Tìm phương pháp khắc phục các bệnh đột biến mtDNA di truyền từ mẹ

ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong thời đại khoa học phát triển đã giúp cải thiện chất lượng cuộc sống của
con người, một trong số đó là người ta đã nghiên cứu phòng ngừa các đột biến di
truyền và bệnh tật. Các nhà khoa học đã chọn nhiều các phương pháp phòng ngừa,
trong đó có kỹ thuật Reprogenetics và phương pháp PGD - Preimplantation genetic
diagnosis (chẩn đoán gien di truyền trước khi cấý), đây là 2 phương pháp và quy trình
kiểm tra và ngăn ngừa các đột biến di truyền có thể xảy ra trước khi trứng của người
mẹ thụ tinh phát triển thành phôi thai. Vấn đề này vẫn còn gây tranh cãi, vì không tuân
theo quy luật tự nhiên và liên quan đến đạo đức. Tuy vậy các kỹ thuật reprogenetics có
nhiều ưu điểm giảm những bênh tật không mong muốn, cung cấp chất lượng cuộc
sống tốt hơn cho người bị đột biến di truyền cũng như thế hệ con cái.
Đột biến gen ở ty thể, gây ra nhiều bệnh như đái tháo đường và dẫn đến điếc,
bệnh liệt thần kinh thị giác di truyền của Leber, chứng động kinh co giật cơ... Những
đột biến này do đột biến gen ty thể (mtDNA), nơi sản xuất năng lượng chính cho tế
bào. Đột biến gen ở ty thể, tạo ra các protein đột biến chức năng thay cho các protein
bình thường sản xuất năng lượng cho nhu cầu của tế bào. Những bệnh liên quan đến
đột biến gen ở Ty thể làm giảm chất lượng cuộc sống cho những người bị bệnh, gây
gánh nặng tài chính cho gia đình bệnh nhân, với chi phí chăm sóc sức khỏe suốt đời
rất cao.
mtDNA là một trong các thành phần quy định tính di truyền của tế bào chất.
Đối với con người mtDNA là nhân tố di truyền theo mẹ, bởi vì chỉ ở tế bào trứng có
chứa khối tế bào chất lớn và chứa nhiều ty thể, ở tinh trùng ty thể chỉ có ở phần cổ, và
khi thụ tinh chỉ có đầu tinh trùng xâm nhập vào tế bào trứng, còn phần cổ thì bị loại
bỏ, nếu nó được xâm nhập vào tế bào trứng cũng bị tiêu hủy bởi lizoxom. Từ đó các
nhà khoa học đã đưa ra các phương pháp thích hợp để phòng những bệnh liên quan
đến đột biến gen ty thể. Trường hợp người mẹ có con bị bệnh đột biến gen ở ty thể, thì
1


người Mẹ đó đã mang gen đột biến ở ty thể và di truyền sang con, để làm sao đứa con
tiếp theo không bị bệnh, do đó tôi tiến hành đề tài tiểu luận tìm hiểu về vấn đề này. Do

đó mục tiêu của tiểu luận này là “Tìm phương pháp khắc phục các bệnh đột biến
mtDNA di truyền từ mẹ”

2


CHƯƠNG 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tìm hiểu về Ty thể
1.1.1. Cấu tạo và chức năng
Ty thể là bào quan nhỏ của tế bào, là nơi tổng hợp các enzym hô hấp, có chức
năng chuyển hóa năng lượng trong chất dinh dưỡng thành năng lượng trong ATP, đảm
bảo năng lượng cho toàn bộ quá trình trao đổi chất. Ty thể có trong tất cả tế bào nhân
chuẩn, Ty thể được Atman phát hiện vào năm 1894 và đến năm 1897 được Benda đặt
tên là mitochondria (theo tiếng Hy lạp- mito là sợi và chondria là hạt) vì chúng thường
có dạng sợi, hoặc dạng hạt khi quan sát dưới kính hiển vi thường (Nguyễn Như Hiền,
2010).

Hình 1. Cấu trúc và hình thái của ty thể
Theo Green và cộng sự (1998), ty thể (mitochondria) được coi là trung tâm
năng lượng của tế bào, ở đây diễn ra quá trình chuyển hóa các hợp chất hữu cơ thành
năng lượng mà tế bào có thể sử dụng được là ATP. Ngoài ra, ty thể còn đóng vai trò
quan trọng trong nhiều quá trình chuyển hóa khác như apoptosis (quá trình tự chết của
tế bào), điều khiển tín hiệu Calci, điều khiển quá trình trao đổi chất của tế bào, tổng
hợp nhân Heme, tổng hợp Steroid.
3


