Nghiên cứu thành phần và thử hoạt tính sinh học các hợp chất Cassaine Diterpene Alkaloids từ lá cây Lim xanh Erythrophleum fordii, Việt Nam

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

DƯƠNG THANH PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN VÀ THỬ HOẠT
TÍNH SINH HỌC CÁC HỢP CHẤT CASSAINE
DITERPENE ALKALOIDS TỪ LÁ CÂY LIM
XANH ERYTHROPHLEUM FORDII, VIỆT NAM

Chuyên ngành: HÓA HỮU CƠ
Mã số: 60 44 01 14

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Đà Nẵng, Năm 2017


Công trình được hoàn thành tại
TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN MINH HIỀN

Phản biện 1: PGS.TS. Trần Thị Xô
Phản biện 2: TS. Trần Mạnh Lục

Luận văn đã được bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận văn
tốt nghiệp thạc sĩ Khoa học họp tại Đại học Đà Nẵng vào ngày
09 tháng 09 năm 2017

Có thể tìm hiểu luận văn tại:

 Trung tâm Thông tin-Học liệu, Đại học Đà Nẵng
 Thư viện trường Đại học Bách khoa, Đại học Đà Nẵng


1
MỞ ĐẦU
1.Đặt vấn đề
Lim xanh có tên khoa học là Erythrophleum fordii, phân bổ
chủ yếu ở Việt Nam, Trung Quốc và Đài Loan. Trong các bài thuốc
dân gian cổ truyền Trung Quốc, lim xanh được sử dụng như một bài
thuốc giúp tăng tuần hoàn máu. Lim xanh là cây gỗ lớn, cao 37-45m,
đường kính có khi tới 2-2,5m, thường xanh. Gốc có bạnh vè, thân
tròn, phân cành nhánh lớn, tán lá hình ô, dày, rộng. Vỏ màu nâu,
bong vảy lớn, khi non có nhiều bì khổng. Lá kép lông chim 2 lần với
3-5 đôi cuống thứ cấp và mỗi cuống mang 9-15 lá chét hình trái
xoan, đầu nhọn, gốc tròn.
Là cây đặc hữu của Việt Nam, phân bố ở đai thấp vùng có
lượng mưa 1500-3000 mm/năm, từ Quảng Ninh, Bắc Giang, Phú
Thọ, Vĩnh Phúc, Hoà Bình, Thanh Hoá, Nghệ An, Quảng Bình,
Huế, Quảng Nam tới Bình Thuận. Là cây ưa sáng, lúc non chịu
bóng, lớn lên tính ưa sáng càng rõ và thường chiếm tầng trên của
rừng. Lim xanh ưa đất feralit đỏ vàng, tốt, tầng dày, ẩm mát, còn
tính chất đất rừng, tái sinh dưới các dạng rừng có độ tàn che 0,30,7, tái sinh chồi mạnh hơn hạt. Sống hỗn giao với Sồi, Giẻ, Trám
trắng, au sau, ăng lẻ, Gội, Trâm,…
Lim xanh được coi là một cây giàu tannin, vỏ cây chứa
khoảng 15,21% tannin. Gỗ lim có dác lõi phân biệt, dác màu xám
nhạt hay vàng nâu; lõi khi mới chặt màu xanh vàng sau chuyển màu
nâu sẫm, rất cứng, thuộc loại tứ thiết; một trong những loại gỗ tốt
nhất của Việt Nam.
Rễ cây có nốt sần cố định đạm làm tăng độ phì của đất. Khi

cây bị chết, rễ mục là giá thể tốt nhất cho loài nấm, một loài nấm làm
thuốc bổ rất quí phát triển. Nấm Lim xanh thường dùng để trị: ung


