Tải bản đầy đủ (.pdf) (193 trang)

Nghiên cứu thu nhận, khảo sát cấu trúc và tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ lactobacillus fermentum

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (6.22 MB, 193 trang )

FF

ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

Trần Thị Ái Luyến

NGHIÊN CỨU THU NHẬN, KHẢO SÁT CẤU TRÚC VÀ TÍNH
CHẤT CỦA EXOPOLYSACCHARIDE SINH TỔNG HỢP TỪ
Lactobacillus fermentum

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

HUẾ - NĂM 2019


ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

Trần Thị Ái Luyến

NGHIÊN CỨU THU NHẬN, KHẢO SÁT CẤU TRÚC VÀ TÍNH
CHẤT CỦA EXOPOLYSACCHARIDE SINH TỔNG HỢP TỪ
Lactobacillus fermentum

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Mã số: 9440114
LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:
PGS.TS. Đỗ Thị Bích Thủy



HUẾ - NĂM 2019


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa
học độc lập của riêng tôi. Các số liệu sử dụng phân tích
trong luận án có nguồn gốc rõ ràng, đã công bố theo
đúng quy định. Các kết quả nghiên cứu trong luận án do
tôi tự tìm hiểu, phân tích một cách trung thực, khách
quan và phù hợp với thực tiễn của Việt Nam. Các kết
quả này chưa từng được công bố trong bất kỳ nghiên cứu
nào khác.
Nghiên cứu sinh

Trần Thị Ái Luyến

i


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt
BMM
C
CFU/mL
COSY
DMSO
DPPH

EPS
EPS-TC13
EPS-TC16
EPS-TC21
EPS-MC3
EtOH
FDA
Fruc
FTF
HePS
HMBC
HoPS
HPLC
HSQC
Gal
GalNAc
GalT
GC-MS
GDP
Glc
Glc-1-P
Glc-6-P
GlcNAc

Tiếng anh hoặc tên khoa học
Tiếng việt
basal minimum medium
Môi trường tối ưu cơ bản
Carbon
Cacbon

colony-forming unit/Ml
số lượng tế bào/mL
Correlated Spectroscopy
Dimethyl sulfoxide
1,
1-diphenyl-2picrylhydrazyl
Exopolysaccharide
Exopolysaccharide sinh tổng hợp
từ Lb. fermentum TC13
Exopolysaccharide sinh tổng hợp
từ Lb. fermentum TC16
Exopolysaccharide sinh tổng hợp
từ Lb. fermentum TC21
Exopolysaccharide sinh tổng hợp
từ Lb. fermentum MC3
Ethanol
Cồn etylic
Food and Drug Administration Cục quản lý Thực phẩm và Dược
phẩm Hoa Kỳ
Fructose
fructosyltransferase
heteropolysaccharide
Polysaccharide phức tạp
Heteronuclear multiple - Bond
Correlation
homopolysaccharide
Polysaccharide thuần
High-performance
liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao
chromatography

Heteronuclear SpectroscopyQuantum Coherence
galactose
N-acetyl-D-galactosamine
galactose
1-phosphateuridyltransferase
Gas Chromatrography Mass Sắc ký khí ghép khối phổ
Spectometry
guanosine diphosphate
glucose
glucose-6-phosphate
glucose-1-phosphate
N-acetyl-D-glucosamine
ii


GlcA
GRAS
GTF
La.
LAB
Lac
Lb.
Leu.
Man-6-P
Man-1-P
MeOH
MRS
MTTH
N
NDP

NMR
NOESY
P.
PEP-PTS
PGM
PMM
PS
Rha
S.
Suc
TCA
TDP
TFA
TGP
TMS
UDP
WPC

glucuronic acid
Generally Recognized As Safe Vi sinh vật an toàn
glycosyltransferase
Lactococcus
Lactic Acid bacteria
Vi khuẩn lactic
Lactose
Lactobacillus
Leuconostoc
Mannose-6-Phosphate
Mannose-1-Phosphate
Methanol

Man Rogosa Sharpe
Môi trường thích hợp
Nitrogen
Nitơ
diphosphate nucleoside
Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Nuclear Overhauser Effect
Spectroscopy
Pediococcus
phosphoenolpyruvatephosphotransferase
phosphoglucomutase
phosphomannomutase
Polysaccharide
Rhamnose
Streptococcus
Sucrose
trichloroacetic acid
tyrosine diphosphate
Trifluoroacetic acid
TDP-glucose
pyrophosphorylase
Tetramethylsilan
Uridine diphosphate
whey protein concentration

iii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................................... i

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ...................................................................................... ii
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU......................................................................................... vi
DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................................... vii
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................... 3
1.1. Tổng quan về polysaccharide ...........................................................................3
1.1.1. Giới thiệu chung về polysaccharide ..........................................................3
1.1.2. Ứng dụng của polysaccharide ...................................................................4
1.2. Tổng quan về Lactobacillus fermentum ...........................................................5
1.3. Tổng quan về exopolysaccharide từ vi khuẩn lactic ........................................6
1.3.1. Khái niệm ..................................................................................................6
1.3.2. Đặc điểm phân loại và một số đặc tính lý hóa ..........................................6
1.3.3. Tính chất chức năng và ứng dụng ...........................................................14
1.4. Tình hình nghiên cứu về exopolysaccharide từ LAB ....................................20
1.4.1. Về điều kiện nuôi cấy thu nhận EPS .......................................................20
1.4.2. Về quá trình tách chiết và tinh chế EPS ..................................................23
1.4.3. Về đặc tính hóa lý: khối lượng phân tử, thành phần, liên kết và cấu trúc ..
...........................................................................................................................24
1.4.4. Về tính chất công nghệ và các tác dụng về sức khỏe ................................34
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................... 37
3.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................37
3.2. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ .......................................................................37
2.2.1. Hóa chất ...................................................................................................37
2.2.2. Thiết bị và dụng cụ..................................................................................37
3.3. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................38
2.3.1. Phương pháp xác định mật độ tế bào vi khuẩn bằng phương pháp đo mật
độ quang (OD)...................................................................................................38
2.3.2. Phương pháp nuôi cấy thu nhận sinh khối [6] ........................................38
2.3.3. Phương pháp thu nhận và tách EPS ........................................................39
2.3.4. Sơ đồ tổng thể về phương pháp nghiên cứu cải thiện hiệu suất thu nhận
EPS từ một số chủng Lb. fermentum ................................................................40