Theo SolanoA và cộng sự (2010) cho đến nay, người ta đã thống kê được trên
150 bệnh di truyền theo mẫu hệ khác nhau do DNA ty thể (mtDNA) quyết định. Các
bệnh do đột biến DNA ty thể thường được biểu hiện rất đa dạng, chúng có thể liên

quan đến đột biến quá trình mã hóa protein hoặc đơn thuần chỉ là những đột biến do
thay đổi các nucleotide.
mtDNA là sợi xoắn kép có cấu trúc vòng, có chiều dài chừng 5 µm, mtDNA của
nấm men có thể đạt kích thước 26 µm. Trong tế bào mtDNA chiếm từ 1 – 5% DNA
của tế bào. Ví dụ trong tế bào gan số phân tử mtDNA trong một ty thể la 5, chúng nằm
trong chất nền định khu cạnh các mào và thường liên kết với mào, mtDNA tự tái bản
theo kiểu bán bảo thủ nhờ hệ DNA polimerase có trong chất nền ty thể và xảy ra ở
gian kỷ của chu kỳ tể bào. mtDNA có dạng vòng và không liên kết với histon, điểu
này làm cho mtDNA khác với DNA của nhân tế bào và tương tự với DNA của vi
khuẩn.
Ngoài ra bộ mã của gen trong mtDNA có ít nhiều khác với bộ mã chung, ví dụ
codon UAG là codon kết thúc ở bộ mã chung thì đối với ty thể (người) thì đó lại là
codon của triptophan. Đột biến xảy ra trong mtDNA gây nên nhiều bệnh tật, nhất là
đối với hệ thần kinh và hệ cơ. Tần số sai lệch trong mtDNA cũng tăng theo tuổi già.
Trong vài năm trở lại đây, những đột biến ty thể liên quan đến các bệnh ty thể được
xem là một trong những mục tiêu nghiên cứu cơ bản của di truyền học và y học. Đặc
biệt, hướng nghiên cứu sử dụng DNA ty thể như một chỉ thị sinh học đang phát triển
nhanh chóng trong nhiều lĩnh vực khác nhau liên quan đến các bệnh chuyển hóa hiếm
gặp, lão hóa, xác định các đặc tính di truyền quần thể sử dụng các dấu chuẩn di truyền
của mẹ..
1.1.2. Hệ genome ty thể
Theo Ander son (1981), ty thể có chứa DNA, DNA của ty thể có khả năng nhân
đôi độc lập với quá trình tự nhân đôi của DNA (nhiễm sắc thể) trong nhân tế bào, có
khả năng tổng hợp các protein đặc trưng của ty thể. DNA ty thể là phân tử sợi kép,
dạng vòng có kích thước 16569bp, gồm hai chuỗi khác nhau về thành phần nucleotide:
chuỗi nặng có chứa nhiều guanine, chuỗi nhẹ chứa nhiều cytosine. Chuỗi nặng mã hóa
4


cho 28 gen, chuỗi nhẹ mã cho 9 gen trong tổng số 37 gen của hệ gen ty thể. Trong 37

gen này có 13 gen ghi mã cho 13 chuỗi polypeptide cần thiết cho hệ thống phosphoryl
hóa oxy hóa. Số gen còn lại ghi mã cho 22 tARN, 2 rARN có vai trò trong sự dịch mã
của ty thể . Các chuỗi polypeptide còn lại cần thiết cho cấu trúc và chức năng của ty
thể đều được ghi mã bởi genome nhân và được tổng hợp trong ribosome của tế bào
chất.
Theo TaylooR.W và cộn sự (2005), các nghiên cứu trên DNA ty thể cho thấy hệ
gen ty thể có những đặc trưng riêng, phân biệt với hệ gen nhân. Hệ gen ty thể có đặc
tính di truyền theo dòng mẹ, có từ vài trăm đến vài nghìn bản copy trong một tế bào.
Các tế bào khác nhau có số lượng bản copy khác nhau, tùy thuộc vào nhu cầu năng
lượng trong mô. Hệ gen ty thể không có vùng intron và các gen không có, hoặc có rất
ít các bazo không mã hóa ở giữa chúng. Trong nhiều trường hợp không xuất hiện các
codon kết thúc mà chỉ có sự polyadenin hóa sau phiên mã. D- Loop là vùng duy nhất
trong hệ gen ty thể không tham gia mã hóa.
Theo LeeH. C và cộn sự Vùng D-Loop có kích thước 1,1 kb chứa các yếu tố
quan trọng cho quá trình phiên mã và dịch mã như chứa promoter phiên mã của chuỗi
nặng và chuỗi nhẹ, có vùng gắn với các yếu tố phiên mã DNA ty thể…Khi vùng DLoop xảy ra đột biến sẽ ảnh hưởng tới tính toàn vẹn của các chuỗi polypeptide được
mã hóa trong ty thể.