2
thư gan, xơ gan, viêm gan B, viêm gan C, ung thư đại tràng, đau dạ
dày, thấp khớp, nóng gan,mụn, suy nhược thần kinh….Ngoài ra nấm
lim xanh còn làm tăng sự miễn dịch của cơ thể, làm mạnh gan, cô lập
và diệt các tế bào ung thư.
Trong những năm gần đây việc nghiên cứu các hoạt chất có
hoạt tinh sinh học trong cây lim xanh thu hút sự quan tâm của nhiều
nhà khoa học trên thế giới. Trong lim xanh Erythrophleum fordii có
nhiều cassaine diterpenoid amine, amide và triterpene. Đặc biệt, các
cassaine alkaloid trong cây lim xanh cho thấy hoạt tính tương tự
như cây mao địa hoàng (dùng làm thuốc chữa suy tim). Ngoài ra,
còn cho thấy khả năng gây độc tế bào với một số dòng ung thư.
Vì vậy việc nghiên cứu, phân lập các hoạt chất cassaine alkaloid từ
Erythrophleum fordii, là điều cấp thiết, từ đó có thể thực hiện các
tính toán in-silico, chuyển hoá các nhóm chức để tăng hoạt tính của
các cassaine alkaloid. Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên chúng tôi
quyết định chọn đề tài “Nghiên cứu thành phần và thử hoạt tính
sinh học các hợp chất Cassaine Diterpene Alkaloids từ lá cây lim
xanh Erythrophleum fordii, Việt Nam”
2. Mục tiêu nghiên cứu:
- Xây dựng quy trình chiết tách các hợp chất hóa học trong lá
cây lim xanh.
- Phân tích định tính và định lượng các hợp chất cassaine
diterpene alkaloid có trong lá cây lim xanh Erythrophleum fordii.
- Phân lập các hợp chất hóa học, xác định thành phần hóa học,
cấu trúc của một số hợp chất hóa học có trong lá cây lim xanh.

- Bước đầu khảo sát hoạt tính sinh học các phân đoạn chiết,
các cassaine alkaloid phân lập được


3
3. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
3.1

Đối tượng
Cây lim xanh tại tỉnh Quảng Nam.

3.2.

Nguyên liệu
Cây lim xanh tại Quảng Nam

4. Phương pháp nghiên cứu
4.1 Nghiên cứu lý thuyết
- Nghiên cứu về cây lim xanh : đặc điểm, phân bố, công dụng
- Nghiên cứu về diterpene alkaloid
- Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các phân đoạn
cặn chiết từ cây lim xanh.
- Đánh giá khả năng gây độc tế bào của các hợp chất Cassaine
diterpene alkaloid.
4.1 Nghiên cứu thực nghiệm
- Khảo sát chiết lá của cây lim xanh.
- Phân tích định tính các cassaine diterpene alkaloid có trong
dịch chiết
- Phân tích định lượng các cassaine diterpene alkaloid bằng
phương pháp sắc ký lỏng cao áp ghép khối phổ (LC- MS),

(LC,MS/MS)
- Phân lập một số cấu tử, xác định cấu trúc. Thử hoạt tính sinh
học.
4.Dự kiến tiến độ nghiên cứu
Tháng 12/2016: Xây dựng đề cương nghiên cứu;
- Tháng 01/2017:
+ Chuẩn bị phần tổng quan tài liệu nghiên cứu;
+ Chuẩn bị phòng thí nghiệm, dụng cụ, hóa chất, nguyên liêu và
các trang thiết bị cần thiết để thực hiện thí nghiệm;


4
+ Xây dựng mô hình thí nghiệm;
-Tháng 02– 06/2017: Tiến hành thí nghiệm theo nội dung nghiên
cứu đã xây dựng; thảo luận, xin ý kiến chỉ đạo của giáo viên hướng
dẫn;
- Tháng 07/2017: Xử lý số liệu và hoàn chỉnh luận
văn;
- Tháng 08/2017 : bảo vệ luận văn.


