Nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo bộ sinh phẩm nested PCR chẩn đoán nhiễm nấm c neoformans trong dịch não tủy

BỘ Y TẾ
VIỆN SỐT RÉT – KÝ SINH TRÙNG – CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG

TRẦN THỊ QUỲNH LIÊN

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHẾ TẠO
BỘ SINH PHẨM NESTED-PCR CHẨN ĐOÁN NHIỄM NẤM
Cryptococcus neoformans TRONG DỊCH NÃO TỦY

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI, 2019


BỘ Y TẾ
VIỆN SỐT RÉT – KÝ SINH TRÙNG – CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG

TRẦN THỊ QUỲNH LIÊN

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHẾ TẠO
BỘ SINH PHẨM NESTED-PCR CHẨN ĐOÁN NHIỄM NẤM
Cryptococcusneoformans TRONG DỊCH NÃO TỦY

Chuyên ngành: Ký sinh trùng y học
Mã số : 62 72 01 16

Hướng dẫn khoa học:
PGS.TS. Cao Trường Sinh
PGS.TS. Nguyễn Thị Hương Bình

HÀ NỘI, 2019

i

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Cao Trường Sinh,
PGS.TS. Nguyễn Thị Hương Bình, đã nhiệt tình chỉ dẫn giúp đỡ tôi hoàn
thành luận án này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn!
PGS.TS. Trần Thanh Dương Viện trưởng và Ban Giám đốc Viện Sốt
rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương; PGS. TS. Cao Bá Lợi cùng toàn
bộ cán bộ Phòng Khoa học – Đào tạo Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn
trùng Trung ương;
Ban chủ nhiệm đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật
sinh học phân tử để chấn đoán một số vi nấm gây bệnh nội tạng ở người” Mã
số CK.10.32/11-15.
PGS.TS. Nguyễn Khắc Lực, TS. Đỗ Ngọc Ánh cùng toàn thể cán bộ bộ
môn Ký sinh trùng – Côn trùng Học viện Quân Y; Khoa Sinh học phân tử
Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương; Trung tâm nghiên cứu
Sinh Y Dược học Quân sự Học viện Quân Y; Khoa Vi sinh Bệnh Viện Chợ
Rẫy; Khoa Vi sinh Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch - Thành phố Hồ Chí Minh;
Bệnh viện Quân y 103; Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung Ương đã tận tình
giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài nghiên cứu.
GS.TS. Lê Bách Quang, PGS.TS. Nguyễn Mạnh Hùng, PGS. TS
Nguyễn Ngọc San,… đã có những ý kiến đóng góp quý báu giúp tôi hoàn
thiện luận án.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ba, Mẹ, Chồng, Con, anh chị
em trong gia đình và bạn bè đồng nghiệp đã động viên khích lệ tôi vượt qua
mọi khó khăn hoàn thành luận án. Luận án chỉ là bước đầu trong sự nghiệp
khoa học. Những lời cảm ơn là chưa đủ vì làm sao kể hết những tình cảm thật

ii

cao quý, những tình cảm đó sẽ theo tôi trong suốt cuộc đời không bao giờ
thay đổi!
Trần Thị Quỳnh Liên


iii

LỜI CAM ĐOAN
Đây là một nhánh của đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu ứng dụng kỹ
thuật sinh học phân tử để chấn đoán một số vi nấm gây bệnh nội tạng ở
người” Mã số CK.10.32/11-15 mà tôi đã trực tiếp tham gia.
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các kết quả, số liệu thu được trong luận án là trung thực và chưa được
công bố trong bất kỳ luận án nào khác.
Các bước tiến hành thực hiện đề tài đúng như đề cương nghiên cứu,
chấp hành đầy đủ các quy định khi tiến hành nghiên cứu.
Nếu có sai sót gì tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm
Hà Nội, ngày

tháng năm 2019

Tác giả

Trần Thị Quỳnh Liên

iv

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
AIDS

Acquired immunodeficiency syndrome (Hội chứng suy giảm
miễn dịch mắc phải)

ADN

Acid Deoxyribonucleic

ARV

Antiretroviral (Liệu pháp kháng retro vi rút)

CFU

Colony forming units (Đơn vị hình thành khuẩn lạc)

CNS

Central nervous system (Hệ Thần kinh Trung ương)

CS

Cộng sự

CSF

Cerebrospinal fluid (Dịch não tủy)

DNT

Dịch não tủy

ELISA

Enzyme-Linked immunosorbent Assay (Phản ứng miễn dịch
hấp phụ liên kết enzym)

EIA

Enzym immunoassay (thử nghiệm miễn dịch enzym)

FP

False positive (Dương tính giả)

FN

False negative (Âm tính giả)

