kiện
thuận lợi cho em hoàn thành đề tài nghiên cứu này.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới gia đình,
người thân và bạn bè đã động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và
thực hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, ngày tháng
Học Viên
Vũ Hoài Nam

năm 2018


ii
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i
MỤC LỤC ......................................................................................................... ii

DANH MỤC BẢNG ......................................................................................... v
DANH MỤC HÌNH ........................................................................................ vii
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài. .......................................................................................... 1
2 Mục đích nghiên cứu ...................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 3
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 4
1.1. Tổng quan về Đông trùng hạ thảo .............................................................. 4
1.1.1. Tên gọi Đông trùng hạ thảo .................................................................... 4
1.1.2. Nguồn gốc và phân loại........................................................................... 4
1.1.4. Nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris ........................................ 6
1.2 Giá trị nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris.................................. 7
1.2.1 Giá trị dược liệu ....................................................................................... 7
1.2.2. Giá trị dinh dưỡng ................................................................................. 11
1.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng, phát triển nấm Đông trùng hạ thảo
Cordyceps militaris ......................................................................................... 13
1.3.1. Vai trò của giống. .................................................................................. 13
1.3.2. Yếu tố dinh dưỡng................................................................................. 14
1.4 Tiềm năng nuôi trồng Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris trên giá thể
nhân tạo thể rắn ............................................................................................... 15
1.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ............................................... 16
1.5.1. Tình hình nghiên cứu trong nước.......................................................... 16
1.5.2. Tình hình nghiên cứu trên Thế gới ....................................................... 19


iii
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU ................................................................................................................ 21
2.1. Đối tượng, phạm vi, vật liệu nghiên cứu ................................................. 21
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................ 21

2.1.2 Phạm vi nghiên cứu ................................................................................ 21
2.2. Hóa chất và thiết bị .................................................................................. 21
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................ 22
2.2.1 Địa điểm nghiên cứu .............................................................................. 22
2.2.2 Thời gian nghiên cứu ............................................................................. 22
2.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 22
2.4 Phương pháp nghiên cứu........................................................................... 22
2.4.1. Bố trí thí nghiệm ................................................................................... 23
2.4.2. Phương pháp chuẩn bị giống cấp I ........................................................ 23
2.4.3. Phương pháp cấy giống ......................................................................... 24
2.4.4. Phương pháp xử lý số liệu..................................................................... 25
2.4.5. Phương pháp phân tích hàm lượng cordycepin .................................... 27
2.5. Sơ đồ phương pháp nghiên cứu ............................................................... 31
2.6. Chỉ tiêu theo dõi ....................................................................................... 29
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................ 32
3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các môi trường nhân giống cấp I tới
sinh trưởng và phát triển của nấm Đông trùng hạ thảo ................................... 32
3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của loại gạo khác nhau dùng làm giá thể tới
khả năng sinh trưởng và phát triên nấm Đông trùng hạ thảo.......................... 35
3.3. Ảnh hưởng của các nguồn carbon đến khả năng sinh trưởng của sợi nấm,
sự hình thành và phát triển của quả thể, năng suất sinh học. .......................... 37
3.4. Ảnh hưởng của các nguồn ni to đến khả năng sinh trưởng của sợi nấm, sự
hình thành và phát triển của quả thể, năng suất sinh học................................ 42


iv
3.5. Ảnh hưởng của muối đến khả năng sinh trưởng của sợi nấm, sự hình thành
và phát triển của quả thể, năng suất sinh học .................................................. 46
3.6 Kết quả nghiên cứu mối tương quan giữa các nguồn dinh dưỡng đến sự hình
thành và phát triển quả thể nấm Cordyceps militaris trên môi trường nhân tạo.

......................................................................................................................... 50
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 53
4.1 Kết luận ..................................................................................................... 53
4.2 Đề nghị ...................................................................................................... 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 55


v

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

BE

:

Biological efficiency

ĐC

:

Đối chứng

ĐTHT

:

Đông trùng hạ thảo

PDA

:

Potatose dextrose Aga

SDAY

:

Sabouraud Maltose aga plus Yeast Extract

SMAY

:

Sabouraud Dextrose aga plus Yeast Extract

WA

:

Water agar


vi
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng nấm ĐTHT Cordyceps militaris .............. 12
Bảng 2.1: Thiết bị, dụng cụ và hóa chất.......................................................... 21
Bảng 3.1: So sánh về tốc độ phát triển của khuẩn lạc trên môi trường nhân
giống cấp I. ...................................................................................................... 33