5
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY LIM XANH
1.1.1. Đặc điểm sinh thái
1.1.2. Đặc điểm phân bố
1.1.3. Công dụng của Lim xanh
1.2. LỚP CHẤT DITERPENE
1.2.1. Giới thiệu chung

1.2.2. Phân loại diterpene và công dụng của một số
diterpene điển hình
1.3. CASSAINE DITERPENE ALKALOIDS
1.3.1. Cassaine
1.3.2. Cassaine diterpene alkaloids
1.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1.4.1. Phương pháp chiết
1.4.2. Phương pháp sắc ký bản mỏng và sắc ký cột
1.4.3. Phương pháp sắc ký lỏng cao áp ghép khối phổ (LCMS)


6
CHƯƠNG 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU, DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT
2.1.1. Nguyên liệu
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất
2.2. SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU


7
2.3. LỰA CHỌN PHÂN ĐOẠN CHIẾT TỐI ƯU
2.3.1. Phương pháp chiết
2.3.2. Khảo sát dung môi chiết với dung môi Methanol
2.3.3. Khảo sát dung môi chiết với dung môi Ethanol/nước
2.4. ĐỊNH TÍNH BẰNG CÁC THUỐC THỬ MÀU TƯƠNG
ỨNG
2.4.1. Thuốc thử Mayer
2.4.2. Thuốc thử Wanger
2.4.3. Thuốc thử Dragendoff

2.5. PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH
VÂT
2.6. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ
TRONG CÁC DỊCH CHIẾT
2.7. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ
HOẠT TÍNH SINH HỌC BƯỚC ĐẦU TRONG CÁC PHÂN
ĐOẠN CHIẾT TƯƠNG ỨNG
2.7.1. Phương pháp ESI-MS và phương pháp LC-MS
2.7.2. Phương pháp sắc ký bản mỏng
2.7.3. Phương pháp tách và tinh chế chất
2.7.4. Chạy cột sắc ký phân đoạn F1
2.7.4. Chạy cột sắc ký phân đoạn F11


8
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. ĐỊNH TÍNH BẰNG THUỐC THỬ MÀU
Bột lá Lim xanh sau khi được chiết qua các dung môi Bột lá Lim
xanh sau khi được chiết qua các dung môi : hexane, chloroform,
butanol, ethyl acetate thử qua các loại thuốc thử : Mayer, Wanger,
Dragendroff.
Qua ba thuốc thử dùng để định tính alkaloids, các kết quả
được tổng hợp trong bảng 3.1 dưới đây
Thuốc thử
Dung môi
Mayer

Wanger

Dragendorff

hexane

++

+

+

Chloroform

+

++

++

butanol

+

+

+

Ethyl acetate

+

+

+

Nhận xét : Dựa vào bảng 3.1, cả bốn dịch chiết với bốn dung môi
khác nhau về độ phân cực trong đó butanol là dạng dung môi protic
polar (có khả năng hòa tan các anion thông qua các liên kết Hydro
nhờ vào việc sở hữu Hydro linh động) đều cho thầy sự xuất hiện của
Alkaloid. Tuy nhiên dựa vào độ lập lại, cường độ và lượng kết tủa
thu được, bước đầu có thể kết luận, chiết với chloroform cho lượng
alkaloid nhiều nhất.
3.2. PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH
VẬT
3.2.1. Ảnh hưởng của dịch chiết đến sự sinh trưởng của các
chủng vi khuẩn kiểm định


9
Bảng 3.2. Kết quả ảnh hưởng của dung môi đến sự sinh trưởng
của các chủng vi khuẩn kiểm định
Các chủng vi khuẩn

Dung môi

E.coli

B.cereus

hexane

0,5 ±0,5mm

3±0,5mm

Chloroform

1 ± 0,5 mm

2 ± 0,5 mm

butanol

20 ± 0,5 mm

21 ± 0,5 mm

Ethyl acetate

6 ± 0,5 mm

5 ± 0,5 mm

Nhận xét : Qua kết quả, có thể nhận thấy các mẫu dịch chiết
đã thể hiện hoạt tính ức chế vi sinh vật từ thấp đến cao. Sự khác biệt
về hoạt tính sinh học ức chế đối với các loài vi sinh vật của dịch
chiết có thể do ảnh hưởng nhiều yếu tố.
Từ kết quả trên, mẫu dịch chiết cho hoạt tính kháng sinh cao
nhất là dịch chiết butanol.
3.2.2. Thử hoạt tính kháng sinh của dịch chiết trên các
chủng vi khuẩn kiểm định

Bảng 3.3. Kết quả thử hoạt tính kháng sinh của dịch chiết trên
các chủng vi khuẩn kiểm định
Vi sinh vật thử hoạt tính
E.Coli