GACA

Giuzotia abyssinica creatinin agra (Thạch nuôi cấy GACA)

GRHP

Ground red hot pepper agar (Thạch ớt đỏ)

HE

Hematoxylin eosin (Nhuộm HE)

HIV

Human immunodeficinecy Virus (vi rút gây suy giảm miễn
dịch ở người)

K

Kappa (Hệ số tương đồng)

LAT

Latex agglutination assay test (Thử nghiệm đông kết latex)

LFA

Lateral flow assay (Thử nghiệm miễn dịch dòng chảy)

MRI

Magnetic resonance imaging (Chụp cộng hưởng từ)

NPV

Negative predictive value (Giá trị tiên đoán âm)

PCR

Polymerase chairn reaction (Phản ứng chuỗi Polymerase)

PAS

Periodic acid schiff (nhuộm PAS)


v

PPV

Positive predictive value (Giá trị tiên đoán dương)

RFLP

Restriction fragment length polymorphism (Đa hình các đoạn
phân cắt giới hạn)

Se

Sensitivity (Độ nhạy)

SOP

Standard operating procedure (Quy trình các thao tác chuẩn)

Sp

Specificity (Độ đặc hiệu)

TN

True negative (dương tính giả)

TP

True positive (dương tính thật)


vi

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................ iii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................. iv
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3
1.1. Đặc điểm sinh học và vai trò y học của nấm Cryptococcus neoformans .. 3
1.1.1. Đặc điểm sinh học của nấm C. neoformans. ........................................... 3
1.1.2. Vai trò y học ............................................................................................ 5
1.1.3. Tình hình viêm màng não do nấm C. neoformans ở trên thế giới và Việt
Nam ................................................................................................................... 9
1.2. Các phương pháp chẩn đoán nhiễm nấm Cryptococcus neoformans ...... 13
1.2.1. Chẩn đoán trực tiếp ............................................................................... 14
1.2.2. Chẩn đoán miễn dịch học phát hiện kháng nguyên .............................. 16
1.2.3. Chẩn đoán bằng kỹ thuật sinh học phân tử ........................................... 17
1.3. Nghiên cứu xây dựng và chuẩn hóa các bộ sinh phẩm PCR chẩn đoán tác
nhân gây bệnh.................................................................................................. 23

1.3.1. Thiết kế và chuẩn hóa nồng độ mồi cho phản ứng PCR ....................... 25
1.3.2. Chuẩn hóa các điều kiện của phản ứng PCR ....................................... 27
1.3.3. Xác định ngưỡng phát hiện, xây dựng chuẩn dương của kỹ thuật ...... 31
1.4. Nghiên cứu đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ sinh phẩm
PCR chẩn đoán tác nhân gây bệnh .................................................................. 32
1.4.1.Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của một xét nghiệm chẩn đoán ........... 32
1.4.2. So sánh tính tương đồng của bộ sinh phẩm .......................................... 35
1.4.3. Đánh giá tính ổn định của bộ sinh phẩm............................................... 36
1.4.4. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của bộ sinh phẩm ...................................... 36


vii

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 37
2.1. Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu .............................................. 37
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................ 37
2.1.2. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 38
2.1.3. Thời gian nghiên cứu: ........................................................................... 39
2.2. Dụng cụ, vật liệu, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ............................... 39
2.2.1. Cơ sở vật chất và trang thiết bị, máy móc ............................................. 39
2.2.2. Sinh phẩm hóa chất ............................................................................... 39
2.2.3. Các hóa chất, sinh phẩm khác ............................................................... 40
2.2.4. Dụng cụ, phụ tùng, vật tư tiêu hao ........................................................ 40
2.3. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 40
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu thực nghiệm phòng thí nghiệm ....... 40
2.3.2. Mẫu nghiên cứu ..................................................................................... 42
2.3.3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................. 44
2.3.4. Các chỉ số nghiên cứu ........................................................................... 50
2.3.5. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu ................................................ 51
2.4. Phương pháp kiểm soát nhiễu và sai số trong nghiên cứu ....................... 63