Bảng 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đến sự phát triển của hệ
sợi nấm Đông trùng hạ thảo ............................................................................ 34
Bảng 3.3: bảng tổng hợp đánh giá khả năng thích nghi của hệ sợi nấm trên các
loại cơ chất giá thể khác nhau. ........................................................................ 35
Bảng 3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các cơ chất gạo đến sự hình thành
và phát triển của mầm quả thể, năng suất sinh học........................................ 36
Bảng 3.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng các nguồn carbon tới năng suất nuôi
trồng nấm Đông trùng hạ thảo ........................................................................ 40
Bảng 3.6: Bảng phân tích ảnh hưởng của nguồn carbon tới hàm lượng
Cordycepine ở quả thể nấm ĐTHT ................................................................. 41
Bảng 3.7 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng các nguồn ni to khác nhau tới năng
suất nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo ......................................................... 44
Bảng 3.8: Bảng phân tích ảnh hưởng của nguồn ni tơ tới hàm lượng
Cordycepine ở quả thể nấm ĐTHT ................................................................. 45
Bảng 3.9. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng muối khoáng khác nhau tới năng suất
nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo ................................................................ 48
Bảng 3.10: Bảng phân tích ảnh hưởng của nguồn muối khoáng tới hàm lượng
Cordycepine ở quả thể nấm ĐTHT ................................................................. 49
Bảng 3.11: Xác định nguồn dinh dưỡng và mức biến đổi các yếu tố dinh dưỡng 50
Bảng 3.12: Ma trận kết quả mối tương quan giữa các yếu tố dinh dưỡng tới
năng suất nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo ................................................ 51


vii
DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Đông trùng hạ thảo trong tự nhiên . ................................................... 4
Hình 1.2 Phân loại nấm Cordyceps ................................................................... 5
Hình 1.3 Vòng đời sinh trưởng của nấm Đông trùng hạ thảo........................... 6
Hình 2.1: Sơ đồ quy trình nuôi cấy nấm Đông trùng hạ thảo ......................... 30

Hình 3.1: Hệ sợi nấm Cordyceps militaris trên các môi trường nhân giống cấp
I sau 10 ngày ................................................................................................... 32
Hình 3.2: Hệ sợi nấm Cordyceps militaris ở môi trường PDA có bổ sung các
nồng độ pepton khác nhau sau 15 ngày .......................................................... 34
Hình 3.3: Kết quả khảo sát mật độ quả thể nấm ĐTHT trên các loại cơ chất gạo
khác nhau......................................................................................................... 37
Hình 3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn carbon đến khả năng sinh
trưởng của sợi nấm. ......................................................................................... 38
Hình 3.5 Ảnh hưởng của nguồn carbon tới sinh trưởng và phát triển của quả thể
nấm Đông trùng hạ thảo .................................................................................. 39
Hình 3.6. Ảnh hưởng của các nguồn carbon khác nhau tới năng suất nuôi trồng
nấm .................................................................................................................. 41
Hình 3.7. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn ni tơ đến khả năng sinh
trưởng của sợi nấm .......................................................................................... 42
Hình 3.8 Ảnh hưởng của nguồn ni tơ tới sinh trưởng và phát triển của quả thể
nấm Đông trùng hạ thảo .................................................................................. 43
Hình 3.9 Ảnh hưởng của các nguồn ni tơ khác nhau tới năng suất nuôi trồng
nấm .................................................................................................................. 44
Hình 3.10. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn muối khoáng đến khả
năng sinh trưởng của sợi nấm ......................................................................... 46
Hình 3.11. Ảnh hưởng của muối khoáng tới sinh trưởng và phát triển của quả
thể nấm Đông trùng hạ thảo ............................................................................ 47
Hình 3.12. Ảnh hưởng của các muối khoáng khác nhau tới năng suất nuôi trồng
nấm .................................................................................................................. 49


1
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài.
Đông trùng hạ thảo là tên gọi chung chỉ những loài nấm thuộc lớp

Ascomycetes kí sinh trên ấu trùng các loài bướm thuộc chi Thitarodes. Tên gọi
của chúng bắt nguồn từ những quan sát thực tế: vào mùa Đông bào tử nấm xâm
nhiễm, ký sinh trong cơ thể ấu trùng (Đông trùng), đến mùa hè quả thể nấm mọc
chồi từ đầu con sâu nhô lên khỏi mặt đất trông giống một loại thực vật (Hạ thảo)
vì vậy nó có tên là Đông trùng hạ thảo.
Từ y học cổ truyền Trung Hoa cho đến y học hiện đại của các nước phát
triển Mỹ, châu Âu đều công nhận giá trị dược lý của đông trùng hạ thảo. C.
militaris có hàm lượng các hoạt chất có hoạt tính sinh học trong quả thể:
Cordycepin có tác dụng ức chế sự phân hạch và trì hoãn sự lây lan của các tế
bào ung thư (Khan, Tania et al. 2010); Adenosine được chứng minh có tác dụng
điều hòa miễn dịch, bảo vệ tim mạch; Mannitol có tác dụng làm tăng độ thẩm
thấu của huyết tương và dịch trong ống thận, gây lợi niệu thẩm thấu và làm tăng
lưu lượng máu thận; Superoxide dismutise để phòng ngừa và điều trị xuất huyết
não, viêm loét, loại bỏ tình trạng viêm, loạn nhịp tim, phù nề, nhiễm độc, bệnh
thấp khớp, thấp khớp, viêm khớp dạng thấp, tổn thương bức xạ, nhiễm độc
thuyên tắc. Ngoài ra, trong dịch chiết Đông trùng hạ thảo còn chứa chứa nhiều
loại vitamin và acid amin thiết yếu cho cơ thể.
Do có công dụng tốt nên nhu cầu sử dụng ĐTHT ngày càng tăng cao,
trong khi đó nguồn cung cấp từ tự nhiên mỗi năm chỉ đáp ứng được m nhu cầu
thị trường. Bên cạnh đó, hoạt động khai thác quá mức có thể khiến loài nấm
này có nguy cơ bị tuyệt chủng. Trước tình hình đó, các nhà khoa học trên thế
giới như đã tiến hành nghiên cứu nuôi ĐTHT trên môi trường nhân tạo. Trong
các loài thuộc chi Cordyceps, Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris là hai
loài phổ biến và được nghiên cứu nhiều hơn cả. Các hướng nghiên cứu hiện nay