5


Hình 2. Sơ đồ cấu tạo DNA ty thể người
Theo Modica- Napolitanoj. S và cộng sự (2007), các đặc điểm của hệ gen ty thể
như không có intron, không có histon bảo vệ, lại phân bố gần chuỗi phosphoryl hóa
oxy hóa, nơi mà các gốc tự do được tạo ra trong quá trình phosphoryl hóa oxy hóa, đã
làm cho khả năng bị đột biến của DNA ty thể cao hơn ở nhân (khoảng 10 lần) Bởi
DNA ty thể có nhiều bản sao nên phân tử bị đột biến có thể cùng tồn tại với dạng dại
(wild type) không bị đột biến, tạo nên hiện tượng không đồng nhất (heteroplasmy).
DNA ty thể có thể ở dạng đồng nhất (homoplasmy) khi tất cả các bản sao của genome
ty thể là như nhau. Trong nhiều trường hợp, đột biến dạng heteroplasmy không gây ra

những biểu hiện lâm sàng hay cả những biểu hiện hóa sinh cho tới khi nó đạt tới
ngưỡng đột biến. Vì vậy, xác định được mức độ không đồng nhất của đột biến DNA ty
thể có ý nghĩa cao trong chẩn đoán bệnh ty thể.
1.2 Những nghiên cứu trên thế giới về đột biến DNA ty thể và bệnh ty thể
6


Theo Wallace D.C (1998) ,những đặc điểm của hệ gen ty thể được phát hiện từ
đầu những năm 1980, và tới năm 1988 những đột biến đầu tiên có liên quan tới các
bệnh đã được tìm thấy. Bệnh ty thể là thuật ngữ được dùng để chỉ một nhóm các bệnh
gây ra do các hư hại trong quá trình tạo ATP. Khi lượng ATP được sinh ra thấp hơn nhu
cầu tối thiểu của mô thì bệnh ty thể sẽ xuất hiện do sự hư hỏng của các protein tham
gia vào chuỗi phosphoryl hóa oxy hóa. Số lượng các phân tử DNA ở các mô, các cơ
quan là khác nhau do có nhu cầu năng lượng khác nhau. Bởi vậy, các mô bị ảnh hưởng
nhiều nhất của đột biến DNA ty thể là hệ thống thần kinh trung ương, cơ xương, tim,
thận, gan, tụy. Các bệnh được mô tả khá rõ dựa trên các biểu hiện lâm sàng, hình thái
và hóa sinh, tuy vậy bệnh khó nhận ra bởi biểu hiện lâm sàng của bệnh rất biến đổi và
khởi đầu bệnh diễn ra rất âm thầm, đặc biệt trong giai đoạn đứa trẻ còn nhỏ. Tuy
nhiên, hiện nay, do tiến bộ của các phương pháp sinh học phân tử, việc xác định bệnh
ty thể đã có nhiều khả quan. Các nghiên cứu dịch tễ học trong những năm gần đây cho
thấy bệnh ty thể là một trong những bệnh liên quan đến đột biến gen phổ biến ở người,
ảnh hưởng tới ít nhất 1 trên 5000 người trong quần cư dân ,theo Chinnery P.E (2000).

Hình 3. Các bệnh liên quan đến đột biến DNA ty thể [64]
7


Theo SolanoA (2001) Cho đến nay đã có hơn 150 đột biến DNA ty thể gây ra
các bệnh ở người được phát hiện. Các bệnh này có thể xuất hiện ở bất kỳ giai đoạn nào
trong cuộc đời, từ đứa bé mới sinh đến người trưởng thành ở mọi lứa tuổi. Ngoài ra,

nhiều đột biến được di truyền theo dòng mẹ, bởi vậy mà những chẩn đoán cho một
người có thể được dùng cho nhiều thế hệ trong gia đình. Các nghiên cứu cho thấy đột
biến DNA ty thể có liên quan đến tình trạng cơ, thần kinh và tim mạch. Các đột biến
ty thể gây bệnh bao gồm đột biến điểm và đột biến mất đoạn có liên quan tới các bệnh
ở người, hầu hết trong số đó ảnh hưởng đến hệ thần kinh trung ương và ngoại biên.
Sau đây là một số bệnh có liên quan với đột biến DNA ty thể:
- Bệnh liệt thần kinh thị giác di truyền Leber (LHON): có tới 16 đột biến điểm
gây bệnh, tuy vậy chỉ có ba đột biến gây bệnh chính chiếm tới 90% là G3460A,
G11778A và T14484C. Cả ba đột biến này đều ở gen thuộc phức hệ I của chuỗi hô
hấp. Bệnh tiến triển cấp, bán cấp, mất thị lực trung tâm dẫn đến chức năng thị giác
chung giảm kèm chứng loạn màu sắc.
Bệnh thần kinh, sắc tố võng mạc, mất điều hòa (NARP): bệnh gây ra bởi đột
biến T8993G trên gen ATPasa 6 thuộc phức hệ V. Người bệnh có biểu hiện chậm phát
triển, sắc tố võng mạc, mất trí nhớ, mất điều hòa, yếu cơ thần kinh.
- Hội chứng Leigh: Bệnh cũng gây ra bởi đột biến T8993G trên gen ATPasa 6,
giống với bệnh NARP, tuy nhiên bệnh nhân mang hơn 90% đột biến thể hiện hội
chứng Leigh. Người bệnh có biểu hiện đột biến thoái hóa thần kinh tiến triển, biểu
hiện sớm trong năm đầu tiên của trẻ, có tổn thương ở một hoặc nhiều khu vực của hệ
thần kinh trung ương.
Tạp chí New Scientist của Anh số ra ngày 27/9/2016, đăng tải công trình của
bác sỹ John Zhang và cộng sự thuộc Trung tâm New Hope Fertility ở thành phố New
York, phát triển thành công kỹ thuật mới cho ra một em bé đã chào đời khỏe mạnh nhờ
kỹ thuật mới, kết hợp DNA của 3 người gồm cặp bố mẹ và một người hiến tặng
trứng.Mẹ của bé là người Jordan, không may mang các gen gây hội chứng Leigh chứng đột biến hệ thần kinh có thể gây tử vong hoặc di truyền sang thai nhi, và đã
từng sảy thai 4 lần.
8