2.5. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu ................................................... 63
2.6. Đạo đức trong nghiên cứu ........................................................................ 66
2.7. Nhiễm sai số và cách hạn chế .................................................................. 66
2.8. Hạn chế của đề tài .................................................................................... 67
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................... 68
3.1. Kết quả xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR
chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans ............................................................. 68
3.1.1. Kết quả giám định loài vi nấm C. neoformans để sử dụng cho nghiên
cứu ................................................................................................................... 68


viii

3.1.2. Kết quả thiết kế/lựa chọn mồi cho kỹ thuật nested-PCR chẩn đoán
nhiễm nấm C. neoformans .............................................................................. 71
3.1.3. Kết quả xác định các điều kiện cho kỹ thuật nested-PCR chẩn đoán
nhiễm nấm C. neoformans .............................................................................. 78
3.1.4. Kết quả chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm
C. neoformans ................................................................................................. 92
3.2. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của bộ sinh phẩm chẩn
đoán nhiễm nấm C. neoformans trong dịch não tủy .......................................... 97
3.2.1. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của bộ sinh phẩm
trong phòng thí nghiệm ................................................................................... 97
3.2.2. Kết quả đánh giá của bộ sinh phẩm trong các mẫu DNT lâm sàng .... 102
3.2.3. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và kiểm định chất lượng bộ sinh phẩm chế
tạo ra .............................................................................................................. 107
Chương 4. BÀN LUẬN ................................................................................. 109
4.1. Về kết quả xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR
chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans ........................................................... 109
4.1.1. Bàn luận về kết quả giám định loài vi nấm C. neoformans để sử dụng

cho nghiên cứu xây dựng quy trình............................................................... 109
4.1.2. Về kết quả thiết kế/lựa chọn mồi và xác định các điều kiện cho kỹ thuật
nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans ....................................... 112
4.1.3. Kết quả chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm
C.neoformans ................................................................................................ 122
4.2. Bàn luận về độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn
đoán nhiễm nấm C. neoformans trong dịch não tủy. .................................... 124
4.2.1. Bàn luận về kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của bộ
sinh phẩm trong phòng thí nghiệm ............................................................... 125


ix

4.2.2. Bàn luận về kết quả đánh giá bộ sinh phẩm trong đoán nhiễm C.
neoformans ở các mẫu DNT lâm sàng .......................................................... 127
4.2.2.1. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu trên các mẫu nhiễm C.neoformans
phân lập ở Việt Nam. .................................................................................... 127
KẾT LUẬN ................................................................................................... 133
1. Xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán
nhiễm nấm C.neoformans ............................................................................. 133
2. Về độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của bộ sinh phẩm tạo ra trong chẩn
đoán nhiễm nấm C. neoformans dịch não tủy. .............................................. 134
KIẾN NGHỊ .................................................................................................. 135
TÍNH KHOA HỌC, TÍNH MỚI CỦA ĐỀ TÀI .................................................
Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI ..............................................................
DANH MỤC CÁC BÀI BÁO LIÊN QUAN TRỰC TIẾP ĐẾN NỘI DUNG
LUẬN ÁN ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ.....................................................................
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................

x

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Nấm C. neoformans nhuộm mực tàu, quan sát dưới kính hiển vi .... 4
Hình 1.2. Khuẩn lạc C. neoformans trên môi trường thạch Sabouraud ............ 5
Hình 1.3.Tổn thương não do C. neoformans .................................................... 7
Hình 1.4. Hình ảnh tổn thương phổi do C. neoformans.................................... 8
Hình 1.5. Tổn thương da do nấm C. neoformans.............................................. 8
Hình 2.1. Chủng chuẩn nấm C. neoformans ATCC@ 90113 .......................... 37
Hình 2.2. Môi trường thạch Sabouraud trên đĩa thạch và ống thạch nghiêng 53
Hình 2.3. Phương pháp pha loãng dịch não tủy .............................................. 55
Hình 3.1. Mẫu nấm C. neoformans thu thập tại thực địa Việt Nam ............... 69
Hình 3.2. Sản phẩm PCR với cặp mồi ITS1, ITS4 của một số mẫu nấm C.
neoformans ...................................................................................................... 69
Hình 3.3. Kích thước các mảnh cắt giới hạn sản phẩm PCR bằng enzyme
MspI của một số mẫu nấm C. neoformans...................................................... 70
Hình 3.4. Minh họa đoạn gen khuếch đại với 02 cặp mồi được lựa chọn ...... 72
Hình 3.5. Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của cặp mồi ITS1-ITS4 bằng phần
mềm Primer Blast ............................................................................................ 74
Hình 3.6. Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của cặp mồi CN4-CN5 bằng phần
mềm Primer Blast ............................................................................................ 75
Hình 3.7. So sánh trình tự ADN nấm chuẩn được khuếch đại bởi cặp mồi
ITS1, ITS4 và các trình tự C. neoformans trên ngân hàng gen ...................... 76
Hình 3.8. Kết quả PCR theo panel nồng độ .................................................... 79
Hình 3.9. Kết quả phản ứng PCR1 tiến hành theo quy trình tự xây dựng ...... 83
Hình 3.10. Sản phẩm PCR theo nồng độ Mg2+ ............................................... 85
Hình 3.11. Phản ứng PCR theo gradien .......................................................... 86
Hình 3.12. Kết quả PCR theo thời gian kéo dài mồi ...................................... 86