2.3.5. Xác định hàm lượng EPS bằng phương pháp phenol-sulfuric [37] ........43
2.3.6. Xác định hàm lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl [5] ........44

iv


2.3.7. Phương pháp khảo sát một số tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công
nghệ thực phẩm .................................................................................................45
2.3.8. Phương pháp xác định khối lượng phân tử và đặc điểm cấu trúc của EPS
...........................................................................................................................47
2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu.......................................................................50
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN......................................... 52
3.1. Kết quả nghiên cứu cải thiện hiệu suất thu nhận EPS từ một số chủng Lb.
fermentum ..............................................................................................................52
3.1.1. Kết quả tuyển chọn một số chủng Lb. fermentum sinh tổng hợp EPS cao .
...........................................................................................................................52
3.1.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường lên quá trình sinh
tổng hợp EPS từ các chủng Lb. fermentum tuyển chọn ...................................54
3.1.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp EPS của
các chủng Lb. fermentum TC13, TC16, TC21, MC3........................................66
3.1.4. Kết quả khảo sát điều kiện tách EPS từ dịch lên men ............................82
3.2.1. Khả năng hòa tan trong nước ..................................................................89
3.2.2. Khảo sát khả năng giữ nước và giữ dầu ..................................................91
3.2.3. Khả năng chống oxy hóa .........................................................................95
3.3. Kết quả phân tích khối lượng phân tử và một số đặc điểm về cấu trúc của các
EPS sinh tổng hợp từ Lb. fermentum MC3 ...........................................................99
3.3.1. Khối lượng phân tử .................................................................................99
3.3.2. Đặc điểm về cấu trúc của EPS-MC3 .....................................................103
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................................... 128
1. Kết luận ...........................................................................................................128

2. Kiến nghị .........................................................................................................130
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÓ LIÊN QUAN ĐÃ CÔNG BỐ
................................................................................................................................................. 131
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 133
PHỤ LỤC

v


DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1. Tổng quan về một số điều kiện nuôi cấy nhằm thu nhận EPS cao từ các
loài Lactobacillus đã được công bố ..........................................................................22
Bảng 1.2. Thông tin về cấu trúc và các phương pháp NMR tương ứng ...................27
Bảng 1.3. Tổng quan các nghiên cứu về cấu trúc của EPS sinh tổng hợp từ LAB đã
được công bố .............................................................................................................29
Bảng 1.4. Tổng quan các nghiên cứu liên quan đến sức khỏe của EPS sinh tổng hợp
từ LAB đã được công bố ...........................................................................................35
Bảng 2.1. Chương trình nhiệt độ phân tích mẫu trên thiết bị sắc ký GC-MS ..........50
Bảng 3.1. Điều kiện thu nhận EPS cao của các chủng Lb. fermentum nghiên cứu trong
luận án .......................................................................................................................81
Bảng 3.2. Các điều kiện tách EPS từ dịch nuôi cấy thích hợp của các chủng Lb.
fermentum trong luận án............................................................................................89
Bảng 3.3. Độ hòa tan trong nước của EPS từ các chủng Lb. fermentum .................90
Bảng 3.4. Khả năng giữ nước của các EPS từ các chủng Lb. fermentum ................92
Bảng 3.5. Khả năng giữ dầu của EPS từ các chủng Lb. fermentum .........................93
Bảng 3.6. Tỷ lệ bắt gốc tự do DPPH (%) của các EPS thu được từ các chủng Lb.
fermentum (TC13, TC16, TC21, MC3) ....................................................................96
Bảng 3.7. Các dẫn xuất monosaccharide thu được từ EPS sinh tổng hợp bởi Lb.
fermentum MC3 ......................................................................................................103
Bảng 3.8. Tỷ lệ, thành phần (%) các monosaccharide trong cấu trúc EPS sinh tổng

hợp bởi Lb. fermentum MC3 ...................................................................................103
Bảng 3.9. Các dẫn xuất methyl alditol acetate monosaccharide thu được và liên kết
glycoside tương ứng của EPS sinh tổng hợp bởi Lb. fermentum MC3...................110
Bảng 3.10. Độ chuyển dịch hóa học 1H –NMR và 13C – NMR của EPS-MC3 đo trong
DMSO .....................................................................................................................118
Bảng 3.11. Các dạng liên kết trong cấu trúc của EPS-MC3 qua phổ NOESY, HMBC
.................................................................................................................................119
Bảng 3.12. Đặc điểm về cấu trúc của các EPS sinh tổng hợp từ chi Lactobacillus đã
công bố và của EPS-MC3 của luận án ....................................................................123