2
chủ yếu theo ba con đường: Một là ĐTHT được nuôi trên ký chủ côn trùng,
mặc dù sản lượng đã được cải thiện song vẫn chưa đáp ứng được ở quy mô
công nghiệp và chi phí sản xuất vẫn còn cao. Hai là, nuôi cấy ĐTHT trên môi

trường dịch lỏng với mục tiêu là nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp hoạt chất
chính là Cordycepine; tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là khâu xử
lý nguồn nước thải sau khi thu hồi hoạt chất, đồng thời việc tách chiết thu hồi
hoạt chất còn phức tạp và giá thành cao. Hướng thứ ba là nuôi trên giá thể rắn
nhân tạo, đây là một hướng đi đầy tiềm năng do: Việc thu hoạch quả thể nấm
trên giá thể nhân tạo không những có thể thu hoạch được hoạt chất sinh học
vốn quý trong nấm mà còn có thêm các acid amin và các vitamin thiết yếu khác.
Bên cạnh đó, nguồn cơ chất nhân tạo còn lại có thể tận dụng phục vụ cho công
tác chăn nuôi. Hơn nữa các báo cáo trước đây đã chứng minh rằng trên quả thể
của nấm có chứa nhiều các hoạt tính sinh học hơn trong các sợi nấm.
Tại Việt Nam, cho đến nay mặc dù đã có nhiều cơ sở và đơn vị nhân nuôi
thành công nấm Đông trùng hạ thảo, tuy nhiên nuôi trồng Đông trùng hạ thảo
trên môi trường nhân tạo gặp phải những khó khăn: Nấm C.militaris có tính
thoái hóa cao nên việc sản xuất nấm không ổn định, hoặc ở một vài nơi mặc dù
nuôi trồng thành công nhưng hàm lượng hoạt chất sinh học không cao. Xuất
phát từ những quan điểm đó, tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ảnh
hưởng của các điều kiện môi trường đến năng suất, chất lượng của nấm
Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris”.
2 Mục đích nghiên cứu

- Đánh giá được ảnh hưởng môi trường nhân giống và các điều kiện dinh
dưỡng tới khả năng sinh tổng hợp Cordycepine của nấm Đông trùng hạ thảo
Cordyceps militaris trên môi trường giá thể thể rắn.


3

3. Mục tiêu nghiên cứu

- Tối ưu hóa các điều kiện dinh dưỡng tới năng suất và hàm lượng

hoạt chất Cordycepine ở nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris.


4
CHƯƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về Đông trùng hạ thảo
1.1.1. Tên gọi Đông trùng hạ thảo
Đông trùng Hạ thảo (ĐTHT) tên khoa học là Cordyceps, chỉ hiện tượng
những loài nấm thuộc lớp Ascomycetes kí sinh trên ấu trùng các loài bọ cánh
phấn thuộc chi Thitarodes. Tên gọi chúng xuất phát từ quan sát thực tế: vào mùa
Đông bào tử nấm xâm nhiễm, ký sinh trong cơ thể ấu trùng (Đông trùng), đến
mùa hè quả thể nấm mọc chồi từ đầu con sâu nhô lên khỏi mặt đất trông giống
một loại thực vật (Hạ thảo) vì vậy nó có tên là Đông trùng hạ thảo.

Hình 1.1 Đông trùng hạ thảo trong tự nhiên .
1.1.2. Nguồn gốc và phân loại
ĐTHT trong tự nhiên được phát hiện chủ yếu ở một số cao nguyên của
Nepal, Ấn Độ, Trung Quốc và Bhutan…, trung bình các cao nguyên này có độ
cao từ 3500m đến 5000m so với mặt nước biển. Dựa trên đặc điểm hình thái
cũng như đặc điểm cấu trúc phân tử, Đông trùng hạ thảo được xếp vào phân
giới nấm (Fungi), ngành nấm túi (Ascomycota), lớp Sordariomycetes, bộ


5
Hypocreales, họ Cordycipitaceae, chi Cordyceps, bao gồm 400 loài đã được
phát hiện, tuy nhiên cho đến nay người ta mới chỉ tập trung nghiên cứu 2 loài
nấm Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris có giá trị dược liệu tốt với con
người.