xi

Hình 3.13. Kết quả PCR theo số chu kỳ phản ứng ......................................... 87
Hình 3.14. Kết quả PCR theo nồng độ ADN khuôn ....................................... 88
Hình 3.15. Kế t quả PCR2 các mẫu N117 và N132 .......................................... 91
Hình 3.16. Bộ sinh phẩm nested - PCR chẩn đoán C. neoformans ................ 96
Hình 3.17. Kết quả khuếch đại gen đích của nấm C. neoformans bằng kỹ thuật
nested-PCR .................................................................................................... 103


xii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Ngưỡng phát hiện của phương pháp nuôi cấy với các cách xử lý
mẫu khác nhau ................................................................................................. 15
Bảng 1.2. Một số bộ sinh phẩm chẩn đoán C. neoformans của hãng Norgen
Biotek .............................................................................................................. 23
Bảng 1.3. Thành phần phản ứng PCR thông thường với thể tích 50 µl ........ 29
Bảng 1.4. Chu kỳ nhiệt của một phản ứng PCR thông thường ...................... 30
Bảng 2.1. Các mồi chung khuếch đại gen đích vi nấm ................................... 40
Bảng 2.2. Các thành phần cơ bản của phản ứng PCR .................................... 61
Bảng 2.3. Chu trình nhiệt PCR1 được thiết lập cho việc nhân bản đoạn gen
kích thước khoảng 100bp - 600 bp.................................................................. 61
Bảng 2.4. Minh họa chạy gradient nhiệt độ và nồng độ Mg2+ ........................ 62
Bảng 3.1. Kết quả thu thập và phân lập nấm C. neoformans ........................... 68
Bảng 3.2. Tỷ lệ tương đồng nucleotide của 06 mẫu trong nghiên cứu với các
trình tự tham chiếu trên ngân hàng gen........................................................... 70
Bảng 3.3. Các phương pháp sinh học phân tử được áp dụng để định loại nấm
C. neoformans 1990 - 2014 ............................................................................. 71
Bảng 3.4. Đánh giá chất lượng của mồi so với tiêu chuẩn ............................. 73

Bảng 3.5. Đánh giá tính đặc hiệu của cặp mồi trên các nền mẫu khác nhau .. 77
Bảng 3.6. Nồng độ AND thu được từ chủng chuẩn C. neoformans ............... 78
Bảng 3.7. Kết quả tạo panel chuẩn dương nấm C. neoformans...................... 79
Bảng 3.8. Danh mục chứng chuẩn âm ............................................................ 80
Bảng 3.9. Kết quả so sánh phản ứng PCR1 với các điều kiện khác nhau ...... 81
Bảng 3.10. Kết quả chuẩn hóa từng thành phần phản ứng cho PCR1 ............ 82
Bảng 3.11. Kết quả chu trình nhiệt của phản ứng PCR1 ................................ 82
Bảng 3.12. Kết quả lựa chọn nồng độ ADN khuôn cho phản ứng PCR2....... 84


xiii

Bảng 3.13. Kết quả thử nghiệm nồng độ Mg2+ trong phản ứng PCR2 ........... 84
Bảng 3.14. Điều kiện của phản ứng PCR2 với cặp mồi CN4 và CN5 ........... 87
Bảng 3.15. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR2 ............................................. 88
Bảng 3.16. Thử nghiệm đánh giá ngưỡng phát hiện của kỹ thuật nested-PCR ...... 89
Bảng 3.17. Kết quả đánh giá kỹ thuật nested-PCR trên chủng nấm
C. neoformans thu thập từ mẫu lâm sàng tại Việt Nam .................................. 90
Bảng 3.18. Thành phần hóa chất của 02 ống dung dịch MX1 ........................ 92
Bảng 3.19. Thành phần hóa chất của 02 ống dung dịch MX2 ........................ 92
Bảng 3.20. Thành phần hóa chất cho ống dung dịch MC-CR1 ...................... 93
Bảng 3.21. Thành phần hóa chất cho ống dung dịch MC-CR2 ...................... 93
Bảng 3.22. Thành phần hóa chất của ống dung dịch CR1 .............................. 93
Bảng 3.23. Thành phần hóa chất của ống dung dịch CR2 .............................. 94
Bảng 3.24. Kết quả đánh giá hoạt động 02 dạng đóng gói ............................. 95
Bảng 3.25.Thành phần bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nấm
C.neoformans .................................................................................................. 96
Bảng 3.26. Kết quả thử nghiệm bộ sinh phẩm trên mẫu C. neoformans chuẩn .......98
Bảng 3.27. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm trên các
mẫu chuẩn ....................................................................................................... 98