vi


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc dạng vòng 6 cạnh -pyranose (a) của glucose và 5 cạnh -furanose
(b) của fructose ............................................................................................................3
Hình 1.2. Hình dạng khuẩn lạc Lb. fermentum ..........................................................5
Hình 1.3. Cấu trúc của dạng mạch thẳng (a) và mạch nhánh (b) của HoPS ..............7
Hình 1.4. Mô hình về quá trình sinh tổng hợp glucan và fructan ..............................7
Hình 1.5. Sơ đồ phân loại và đặc điểm cấu tạo của HoPS sinh tổng hợp từ LAB .....9
Hình 1.6. Cấu trúc của dạng mạch thẳng (a) và mạch nhánh (b) của HePS ............10
Hình 1.7. Sơ đồ quá trình sinh tổng hợp HePS trong tế bào LAB ...........................11
Hình 1.8. Cấu tạo của UDP-glucose và TDP-glucose, TDP-rhamnose và UDPglactose ......................................................................................................................12
Hình 1.9. Sơ đồ phân loại và đặc điểm cấu tạo của các HePS sinh tổng hợp từ LAB
...................................................................................................................................14
Hình 1.10. Sơ đồ biểu diễn các tính chất tăng cường sức khỏe của EPS từ LAB ....15
Hình 2.1. Sơ đồ nuôi cấy thu nhận sinh khối ...........................................................38
Hình 2.2. Sơ đồ thu nhận và tách EPS .....................................................................39
Hình 2.3. Sơ đồ nghiên cứu khảo sát cải thiện hiệu suất thu nhận EPS ...................40
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu một số tính chất có tiềm năng ứng dụng

trong công nghệ thực phẩm .......................................................................................45
Hình 2.5. Sơ đồ quy trình xử lý mẫu phân tích GC-MS để xác định liên kết glycoside
...................................................................................................................................48
Hình 2.6. Sơ đồ quy trình xử lý mẫu phân tích GC – MS ........................................49
Hình 3-1. Khả năng sinh tổng hợp EPS của một số chủng vi khuẩn lactic ..............53
Hình 3.2. Ảnh hưởng của nguồn carbon và nồng độ bổ sung của chúng vào môi
trường MRS đến khả năng tổng hợp EPS của các chủng Lb. fermentum .................55
Hình 3.3. Ảnh hưởng của nguồn N và nồng độ bổ sung của chúng vào MTTH đến
khả năng tổng hợp EPS của các chủng Lb. fermentum .............................................61
Hình 3.4. Ảnh hưởng của mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu lên quá trình sinh tổng hợp
EPS bởi các chủng Lb. fermentum ............................................................................66
Hình 3.5. Ảnh hưởng của pH ban đầu lên quá trình sinh tổng hợp EPS bởi các chủng
Lb. fermentum ...........................................................................................................69
Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên quá trình sinh tổng hợp EPS bởi các
chủng Lb. fermentum .................................................................................................72

vii


Hình 3.7. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến quá trình sinh tổng hợp EPS bởi các
chủng Lb. fermentum .................................................................................................77
Hình 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein và
lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum TC13 .............................................83
Hình 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein và
lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum TC16 .............................................83
Hình 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein và
lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum TC21 .............................................83
Hình 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein và
lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum MC3 ..............................................84
Hình 3.12. Ảnh hưởng của thể tích ethanol so với dịch nổi đến khả năng tách EPS

...................................................................................................................................87
Hình 3.13. Ảnh hưởng của thời gian tủa bằng ethanol lên khả năng tách EPS .......88
Hình 3.14. Sắc kí đồ khối lượng phân tử của EPS-MC3 bằng phương pháp sắc ký
thẩm thấu gel ...........................................................................................................100
Hình 3.15. Sơ đồ xử lý mẫu cho phân tích NMR ...................................................111
Hình 3.16. Phổ 1H-NMR của EPS-MC3 ...............................................................112
Hình 3.17. Phổ 13C-NMR của EPS-MC3 ..............................................................113
Hình 3.18. Phổ HSQC (a, b, c) của EPS-MC3 .......................................................116
Hình 3.19. Phổ đồ COSY của EPS-MC3 ...............................................................117
Hình 3020. Phổ đồ HMBC của EPS-MC3 .............................................................118
Hình 3.21. Phổ đồ NOESY của EPS-MC3 ............................................................119
Hình 3.22. Các đơn vị lặp lại trong cấu trúc của EPS-MC3 đã được thủy phân một
phần .........................................................................................................................120

viii


MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây, khuynh hướng ứng dụng polymer tự nhiên trong
nhiều lĩnh vực tăng lên đã dẫn đến sự phát triển nghiên cứu thu nhận
exopolysaccharide (EPS) từ vi khuẩn. Nhiều vi khuẩn có thể tổng hợp các
polysaccharide (PS) ngoại bào và tiết chúng ra bên ngoài môi trường [115]. Các PS
tách chiết được có sự đa dạng về cấu trúc và các tính chất chức năng. Chính vì vậy,
nguồn EPS này ngày càng được sử dụng rộng rãi trong công nghệ thực phẩm cũng
như mỹ phẩm. Chúng là những tác nhân làm đặc, ổn định kết cấu, nhũ hóa, tạo gel,
... Hơn nữa, gần đây, những hoạt tính sinh học khác nhau liên quan đến EPS như khả
năng chống oxy hóa, chống ung thư, làm giảm cholesterol, hoạt động probiotic cũng
được nghiên cứu phổ biến [88], [125], [139] …
Mặc dù có rất nhiều đóng góp quan trọng trong công nghiệp và trong y học
nhưng EPS từ vi khuẩn vẫn tồn tại một nhược điểm là năng suất thu nhận thấp. Đây