Cặp vợ chồng này sau đó đã tìm đến bác sỹ John Zhang thuộc Trung tâm New
Hope Fertility ở thành phố New York với mong muốn có thể mang thai đứa con mang

chính gen của họ nhưng không mắc căn bệnh di truyền nói trên. Bác sỹ Zhang cùng
cộng sự đã phát triển kỹ thuật mới có tên là truyền nhân non (spindle nuclear transfer),
theo đó kết hợp ADN hạt nhân của người mẹ với ty thể của người hiến tặng trứng.
Các bác sỹ sau đó đã hút nhân trứng của người mẹ và chèn vào trứng của người
hiến tặng vốn trước đó cũng đã được loại bỏ nhân. Trứng kết hợp này, với ADN hạt
nhân của người mẹ và ADN ty thể của người hiến tặng trứng, sau đó sẽ được thụ tinh
với tinh trùng của người bố.
Các bước thực hiện gồm: Gỡ bỏ nhân của trứng hiến tặng, giữ lại toàn bộ bào
quan và ty thể; Chuyển nhân của trứng của mẹ vào trứng trên; Thụ tinh với tinh trùng
của bố. Em bé sinh tại Mexico vào ngày 6/4/2016, và sau hơn 5 tháng, bé phát triển
tốt, không có dấu hiệu bệnh tật.
Kỹ thuật này đã được nhóm nghiên cứu của ông khởi sự từ cuối những năm
1990 thực hiện trên động vật và đến nay mới áp dụng cho người. Tất nhiên với
mtDNA ghép thì truy tìm phả hệ theo dòng mẹ sẽ gặp lúng túng.
Cũng theo công trình nghiên cứu, kết quả xét nghiệm mới nhất cho thấy chỉ có
chưa đến 1% ty thể của bé trai ra đời bằng phương pháp kết hợp ADN này mang gen
đột biến.
- Bệnh viêm não tủy nhiễm acid lactic với các biểu hiện tương tự đột quỵ
(MELAS): bệnh gây ra bởi đột biến A3243G thuộc gen tRNA (leu). Bệnh có các triệu
chứng đột biến thần kinh trung ương, liệt nửa người, mù và nôn mửa.
- Chứng động kinh co giật cơ và có sợi đỏ nham nhở (MERRF): Bệnh gây ra
bởi đột biến A8344G, T8356C thuộc gen tRNA (lys). Người bệnh có biểu hiện tai
biến, co giật
1.3.Tình hình nghiên cứu ở trong nước về đột biến mt DNA
Phạm Văn Chi (2006), cho đến nay các nghiên cứu về đột biến DNA ty thể ở
người Việt Nam vẫn chưa nhiều, số liệu còn hạn chế và chưa có tính hệ thống. Phan
9