Pseudomoas

Klebsilla

Nước cất

-

-

-

hexane

1± 0,5 mm

2 ± 0,5 mm

5 ± 0,5 mm

chloroform

2± 0,5 mm

3 ± 0,5 mm

2 ± 0,5 mm

24 ± 0,5 mm

20 ±0,5mm

butanol
ethyl acetate

19

±

0,5

±

0,5
20 ± 0,5 mm

mm
15
mm

19± 0,5 mm


10
Nhận xét: Qua kết quả trên, có thể nhận thấy cả bốn dịch chiết

đều gây ức chế đối với các vi khuẩn kiểm định với độ lập lại tương
đương các thí nghiệm mục 3.2.1. Ngoài ra, các dung môi không cho
thầy sự ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn khảo
sát, ngoại trừ dung môi butanol. Thử hoạt tính sinh học với vi khuẩn
Pseudomonas thì dịch chiết với dung môi ethyl acetate cho thấy hoạt
tính gây ức chế đối với sự sinh trưởng Pseudomonas là mạnh nhất.
3.3. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THÀNH PHẦN CÓ HOẠT TÍNH
SINH HỌC TRONG DỊCH CHIẾT.
Bảng 3.4. Khối lượng cao sau khi chiết từng phân đoạn với các dung
môi : hexane, chloroform, butanol, ethyl acetate
Dung

môi

chiết Khối lượng cao chiết Khối lượng cao Chiết

phân đoạn

với methanol (g)

với ethanol/nước (g)

hexane

4,003

3,900

Chloroform

4,223

4,321

butanol

3,564

3,786

ethyl acetate

3,211

3,485

Nhận xét: Dựa vào bảng 3.4, mô tả khối lượng cao chiết với từng
dung môi : hexane, chloroform, butanol, ethyl acetate. Qua bảng 3.4,
khối lượng cao thu được nhiều nhất sau khi chiết ứng với dung môi
chlororform, cũng như không có chênh lệch đáng kể khi dung môi
chiết ban đầu là methnol hay hỗn hợp ethanol/nước (95:5,v/v). Điều
này cho thấy có thể tùy theo mục đích nghiên cứu và ứng dụng về
sau mà chọn methanol hoặc hỗn hợp ethanol/nước (95:5,v/v) sao cho
phù hợp.

a) Các hợp chất có hoạt tính sinh học đáng chú ý trong dịch


11
chiết với Methanol

Bảng 3.5. Một số hợp chất có hoạt tính sinh học đáng chú ý trong
dịch chiết hexane
STT

m/z

Tên cấu tử CTPT

1

357

Prolithospermic acid

Công thức cấu tạo

C18H13O8

Từ bảng 3.5, hợp chất được định danh là Prolithospermic acid,
là một dihydroxybenzoic acid, một loại phenolic acid.
Bảng 3.6. Một số hợp chất có hoạt tính sinh học đáng chú ý trong
dịch chiết với chloroform
STT m/z

Tên cấu tử CTPT

1

Rosmarinic acid

359

C18H11O6

2

565

Ethyl
lithospermate
C29H25O12

3

565

Dimethyl
lithospermate
C29H25O12l

Công thức cấu tạo


12
Từ bảng 3.6, hợp chất được định danh là Rosmarinic acid,
Ethyl lithospermate, Dimethyl lithospermate, Rosmarinic acid là một
hợp chất hóa học được tìm thấy trong nhiều loại thực vật, có tính oxy
hóa mạnh.
Bảng 3.7. Một số hợp chất có hoạt tính sinh học đáng chú ý trong
dịch chiết với butanol.