Hình 1.2 Phân loại nấm Cordyceps
1.1.3 Cơ chế xâm nhiễm vào ký chủ của nấm Đông trùng hạ thảo
Trong tự nhiên, nấm Đông trùng hạ thảo được coi là nấm gây bệnh cho
côn trùng do chúng ký sinh trên cơ thể ấu trùng hoặc côn trùng đã trưởng thành.
Các loài thuộc chi Cordyceps khác nhau lây nhiễm ở giai đoạn nhộng và các
ký chủ khác nhau, rồi nhân lên trong cơ thể ký chủ. Vào cuối thu hoặc đầu mùa
đông, bào tử nấm nhờ gió phát tán ra bên ngoài và tìm kiếm cơ thể ký chủ phù
hợp. Khi tiếp xúc với ký chủ, bào tử nấm bắt đầu hı̀nh thành các ống nảy mầm
có các thể bám. Các ống này tiết ra các enzyme như lipase, chitinase, protease…
làm tan vỏ ngoài của ký chủ và xâm nhập vào bên trong cơ thể. Một vài
loài Cordyceps còn có khả năng tác động tới hành vi vật chủ, khiến chúng phải
leo lên cây và gắn mình vào đó trước khi chết để đảm bảo sự phát tán bào tử
một cách tối đa. Sau đó các bào tử bắt đầu hình thành hệ sợi, hê ̣sợi nấm hút
dinh dưỡng và sinh trưởng mạnh mẽ gây chết ký chủ. Khi thời tiết ấm áp hơn,


6
hệ sợi nấm bắt đầu phát triển một cách mạnh mẽ hình thành quả thể và chồi lên
khỏi mặt đất và tiếp tục vòng sinh sản mới nhờ phát tán bào tử.

Hình 1.3 Vòng đời sinh trưởng của nấm Đông trùng hạ thảo
1.1.4. Nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris
Trong cây phân loại loài, Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris được
xem là loài có đặc điểm tiến hóa nhất chi Cordyceps do có phổ kí chủ rộng.
Chúng có thể kí sinh trên cả sâu non, nhộng hoặc cá thể trưởng thành của một số
loại côn trùng. Cordyceps militaris là một loài sinh sản vô tính, sau khi phát
triển thành thục có thể hình thành các nang bào tử; bên trong các nang bào tử là
tập hợp các bào tử đơn và phát tán vào trong không khí. Các bào tử này trong
điều kiện thích hợp sẽ nảy chồi tạo thành các sợi nấm sơ cấp. Các sợi nấm sơ cấp
một mặt không ngừng phát triển để tạo hệ sợi thứ cấp, một mặt tiếp tục xâm nhập

vào cơ thể côn trùng sử dụng nguồn dinh dưỡng trong cơ thể côn trùng. Kết thúc
giai đoạn sinh trưởng, các hệ sợi thứ cấp được liên kết với nhau tạo thành một
khối thồng nhất gọi là quả thể nấm. Quả thể nấm có màu vàng cam hoặc cam
hồng dài khoảng từ 2 – 8 cm. Quả thể nấm tiếp tục phát triển đến giai đoạn thành
thục và phát tán bào tử bắt đầu chu kì sinh trưởng và phát triển mới.


7
So với Cordyceps sinensis, Cordyceps militaris nuôi trồng dễ hơn trong
môi trường nhân tạo. Gần đây, Cordyceps militaris ngày càng được xem như
là một nguồn thay thế cho Cordyceps sinensis vì các chất có hoạt tính sinh học
và tính chất dược liệu tương tự nhau. Hơn nữa, nghiên cứu gần đây cũng đã
chứng minh rằng Cordyceps militaris chứa nhiều loại thành phần có hoạt tính
sinh học như cordycepin, ergosterol, mannitol và polysaccharides....
1.2 Giá trị nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris
1.2.1 Giá trị dược liệu
 Giá trị dược liệu theo y học cổ truyền
Nấm Đông trùng hạ thảo được coi là một dược liệu truyền thống của
Trung Quốc và chữa trị được nhiều bệnh nan y. Theo y học cổ truyền của Trung
Quốc, nấm Đông trùng hạ thảo được dùng để điều trị thành công các chứng rối
loạn lipit máu, viêm phế quản mạn, hen phế quản, viêm thận mạn tính, suy thận,
rối loạn nhịp tim, cao huyết áp, viêm mũi dị ứng, viêm gan B mạn tính, ung thư
phổi và thiểu năng sinh dục...
Những năm gần đây, các nghiên cứu hiện đại đã chứng minh được những
công dụng chữa bệnh và bồi bổ cơ thể mà các nhà Y học cổ truyền đã sử dụng
do các hoạt chất sinh học quý trong quả thể nấm: Cordycepin (3’deoxyadenosine) có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng u, hoạt động
kháng virus (Zhou, Meyer et al. 2002); Adenosine được cho là có tác dụng
điều hòa miễn dịch, bảo vệ tim mạch (Tsai, Lin et al. 2010); Mannitol cũng có
chức năng hoạt tính sinh học, giúp lợi tiểu, chống các chứng ho ra máu (Li,
Yang et al. 2006)… và nhiều loại vitamin khác.