Văn Chi và cs (2004) khi nghiên cứu giải mã genome ty thể các tộc người Việt Nam

đã tìm thấy một số biến đổi của DNA ty thể ở người Việt Nam thuộc vùng D-loop, các
gen ND1, ND2, ND5, ND6, cytochrome b, rRNA 12S, rRNA 16S, COXI, COXII,
COXIII, ATP6, ATP8. Ngoài ra, trong nghiên cứu này đã tìm thấy đột biến A3243G ở
bệnh nhân mắc bệnh MELAS (2/34 bệnh nhân mang đột biến).
Chu Văn Mẫn và cs (2009) đã sử dụng phương pháp PCR-RFLP kết hợp giải
trình tự DNA và đã xác định thấy đột biến A3243G có mặt ở bệnh nhân và mẹ bệnh
nhân trong một gia đình có người mắc hội chứng MELAS.
Phạm Hùng Vân và cs (2010) đã sử dụng phương pháp giải trình tự trực tiếp
DNA ty thể tách chiết từ máu bệnh nhân mang bệnh LEBER, và đã xác định thấy 9/12
ca có đột biến DNA ty thể, 7 trong số 9 ca này mang đột biến G11778A là đột biến
nặng và thường gặp nhất, 2 ca còn lại mang đột biến T14484C [8].
Nhóm nghiên cứu của Nguyễn Hữu Nghĩa đã sử dụng phương pháp giải
trình tự tách dòng, và đã xác định thấy nhiều đột biến (tại 14 vị trí) trên vùng D-Loop
ở một người lao động thường xuyên tiếp xúc với bức xạ ion hóa. Liên quan đến xác
định đột biến DNA ty thể ở bệnh nhân ung thư người Việt Nam, kết quả thu được còn
rất ít. Cho đến nay, chúng tôi chỉ tìm thấy 1 nghiên cứu trên đối tượng bệnh nhân ung
thư vú. Nghiên cứu được thực hiện với số mẫu hạn chế (2 bệnh nhân). Kết quả phân
tích đã cho thấy có đột biến điểm và đột biến mất đoạn 280 bp trong vùng D-loop của
bệnh nhân ung thư vú người Việt Nam.
Như vậy, như đã tổng quan ở trên, các nghiên cứu điều tra trên thế giới đã cho
thấy đột biến DNA ty thể liên quan chặt chẽ với nhiều loại bệnh, nhất là bệnh ty thể và
bệnh ung thư. cơ, lưỡi, nhiễu loạn thính giác, suy nhược thần kinh do teo não và
nhược cơ.
1.4.

Các phương pháp phát hiện đột biến gen ty thể giúp chẩn đoán bệnh
Các đột biến DNA ty thể phần lớn ở dạng không đồng nhất (heteroplasmy), các

đặc điểm lâm sàng của bệnh chỉ biểu hiện khi tỷ lệ không đồng nhất này đạt đến một
mức độ nhất định tùy thuộc vào loại mô, tế bào. Bởi vậy để chẩn đoán được bệnh

10


chính xác và kịp thời, người ta thường sử dụng các kỹ thuật phân tích trực tiếp DNA ty
thể.
- Phương pháp PCR-RFLP
Phương pháp cơ bản và được sử dụng phổ biến nhất để xác định đột biến điểm
của DNA ty thể là PCR-RFLP. Đây là sự kết hợp kỹ thuật PCR với kỹ thuật xác định
đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP). Đầu tiên, đoạn DNA ty thể có chứa đột
biến được nhân lên bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm PCR sau đó được cắt
bởi enzym giới hạn thích hợp. Cuối cùng, các đột biến sẽ được nhận biết qua phổ băng
điện di. Phương pháp PCR-RFLP giúp phát hiện đột biến thuận lợi, nhanh chóng và
không đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền.
-

Phương pháp giải trình tự

Để khẳng định chính xác đột biến, người ta phải xác định trình tự nucleotide
đoạn DNA mang đột biến. Nguyên tắc của hầu hết các phương pháp giải trình tự hiện
nay đều dựa trên phương pháp được Sanger và cộng sự công bố năm 1977, được gọi là
phương pháp dideoxyribonuleotide (gọi tắt là phương pháp dideoxy). Theo phương
pháp này, một trình tự Sanger giới hạn được bắt đầu tại một vị trí cụ thể trên chuỗi
DNA bằng cách sử dụng một oligonucleotide ngắn, có trình tự bổ sung với trình tự của
mẫu tại vị trí đó. Các mồi oligonucleotide được kéo dài nhờ tác dụng của enzyme
DNA polymerase. Trong hỗn hợp phản ứng có sẵn các loại deoxynucleotide A, T, G, C
trong đó có một loại là di-deoxynucleotide để ngắt phản ứng kéo dài chuỗi. Các đoạn
ngắn DNA mới được tổng hợp sau đó được điện di trên gel polyacrylamide, hình ảnh
thu được sẽ được dùng để phân tích trình tự DNA. Ngày nay, phương pháp giải trình
tự tự động được áp dụng rộng rãi ở các phòng thí nghiệm trên thế giới nhưng cơ bản
vẫn áp dụng nguyên lý như trên. Người ta đã tiến hành cải tiến, sử dụng chất huỳnh

quang, cho phép xác định chính xác các điểm đột biến trên cả một hệ gen với độ nhạy
rất cao.
Ưu điểm lớn nhất của giải trình tự là cung cấp đầy đủ thông tin về điểm đột
biến như: loại đột biến, vị trí, hậu quả. Tuy nhiên nó có hạn chế là đòi hỏi sản phẩm
khuếch đại DNA phải có độ tinh sạch rất cao và các hóa chất, thiết bị đắt tiền. Ngoài
11


ra, tỷ lệ không đồng nhất mà phương pháp này có thể xác định được khoảng 25% trở
lên.
Với mục tiêu phát hiện sớm bệnh ở giai đoạn đầu để điều trị, người ta sử dụng một số
phương pháp có khả năng phát hiện mức độ không đồng nhất của DNA ty thể ở một tỷ
lệ rất thấp mà phương pháp PCR-RFLP không phân tích được. Đó là phương pháp
PCR định lượng (Realtime PCR) và sắc ký lỏng hiệu năng cao biến tính (DHPLC).
-