Bảng 3.28. Kết quả đánh giá tính ổn định của bộ sinh phẩm ......................... 99
Bảng 3.29. Kết quả phản ứng nested PCR với các mẫu DNT giả định ........ 100
Bảng 3.30. Kết quả đánh giá của trên các mẫu nhiễm giả định nồng độ
105CFU/ ml ................................................................................................... 100
Bảng 3.31. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm trên các
mẫu nhiễm giả định nồng độ 102CFU/ ml .................................................... 101
Bảng 3.32. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm trên các
mẫu nhiễm giả định nồng độ từ 102CFU/ ml trở lên..................................... 102


xiv

Bảng 3.33. Kết quả thử nghiệm bộ sinh phẩm trên các chủng C.neoformans
phân lập ở Việt Nam ..................................................................................... 102
Bảng 3.34. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm trên các
chủng C. neoformans phân lập ở Việt Nam .................................................. 103
Bảng 3.35. Kết quả thử nghiệm bộ sinh phẩm trên các mẫu DNT của bệnh
nhân có triệu chứng lâm sàng VMN ............................................................. 104
Bảng 3.36. Độ nhạy, độ đặc hiệu so với phương pháp nuôi cấy .................. 105
Bảng 3.37. Độ tương đồng so với phương pháp soi tươi nhuộm mực tàu .... 106
Bảng 3.38. Độ tương đồng so với bộ sinh phẩm của Norgen ....................... 107
Bảng 3.39. Tóm tắt tiêu chuẩn cơ sở............................................................. 107


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Viêm não, màng não là tình trạng nhiễm trùng thần kinh trung ương
gây ra bởi các căn nguyên khác nhau như vi khuẩn, virus, vi nấm hoặc ký sinh
trùng. Trong một số trường hợp biểu hiện lâm sàng của viêm não, màng não

do các căn nguyên khác nhau khá giống nhau nên dựa vào lâm sàng khó phân
biệt. Do vậy, để xác định căn nguyên gây viêm não, màng não cần phải dựa
vào các xét nghiệm cận lâm sàng [1],[2],[3].
Trong số các loài vi nấm gây viêm não màng não, nấm Cryptococcus
neoformans được xác định là loài gây viêm màng não phổ biến nhất, đặc biệt
là ở bệnh nhân HIV/AIDS, ung thư, bệnh nhân suy kiệt...,[4],[5],[6]. Theo
nghiên cứu của Safdieh.J.E và cs (2008) về nguyên nhân gây viêm não, màng
não ở bệnh nhân ung thư cho thấy: viêm màng não do Cryptococcus chiếm
7%, viêm màng não do vi khuẩn chiếm tỷ lệ cao nhất với > 75%[5]. Ở Việt
Nam, điều tra nhiễm trùng cơ hội trên 100 bệnh nhân HIV/AIDS tại Bệnh
viện Bệnh Nhiệt đới TP. Hồ Chí Minh năm 2000 của Louie JK và cs (2004)
cho thấy, nhiễm nấm C. neoformans ở dịch não tủy chiếm khoảng 9%[6].
Bệnh do nấm Cryptococcus là nguyên nhân nhiễm trùng gây tử vong xếp
hàng thứ tư ở những bệnh nhân AIDS và khoảng 1/3 bệnh nhân AIDS có mắc
bệnh này [7].
Trên lâm sàng, biểu hiện viêm màng não do nấm C. neoformans rất
giống với các căn nguyên vi sinh vật khác. Ngoài ra, cũng giống như các vi
nấm gây bệnh khác,viêm màng não do C. neoformans thường được nghĩ tới
sau các căn nguyên khác nên thường chẩn đoán muộn, khi các triệu chứng đã
trở nên trầm trọng [10],[11]. Trong khi, viêm màng não do nấm C. neoformans
là một bệnh nguy hiểm, tiến triển nhanh, nếu không được chẩn đoán sớm và
điều trị kịp thời có thể để lại di chứng trầm trọng có khi tử vong nhanh[4],[8].
Chẩn đoán muộn, chẩn đoán nhầm, lựa chọn thuốc không đúng chính là