8


Giá trị dược liệu theo y học hiện đại

Đã có những nghiên cứu phân tích được một số thành phần có hoạt chất có
trong nấm Đông trùng hạ thảo như cordycepin (3'-deoxyadenosine),
ergothioneine, ergosterol, D-mannitol, γ-aminobutyric acid (GABA), và
polysaccharides. Do có nhiều hoạt tính hữu ích nên đã được sử dụng cho nhiều
mục đích y học (Mizuno T 1996). Đến nay, hơn 10 nucleoside và các thành
phần liên quan của nó (bao gồm adenine, adenosine, cytidine, cytosine,
guanine, guanosine, uracil, uridine, hypoxanthine, inosine, thymine, thymidine,
2` deoxyuridine, 2`-deoxyadenosine, cordycepin N6-methyladenosine, và 6hydroxyethyl-adenosine) đã được xác định và tách chiết (Chang ST and Wasser
SP 2012).
Một số hoạt chất quan trọng mang giá trị dược liệu
Cordycepin (3'-deoxyadenosine)
Cordycepin là thành phần hoạt chất chính có trong quả thể Cordyceps
militaris, được phát hiện lần đầu tiên từ Cordyceps militaris và sau đó tìm thấy
có mặt trong Cordyceps sinensis (Cunningham, Manson et al. 1950) và
Cordyceps kyushuensis (Ling JY, Sun YJ et al. 2002).
Theo Khan và cộng sự (2010), Cordycepine trong ĐTHT có khả năng ức
chế sự phát triển của khối U, tăng thời gian sống cho những con chuột được
cấy tế bào Sarcoma S180 và ức chế sự di căn của tế bào ung thư (Asaduzzaman
Khan, Mousumi Tania et al. 2010). Dịch chiết từ nấm ĐTHT ức chế sự phát
triển của tế bào máu từ cuống rốn (HUVEC), dòng tế bào mô mềm Sarcoma
gây ung thư ác tính HT180. Dịch chiết của nấm này cũng giảm
metalloproteinase 2(mmp2) biểu hiện gen trong tế bào HT1080. Mới đây người
ta cũng đã phát hiện ra một emzym phân giải protein từ các quả thể khô của

Cordyceps militaris có khả năng chống lại tính độc của các tế bào u vú và ung
thư bàng quang.


9
Cơ chế chống ung thư quan trọng nhất của nấm ĐTHT là hoạt hóa lại quá
trình apoptosis (tế bào tự chết) của các tế bào ung thư. Trong một nghiên cứu
Park et al. (2009) quan sát thấy rằng dịch chiết ĐTHT ức chế sự tăng trưởng tế
bào bạch cầu U937 ở người bằng cách làm biến dạng hình thái của tế bào hoặc
làm cho tế bào chết theo chương trình apoptosis (chương trình tự chết của tế
bào) (Park, Na et al. 2009). Một nghiên cứu khác cũng chứng minh khả năng
ức chế tăng trưởng và gây ra sự chết tế bào của nước chiết nấm Cordyceps
militaris trong điều trị tế bào ung thư phổi A594.
Adenosine (C10H13N5O4)
Nucleotides (bao gồm adenosine, uridine, cytidine, uracil và guanosine)
là các thành phần quan trọng trong Cordyceps militaris (Kredich NM and
Guarino AJ 1961).. Adenosine có nhiều tác dụng dược lý, nó có thể điều trị suy
tim mãn tính và ức chế sự dẫn truyền thần kinh trong hệ thần kinh trung ương.
Các nucleosides khác cũng có thể được sử dụng để điều trị nhiều bệnh khác
nhau. Ribeiro (1995) thấy rằng adenosine ức chế sự dẫn truyền hệ thần kinh
kích thích. Dunwiddie & Masino (2001) nhận thấy rằng adenosine là một bộ
điều biến có tác dụng ức chế và tổng hợp về hoạt động thần kinh, trong đó bao
gồm quy định của giấc ngủ và mức độ hưng phấn, rối loạn thần kinh, quy định
về giữ tính nhạy cảm, vận động, giảm đau, điều hòa những tác động của ethanol
và chất gây nghiện. Tabrizchi & Bedi (2001) xem xét các đặc tính của phân
nhóm của các thụ thể adenosine trong mạch máu, cũng như ảnh hưởng của các
thụ thể adenosine trên hệ tuần hoàn ngoại biên. Carlezon et al. (2005) nhận thấy
rằng cytidine có tác dụng chống trầm cảm giống như trong các thử nghiệm bơi
ở chuột (Baik JS, Kwon HY et al.).
Cordycepic acid (D-mannitol)(C6H14O6)