STT

m/z

Tên cấu tử CTPT

1

153

Protocatechuic acid

Công thức cấu tạo

[C7H5O4]

Từ bảng 3.7, hợp chất được định danh là Protocatechuic acid,
Protocatechuic acid là một axit dihydroxybenoic, một loại axit
phenolic. Nó là một chất chuyển hóa chính của các polyphenol chống
oxy hóa có trong trà xanh. Nó có ảnh hưởng hỗn hợp lên tế bào bình
thường và ung thư trong các nghiên cứu in vitro và in vivo


13
Bảng 3.8. Một số hợp chất có hoạt tính sinh học đáng chú ý trong
dịch chiết với ethyl acetate
Tên cấu tử
Công thức cấu tạo
CTPT

STT

m/z

1

717

Salvianolic
acid B
[C36H29O16]

2

717

Salvianolic
acid E
[C36H29O16]

Từ bảng 3.8, hợp chất được định danh là Salvianolic acid B và
Salvianolic E. Hai hợp chất này là các chất chống oxy hóa bảo vệ tế
bào và chất thải gốc tự do đang điều tra cho một loạt các điều kiện từ
rối loạn nhịp tim thiếu máu đến bệnh Alzheimer.
b) Một số hợp chất trong dịch chiết với ethanol/nước
Bảng 3.9. Một số hợp chất có hoạt tính sinh học đáng chú ý trong
dịch chiết hexane
STT
m/z Tên cấu tử CTPT

Công thức cấu tạo
1

153

Protocatechuic
acid
[C7H5O4]

2

551

Monomethyl
lithospermate
[C28H23O12]


14
Từ bảng 3.9, hợp chất được định danh là Protocatechuic và
Monomethylllithospermate.

Protocachuic

acid

là

một

axit

dihydroxybenzoic, một loại axit phenolic. Nó là một chất chuyển hóa
chính của các polyphenol chống oxy hóa có trong trà xanh. Nó có
ảnh hưởng hỗn hợp lên tế bào bình thường và ung thư trong nghiên
cứu in vitro và in vivo
Bảng 3.10. Một số hợp chất có hoạt tính sinh học đáng chú ý trong
STT

m/z

dịch chiết với chloroform
Tên cấu tử CTPT
Công thức cấu tạo

1

313

Salvianolic acid F
[C17H13O6]

Từ bảng 3.10, hợp chất được định danh là Salvianolic acid F.
Hợp chất Salvianolic acid F có hoạt tính chống oxy hóa.
Bảng 3.11. Một số hợp chất có hoạt tính sinh học đáng chú ý trong
STT

m/z

dịch chiết với butanol

Tên cấu tử CTPT
Công thức cấu tạo

1

313

Salvianolic acid F
[C17H13O6]

2

551

Monomethyl lithospermate
[C28H23O12]


15
3

295

1,2Didehydrocryptotanshinone
[C18H17O3]b

4

295

Tanshinone IIA
[C18H17O3]b

Từ bảng 3.11, một số hợp chất được định danh là Salvianolic
acid F, Monomethyl lithospermate, 1,2-Didehydrocryptotanshinone,
Tanshinone IIA. Các hợp chất này có khả năng chống viêm, chống
oxy hóa.
Bảng 3.12. Một số hợp chất có hoạt tính sinh học đáng chú ý trong
STT

m/z

1

277

dịch chiết với ethyl acetate
Tên cấu tử CTPT
Công thức cấu tạo
Tanshinone
[C20H19O5]b

2

313

Salvianolic acid F
[C17H13O6]

3

357

Prolithospermic acid
C18H13O8

4

537

Lithospermic acid
[C18H15O8]


16
Từ bảng 3.12, một số hợp chất có hoạt tính sinh học đáng chú
ý được định danh là Tanshinone, Salvianolic acid F, Protocatechic
acid, Lithospermic acid.
Nhận xét : Các kết quả ESI-MS cho thấy, so với các dịch chiết trong
dung môi hexane và chloroform, các dịch chiết trong dung môi
butanol và ethyl acetate cho thấy thành phần chứa nhiều các hợp chất
phenolic. Mặc dù các mẫu chiết đều cho thấy các peak m/z ứng với
khối lượng phân tử của các cassaie diterpene alkaloid, tuy nhiên đều
lẫn tạp chất rất nhiều. Vì vậy, việc phân lập bằng các phương pháp
sắc kí khác sau khi được các phân đoạn chiết để định danh cụ thể các
cassaine diterpene alkaloid có trong lá của cây Lim xanh là cần thiết.
3.4.THỬ SẮC KÍ BẢN MỎNG KẾT HỢP LC-MS