là lý do chính khiến khả năng thương mại hóa của EPS từ vi khuẩn nói chung và từ
vi khuẩn lactic (LAB-Lactic acid bacteria) nói riêng còn khá hạn chế. Từ khi LAB
được "công nhận là vi sinh vật an toàn” (GRAS-Generally Recognized As Safe), việc
cải thiện quá trình thu nhận, tách chiết EPS được coi là một phương pháp hữu ích để
sản xuất EPS đáp ứng phương diện ứng dụng trong thực phẩm [59]. Nhiều chủng
LAB được biết đến là nguồn sản xuất EPS – với những tác động liên quan đến việc
cải thiện cấu trúc của các sản phẩm lên men như sữa chua, phomat,... Bên cạnh đó,
nhờ những đặc điểm đa dạng trong cấu trúc cũng như sự an toàn đối với sức khỏe con
người mà EPS sinh tổng hợp từ vi khuẩn lactic (LAB) được quan tâm nhiều hơn so
với EPS từ các loài khác.
Nhiều nghiên cứu đã kết luận rằng, thành phần monosaccharide, vị trí liên kết
trong cấu trúc và những tính chất có tiềm năng ứng dụng của các EPS sinh tổng hợp
bởi các chủng thuộc LAB khác nhau phụ thuộc vào loại chủng, điều kiện nuôi cấy và
thành phần môi trường [74], [102], [104], [126],….
Như vậy, sự đa dạng trong cấu trúc của các loài vi khuẩn khác nhau có thể liên
quan đến nguồn phân lập vi khuẩn, thành phần các chất dinh dưỡng trong quá trình

1


lên men cũng như điều kiện nuôi cấy và thu nhận. Sự đa dạng này sẽ tạo nên những
ảnh hưởng không nhỏ đến các hoạt tính sinh học cũng như những tính chất chức năng
trong công nghệ thực phẩm. Chính vì vậy, để nâng cao hiệu quả thu nhận EPS và đặc
biệt là cung cấp một số thông tin chi tiết hơn về các đặc tính cấu trúc của các EPS
sinh tổng hợp từ một trong các chủng LAB nói chung và một số chủng Lactobacillus
fermentum nói riêng, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu thu nhận, khảo sát
cấu trúc và tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus
fermentum”.
Với đề tài trong luận án này, chúng tôi sẽ xác định được:
1) Điều kiện thu nhận EPS từ một số chủng Lb. fermentum hiệu quả nhất;

2) Một số tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm;
3) Một số thông tin về phân tử lượng, thành phần đường, mối liên kết của một
số EPS mới được tách chiết từ các chủng vi khuẩn nghiên cứu.
Với những đặc tính mới được phát hiện, chúng có thể là tiền đề cho các nghiên
cứu ứng dụng trong y dược, trong thực phẩm thay thế cho các hợp chất được tổng
hợp hóa học.

2


CHƯƠNG 1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về polysaccharide
1.1.1. Giới thiệu chung về polysaccharide
Polysaccharide (PS) là polyme thiên nhiên thuộc nhóm carbohydrate và thường
được coi là các polyme sinh học đa năng với các chức năng được biết đến như là
nguồn năng lượng dự trữ (tinh bột, glycogen); tạo nên cấu trúc vững chắc cho thực
vật hoặc động vật (cellulose, chitin); chất bảo vệ (exopolysaccharide của vi sinh
vật),... [29].
Trong chuỗi PS, các monosaccharide liên kết với nhau bằng liên kết glycoside.
Sự khác nhau giữa các PS thường liên quan đến các monosaccharide cấu tạo nên
chúng. Các PS chỉ chứa một loại monosaccharide được gọi là homopolysaccharide
hoặc homoglycan. Các PS chứa nhiều hơn một loại monosaccharide được gọi là
heteropolysaccharide hoặc heteroglycan.
Các monosaccharide có cấu trúc dị vòng được cấu tạo bởi các nguyên tử oxy,
hydro, carbon. Sự phân loại các monosaccharide dựa vào số lượng nguyên tử carbon
dạng vòng 7, 6, 5 cạnh hoặc dạng mạch hở. Các PS thường được tạo nên bởi các đơn
vị lặp lại, bao gồm một hoặc nhiều monosaccharide và phổ biến nhất trong tự nhiên

thường có cấu trúc vòng 6 cạnh (pyranose). Các monosaccharide này có cấu trúc dạng
α và β. Trong đó, dạng β-D-glucopyranose là phổ biến nhất. β-D-glucopyranose có
thể chuyển đổi lẫn nhau tạo nên dạng cấu hình ghế (Hình 1.1a). Ngoài ra, vòng 5 cạnh
(furanose) cũng được coi là thành phần có vai trò quan trọng về mặt sinh học (Hình
1.1b) do chúng có mặt trong acid nucleic và một số PS từ vi sinh vật.

b)

a)

Hình 1.1. Cấu trúc dạng vòng 6 cạnh -pyranose (a) của glucose và 5 cạnh -furanose
(a)
(b)
(b) của fructose [29]
3


Trong những năm gần đây, nhiều loại PS mới có vai trò quan trọng trong y học
và thương mại đã được thu nhận từ quá trình lên men vi sinh vật. Các PS này có thể
được sinh tổng hợp từ các loài vi sinh vật gây bệnh hoặc không gây bệnh. Trong đó,
các PS được tổng hợp từ các loài vi sinh vật không gây bệnh đã được khai thác vì
chúng có nhiều ứng dụng quan trọng trong công nghiệp và trong công nghệ sinh học
với những tính chất độc đáo và mới lạ như tạo gel, khả năng tự phân hủy sinh học,
tính bám dính sinh học,... Một số PS phổ biến đã được thu nhận từ vi sinh vật có thể
kể đến như (i) xanthan, gellan, dextran, alternan, curdlan, exopolysaccharide (EPS)
của vi khuẩn lactic (LAB), levan, alginate (từ vi khuẩn); (ii) pullulan, scleroglucan,
schizophyllan và lentinan (từ nấm); và (iii) BYG (Beer’ yeast glucan) - các glucan
thương mại từ nấm men bia [67].
1.1.2. Ứng dụng của polysaccharide
Với nguồn nguyên liệu thu nhận phổ biến, chi phí thu nhận thấp đã góp phần