Cordycepic acid, một chất đồng phân của axit quinic, là một trong những thành
phần dược phẩm chính hoạt động. Cordycepic acid đã được xác định là D-


10
mannitol. Mannitol là một chế phẩm sinh học với hoạt động sinh học quan trọng.
Hàm lượng của mannitol trong loài Cordyceps thay đổi theo môi trường sống.
Nghiên cứu cho thấy, có khoảng 25-80 mg/g ở trong quả thể nấm (Chatterjee R,
Srinivasan KS et al. 1957),(Liu JM, Zhong YR et al. 1989).
Polysaccharides
Một số polysaccharides và đường khác đã được xác định có trong chiết xuất
Cordyceps militaris và các hoạt động dược lý của chúng đã được nghiên cứu.
Những polysaccharides có hiệu quả trong việc điều chỉnh lượng đường trong
máu, ngăn ngừa di căn, chống ung thư cũng như bảo vệ gan và tác dụng hạ
huyết áp (Kim JR, Yeon SH et al. 2002),(Yu R, Song L et al. 2004).
Ergosterol (C28H44O)
Ergosterol là sterol duy nhất có trong nấm và là một tiền chất quan trọng
của vitamin D2, nó có giá trị chữa bệnh quan trọng (Peterson RRM 2008).
Lovastatin
Lovastatin, một trong những chất chuyển hóa thứ cấp trước đây tìm thấy ở
các loài nấm mốc thuộc chi Monascus, là một 3-hydroxy-3-methylglutarylcoenzym A xúc tác trong quá trình sinh tổng hợp cholesterol và đã được chứng
minh là có hiệu quả chống viêm, chống oxy hóa, và tính profibrinolytic và để
ngăn chặn hội chứng mạch vành cấp tính và bệnh xơ vữa động mạch (Aarons
CB, Cohen PA et al. 2007).
GABA
GABA là một trong những chất dẫn truyền thần kinh ức chế trong hệ thống
thần kinh trung ương và ức chế dẫn truyền thần kinh giao cảm ngoại biên. Một
vai trò quan trọng đối với GABA ở cả điều khiển hệ thống thần kinh trung ương
và ngoại vi đến huyết áp đã được chứng minh (Suzuki R, Maehara R et al.
2012).

11
GABA cũng có vai trò miễn dịch khuếch đại trong các bệnh viêm thần kinh
chẳng hạn như bệnh đa xơ cứng (Carmans S, Hendriks J et al. 2013).
Ergothioneine
Ergothioneine là một dẫn xuất histidine với lưu huỳnh vào vòng imidazole
và amin trimethylated (Turner E, Klevit R et al. 1986).
Nhiều thử nghiệm cho thấy đây là chất chống oxy hóa và có khả năng hoạt
hóa các tế bào chống lại một loạt các yếu tố gây stress tế bào (Cheah I and
Halliwell B 2012)
Ergothioneine đã được chứng minh là chất tác dụng ngăn ngừa bức xạ và
dọn dẹp các gốc tự do, các gốc hydroxyl, axit hypochlorous, và các gốc peroxyl
cũng như để ức chế nitrat peroxynitrite vào các protein và DNA (Dubost NJ,
Beelman RB et al. 2007).
Tuy nhiên, ergothioneine là hầu như chỉ được sản xuất bởi nấm và một số sinh
vật nhân sơ (Bello M, Barrera-Perez V et al. 2012). Ergothioneine chỉ có thể được
hấp thụ từ chế độ ăn uống và không thể tự sinh tổng hợp được ở người.
1.2.2. Giá trị dinh dưỡng
Bên cạnh các giá trị dược liệu đã được y học hiện đại chứng minh, các
phân tích dịch chiết nấm Đông trùng hạ thảo cũng cho thấy trong thành phần
của nấm có nhiều acid amin khác nhau, D-mannitol, lipit và nhiều nguyên tố
khoáng (Se, Zn, Cu...).
Tác giả Hur 2008 cũng công bố một số kết quả nghiên cứu về thành phần
hóa học của nấm ĐTHT Cordyceps militaris như sau:


12
Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng nấm ĐTHT Cordyceps militaris
(Hyun Hur 2008)

Thành phần

Hàm lượng
Quả thể

Hệ sợi

Amino acid (mg/g)

69,32

14,03

Aspartic

4,75

0,36

Serine

3,13

0,39

Glutamic

8,79

1,40

Glycine

1,84

0,52

Histedine

1,84

0,46

Arginine

5,29

0,65

Threonine

5,99

0,86

Alanine

5,18

0,98

Proline

6,68

2,99

Tyrosine

3,39

1,27

Valine

3,36

0,65

Methionine

0,18

0,07

Lysine

15,06

2,20

Isoleucine

1,16

0,35

Leucine

1,43

0,46

Phenylalanine

1,15

0,42

Palmitic

24,5

21,5

Palmitoeic

2,3

2,1

Stearic

5,8

5,0

Oleic

6,0

17,7

Linoleic

61,3

33,0

Adenosine (%)