2

những nguyên nhân khiến bệnh nhân phải chịu những tổn hại nặng nề về cả
sức khỏe lẫn kinh tế [9].
Các biện pháp truyền thống như soi tươi cho kết quả nhanh nhưng độ

nhạy thấp và dương tính giả có thể xảy ra [8], nuôi cấy được coi là tiêu chuẩn
vàng trong chẩn đoán nhiễm nấm nhưng phải mất ít nhất 2 ngày mới có kết
quả và tỷ lệ nuôi cấy dương tính cũng chỉ khoảng 70-90% [8]. Nuôi cấy
thường cho kết quả âm tính nếu bệnh nhân trước đó sử dụng thuốc chống nấm
[4],[13],[14]. Kỹ thuật miễn dịch có độ nhạy, độ đặc hiệu cao ≥ 90% [9],
nhưng cũng dễ có phản ứng dương tính giả và chưa phổ biến ở Việt Nam. Các
kỹ thuật sinh học phân tử với thời gian chẩn đoán nhanh và cùng lúc phát hiện
được nhiều mầm bệnh đang được nhiều tác giả nghiên cứu. Các kỹ thuật sinh
học phân tử cho phép xác định căn nguyên gây bệnh ngay cả khi kết quả soi
tươi, nuôi cấy âm tính, đặc biệt trong trường hợp trước đó bệnh nhân sử dụng
kháng sinh, kháng nấm [10], [11], [12].
Trong các kỹ thuật chẩn đoán dựa trên phản ứng PCR, nested – PCR là
một trong những kỹ thuật có độ nhạy, độ đặc hiệu cao nhất, do đó chúng tôi lựa
chọn tiến hành đề tài "Nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo bộ
sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans trong dịch
não tủy".
Với 02 mục tiêu:
1. Xây dựng được quy trình kỹ thuật chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR
chẩn đoán nhiễm nấm C.neoformans trong dịch não tủy.
2. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của bộ sinh phẩm được
tạo ra trong chẩn đoán nhiễm nấm C.neoformans trong dịch não tủy.


3

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc điểm sinh học và vai trò y học của nấm Cryptococcus neoformans
Giống nấm Cryptococcus có khoảng hơn 70 loài được định loại dựa
vào hình thái nhưng loài gây bệnh chủ yếu là C. neoformans chiếm 80% [13],
[14]. Bệnh do nấm C. neoformans gây ra gọi là Cryptococcosis. Triệu chứng

bệnh được Zenker miêu tả đầu tiên năm 1861, nhưng đến năm 1864, hai nhà
bác học Busse và Buschkle người Đức đã phân lập và nuôi cấy được nấm C.
neoformans từ bệnh nhân có triệu chứng giống như đã được Zenker miêu tả
[18],[20],[21]. Ngoài C. neoformans, loài C. albidus và C. laurentii cũng có
khả năng gây bệnh nhưng ít gặp [14].
Trước đây, người ta cho rằng nấm C. neoformans có 2 phân loài, đó là C.
neoformans var. neoformans (gồm các tuýp huyết thanh A, D, AD) và C.
neoformans var. gattii (gồm các tuýp B, C). Hiện nay, người ta đã khẳng định
có 3

phân giống C. neoformans: grubii (tuýp A), gattii (tuýp B, C) và

neoformans (tuýp D) [15]. Trong đó C. neoformans var. gattii được cho là một
loài riêng biệt gây bệnh ở những người bình thường với tên là C. Bacillisporus
[23], [24], [25]. Nấm C. neoformans var. neoformans còn được gọi là
Filobasidiella neoformans [16].
1.1.1. Đặc điểm sinh học của nấm C. neoformans.
1.1.1.1. Đặc điểm hình thể.
C. neoformans là nấm men, đường kính tế bào khoảng 5-10 µm, được
bao ngoài bởi một nang (capsule) hình cầu hoặc hình bầu dục, kích thước
nang thay đổi từ 2-40µm.


4

Hình 1.1. Nấm C. neoformans nhuộm mực tàu, quan sát dưới kính hiển vi
(Nguồ n: Day J.N, 2013)
1.1.1.2. Môi trường sống
Giống nấm Cryptococcus tồn tại trong môi trường tự do được Kutzing
đặt tên năm 1833, mẫu phân lập được từ bụi kính cửa sổ.

C. neoformans là sinh vật sống hoại sinh, ngoài cơ thể vật chủ, có thể
sống tự do bên ngoài môi trường. Nấm phân bố toàn cầu có thể tìm thấy trong
chất thải của gia cầm, chim bồ câu, vẹt, yến. Trong các hang động, nước trái cây
lên men, sữa, đường ruột của một số động vật ăn cỏ, trên cơ thể dơi, gián, trong
đất và các hốc cây khác nhau. Nấm còn được tìm thấy trong thân gỗ mục của
một số loài cây như: cây bạch đàn, cây cao su màu đỏ [13], [17], [18].
1.1.1.3. Tính chất nuôi cấy
Khinghiên cứu nuôi cấy, phân lập, nấm C. neoformans có thể mọc trên
thạch Sabouraud dextrose, thạch máu cừu, thạch chocolate và các môi trường
khác ở nhiệt độ từ 20-370C. Ở nhiệt độ này nấm bắt đầu mọc trong vòng khoảng
72 giờ, nhiệt độ thích hợp nhất cho nấm phát triển là 300C [19]. C. neoformans
phát triển tốt trong môi trường chứa khoảng 5 % CO2, pH hơi kiềm và một lượng
nhỏ chất sắt [20].