giúp các hợp chất PS có thêm nhiều phạm vi ứng dụng hơn trong sản xuất thực phẩm,
dược phẩm, mỹ phẩm,…
Trong công nghệ thực phẩm: Các PS được sử dụng như những chất phụ gia
được bổ sung vào quá trình chế biến thực phẩm với vai trò giúp hoàn thiện cấu trúc
thực phẩm từ đó làm tăng giá trị cảm quan cho sản phẩm: tạo gel, làm tăng độ nhớt,
từ đó tạo nên sự ổn định của nhũ tương hoặc giúp ngăn chặn hiện tượng tách nước
trong một số sản phẩm có bản chất cấu trúc gel đặc biệt là sữa chua [67].
Trong dược phẩm: PS được coi là những vật liệu sinh học phổ biến. Chúng đang
đóng góp vai trò quan trọng cho quá trình phát triển sản phẩm mới trong dược phẩm
và những ứng dụng y tế như các chất kết dính đơn giản hoặc là phương tiện phân phối
thuốc tinh vi [67], [114].
Trong công nghệ sinh học và phòng thí nghiệm: Nhờ các đặc tính tạo màng film,
tạo gel cùng khả năng gắn các ion đã giúp cho các PS được sử dụng như là các công
cụ vô giá trong công nghệ sinh học và trong công tác nghiên cứu tại phòng thí nghiệm.
Chẳng hạn như, việc sử dụng agar tạo cho các khuẩn lạc của vi khuẩn phát triển; sử
dụng các PS hòa tan, không hòa tan và dẫn xuất của chúng giúp cố định protein, cố
định enzyme và tế bào động vật hoặc sử dụng như dextran hoặc pullulan làm chất
4


chuẩn trong kỹ thuật phân tách các phân tử bằng phương pháp sắc ký như sắc ký khối
phổ (mass spectrometry (MS)), sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-performance liquid
chromatography (HPLC)) [67], [114].
Nhìn chung, nhờ vào những tính chất chức năng công nghệ như khả năng tạo
gel, tạo độ nhớt, làm bền nhũ tương cũng như khả năng tự phân giải nên các hợp chất
PS càng ngày càng được quan tâm nghiên cứu khai thác bởi các nhà khoa học trong
nước cũng như trên thế giới [10], [19], [39], [136]. Một trong những nguồn cung cấp
các hợp chất PS đang được quan tâm nhiều nhất là LAB đặc biệt là các PS được chúng
tiết ra ngoài môi trường và được gọi là EPS.
1.2. Tổng quan về Lactobacillus fermentum

Lactobacillus fermentum là một loài vi khuẩn Gram dương thuộc chi
Lactobacillus (Lb.), các vi khuẩn này thường được tìm thấy trong các sản phẩm lên
men từ động vật và thực vật. Chúng là những vi khuẩn ưa ấm, có nhu cầu dinh dưỡng
phức tạp, lên men dị hình chặt chẽ, có thể lên men các đường như glucose (glc),
fructose (fruc), maltose, sucrose, lactose... Trong quá trình sinh trưởng và phát triển,
chúng chịu các tác động không nhỏ bởi các yếu tố vật lý (pH, nhiệt độ, thời gian, …),
các yếu tố hóa học (nguồn carbon (C) nguồn nitrogen (N),…). Lb. fermentum có thể
tạo thành các khuẩn lạc màu trắng xám với đường kính khoảng 1µm. Hình dạng khuẩn
lạc của chủng này có thể lồi lõm hoặc hơi lồi, bề mặt nhẵn (Hình 1.2a). Đặc điểm nổi
bật của khuẩn lạc Lb. fermentum là có cấu trúc vòng tròn đồng tâm ở trung tâm khi
được quan sát dưới kính hiển vi (Hình 1.2b). Hầu hết các tế bào vi khuẩn được sắp
xếp dưới dạng đơn lẻ hoặc theo cặp; chúng không có khả năng sinh bào tử và không
di động [143].
b)

a)

Hình 1.2. Hình dạng khuẩn lạc Lb. fermentum [143]
5


Từ lâu, Lb. fermentum đã được sử dụng như là giống khởi đầu cho quá trình lên
men trong nhiều sản phẩm thực phẩm và đồ uống. Bên cạnh đó, cũng giống như các
loài thuộc LAB khác, trong quá trình lên men carbohydrate, ngoài sản phẩm chính là
acid lactic, Lb. fermentum còn tạo ra các hợp chất tạo hương (diacetyl/acetoin) và đặc
biệt là các PS ngoại bào (EPS) [59]. Chúng là những hợp chất có giá trị thương mại
lớn với các tính chất hóa lý có lợi như khả năng tạo gel, tạo kết cấu, tạo độ đặc trong
thực phẩm cùng những tác động có lợi liên quan đến sức khỏe như có tiềm năng
probiotic, làm giảm cholesterol, kích thích miễn dịch, chống ung thư [81], [89], [132].
Kể từ các chủng vi khuẩn lactic (LAB-Lactic Acid Bacteria) được Cục quản lý

Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA- Food and Drug Administration) công nhận
là vi khuẩn an toàn cho sức khỏe con người, sự quan tâm về EPS từ LAB nói chung
đặc biệt là từ các loài Lb. fermentum nói riêng nhằm thay thế cho các PS từ thực vật
ngày càng tăng trong xu hướng sản xuất, lưu thông các sản phẩm có tính chất tự nhiên
và an toàn.
Nhờ những tính chất ưu việt độc đáo và mới lạ riêng biệt, gần đây các chế phẩm
PS thương mại được khai thác từ vi sinh vật đã và đang nhận được sự quan tâm nhiều
hơn. Trong luận án này, chúng tôi tập trung nghiên cứu về EPS từ các chủng LAB
thuộc loài Lb. fermentum.
1.3. Tổng quan về exopolysaccharide từ vi khuẩn lactic
1.3.1. Khái niệm
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, vi khuẩn có thể sinh tổng hợp nhiều
loại PS khác nhau. Tùy theo vị trí của chúng trên tế bào, các PS đó có thể là nội bào
hoặc ngoại bào. Những PS được tiết ra bên ngoài màng tế bào được gọi là PS ngoại
bào. Chúng có thể tạo thành một chất dính bám chặt và được gọi là PS dạng màng
bao hoặc cũng có thể được gắn lỏng lẻo hoặc được bài tiết hoàn toàn ra môi trường
như là các chất nhờn gọi là EPS [19], [87], [91]… Chúng là những PS chuỗi dài, phân
nhánh với các đơn vị lặp đi lặp lại của các monosaccharide hoặc các dẫn xuất của
chúng [87].
1.3.2. Đặc điểm phân loại và một số đặc tính lý hóa

6


Căn cứ vào thành phần monosaccharide và đặc biệt là cơ chế sinh tổng hợp, các
EPS từ LAB được chia thành hai nhóm lớn là các heteropolysaccharide (HePS) và
các homopolysaccharide (HoPS) [13], [91], [115]. Quá trình sinh tổng hợp EPS bởi
các chủng vi khuẩn thuộc LAB có thể xảy ra ở bên trong hoặc ở bên ngoài tế bào.
Đây là một quá trình phức tạp với nhiều phản ứng sinh hóa được xúc tác bởi enzyme
[69], [90].

- Nhóm thứ nhất: homopolysaccharide (HoPS)

b)
a)

Hình 1.3. Cấu trúc của dạng mạch thẳng (a) và mạch nhánh (b) của HoPS [13]
HoPS là những PS được cấu tạo từ một loại monosaccharide (dạng hexose) như Dglc hoặc D-fruc (Hình 1.3). Các chi thuộc LAB như Lactobacillus, Leuconostoc (Leu.),
Streptococcus (S.) được biết đến như là nguồn sinh tổng hợp HoPS.

Phần ngoại bào

Màng plasmid
Tế bào chất
Chất
xúc tác

Tín hiệu
xuất

Glc

Fruc

Hình 1.4. Mô hình về quá trình sinh tổng hợp glucan và fructan [13]
7


Quá trình tổng hợp HoPS xảy ra ở bên ngoài tế bào nhờ sự xúc tác của các
enzyme đặc hiệu glycosyltransferase (GTF - glucansucrase) hoặc fructosyltransferase
(FTF - fructansucrase). Các enzyme này từ nội bào di chuyển ra bên ngoài tế bào nhờ

tín hiệu xuất. Sau đó chúng xúc tác thủy phân sucrose thành glc và fruc và tạo ra liên
kết glycoside của glc hoặc fruc với một phân tử chất nhận tạo nên chuỗi glucan hoặc
fructan. Đây chính là các HoPS ngoại bào (EPS) (Hình 1.4) [13], [59].
Như vậy, sucrose chính là cơ chất được LAB sử dụng để sinh tổng hợp EPS.
Trong quá trình này, sucrose được thủy phân thành glc và fruc như là những cơ chất
mới. Phản ứng này cũng có vai trò cung cấp năng lượng cho quá trình tổng hợp nên
các PS [27].
Các HoPS từ LAB thường có sự khác nhau về loại liên kết, mức độ phân nhánh,
độ dài của chuỗi glycan, khối lượng phân tử và cấu tạo của chúng [59], [106]. Tùy
vào thành phần monosaccharide tạo thành trong cấu trúc của HoPS là glc hoặc fruc
mà các HoPS có thể được phân thành hai nhóm chính: glucan và fructan (Hình 1.5)
[13], [92], [106].
Tóm lại, hai phân nhóm glucan và fructan là các HoPS được cấu tạo bởi các
monome là các phân tử glc và fruc. Sự khác nhau giữa chúng được thể hiện qua các
liên kết đặc trưng, khối lượng phân tử, độ dài và cấu tạo hóa học [28].

8


HoPS
10 – 106 Da
5

Fructosyltransferase

Fructan: liên kết β
- Lb. panis
- Lb. pontis
- Lb. frumenti


Glucansucrase
Glucan

Các liên kết α

Inulin: liên kết β(1,2)
Mạch thẳng hoặc
phân nhánh
- Lb. reuteri

Levan: liên kết β-(2,6)
Mạch thẳng
- Lb. reuteri 121
- Lb. sanfranciscensis

Dextran α-(1,6)
- Lb. fermentum
- Lb. sakei
- Lb. parabuchneri
- Lb. hilgardii

Mutan α-(1,3)
- Lb. reuteri ML1

Các liên kết β
- Lb. suebicus
- Lb. G77

Reuteran α-(1,4)
- Lb. reuteri 121

- Lb. reuteri ATCC
55730

Hình 1.5. Sơ đồ phân loại và đặc điểm cấu tạo của HoPS sinh tổng hợp từ LAB [13]

9


- Nhóm thứ hai: heteropolysaccharide (HePS)
Khác biệt với các HoPS, các HePS có sự đa dạng về thành phần, tỷ lệ
monosaccharide và cấu trúc phân tử của các đơn vị lặp đi lặp lại cũng như đặc điểm
cấu tạo và khối lượng phân tử của polyme (Hình 1.6).