0,18

0,06

Cordycepin (%)

0,97

0,36

Acid béo (%)


13
1.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng, phát triển nấm Đông trùng hạ
thảo Cordyceps militaris
1.3.1. Vai trò của giống.
Quả thể nấm được sinh ra cần phải có các điều kiện cần và đủ, đó là giống
nấm và cơ chất có nguồn carbon. Trong đó, giống nấm là yếu tố quyết định
đến sản lượng và chất lượng của nấm làm ra. Một giống khỏe mạnh sẽ sinh
trưởng hệ sợi thuận lợi trên các nguồn cơ chất khác nhau và có khả năng hình
thành quả thể tốt. Mỗi giống lại có một khoảng thời gian sử dụng nhất định,
vượt qua ngưỡng thời gian này sức sinh trưởng của nấm sẽ giảm, giống bị suy
thoái. Một số dấu hiệu của giống thoái hóa bao gồm: giảm tỷ lệ sinh trưởng,
mật độ hệ sợi thấp, năng suất thấp hoặc hình thái quả thể bị biến dạng. Các
chủng thoái hóa có hoạt tính dehydrogenase giảm, quả thể nấm thay đổi sắc tố.
Bản chất của thoái hóa giống ở các chủng ĐTHT nói riêng và các loại nấm
khác nói chung là do đột biết DNA(Li, Wu et al. 2003). Càng nuôi trồng qua
nhiều thế hệ thì tần số đột biến DNA càng lớn dẫn đến các tình trạng thoái hóa
càng cao.
Một trong những nguyên nhân dẫn đến tình trạng thoái hóa giống là do
phương pháp phân lập. Hiện nay có 3 phương pháp phân lập được sử dụng
rộng rãi là: phân lập mô tế vào, phân lập đơn bào tử và phân lập bào tử phức.
Giống được tạo ra bằng phương pháp phân lập mô tế bào hoặc bào tử phức có
thời gian thoái hóa nhanh hơn, có thể sau 1, 2 lần cấy chuyển (Shrestha, Park
et al. 2004). Để hạn chế quá trình thoái hóa giống, người ta sử dụng các chủng
phân lập từ đơn bào tử.
Ngoài ra, vật liệu nuôi trồng giống cũng có ảnh hưởng tới sự sinh trưởng
và phát triển của nấm trên cơ chất. Có 2 loại giống được sử dụng trong nuôi

trồng Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris là giống dạng rắn và giống dịch
thể. Cho đến nay, việc sử dụng giống dạng dịch thể là công cụ mang lại hiệu


14
quả cao nhất (Shrestha, Park et al. 2004). Giống nấm trên cơ chất rắn có xu
hướng chuyển sang màu vàng và có tốc độ lan hệ sợi chậm hơn, thời gian cảm
ứng hình thành quả thể cũng lâu hơn.
1.3.2. Yếu tố dinh dưỡng
1.3.2.1 Nguồn dinh dưỡng carbon
Nấm ĐTHT cần một lượng lớn carbon trong quá trình sinh trưởng phát
triển. Nguồn carbon cung cấp vật chất cho quá trình sinh trưởng, tổng hợp hợp
chuyển hóa năng lượng cho các hoạt động của tế bào. Hàm lượng carbon chiếm
khoảng 50% trọng lượng khô quả thể nấm. Nguồn carbon thích hợp cho nấm
phát triển gồm các monosacharide và polysacharide… Nấm có sự khác biệt rất
lớn trong việc sử dụng các nguồn carbon khác nhau.
Các nghiên cứu đã công bố cho thấy những nguồn carbon có thể sử
dụng để nuôi trồng nấm ĐTHT là các loại đường, tinh bột… trong đó thích hợp
nhất là những loại có cấu trúc phân tử nhỏ (Shrestha et al., 2012)
1.3.2.2 Nguồn dinh dưỡng ni tơ
Ni tơ là nguyên tố bắt buộc để tổng hợp acid nucleic và protein cấu trúc
nên tế bào. Dinh dưỡng ni tơ có thể được lấy từ nguồn ni tơ hữu cơ tự nhiên,
nguồn ni tơ tổng hợp, nguồn ni tơ vô cơ là các muối nitrat hay muối amoni.
Theo Gao et al. (2000) cho biết nấm Cordyceps militaris yêu cầu hàm lượng ni
tơ tương đối thấp. Nếu hàm lượng ni tơ quá nhiều trong môi trường sẽ làm
chậm quá trình biệt hóa để hình thành quả thể
1.3.2.3 Nguồn dinh dưỡng khoáng
Một số muối khoáng như K+, Mg2+ và Ca2+ ở nồng độ 0,1 g/l có thể
làm tăng năng suất quả thể. Một vài nguyên tố có thể làm tăng hoạt chất sinh
học của Cordyceps militaris (Dong et al., 2012).