Phương pháp Realtime PCR

Realtime PCR sử dụng phân tử phát huỳnh quang để ghi lại quá trình tăng
lượng DNA được nhân lên trong phản ứng PCR tỷ lệ thuận với sự tăng tín hiệu huỳnh
quang. PCR định lượng cho phép xác định số bản sao DNA ty thể ban đầu có trong
mẫu với độ chính xác và độ nhạy cao. Có hai loại phương pháp phân tích hay được sử
dụng:
- Phương pháp sử dụng chất nhuộm màu gắn với DNA: Chất nhuộm này có ái lực rất
cao khi có sự hiện diện của sợi đôi DNA, làm cho sợi đôi DNA phát được ánh sáng
huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích.
- Phương pháp sử dụng đầu dò oligonucleotide có gắn phân tử huỳnh quang. Khi có
mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu trong ống phản ứng thì sẽ có sự bắt cặp của đầu dò
lên trình tự đặc hiệu của sản phẩm khuếch đại, khi đó sẽ có sự phát huỳnh quang từ
ống phản ứng khi nó nhận được nguồn sáng kích thích.

Theo Yec và cộng sự (2008), phương pháp PCR định lượng cho phép định lượng đột
biến DNA ty thể với mức độ không đồng nhất thấp dưới 1% .
-

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao biến tính (DHPLC)

Theo LinK.S và cộng sự (2007),phương pháp DHPLC sử dụng cột sắc ký kỵ
nước trên cơ sở sắc ký lỏng pha đảo để phân tách DNA dị sợi kép (heteroduplex) với
đồng sợi kép (homoduplex) tại nhiệt độ tối ưu. Các mạch DNA được phân tách ở nhiệt
độ cao, sau khi hạ nhiệt độ xuống, chúng liên kết với nhau và hình thành DNA dị sợi
kép chứa các cặp ghép đôi không chính xác. Các phân tử dị sợi kép này có thời gian di
chuyển khác biệt so với sợi kép bình thường. Nhiều nghiên cứu đã sử dụng phương
pháp này để sàng lọc toàn bộ genome ty thể, hoặc một vùng nhất định của DNA ty
12


thể để xác định đột biến. Để định lượng mức độ không đồng nhất của ty thể, người ta
đã xác định mối quan hệ giữa diện tích của đỉnh sắc ký có dị sợi kép và mức độ không
đồng nhất của ty thể. Phương pháp DHPLC cho phép định lượng đột biến DNA ty thể
thấp tới 1%.

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP
2.1 Nội dung
Trường hợp người phụ nữ có một đứa con bị bệnh đột biến gen ở ty thể
(mtDNA), thì nếu có sinh những đứa con tiếp theo cũng sẽ vẫn bị bệnh, do đột biến
gen ở ty thể di truyền theo dòng mẹ. Để khắc phục tình trạng đó, người mẹ muốn sinh
đứa con phát triển bình thường thì chỉ có thể sử dụng phương pháp mới nhất hiện nay
đó là spindle nuclear transfer (truyền nhân non hay truyền thể nhân) và parent invitro
fertilization –IVF (thụ tinh trong ống nghiệm) có 3 cha mẹ.
2.2 Phương pháp tiến hành

2.2.1 Phương pháp 1: Chuyển nhân hay gen của tế bào trứng mẹ vào Tế bào trứng
hiến tặng đã được loại bỏ nhân
Bước 1: Tế bào trứng nơi chứa bộ toàn bộ thông tin di truyền là nhân, trứng
được lấy ra khỏi buồng trứng của người mẹ, sau đó hút nhân từ tế bào trứng của người
mẹ. Trong một quy trình song song, lấy một quả trứng của người hiến tặng có ty thể
khỏe mạnh. Tất cả các thông tin di truyền từ cha mẹ ban đầu phải được duy trì thông
13


qua quá trình này. Nhân được lấy từ trứng của người mẹ, bằng cách sử dụng kỹ thuật
hiện đại, bỏ lại ty thể bị khiếm khuyết phía. Quy trình này bao gồm pipet chân không
để giữ trứng đúng chỗ. Một micropipette được sử dụng để xuyên qua Zona Pellucida
(màng ngoài) của trứng và hút lấy nhân. Quy trình tương tự cũng được áp dụng cho
trứng của người hiến tặng, tất cả DNA đều được loại bỏ. DNA của người hiến tặng
được loại bỏ, vì nó không
cần thiết.

Bước 2: Sau đó nhân của người mẹ được đưa vào trứng của người hiến tặng, có
ty thể khỏe mạnh. Như vậy tế bào trứng mới này đảm bảo ty thể khỏe mạnh và có
thông tin di truyền của người mẹ ban đầu.
Bước 3: Tiếp tục chuyển tế bào trứng mới này thụ tinh trong ống nghiệm, tinh
trùng của cha được kết hợp với trứng mới khỏe mạnh mang thông tin di truyền của
người mẹ và được cấy vào tử cung của người mẹ để bắt đầu mang thai.