5

Trên môi trường thạch Sabouraud dextrose ở 25-370C, nấm C.
neoformans mọc thành các khuẩn lạc lồi, mịn, nhày, màu trắng hoặc màu kem,
đường kính có thể đến vài milimet [20].

Hình 1.2. Khuẩn lạc C. neoformans trên môi trường thạch Sabouraud
(Nguồ n: trong nghiên cứu này, 2014)
Các yếu tố như nhiệt độ, nồng độ thẩm thấu, nồng độ CO2, độ pH ảnh
hưởng tới sự phát triển của các bao ngoài… [21]. Nhiệt độ cao từ 39 - 400C
hoặc quá thấp ức chế sự tăng trưởng của nấm. Nồng độ CO2 ở mức sinh lý làm
tăng tổng hợp và kích thước bao ngoài, nồng độ CO2 cao các nang chỉ có kích
thước nhỏ. Môi trường có độ thẩm thấu cao (chứa glucose 16% hoặc NaCl
2,9%), hoặc pH acid sẽ làm giảm sản xuất các bao nang.
1.1.2. Vai trò y học

1.1.2.1. Trên động vật
Nấm C. neoformans có khả năng gây bệnh ở động vật, năm 1895
Sanfelice lần đầu tiên đã phát hiện và nuôi cấy được nấm C. neoformans từ hệ
bạch huyết của bò [13]. Năm 1902, Frothingham đã phân lập được nấm C.
neoformans từ tổn thương trên phổi của ngựa tại Massachuset, Anh.
Cùng với ghi nhận của Busse và Buschkle, các tác giả trên đã khẳng
định nấm C. neoformans có khả năng gây bệnh cả ở trên người và động vật
Những nghiên cứu hiện nay chỉ ra C. neoformans có thể gă ̣p ở mèo,
chó, thỏ, linh trưởng, chuô ̣t và mô ̣t số loa ̣i chim.


6

Ở động vật có vú, bê ̣nh do C. neoformans thường liên quan đến tình
trạng suy giảm miễn dịch như: mèo bị nhiễm một loại virus tương tự
retrovirus, chuột thí nghiệm bi ̣ gây thiế u hu ̣t miễn dich…
Ở chim bồ câu và
̣
các loài chim thường ít bi ̣ mắ c bê ̣nh do C. neoformans do nhiệt độ cơ thể của
chim cao 41°C–42°C. Tuy nhiên, người ta có thể tìm thấ y tế bào nấ m trong
phân chim [13], [22].
1.1.2.2. Bệnh trên người
Do tế bào nấm C. neoformans có thể có mặt trong không khí, trong đất và
trong phân gia cầm nên người rấ t dễ bi nhiễ
m loa ̣i nấ m này khi hít vào qua đường
̣
hô hấp. Tuy nhiên, không phải cơ thể nào bi ̣nhiễm cũng biể u hiê ̣n thành bê ̣nh mà
bê ̣nh thường biể u hiê ̣n ở những cơ thể có hê ̣ thố ng miễn dich
̣ bi ̣ tổ n thương như
bệnh nhân AIDS, phải dùng các thuốc ức chế miễn dịch, ung thư, ghép tạng, ghép

tủy xương... Mức độ nặng của các triệu chứng lâm sàng phụ thuộc vào tình trạng
suy giảm miễn dịch của cơ thể người nhiễm [3], [13], [15], [22].
- Bệnh gây tổn thương ở hệ thần kinh
- Viêm màng não: Đây là bệnh thường gặp nhất. Bệnh thường diễn biến
từ từ, các biểu hiện lâm sàng điển hình bao gồm:
+ Đau đầu, sốt, nôn, rối loạn hành vi, rối loạn cảm giác, đau và cứng
gáy [23],[24],[25].
+ Rối loạn tâm thần bao gồm: mất phương hướng, lú lẫn, thay đổi nhân
cách, mất trí nhớ, loạn thần, trạng thái sững sờ và hôn mê [23], [24].
+ Các triệu chứng ít gặp hơn bao gồm: mất điều hòa, mất phản xạ, triệu
chứng của tổn thương bó tháp, thất ngôn, chứng loạn vận ngôn và động kinh.
+ Các triệu chứng về mắt thường gặp là phù gai thị các triệu chứng
không phổ biến như nhìn mờ, song thị, sợ ánh sáng và đau sau nhãn cầu, có
thể mù [23], [24].