Hình 1.6. Cấu trúc của dạng mạch thẳng (a) và mạch nhánh (b) của HePS [13]
Các chủng vi khuẩn ưa ấm (mesophilic) Lactococcus (La) lactis subsp. lactis,
La. lactis subsp. cremoris, Lb. casei, Lb. sake, Lb. rhamnosus, v.v.) và các chủng ưa
nhiệt (Lb. acidophilus, Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus, Lb. helveticus và S.
thermophilus) được biết đến như là nguồn tổng hợp nên các HePS từ LAB [18], [27]
[29]. Quá trình sinh tổng hợp của các HePS xảy ra trong tế bào (Hình 1.7). Đó là một
chuỗi phức tạp của các phản ứng liên quan đến hệ enzyme nội bào của LAB và thường
trải qua ba giai đoạn: (a) sự hấp thu cơ chất, (b) sự chuyển hóa đường trung gian và
(c) quá trình tổng hợp PS [59], [66].
(1) Sự hấp thụ cơ chất từ môi trường vào trong tế bào vi khuẩn (Hình 1.7a)
Đây là quá trình vận chuyển các nguồn C, chủ yếu là các monosaccharide và
disaccharide, từ bên ngoài môi trường vào tế bào chất. Sau khi vào trong tế bào, hầu
hết các nguồn C đều được chuyển thành glc. Quá trình này được thực hiện lặp đi lặp
lại. Tùy thuộc vào loại cơ chất mà nó có thể được đưa đến các tế bào thông qua một
hệ thống vận chuyển thụ động hoặc chủ động. Các hệ thống tham gia vào quá trình
vận chuyển đường thường là phosphoenolpyruvate - phosphotransferase (PEP-PTS)
của LAB [98].

(2) Sự chuyển hóa tạo nên các loại đường trung gian (Hình 1.7b): Quá trình chuyển
hóa này gồm hai giai đoạn: giai đoạn tổng hợp glucose-1-phosphate (Glc-1P) và giai
đoạn hoạt hóa, liên kết của các loại đường.

10


Hình 1.7. Sơ đồ quá trình sinh tổng hợp HePS trong tế bào LAB [59]

11


- Sự tổng hợp glucose-1-phosphate
Khi vào tế bào chất, glc trải qua quá trình glycolysis và phosphoryl hóa. Đây là
chìa khóa trung gian quan trọng gắn kết các quá trình đồng hóa trong sự tổng hợp
EPS và các quá trình dị hóa của sự phân giải đường. Trước hết, dưới tác dụng của
hexokinase, glc tạo thành glucose-6-phosphate (Glc-6P). Sau đó, dưới tác dụng của
phosphoglucomutase (PGM), Glc-6P được chuyển thành Glc-1P.
- Sự hoạt hóa và liên kết của các loại đường:
Glc-1P tiếp tục được chuyển hóa thành các nucleotide-đường (NDP) như
Uridine diphosphate glucose (UDP-glc) và Thymidine diphosphate glucose (TDPglc) (Hình 1.8) nhờ xúc tác của các enzyme tương ứng là UDP-glucose
pyrophosphorylase (UGP) và TDP-glucose pyrophosphorylase (TGP).
UDP-glucose

TDP-glucose

UDP-galactose

TDP-rhamnose


Hình 1.8. Cấu tạo của UDP-glucose và TDP-glucose, TDP-rhamnose và UDPglactose [27]
Sau đó, các loại đường này tiếp tục chuyển hóa tạo nên các NDP khác bao gồm
Uridine diphosphate galactose (UDP-Gal) do UDP-Glc chuyển thành dưới tác dụng
của UDP-Gal-4-epimerase (UGE) và TDP Rhamnose (TDP-Rha) do sự chuyển hóa
từ TDP-Glc dưới tác dụng xúc tác bởi TDP-glc dehydratase. Bên cạnh đó, Glc-1P
cũng có thể được chuyển hóa theo hướng tạo thành Mannose-6P (Man-6P) nhờ xúc
tác của enzyme phosphomannomutase (PMM). Từ Man-6P tiếp tục hình thành các

12


hợp chất Man-1P, GDP-Man và Guanosine di phosphate fructose (GDP-Fruc) nhờ sự
xúc tác lần lượt của các enzyme tương ứng là, man-1P guanylyltransferase, GDPmannose pyrophosphorylase (GMP) và GDP-mannose dehydratase; hoặc từ Glc-1P
thông qua bước gian là tạo thành fructose-6P (fruc-6P) dưới tác dụng của hexokinase.
Man-6P