14


Hình 4 . Cho thấy thông tin di truyền của người mẹ được lấy ra khỏi trứng và
chuyển sang trứng có ty thể khỏe mạnh, và trứng mới sau đó được thụ tinh.
2.2.2 Phương pháp 2: Tế bào trứng của mẹ được thụ tính sau đó mới lấy ra và

chuyển vào tế bào trứng hiến tặng đã được loại bỏ nhân
Phương pháp này thì tế bào trứng của mẹ đã được thụ tinh sau đó vật liệu di
truyền được chuyển vào trứng của người hiến tặng.
Bước 1: bước đầu tiên trong phương pháp này là thụ tinh trứng của mẹ với tinh trùng
của cha bằng phương pháp in vitro của cha. Nhân này có thông vật liệu di truyền của
cả hai cha mẹ,
Bước 2: Loại bỏ DNA nhân từ trứng của người hiến tặng, giữ lại tế bào chất có ty thề
khỏe manh
Bước 3: Sau đó nhân của người mẹ được đưa vào trứng của người hiến tặng, có ty thể
khỏe mạnh. Như vậy tế bào trứng mới này đảm bảo ty thể khỏe mạnh và có thông tin
di truyền của người mẹ ban đầu
Phương pháp này có cái khó là xác định thời điểm tinh trùng thụ tinh và đi vào
nhân của tế bào trứng mẹ.
15


Hình 5. Mô tả quá trình truyền thông tin di truyền, sự khác biệt lớn duy nhất là ở
bước 1, trong đó trứng đã được thụ tinh trước được hút ra

16


CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Mặc dù cả hai phương pháp gần như giống nhau, phương pháp chuyển AND từ
nhân tế bào mẹ khi chưa thụ tinh có nhiều ưu điểm hơn, là nhân đã được thụ tinh, vì
trong các thí nghiệm lâm sàng cho kết quả tỷ lệ thành công cao hơn (75% so với 62%
tương ứng).
Như vậy phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm (parent invitro fertilization
-IVF), sẽ góp phần giảm chi phí chăm sóc sức khỏe, đặc biệt là đối với các gia đình có
mẹ bị đột biến ty thể, mang lại lợi ích tài chính cho người bị bệnh và gia đình, đồng

thời giảm bệnh tật thì người bệnh sẽ không bị những đau đớn và phiền toái do bệnh
tật.
Theo Bộ Y tế và Dịch vụ Nhân sinh Hoa Kỳ, “chi phí y tế tăng gấp đôi từ năm
1996 đến năm 2006, và được dự đoán sẽ đạt đến một phần tư tổng sản phẩm quốc nội
vào năm 2025”. Khi các quan chức chính phủ và các chính trị gia đấu tranh để tìm một
giải pháp để giảm chi phí chăm sóc sức khỏe, các nhà y khoa tìm ra các phương pháp
điều trị hiệu quả và chi phí. Viện Y tế quốc gia tuyên bố rằng xét nghiệm di truyền và
điều trị các đột biến di truyền có giá khoảng 5.000 đô la/người, dẫn đến chi phí chẩn
đoán và chữa trị ước tính khoảng 2 tỷ đô la cho đột biến di truyền.
Đối với những trường hợp có con muộn, nếu sinh con thì con dễ bị mắc bệnh di
truyền khi phụ nữ trên 40 tuổi, do đó sẽ khó khăn khi liên quan đến kế hoạch làm cha
mẹ. trường hợp này cần tham gia vào chẩn đoán di truyền và điều trị biến chứng liên
quan đến ty thể. Thông qua những tiến bộ trong di truyền học sẽ kiểm soát bệnh tốt
hơn và giảm nguy cơ bất thường cho con.
Mối quan tâm hiện nay trong điều trị đột biến ty lạp thể là bằng phương pháp
IVF vấn đề đạo đức. Cả hai phương pháp trên đều cho tỷ lệ thành công cao trong việc
ngăn ngừa các đột biến ty thể di truyền từ mẹ sang con. Có hai quan điểm đồng tình và
phản đối, tuy nhiên, các quá trình điều trị đột biến ty thể không liên quan đến việc thay

17


đổi bất kỳ thông tin di truyền nào, vì đây là di truyền ngoài nhân, và giúp giảm những
bệnh không mong muốn.
- Những ý kiến phản đối cho rằng chống lại các quy luật tự nhiên. Tuy nhiên 99,9%
vật liệu di truyền trong tế bào được chứa trong nhân tế bào, trong khi chỉ có 0,1%
thông tin di truyền khác được lưu trữ trong DNA của ty thể, mà DNA chứa trong ti thể
chỉ phục vụ cho ty thể hoạt động bình thường và không góp phần vào sự phát triển thể
chất và tinh thần của con cái. Do đó, ty thể chỉ đóng góp 0,1%, không góp phần vào sự
phát triển thể chất của thế hệ con cái, làm suy yếu lập luận rằng ba cha mẹ có liên

quan đến sự phát triển của đứa trẻ. Và hiện nay cũng chưa có luật hiến tặng ty thể cho
các gia đình bị bệnh. Điều quan trọng cần lưu ý những di truyền của mẹ đã loại bỏ
ADN ty thể đột biến có bị trở lại sang con hay không thì cần có thời gian theo dõi.