7

- Viêm màng não - não: Ít gặp, bệnh tiến triển nhanh, thường tiến tới
hôn mê và tử vong trong thời gian ngắn, đáp ứng kém với điều trị.
- U nấm trong não: Hiếm gặp, các tổn thương giả u rắn, khu trú. Triệu
chứng giống khối phát triển trong não.

B

A

Hình 1.3.Tổn thương não do C. neoformans
(Nguồ n: British Journal of Radiology, 2009)
A- Tổn thương não do C. neoformans trên CT sọ não

B-Tổn thương não do C. neoformans trên MRI sọ não
- Bệnh gây tổn thương ở phổi
Đường xâm nhập chính của nấm vào cơ thể vật chủ là qua đường hô
hấp, do người bệnh hít phải các bào tử nấm phát tán trong không khí. Viêm
phổi do nấm C. neoformans có các triệu chứng: Ho, đau ngực, khạc đờm, sút
cân, sốt và ho ra máu [25]. Các triệu chứng khác hiếm thấy như khó thở, ra
mồ hôi ban đêm, cản trở gây ứ trệ tĩnh mạch chủ trên.
Hình ảnh X-quang của viêm phối do nấm C. neoformans: Tổn thương
điển hình là một hoặc nhiều nốt, không canci hóa, thâm nhiễm rốn phổi hoặc
trung thất, thỉnh thoảng có tràn dịch màng phổi và đôi khi tạo hang. Thăm
khám thường không đặc hiệu nhưng đôi khi có thể thấy thở nhanh, phổi có
ran, hạch to, lách to…[22].


8

A

B
Hình 1.4. Hình ảnh tổn thương phổi do C. neoformans
(Nguồ n: George R. Robinson, 1995)
A. Tổn thương phổi do nấm C. neoformans trên phim X-quang phổi
B. Tổn thương phổi do nấm C. neoformans trên CT phổi

- Bệnh gây tổn thương ở da
+ Tổn thương nguyên phát: Loét, viêm mô tế bào [26].
+ Tổn thương thứ phát: thường xuất hiện ở đầu, cổ dưới dạng sẩn, cục,
mảng loét, áp xe, tổn thương dạng herpet, u mềm lây hoặc u Kaposi [26],
[27].

Hình 1.5. Tổn thương da do nấm C. neoformans
(Nguồ n: Hari Kishan Kumar Yadalla và cs, 2011) [27]


9

- Bệnh gây tổn thương ở các cơ quan khác:
+ Tổn thương xương: Tổn thương hủy xương, không có phản ứng màng xương,
đau mơ hồ khi vận động, đôi khi có thể viêm khớp nhất là khớp gối [24].
+ Hệ tiết niệu: C. neoformans thường phân lập được ở nước tiểu bệnh
nhân bị bệnh lan tràn, đôi khi có dấu hiệu của viêm bể thận, viêm tiền liệt
tuyến [24], [26].
+ Tổn thương cơ quan khác: ở vỏ thượng thận, viêm nội tâm mạc, viêm gan,
viêm xoang, tổn thương thực quản [24], [26].
1.1.3. Tình hình viêm màng não do nấm C. neoformans ở trên thế giới và
Việt Nam
Viêm màng não do nấm C. neoformans là một trong những nhiễm trùng
cơ hội quan trọng nhất ở bệnh nhân AIDS. Ở những nước có tỉ lệ nhiễm
HIV/AIDS cao, C. neoformans là nguyên nhân phổ biến gây viêm màng não,
thường xuyên hơn cả phế cầu, não mô cầu [13], [28].
Ca bệnh viêm màng não do nấm C. neoformans đầu tiên trên thế giới
được mô tả vào năm 1905 bởi Von Hansemann khi phát hiện nấm men trong
các nang galentin ở não [13].
Như vậy khả năng xâm nhập vào hệ thần kinh trung ương và gây bệnh
của C. neoformans đã được đề tập từ những năm đầu của thế kỷ 20, nhưng nó
đòi hỏi người bác sỹ phải có nhiều năm kinh nghiệm lâm sàng để đánh giá
mức độ thực sự xu hướng của bệnh.
1.1.3.1. Viêm màng não do nấm C. neoformans ở trên thế giới
Năm 1956, Littman và Zimmerman đã xuất bản sách chuyên khảo về
bệnh viêm màng não do nấm C. neoformans gây ra với những hiểu biết về đặc

điểm lâm sàng, con đường truyền bệnh sau nửa thế kỷ bệnh được phát hiện.
Tại thời điểm đó trên toàn thế giới chỉ ghi nhận 300 trường hợp mắc bệnh.
Trong những năm 1970, cùng với việc sử dụng rộng rãi các thuốc ức chế miễn