Hình 2.17. Sắc kí bản mỏng với hệ dung môi methanol : chloroform :
acid acetic (10:70:0,095)

2 g cao chiết chloroform được tách bằng cột silicagel, rửa giải
hệ dung môi M/Cl/AA với tỷ lệ độ phân cực tăng dần từ 10:70:0,095
đến hệ M/Cl với tỷ lệ 10:60; 10:50; 10:40; 10:30; 10:20; 10:10 thu
được 12 phân đoạn (từ F1-F12). Hứng các phân đoạn vào các lọ
penicillin sạch và khô. Kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng với chất hiện
màu là vanillin trong acid sulfuric. Trong đó, một số phân đoạn có
vệt tròn rõ, đồng thời cho các phản ứng màu ứng với sự xuất hiện
của alkaloid, đó là phân đoạn F1, F11.


17
3.4.1. Kết quả phân lập các hợp chất từ dịch chiết bằng GC-MS

Hình 3.19. Phổ GC-MS của các hợp chất phân đoạn F1

Hình 3.20. Phổ GC-MS của các hợp chất phân đoạn F11

Hình 3.21. Phổ GC-MS của các hợp chất phân đoạn F12
Nhận xét: Dựa vào phổ GC-MS, cho thấy các peak khối lượng MS
đều nhỏ hơn 200, không cho thấy các peak tương ứng với m/z của
cassaine diterpene alkaloid (Mr > 400). Vì vậy, các mẫu được gửi đo


18
LC-MS Phòng thí nghiệm Sinh hoá hữu cơ (Prof. Kajihara’s
Laboratory), Khoa Hoá, Đại học Osaka, Osaka, Nhật Bản và kết quả
đo LC-MS được biện luận cụ thể trong phần tiếp theo.
3.4.2. Kết quả phân lập các hợp chất từ dịch chiết bằng GC-MS

Hình 3.22. Phổ LC-MS các hợp chất có trong phân đoạn F1

Dựa vào phổ LC-MS, cho thầy có 05 đỉnh phân tử ở m/z 422.2
[M+H]+; 452.2[M+H]+;480.1[M+H]+;494.2[M+H]+ và 534.2[M+H]+.
Dựa vào kết quả phổ LC-MS và so sánh các hợp chất đã được công
bố [13] từ cây Lim xanh, một số hợp chất cassaine diterpene alkaloid
có mặt trong phân đoạn F1 bao gồm :
m/z 422.2 [M+H]+ là 6a-Hydroxydinorcassamide (B), ứng với công
thức phân tử là C23H35NO6

(B)
m/z 452.2 [M+H] là 3b-Hydroxynorerythrosuamide (A), ứng với
công thức phân tử là C24H37NO7
+


19

(A)
m/z 480.1 [M+H]+ là 3b-Acetoxydinorerythrosuamide(C), ứng với
công thức phân tử là C25H37NO8

(C)
m/z 494.2 [M+H]+ là 3b-Acetoxynorerythrosuamide (D), ứng với
công thức phân tử là C26H40NO8

(D)
m/z 534.2 [M+H]+ là 3b-Tigloyloxynorerythrosuamide (E), ứng với
công thức phân tử là C29H43NO8

(E)
Nhận xét: Đối với các mono cassaine diterpene alkaloid đã

được báo cáo trước đó [2], đều được tìm thấy trong phân đoạn F1.
Đáng lưu ý với điều kiện chạy RP-HPLC bước đầu khảo sát, các hợp
chất này đều có thời gian lưu (rt) khá khác biệt với phổ MS khá sạch,
là cơ sở tham khảo cho điều kiện chạy cột sắc ký lỏng pha đảo tiếp
theo. Và cần thiết phải kết hợp nhiều phương pháp bao gồm chiết


20
lỏng-lỏng, sắc kí cột silicagel và sắc kí lỏng pha đảo RP-HPLC để có
thể phân lập từng mono cassaine diterpene alkaloid riêng biệt.
Đặc biệt với hợp chất F ứng với thời gian lưu rt = 6.5 min với
hàm lượng tương ứng khá cao (10.5 %), nhưng chưa được định danh,
cụ thể theo hình 3.23