18


19


CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN
Kỹ thuật di truyền Parent invitro fertilization (IVF) với 3 cha mẹ kết hợp với
thụ tinh nhân tạo, đã đạt được thành công lớn, loại bỏ sự gia tăng nguy cơ dị tật di
truyền ở trẻ em. Đột biến di truyền không chỉ ảnh hưởng đến người mắc bệnh, mà di
truyền đến thế hệ con cháu. Do đó, việc chẩn đoán di truyền preimplantation và kết
hợp với các phương pháp kỹ thuật di truyền phòng ngừa bệnh tật để loại bỏ những căn
bệnh này.
IVF với 3 cha mẹ thành công, là bước đầu tiên trong việc đưa ra các giải pháp
chữa các bệnh khác và phức tạp hơn để ngăn chặn các bệnh di truyền đột biến DNA ty
thể (mtDNA).

20


TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Đái Duy Ban (2003), "Bước đầu nghiên cứu ung thư vú bệnh nhân Việt Nam bằng
phương pháp sinh học phân tử sử dụng chỉ thị di truyền hệ gen ty thể vùng D- Loop",
Báo cáo khoa học hội nghị toàn quốc lần thứ hai, nghiên cứu cơ bản trong sinh học,
nông nghiệp, y học, pp. 825-830.

2. Phan Văn Chi (2006), "Nghiên cứu giải mã genome ty thể các tộc người Việt Nam
và định hướng ứng dụng". Báo cáo đề tài cấp nhà nước (mã số: KC-04- 25).
3. Nguyễn Như Hiền (2010), Giáo trình sinh học tế bào, Nhà xuất bản giáo dục Việt
Nam.
4. Chu Văn Mẫn (2009), "Tìm hiểu bệnh ty thể ở người bằng phương pháp sinh học
phân tử". Báo cáo đề tài ĐHQGHN (mã số: QT-08-31).
5. Nguyễn Hữu Nghĩa, Đặng Trần Trung và Tống Quang Vinh (2008), "Đột biến hệ
gen ty thể vùng D-Loop ở người lao động thường xuyên tiếp xúc với bức xạ ion hóa",
Tạp chí Y học Việt Nam, 351, pp. 29-34.
6. Phạm Hùng Vân, Hoàng Hiếu Ngọc và Võ Quang Hồng Điểm (2010), "Các trường
hợp đầu tiên về bệnh lý thần kinh nhãn cầu LEBER xác định bằng kỹ thuật giải trình
tự DNA ty thể tách chiết từ bạch cầu của bệnh nhân để phát hiện các đột biến gây
bệnh", Kỷ yếu hội nghị Sinh học phân tử và hóa sinh y học, pp. 285-289
Tài liệu nước ngoài
7. Anderson S., Bankier A. T., and Barrell B. G. (1981), "Sequence and organization
of the human mitochondrial genome", Nature, 290(1), pp. 457465.
8. Chinnery P. F., Johnson M. A. and Wardell T. M. (2000), "Epidemiology of
pathogenic mitochondrial DNA mutations", Annals of Neurology, 48, pp. 188-193.
23. Choi S. J. et al (2011), "Mutational hotspots in the mitochondrial genome of lung
cancer", Biochemical and Biophysical Research Communications, 407(1), pp. 23-27.
21


9. Green D. R. (1998), "Apoptotic pathways: the roads to ruin", Cell, 6, pp. 695-698.
10. Lee H. C. et al (2004), "Somatic mutations in the D-Loop and decrease in the copy
number of mitochondrial DNA in human hepatocellular carcinoma", Mutations, 547,
pp. 71-7843.
11.Modica-Napolitano J. S., Kulawiec M., and Singh K. K. (2007), "Mitochondria
and Human Cancer", Current Molecular Medicine, 7, pp.121-131.
12. Solano A., Playan A., and Lopez-Perez M. (2001), "Genetic diseases of human

mitochondrial DNA", Salud publica de Mexico, 43, pp. 151-161
13. Taylor R. W. and Turnbull D. M. (2005), "Mitochondrial DNA mutations in human
disease", Nature Reviews Genetics, 6, pp. 389-40
14. Tuppen H. A., Blakely E. L., and Turnbull D. M. (2010), "Mitochondrial DNA
mutations and human disease", Biochimica et Biophysica Acta (BBA) -Bioenergetics,
1797(2), pp. 113-128.
/>genetic-diseases-and-disorders

22

prevent-