được

hình

thành

từ

fruc-6P

nhờ

sự


xúc

tác

của

enzyme

phosphomannoisomerase (PMI) và cuối cùng là GDP-fructose.
Sự tạo thành các NDP này (UDP-glc, TDP-Rha, UDP-Gal và GDP-Fruc) có vai
trò rất quan trọng trong quá trình tổng hợp EPS. Chúng chính là tiền thân của các đơn
vị lặp lại góp phần tạo nên sự đa dạng trong cấu trúc của các PS từ vi khuẩn.
Bên cạnh đó, Glc-6P còn được đồng phân hóa và hướng tới các sản phẩm của
quá trình đường phân tạo thành pyruvate trong điều kiện hiếu khí. Pyruvate này theo
chu trình Kreps và hình thành ATP (Adenosin Triphosphate) để cung cấp năng lượng
cho quá trình sinh tổng hợp các nucleotide-đường trong tế bào.
(3) Quá trình tổng hợp EPS (Hình 1.7c). Đây là sự lắp ráp của các đơn vị lặp đi
lặp lại monosaccharide. Dưới sự xúc tác của hệ enzyme GTF, các NDP gồm UDPglc, UDP-gal, TDP-rha, GDP-fruc kết hợp lại với nhau tạo thành một đơn vị lặp đi
lặp lại trong phân tử HePS. Các phân tử lặp đi lặp lại này được đẩy lên từ bề mặt tế
bào sau đó được polyme hóa để tạo thành một chất nhờn lỏng hoặc PS dạng
periplasmic gắn xung quanh các tế bào và chiết xuất ra bên ngoài.
Như vậy, quá trình sinh tổng hợp các HePS trước hết đòi hỏi sự tổng hợp nên
các tiền chất đã được kích hoạt. Đó là các monosaccharide giàu năng lượng, chủ yếu
là các loại NDP [42]. Các chủng thuộc LAB có thể sử dụng các monosaccharide và
các disaccharide khác nhau như nguồn năng lượng trong quá trình sinh tổng hợp của
chúng [27], [59].
Sự hình thành các HePS gồm một bộ khung của các đơn vị monosaccharide, các
dẫn xuất của monosaccharide và luôn luôn có sự phân nhánh. Nhìn chung, sự phân
nhánh cao trong HePS một phần là do các đơn vị lặp đi lặp lại tạo nên, một phần là
do số lượng các monosaccharide ở các mạch bên tạo thành (có thể là một, hai, hoặc

ba monosaccharide). Các monosaccharide trong HePS thường phân nhánh rất lớn với
các loại liên kết khác nhau (dạng α- hoặc β-) để tạo nên bộ khung khác nhau (có thể
13


là vòng 6 cạnh – pyranose hoặc vòng 5 cạnh – furanose). Trong đó, D-galactose (Gal)
có tần suất xuất hiện lớn nhất ở cả hai dạng pyranose và furanose. D-Glc chỉ có ở
dạng pyranose (Hình 1.9) [13], [27], [28], [29].

- Phân nhánh liên kết
α, β nhánh (ở vị trí
C2, C3, C4, C6)
- Không phân nhánh

Khối lượng phân tử:
từ 1x104 – 6x106 Da
Được tổng hợp từ các
loài Lactobacillus ưa
nhiệt và ưa ẩm

HePS
Gồm 3 – 8 phân tử
monosaccharide cấu
tạo thành
Các monosaccharide chủ yếu gồm:
- D-Glucose
- D-Galactose
- L-Rhamnose
Ngoài ra:
+ Mannose, fructose, glucuronic acid

+ Phosphate, glucosamine, dạng
galactosamine

Các monosaccharide
dạng: pyranose hoặc
furanose

acetyl,

Hình 1.9. Sơ đồ phân loại và đặc điểm cấu tạo của các HePS sinh tổng hợp từ
LAB [13]
Như vậy, khác với các HoPS, ngoài glc và fruc, HePS còn được cấu tạo bởi các
monome đa dạng hơn như D-gal, L-rham, man, dạng acetyl,… và có sự phân nhánh
nhiều hơn. Thành phần của các tiểu đơn vị monosaccharide và cấu trúc của các đơn
vị lặp lại thường không cố định, trong đó, D-gal, D-glc và L-rham hầu như luôn luôn
có mặt, nhưng ở tỷ lệ khác nhau [29]. Sự khác biệt giữa HoPS và HePS không chỉ thể
hiện qua tính chất hoá học, bản chất của các mối liên kết mà nó còn thể hiện thông
qua các enzyme tổng hợp và vị trí tổng hợp nên chúng [18].
1.3.3. Tính chất chức năng và ứng dụng

14


Do có sự đa dạng trong cấu trúc, các EPS từ vi sinh vật, đặc biệt là từ LAB đã
tạo ra được những tiềm năng ứng dụng có giá trị cao, chất lượng sản phẩm hoàn toàn
vượt trội so với các PS từ thực vật, tảo [87]. Bên cạnh những tác dụng nổi bật liên
quan đến việc hỗ trợ về sức khỏe, các tính chất chức năng công nghệ, các ứng dụng
của EPS ngày càng được mở rộng trong các lĩnh vực khác như dược phẩm, dinh
dưỡng, thực phẩm chức năng và mỹ phẩm. Chính vì vậy, chúng có tiềm năng để phát
triển và khai thác làm phụ gia thực phẩm hoặc thành phần của thực phẩm chức năng

về cả sức khỏe và lợi ích kinh tế [27].
1.3.3.1. Chức năng liên quan đến sức khỏe
Việc sử dụng các thực phẩm chứa EPS hoặc các vi khuẩn có khả năng tổng hợp
nên các EPS mang lại rất nhiều lợi ích khác nhau. Trong phạm vi tổng quan của luận
án này, một số chức năng liên quan đến sức khỏe của EPS sinh tổng hợp từ LAB
được giới thiệu chủ yếu như có tính probiotic và prebiotic; hoặc có hoạt tính chống
ung thư, chống viêm loét dạ dày, kích thích miễn dịch, hoặc các hoạt động làm giảm
cholesterol (Hình 1.10) [106], [107].

Ruột

Chống viêm, loét
dạ dày

Tham gia hệ
miễn dịch
- Kích thích hoạt động của đại thực bào
- Giúp tăng nhanh tế bào bạch huyết
- Sản sinh tế bào

Prebiotic và
probiotic

Làm giảm cholesterol
trong máu
Hoạt động chống
khối u (ung thư)

Hình 1.10. Sơ đồ biểu diễn các tính chất tăng cường sức khỏe của EPS từ LAB [106]
- EPS có chức năng như là prebiotic và probiotic

15


×