Hình 3.23. Phổ LC-MS các hợp chất F có trong phân đoạn F1
Đối với phân đoạn F11, lấy 2 g cao từ phân đoạn F11 hòa tan
trong MeOH để chạy cột sắc kí cột với hệ dung môi M/C/AA với tỷ
lệ độ phân cực tăng dần từ 10:70:0,095 đến hệ M/C với tỷ lệ 10:60;
10:50; 10:40; 10:30; 10:20; 10:10 thu được 2 phân đoạn có Rf gần
giống nhau có kí hiệu là F12 và F13. Dựa vào bản mỏng, lựa chọn
được phân đoạn F12 có vết tròn rõ nhất. Sau đó, phun thuốc thử, cô
đuổi dung môi và gởi mẫu đến Phòng thí nghiệm Sinh hoá hữu cơ
(Prof. Kajihara’s Laboratory), Khoa Hoá, Đại học Osaka, Osaka,
Nhật Bản. Kết quả thu được như hình 3.24.


21

Hình 3.24. Phổ LC-MS các hợp chất có trong phân đoạn F12
Dựa vào phổ LC-MS, cho thấy có 2 đỉnh phân tử ở m/z 773.3

[M+Cl]- và 846.1 [M+Cl]-. Dựa vào kết quả phổ m/z và so sánh các
hợp chất đã được công bố [2] ta có :
m/z 773.3 [M+Cl]- là Erythrophlesin F (G), ứng với công thức
phân tử C42H62NO10

(G)
m/z = 846.1 [M+Cl] là Erythrophlesin D (H) ứng với công thức
-

phân tử C45H66NO12

(H)


22
Nhận xét: Phù hợp với các nghiên cứu trước đó, hàm lượng
của các dạng dimer của cassaine diterpene alkaloid tách được từ cây
Lim xanh khá thấp. Vì vậy lượng chất ban đầu để chiết cần khá lớn
để có thể thu được một lượng đáng kể phục vụ các thí nghiệm tiếp
theo.


23
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
1. Đã xác định được khối lượng cao sau khi chiết phân đoạn
tối ưu nhất là chiết với dung môi Chloroform với 4.223 g (chiết với
Methanol) và 4.321 g (chiết với ethanol/nước)
2. Định tính các Alkaloid sử dụng 3 loại thuốc thử màu :
Mayer, Dragendoff, Wanger với các dịch chiết của từng dung môi.

Dung môi Chloroform là dung môi chứa dịch chiết có nhiều
alkaloids nhất.
3. Đã xác định được một số hợp chất flavonoid có hoạt tính
kháng khuẩn mạnh trong các dịch chiết hexane, chloroform, butanol
và ethyl acetate của lá cây Lim xanh nhờ vào phổ ESI-MS. Qua đó,
giải thích được lí do dịch chiết butanol cho tính kháng khuẩn mạnh
nhất mặc dù hàm lượng alkaloid trong dịch chiết butanol không phải
cao nhất.
4. Sử dụng kết hợp phương pháp chiết lỏng-lỏng, sắc kí cột
silicagel và LC/MS cho phép xác định phân đoạn tách có mặt các
cassain diterpene alkaloid nhiều nhất. Các cassaine diterpene
alkaloid được tôi định danh từ dịch chiết chloroform của lá cây Lim
xanh (Việt Nam) bao gồm 6a-Hydroxydinorcassamide, 3bHydroxynorerythrosuamide, 3b-Acetoxydinorerythrosuamide, 3bAcetoxynorerythrosuamide,
3b-Tigloyloxynorerythrosuamide,
Erythrophlesin F, Erythrophlesin D
KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục nghiên cứu phân lập riêng lẽ với khối lượng lớn
từng Cassaine diterpene alkaloid từ lá cây Lim Xanh (Việt Nam)
bằng quy trình đã được tối ưu hoá nêu trong luận văn, đồng thời thử
hoạt tính sinh học quan trọng bao gồm điều hoà huyết áp và chống
ung thư trên một số dòng ung thư của các hợp chất được phân lập.