15
1.3.2.4. Các loại vitamin
Vitamin có vai trò trong chu kỳ phát dục của Đông trùng hạ thảo
Cordyceps militaris. Tuy nhiên ĐTHT không có khả năng tổng hợp vitamin
cần thiết, vì vậy trong nuôi trồng người ta thường bổ sung thêm một hàm lượng
vitamin nhất định
1.4 Tiềm năng nuôi trồng Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris trên giá
thể nhân tạo thể rắn
Do có chứa nhiều hoạt chất sinh học quý: cordycepin, adenosin,
polysaccharides, ergosterol và mannitol nên từ lâu ĐTHT được coi là một loại
thảo dược quý, có nhiều giá trị dược liệu trong việc hạ đường huyết, chống
viêm, ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, điều hòa hệ miễn dịch, chống oxi
hóa, tăng hoạt lực của tinh trùng. Tuy nhiên, ĐTHT trong tự nhiên sản lượng
rất ít nên để tìm kiếm và sử dụng ĐTHT tự nhiên làm dược phẩm hoặc thực
phẩm chức năng là vấn đề không khả thi (Hong,2010).
Những nghiên cứu ban đầu trên thế giới về môi trường nuôi trồng ĐTHT
được thực hiện trên côn trùng, mặc dù sản lượng đã được cải thiện song vẫn
chưa đáp ứng được ở quy mô công nghiệp và chi phí sản xuất vẫn còn cao. Bên
cạnh đó, việc tập trung sản xuất các chất hoạt chất quý trong nấm ĐTHT mà
không thu quả thể bằng phương pháp lên men lỏng cũng đang được hướng tới.
Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là khâu xử lý nguồn nước thải sau
khi thu hồi hoạt chất, đồng thời việc tách chiết thu hồi hoạt chất còn phức tạp
và giá thành cao.
Do đó, việc tìm ra nguồn cơ chất thích hợp để nuôi trồng ĐTHT trên giá
thể nhân tạo là giải pháp tối ưu. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng không
có sự chênh lệch quá nhiều giữa giá trị dinh dưỡng trong ĐTHT tự nhiên và
nuôi trên giá thể nhân tạo. Việc thu hoạch quả thể nấm trên giá thể nhân tạo
không những có thể thu hoạch được hoạt chất sinh học vốn quý trong nấm mà

16
còn có thêm các acid amin và các vitamin thiết yếu khác. Bên cạnh đó, nguồn
cơ chất nhân tạo còn lại có thể tận dụng phục vụ cho công tác chăn nuôi không
có sản phẩm phụ thải ra môi trường.
Theo Li và cộng sự (2004), ngũ cốc và một số chất hữu cơ khác: bột đậu,
hạt ngô, lõi ngô, vỏ hạt bông, kê, lúa miến, lúa mì, ngũ gốc, hoa hướng dương
được chứng minh là cơ chất tốt để thay thế côn trùng (Li et a., 2004; Zhao et
al., 2006). Năm 2014, Ting-chi Wen cho thấy sự hình thành quả thể của nấm
ĐTHT trên cơ chất gạo cho năng suất cao hơn đáng kê so với các loại giá thể
khác (Ting, 2014). Kể từ đó, gạo được sử dụng như một thành phần chủ yếu
cho sự sinh trưởng quả thể của ĐTHT (Li, 2002; Zhang 2003; Li et al., 2006;
Wen et al., 2008).
1.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
1.5.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
Ở nước ta nghiên cứu về nấm Cordyceps đang trong giai đoạn mới đạt
được một số kết quả. Việc nghiên cứu mang tính chất điều tra, phát hiện, thu
thập và bước đầu phân lập chúng trong điều kiện Việt Nam.
Nghiên cứu về thành phần loài:Trịnh Tam Kiệt (1996) đã nêu danh mục
các loài nấm Đông trùng hạ thảo có ở Việt Nam thuộc họ Clavicipitaceae có 3
loài thuộc chi Cordyceps đó là Cordyceps martialis Speg., Cordyceps sinensis
và loài Cordyceps sobolifera. Các tác giả đã ghi nhận nấm Đông trùng hạ thảo có
phân bố ở các tỉnh của Việt Nam như: Lai Châu, Lào Cai, Yên Bái, Tuyên Quang,
Bắc Cạn, Thái Nguyên, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Bắc Giang, Hà Nội, Ninh Bình,
Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Đà Nẵng, Quảng Nam, Lâm Đồng, Khánh Hòa,
Ninh Thuận, Bình Thuận, Tây Ninh (Trịnh Tam Kiệt 1996).
Năm 2009, Viện Khoa học Lâm Nghiệp Việt Nam và trường Đại học
Lâm Nghiệp đã tiến hành điều tra thu mẫu nấm ĐTHT ( Cordyceps nutans ) tại
khu bảo tồn Tây Yên Tử - Sơn Động - Bắc Giang. Tác giả Phạm Quang Thu